JPH05502791A - 酵素の結晶化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素の結晶化方法 本発明は酵素の結晶化方法に関する。

酵素は産業の目的に対し液体又は固体材料として通常提供されている。液体とし て提供されていない場合、酵素は通常無定形材料として提供される。なぜなら酵 素の結晶化に対する公知の方法は通常産業的規模で用いるにはあまりにも高すぎ るものと考えられているからである。

従って、本発明の目的は簡易且つ安価であり更に産業的要求に適合するような、 酵素の結晶゛他方法を提供することにある。

本発明に係る方法は、比較的に高い酵素純度を存し更に酵素含有液体１２当り少 なくとも５ｇの純粋な酵素蛋白質濃度を有する水性酵素含を液体を出発材料とし て用いることを特徴とし更に結晶化剤（これは非ハロゲン化物タイプの易溶性の 塩を、最終濃度（これは無定形の酵素を沈澱させる為に必要な濃度よりもより小 さい）まで、出発材料に添加することを特徴とする。

産業的規模で実施する場合、結晶を濾過器で分離し、次いで引続き精製の目的の 為さっと洗う。図１参照。

請求の範囲の記載と共に本明細書に於いて、易溶性塩は、２５°Ｃの純水中で５ ｇ／／！を超える溶解度を示す塩であると理解されるべきである。

先に示した出発材料は当業者に公知であり、更にそれらは例えばＭｉｃｒｏｂｉ ａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、第１巻、アカデミ−プレス社、１９７９ 年の第９章（「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｎｚｙｍｅ ｓ　Ｊ　）に記載される如く提供され、従って工業銘柄の酵素に対する回収及び 精製方法の概略は該章に見出すことが出来る。更に米国、特許３，７９５，５８ ３は培養ブロスを含有する酵素の精製方法を記載する。

驚くべきことに以下の内容が見出された。即ち簡易且つ安価な本発明方法は、９ ５％までの収率で実施することが可能であり更に該方法は容易に産業的実施に適 合せしめることが出来る。

本発明方法の好ましい態様によれば、酵素の純度は２０％超であり（即ち純粋な 酵素の量が酵素含有液体中全乾燥物質の２０％超に達する）、更に、結晶化剤を 、０．０２−１．７Ｍ、好ましくは０．０５−１．６Ｍ、更に好ましくは０．１ ０−１．５Ｍの結晶化剤の添加量の結晶化剤に相当する最終濃度まで、出発材料 に添加する。

斯して、酵素の結晶化に対する本発明方法の為の好ましい出発材料は、２０％超 の酵素純度（即ち純粋な酵素の量が酵素含有液体中全乾燥物質の２０％超に達す る）を有し更に酵素含を液体１！当り少なくとも５ｇの純粋な酵素蛋白質濃度を 有する水性酵素含有液体である。結晶化に対する必要な時間は通常５−１２時間 である。例えば１％量の結晶の種を添加することにより、結晶化の速度を加速さ せることが出来る。

結晶は好ましくは濾過法により上澄から分離される。

本発明に係る方法の好ましい態様によれば、比較的高い酵素純度及び酵素含有液 体１１当り少なくとも５ｇ゛の純粋な酵素蛋白質濃度更に１５−４５℃、好まし くは２０−４５°Ｃの温度を有する水性酵素含有液体を出発材料として用いる、 更に易溶性塩である結晶化剤を、最終濃度（これは無定形の酵素を沈澱させる為 、に必要な濃度よりもより小さい）まで、出発材料に添加する。

本発明方法の好ましい態様によれば、酵素の純度は２０％超であり（即ち純粋な 酵素の量は酵素含有液体中全乾燥物質の２０％超に達する）、更に結晶化剤を０ ．０２−１．７Ｍの結晶化剤、好ましくは０．０５−１．６Ｍ、より好ましくは ０．１０−１．５Ｍの結晶化剤の添加される量に相当する最終濃度まで出発材料 に添加する。

本発明方法の好ましい１！様によれば、酵素はプロテアーゼ、リパーゼ、アミラ ーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、アミダーゼ又はオキシダー ゼである。これらの酵素は通常洗剤中添加剤として用いられ、更に従って、結晶 酵素が洗剤産業に於いて望ましい場合この態様が好ましい。又これらの酵素の蛋 白質処理変異体も本発明の範囲内である。

本発明方法の好ましい態様によれば、酵素はプロテアーゼであり、プロテアーゼ はズブチリシンタイプのプロテアーゼ、好ましくはサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓ ｅ）　（登録商標）又はサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）　（登録商標）の蛋白 質処理変異体又はアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）　（登録商標）である。こ の様なプロテアーゼの他の例はアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）　（登録商標 ）、ズブチリシンＮ０ＶＯ又はこれらの蛋白質処理変異体であり、これらは洗剤 中添加剤として非常に一般的に用いられ、更に従って結晶のサビナーゼ（Ｓａｖ ｉｎａｓｅ）　（登録商標）、エスペラーゼ（Ｅｓｐｅｒａｓｅ）　（登録商標 ）、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）　Ｃ登録商標）、ズブチリシンＮ０ＶＯ 又はこれらの蛋白質処理変異体が洗剤産業に於いて望ましい場合、この態様が好 ましい。

本発明方法の好ましい態様に於いて、結晶化剤はギ酸ナトリウム、ギ酸カリウム 、ギ酸カルシウムもしくはギ酸マグネシウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、 酢酸カルシウム又は酢酸マグネシウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸カ ルシウム又は硝酸マグネシウムである。この様な方法で、急速で且つ充分な結晶 化が行なわれる。

デンマーク特許出願番号８７２／８６は、酵素含有液体の結晶化方法を記載して おり、ここに於いて上澄液が酵素の同電点近くのｐＨで結晶化される。

米国特許４，６９９．８８２は、特にグルコースイソメラーゼを目的とする結晶 化方法を開示している。必須の行程の一つは約１６℃又はそれ以下に冷却するこ とである。他の必須の行程は、硫酸アンモニウム及び／又は硫酸マグネシウムの 添加である。

国際出願８９１０８７０３は、ズブチリシン結晶化方法を開示しており、これは 必須の行程として結晶化剤を用いており、この結晶化剤はハロゲン化塩であり、 更にこれは約１０℃未満でのみ満足に実施することが出来る。

従って全てのこれらの従来方法は本質的に本発明方法と異なる。

実施例１−４ サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）　（登録商標）結晶の結晶化に対する出発材料 を次の方法で調製する。

７３５ｇのＣａＣＩｚ　’２Ｈｚ　Ｏ及び１１の水を、１ｋｇのサビナーゼ（Ｓ ａｖｉｎａｓｅ）　（登録商標）発酵ブロス（米国特許３．７２３．２５０）に 添加する。ｐＨを、水性水酸化ナトリウム溶液を用いて８．０に調節する。次い で懸濁液を、スーパーフロック（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ）　Ｃ５２１凝集剤（ブロ スｉｆ当り約１５ｇ）及びスーパーフロック（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ）　Ａ　１３ ０凝集剤（プロスＩｆ当り約０．２ｇ）を添加することにより凝集せしめる。

凝集した懸濁液を、遠心し、次いで上澄液を適当な濾過シートで濾過し澄明な液 体を得る。濾液を１２％のＲ１（Ｍ折率）の値まで蒸発により濃縮し、次いで約 ３８°Ｃに加熱する。この温度で硫酸ナトリウム（１ｋｇの酵素溶液当り２５０ 　ｇ）を、急速に撹拌しながら溶液に段階状に添加する。

沈澱物を濾別し次いで冷水（く５°Ｃ）（１ｋｇのフィルターケーク当り３−５ １の水）中に再度スラリー化せしめる。未溶解の材料を、濾過して除き次いで澄 明な濾液を以下の点まで限外濾過し次いでシアフィルターした（ｄｉａｆｉｌｔ ｅｒｅｄ）。ここでその点とは、浸透物中のＲ１（屈折計の指針）乾物の値が、 ０．５％未満であり更にコンセントレート中のＲ１乾物の値が１０−１６％であ る。蛋白分解活性はＩ　８−２２ＫＮＰＵ／ｇである。

得られたコンセントレートは、乾物基準当り２５％ｗ　／　ｗ超の純粋なサビナ ーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）　（登録商標）プロテアーゼの含量を示す。

沈澱剤として作用する７％のギ酸カルシウム（０，５４Ｍ）、２０−２５°Ｃ且 つ約５．０のｐＨで出発物質即ち上記のコンセントレートに添加する。サビナー ゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）　（登録商標）結晶約１％ｗ　／　ｗを用い混合物に種 を蒔き、次いで穏やかに攪拌し、次いで３−６時間後、結晶性サビナーゼ（Ｓａ ｖｉｎａｓｅ）（登録商標）の強力な沈澱物が観測出来る。結晶スラッジの量は 、合計容量の約２０％であり更に約８６　ＫＮＰＵ／　ｇの酵素活性を示す。Ｋ ＮＰＵ基準の沈澱物の収率は約８１％である。

同じサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）　（登録商標）コンセントレート播種手順 、温度（２０−２４°Ｃ）及びｐＨ（５，０）を用い以下の実施例２−４を行な った。全ての得られた結晶性スラッジは、活性約８０にＮＰ［Ｊ／　ｇを有して いた。

実施例２−４に於ける種々のパラメーターは以下の表に示２　Ｃａ（ＣＨＯＯ） ｚ　Ｏ，３８Ｍ　１７．５　７３３　Ｋ（ＣＨ３ＣＯＯ）　０．８２Ｍ　１５． ０　７４４　Ｋ（ＣＨ３ＣＯＯ）　１．　ＯＯＭ　１６．０　７８実施例５−６ ９ 結晶化プロセスが以下のパラメーターに依存することが見出された： ｐＨ：　ｐＨが増加すると結晶の大きさは減少し、更に結晶化速度は増加する。

塩濃度：塩の濃度が増加すると、結晶化の収率は増大し、結晶化速度は増加し更 に結晶の寸法は減少する。

塩のタイプ：結晶化の挙動は塩によって異なる。

温度：温度が増加すると、結晶化速度は増大し、更に結晶の大きさは減少する。

酵素濃度：酵素濃度が増加すると、結晶化速度は増加し、結晶化収率は増加し更 に結晶の大きさは減少する。

酵素の純度：酵素の純度が増加すると、結晶速度が増加し、更に結晶の収率は増 加する。

以下の実施例５−１８　（これらは上記のｐＦｌ依存性及び塩濃度依存性を示す ）を、実施例１−４で述べた方法により製造したサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ ）　（登録商標）コンセントレートを用いて行なった。温度を２０−２５°Ｃで 保持し更に酵素濃度は約５５ｇ／ｉ！であった。結晶化剤は酢酸カリウムであっ た。

酵素の純度は約３５％であった。

５　４．０　０．８　結晶化なし ６　４．５　０．８　１−２時間、２０−５０μ−結晶７　５．５　０．８　１ ／２−１時間、１０−５０μ−結晶８　６、５　０．８　［Ｚ１／２１／２５５ −５０ａ結晶９　７．５　０．８　ホぼ１７２時間、５５−１Ｏｔ１結晶１０　 ５．５　０．０５　結晶化なし １１　５．５　０．１０　結晶化なし １２　５．５　０．２０　結晶化なし １３　５．５　０．４０　はぼ７５％、　１０−３０μｍ結晶１４　５．５　０ ．６０　はぼ８４％、　５−２０μ鋼結晶１５　５．５　０．８０　はぼ８４％ 、　１−２０μ−結晶１６　５．５　１．２０　はぼ８４％、　１−２０μ蒙結 晶１７　５．５　１．４０　はぼ８７％、１−Ｌｏｕｍ結晶１８　５．５　＞１ ．６０　無定形の断片第２図参照のこと、この第２図は酵素の純度の関数として 、結晶化の挙動（サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）　（登録商標））を示す。

第２図は、酵素の純度は増加するにつれ結晶化の速度及び結晶化の収率が増大す ることを示す。

酵素濃度の関数として結晶化の挙動を示す以下の実施例１９−２５は、２０−２ ５°Ｃで、１１当り０．８モルの酢酸カリウムを添加し且つｐＨ４，９で行なわ れた。酵素の純度は約３８％（ＤＳ基準）であった、サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａ ｓｅ）　（登録商標）サンプルを、カラム「ｇ酵素／Ｉｌ」内の値に対応する、 実施例１−４で言及した回収プロセスに於ける最終の限外濾過に於いて種々の段 階で取り出す。

裏施勇嘗号　鼠粟」ＩＺ工Ｌ　猪益化Ω工笠　双−圭１９　８．０　÷　０％ ２０　１７．０　２−３時間　７０％ ２１　２５．０　１１／２−２時間　８５％２２　３３．０　１１／２時間　８ ８％２３　４１、０　１／２−１時間　９０％２４　５０．０　１／２−１時間 　９２％２５　５８．０　１／２−１時間　９４％酵素の温度の関数として結晶 化の挙動を示す以下の実施例２６−２９は、１２当り０．５１モルの酢酸カリウ ムを添加し、ｐＨ５，５で且つ約５５ｇ／ｌの酵素濃度で行なわれる。

酵素の純度は約３６％（ＤＳ基準）であった。最大結晶化時間は２１２時間であ る。

実施例１号　ｔｕｔｉ益化Ω皿殆　双−圭２６　１０°Ｃ１０時間未満　１％超 ２７　１５°Ｃ３時間　７８％ ２８　２０°Ｃ２時間　８５％ ２９　３０°Ｃ３／４時間　９３％ 以下の実施例３０−６９は、結晶化のプロセスがアルカラーゼ（Ａ　ｌｃａ　１ ａｓｅ）　（登録商標）及びドゥラザイム（Ｄｕｒａｚｙｍ）　（登録商標）の ような他のズブチリシンを用いて容易に行うことが出来る。

結晶化に対する出発物質は、実施例１−４で記載したプロセスと極めて類似の回 収プロセスにより製造される。

アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）　（登録商標）の場合には凝集行程中、塩化 カルシウムの他に、発酵プロスＩｆ当り約４ｇのＮ　ａ　Ａ　１０２を添加する 。生成物は最終的に約３．５ＡＵ／ｇの蛋白分解活性を有する。

サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）　（登録商標）の蛋白質処理変異体であるドゥ ラザイム（Ｄｕｒａｚｙｎ＋）　（登録商標）は、実施例１−４に於けるサビナ ーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）　（登録商標）の結晶化に類イ以して調製される。生 成物は最終的に約１９　ＤＰＵ／　ｇの蛋白分解活性を有するであろう。

結晶化の前は、両方の酵素は乾物基準で測定して２５％超の酵素純度を有する。

以下の実施例３０−３４に於いて、酵素はアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）　 （登録商標）であり更に結晶化中のｐＨは４．５−８．５であり温度は２０−２ ５℃であり結晶化剤はギ酸ナトリウムでありこれは１．　５Ｍ／Ｉ！、の濃度で 添加され、酵素濃度はｖ１６６ｇ／ｌであり更に酵素純度は５０％である。

１８１号　ｄＩｉＬ益化皇Ｍ泣　双−圭３０　４．５　１時間　９２％ ３１　５．５　１時間　９３％ ３２　６．５　１／２時間　９５％ ３３　７．５　１／２時間　はぼ９３％３４　８．５　＜１／２時間　はぼ９３ ％アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）　（登録商標）及び異なる結晶化剤を用い る以下の実施例に於いて、結晶化中のｐＨは４．５−５．０であり、温度は２０ −２５°Ｃであり、結晶化の時間は６−２４時間であり、結晶化の濃度は約６６ ｇ／Ｉ！であり更に酵素の純度は５０％である。

酵素：アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）　（登録商標〕３５　Ｎａ（ＣＨ３Ｃ ＯＯ）　０．７　３５　％３６　Ｎａ（ＣＨｚＣＯＯ）　１．２　７０　％３７ 　Ｎａ（ＣＨ：＋Ｃ００）　１．７　７８％３８　Ｎａ（ＣＨＯＯ）　０．９　 ８０％３９　−Ｎａ（ＣＨＯＯ）　１．１　９０％４０　Ｎａ（ＣＨＯＯ）　１ ．４　９６％４１　Ｃａ（ＣＨＯＯ）ｚ　０．４　４５％４２　Ｃａ（ＣＨＯＯ ）ｚ　０．８　６０％４３　Ｃａ（ＣＨＯＯ）ｚ　Ｏ，９７８％アルカラーゼ（ Ａｌｃａｌａｓｅ）　（登録商標）を用い更に種々の酵素濃度でギ酸ナトリウム を用いて結晶化を行う以下の実施例に於いて、結晶化中のｐＨは４．５−５．０ であり、温度は２０’−２５°Ｃであり、結晶化の時間は１２時間（２０’−２ ５゛Ｃで）プラスＩＯ℃で１２時間である。酵素濃度は約６６ｇ／ｌであり、酵 素純度は５０％であり更に塩は１．　５　Ｍｏｌ／ｌの用量で添加される。

実施■且豆　Ｈ寒ユ■Ｚ工月　延益化至皿麹　玄−率４４　１９　２時間　６０ ％ ４５　２９　１時間　８１％ ４６　４０　１時間　８６％ ４７　５０　３／４時間　９０％ ４８　５８　３／４時間未満　９３％ 温度の関数として結晶化の挙動を示すアルカラーゼ（Ａｌｃａ−１ａｓｅ）　（ 登録商標）を用いる以下の実施例は、ｐＨ４，５及び５−３０°Ｃの温度で行な われる。ギ酸ナトリウムを１．　５　Ｍｏｌ／１の量で添加する。酵素濃度は約 ６６ｇ／ｌであり、酵素純度は５０％である。結晶化の時間は言及した温度で１ ２時間プラス１０°Ｃで１２時間である。

尖箇班査号　ｌ−皮　延星止■Ｍ殆　双−圭４９　５°Ｃ１，２時間超　− ５０１５°Ｃ１２時間超　− ５１２０°Ｃ１時間　９０％ ５２　２５°Ｃ１／２時間未満　はぼ８８％５３　３０°Ｃ１／２時間未満　は ぼ８６％酵素温度の関数としてアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）　（登録商標 ）の結晶化の挙動を示す以下の実施例は、ｐＨ５，０及び１５−３０゛Ｃの温度 で行なわれる。ギ酸カルシウムの用量は添加された０、８　Ｍｏｌ／ｊ２である 。酵素濃度は約６３　ｇ＃２であり酵素純度は５０％である。

結晶化の時間は言及した温度で１２時間プラス１０゛Ｃで１２時間である。

実施玉１号　１一度　藍益止皇Ｍ泣　°　１の　きさ５４　１５°Ｃ１０時間　 ４％１５０−８０μ１５５　２０°Ｃ４時間　１４％／４０−４０−８０ａ　２ ５℃　２１７４時間　４６％／１０−６０！！悶５７　３０°Ｃ１／２時間未満 　４９％／１５−４０μｍ種々のｐＨＯ値でアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ） 　（登録商標）の結晶化を示す以下の実施例が行なわれ、ｐｉｔは４．５−８． ５の間で変化し温度は２０−２５°Ｃであり、塩の用量は添加される０、８　Ｍ ｏｌ／ｆであり、酵素濃度は約６６　ｇ／ｌでありさらに酵素純度は５０％であ る。塩は酢酸カリウムである。

叉施五簀号　戸　猪益化皇回翅　°　８の　きさ５８　４．５　３１／２時間　 ５５％／３０−７０μｍ５９　５．５　１１／２時間　はぼ６０％”／　ＬＩＯ μｍ６０　６．５　１１／２時間　はぼ６０％”／　１−１０μｍ６１　７．５ 　１時間　はぼ６０％”／　１−１０．ｃｎｎ６２　８．５　１／４時間　はぼ ６０％”／　１−１０μｍり結晶は極めて小さく、従って母液から分離すること が困難である。

種々の結晶化剤を用いた結晶化を示すドゥラザイム（Ｄｕｒａ−ｚｙａ＋）　（ 登録商標）を用いる以下の実施例が、ｐＨ４，９及び２０−２５°Ｃの温度で行 なわれる。酵素濃度は約４８　ｇ　／　１であり酵素純度は約３０％である。

酵素：ドゥラザイム（Ｄｕｒａｚｙｍ）　（登録商標）災施尉１号　塩　５．． 　される　Ｍ　ｌ　裂−率６３　Ｎａ（Ｃ）１００）　０．６　４２％６４　Ｎ ａ（ＣＨＯＯ）　１．１　９０％６５　Ｎａ（Ｃｔｌｏｏ）　１．５　９６％６ ６　Ｋ（ＣＨ３ＣＯＯ）　０．６　６２％６７　Ｋ（ＣＨ，Ｃ００）　０．８　 ８３％６８　Ｋ（ＣＨ：＋Ｃ００）　１．２　８６％実施例６９ カンジダリパーゼＢの結晶化 カンジダリパーゼＢは国際比＠８８１０２７７５に開示されており、この出願か ら該リパーゼはカンジダアンタルクチ力（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｎｔａｒｃｔｉｃ ａ）　Ｄ　Ｍ　Ｓ　３８５５によって産生されることが明らかである。

発酵後、培養ブロスを、培養ブロス１！当り水０．２５１を添加して予備処理す る。ｐＨを水酸化ナトリウムの水溶液を用いて８．０に調節する。懸濁液をドラ ムフィルターで濾過し、これはダイカライ）　（Ｄｉｃａｌｉｔｅ）　４２０８ 多孔質珪藻土を用いて予備コートされる。引続き濾液を適当な濾過プレートで濾 過し完全に澄明な液体を得る。最後にコンセントレート中のＲ１，（屈折計指標 ）乾燥物質の値が約１２％及び透過物中のＲ１乾燥物質の値が２％未満になるま で限外濾過及び透析濾過を行う。最後に滅菌濾過を行う。約２５ＫＬＵ／ｇのリ パーゼ活性及び７．０のｐｌ（を示す濾液は、結晶化に対する出発物質である。

出発物質に４−６％の塩を加え、この塩はＣＨｚ　ＣＯＯＫ　（Ｋ　Ａ　ｃ　） 又はＨＣＯＯＮａである。２．３分後、結晶性カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）リパ ーゼＢの強力な沈澱物が形成し更に２−５時間後に、結晶が沈澱し、全量の約２ ０％に達する。結晶は６５−７０　ＫＬ［Ｊ／ｇ活性を示し、収率は８０％を超 える。結晶は小さく且つ針状形である。

要　約　書 産業的要求に合致する。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年６月ｌ？日

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．酵素の結晶化方法であって、比較的に高い酵素の純度を有し更に酵素含有液 体１ｌ当り少なくとも５ｇ／ｌの純粋な酵素蛋白質濃度を有する水性酵素含有液 体を、出発物質として用い更に結晶化剤（これは非ハロゲン化物タイプの易溶解 性塩である）を、最終濃度（これは無定形で酵素を沈澱させる為に必要とされる 濃度よりもより小さい）まで、出発物質に添加することを特徴とする、前記方法 。
2. ２．酵素の純度が２０％超（即ち純粋な酵素の量が酵素含有液体中全乾燥物質の ２０％を超える量に達する）であり、更に結晶化剤を、０．０２−１．７Ｍの結 晶化剤、好ましくは０．０５−１．６Ｍ、更に好ましくは０．１０−１．５Ｍの 結晶化剤の添加される量に相当する最終濃度まで出発物質に添加する、請求の範 囲第１項記載の方法。
3. ３．酵素の結晶化方法であって、比較的高い酵素の純度を有し更に酵素含有液体 １ｌ当り少なくとも５ｇ／ｌの純粋な酵素蛋白質濃度を有し更に１５−４５℃、 好ましくは２０−４５℃の温度を有する水性酵素含有液体を、出発物質として用 い更に結晶化剤（これは易溶解性塩である）を、最終濃度（これは無定形で酵素 を沈澱させる為に必要とされる濃度よりもより小さい）まで、出発物質に添加す ることを特徴とする、前記方法。
4. ４．酵素の純度が２０％超（即ち純粋な酵素の量が酵素含有液体中全乾燥物質の ２０％を超える量に達している）であり、更に結晶化剤を０．０２−１．７Ｍの 結晶化剤、好ましくは０．０５−１．６Ｍ、更に好ましくは０．１０−１．５Ｍ の結晶化剤の添加される量に相当する最終濃度まで出発物質に添加する、請求の 範囲第３項記載の方法。
5. ５．酵素がプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ 、ペクチナーゼ、アミダーゼ又はオキシダーゼである、請求の範囲第１項〜第４ 項のいずれかに記載の方法。
6. ６．酵素がプロテアーゼであり更にプロテアーゼがズブチリシンタイプのプロテ アーゼであり、好ましくはサビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）（登録商標）又はサ ビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）（登録商標）の蛋白質処理変異体又はアルカラー ゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）（登録商標）である、請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．結晶化剤がギ酸、酢酸もしくは硝酸のそれぞれナトリウム、カリウム、カル シウムもしくはマグネシウム塩である、請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに 記載の方法。