JP2886921B2 - スブチリシンの結晶化法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は酵素の回収及び精製、更に詳しくは結晶化に
よるスブチリシンの精製法に関する。

発明の背景 スブチリシンは洗濯用洗剤、銀の回収、魚の餌の製造
並びに他の製品及び方法における使用を含めて広範囲の
用途を有するプロテアーゼである。スブチリシンは結晶
形態のものが色々な理由から好ましい。結晶性スブチリ
シンは非晶質のスブチリシンの沈殿のような他のルート
で製造されたスブチリシンの他の形態のものより純度が
高い。スブチリシンの結晶は目的とされる各種の最終用
途のための媒体及び処方物の選択に融通性を与えること
ができるのみならず、高度の安定性も与えることができ
る。スブチリシンはそれが結晶形態であろうと、沈殿し
た非晶質形態であろうと、乾燥することができ、かつ様
々の粒体製品又は粉体製品として用いることができる。
しかし、スブチリシンは更にしばしば液状製品において
使用するための、あるいは液状又は固状製品の製造にお
いて使用するための各種液状製品の形で、例えば水性、
グリセリン、ソルビトール、プロピレングリコール等の
溶液として溶解、処方される。結晶性スブチリシン及び
この結晶形スブチリシンから製造した液状製品には、そ
の高純度の故に、医用用途や食品製品における用途等の
多数の高品質用途がある。

スブチリシンの結晶それ自体は寸法が通常約５ミクロ
ン乃至約50ミクロンの範囲である長斜方形板状結晶であ
る。結晶の溶解度は水中で約４グラム／リッター（g/
l）、ブライン中で約8g/l、プロピレングリコール中で
約500g/l以上である。

スブチリシン結晶は他の酵素の結晶を所定の醗酵によ
り得る方法とほとんど同じ方法でバチラススブチリス(B
acillus subtilis)の醗酵により得られていた。醗酵混
合物はまず分離工程に付される。この工程はバクテリア
の細胞と懸濁した固体を除去して固体を含まない溶液即
ちブイヨンを形成する工程である。得られた溶液は目的
酵素についてある特定の最低濃度水準を得るためにしば
しば濃縮される。次いで、通常は種結晶の助けをかりて
結晶化が行われ、そして高純度の結晶性製品が溶液から
分離される。

ニュー・ヨーク州（New York）ニュー・ヨーク市（Ne
w York）のコロンビア・バイン・プレス社（Columbia V
ine Press）刊のノースラツプ（Northrup）等著結晶性
酵素(Crystalline Enzymes)（1948年）、第253〜254頁
の“酵素の製造と結晶化（Preparation And Crystalliz
ation of the Enzymes）”において論じられているよう
に、蛋白質の結晶生成に対しては濃厚蛋白質溶液、即ち
１〜10パーセントの濃度が必須である、と言うのは、稀
薄蛋白質溶液としての蛋白質は仮りに分離できるとして
も困難を伴つて可能なだけなのに対して、同じ蛋白質で
も濃厚溶液となると一般に分離がはるかに容易になるか
らである。また、蛋白質を結晶化するには、純度がより
低い非晶質形をもたらしてしまう沈殿を形成させずに行
う必要がある。この結晶化は溶液中の蛋白質、塩、溶媒
及び／又は有機溶媒類の相対濃度を調整することによつ
て誘発される。その溶液は、過飽和が蛋白質のあまり望
ましくない非晶質形の沈殿の形成を促進するので、塩又
は溶媒中で飽和状態となつていないか又は過度に著しく
過飽和状態となつていないことが重要である。従つて、
結晶性酵素製品を得る最適濃度は極くわずかな準飽和
（subsaturation）の水準の濃厚塩／蛋白質溶液である
とされた。

わずかな準飽和のこのような最適条件は往々にして達
成困難であり、そして常用の結晶化技術を使用しての処
理に際しては特に維持困難である。更に具体的に説明す
ると、酵素の通常の結晶化法は沈殿が正に現われてくる
まで硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムのような沈殿
剤の添加が必要である。しかし、沈殿は往々にして溶液
が飽和されるか、又は高度に過飽和状態になるまで現わ
れず、従つてこの処理は常に酵素の非晶質形が沈殿で生
成するだろうという危険を伴う。

最適のわずかな準飽和が達成される場合でもこのよう
な理想的状態は急速に理想的でなくなつてしまう。更に
具体的に言うと、溶液から蛋白質を結晶形として取り除
くことによつて残つている溶液はその近飽和濃度を失つ
てしまい、結晶が更に形成するのがだんだん困難にな
る。これは、蛋白質の大部分が上層液に残つている状態
であるので、蛋白質製品の相当の損失をもたらす。この
問題を克服するには、溶液をほとんど全ての蛋白質が溶
液から結晶化するまでわずかに準飽和の状態に保つこと
ができるように追加量の塩を添加することによつて溶液
の状態を連続調整することが必要である。

上記の議論から明らかなように、現在知られている結
晶性スブチリシンの製造技術はしばしば信頼性に欠け、
かつ制御困難なものである。これを実施する人はスブチ
リシン溶液がわずかに準飽和となる点を測定することが
できなければならないばかりでなく、結晶化が一旦開始
したらその溶液系を目的濃度が維持されるように連続調
整して高価なスブチリシン製品が失われるのを回避し、
かついかなる高度に過飽和の状態も、またその結果とし
てのスブチリシンの非晶質形の形成も回避するようにし
なければならない。

公知の酵素結晶化技術の以上の制限及び欠点から、ま
た上記では言及しなかつたその他の不利点から見て、結
晶化を起こすための酵素溶液をわずかに準飽和の濃度に
保つことには左右されず、しかも結晶性スブチリシンの
効率的で信頼性のある製造を可能にする、結晶化による
スブチリシンの精製法の必要が存在することは明らかで
ある。本発明の１つの目的は、酵素溶液が準飽和状態で
あるときスブチリシン酵素の結晶化を誘発してそのスブ
チリシン酵素溶液が過飽和であるときに形成する可能性
のある非晶質の沈殿の形成を回避する塩を使用する結晶
化によるスブチリシン酵素の精製法を提供することによ
つて上記の必要を実現することである。

本発明の更にもう１つの目的は、沈殿剤として硫酸ア
ンモニウムを必要とせず、しかしてこのことによつて硫
酸アルミニウムの使用に付随する環境問題や廃棄物処理
の問題を回避する、結晶化によるスブチリシン酵素の精
製法を提供することである。

本発明の他の目的は、原料コスト及び運転コストが低
い、結晶化によるスブチリシンの精製法を提供すること
である。

本発明の更に他の目的は、高収率及び高処理量の能力
がある、結晶化によるスブチリシンの精製法を提供する
ことである。

本発明の更に他の目的は、高純度かつ実質的に微生物
を含まないスブチリシン製品を生成させる、結晶化によ
るスブチリシンの精製法を提供することである。

本発明の以上の、及び以下において明らかになる他の
目的、利点及び特徴に関し、本発明の本質は次の本発明
の記載、添付請求の範囲及び図面を参照することによつ
て更に明白に理解できるだろう。

発明の概要 本発明は、１つの面として、次の （ｉ）スブチリシン生成バクテリアの醗酵によつて製造
される醗酵混合物から細胞及び懸濁固体を除去すること
によつてスブチリシン溶液を調製し； （ii）スブチリシン溶液をスブチリシンが少なくとも約
40g/lの濃度で存在するように濃縮することによつて濃
厚溶液を形成し； （iii）ハロゲン化物塩をスブチリシンの結晶を形成さ
せるのに有効な量で添加し；そして （iv）スブチリシンの結晶を形成させる 工程を含むスブチリシン結晶の製造法を提供するもので
ある。

本発明の方法は従来法に比較してある予想外の利点を
含めて従来技術を越える様々な利点を与える。前記の目
的を満足する本発明によつて与えられる利点に加えて、
本発明の方法において与えられるハロゲン化物塩の使用
により得られるもう１つの利点はその塩／スブチリシン
溶液が飽和水準に近くないときにスブチリシン結晶が最
良の速度で形成するということである。従つて、その濃
度をわずかに準飽和の水準に維持することは必要ない
（又は望ましくさえない）。本発明の方法は、全溶液を
飽和に又は飽和近くに保つ必要なしに操作中に塩水準を
より広い、臨界性の少ない範囲にわたつて維持し、調整
できるので、操作及び制御が容易である。

本発明により提供される驚くべきそして予想外の利点
は、従来法とは違つて、例えば溶液に過剰量の塩を添加
し、あるいは溶液の温度を下げることによつてハロゲン
化物塩／スブチリシン溶液が過飽和となつてもスブチリ
シンの非晶質形は現われないことである。驚くべきこと
に、2Mもの高塩濃度下でも、あるいは4Mもの高濃度下で
あつてさえも、スブチリシンの結晶形しか生成せず、広
範な操作条件範囲にわたつて一貫して高純度の結晶生ス
ブチリシンが得られる。

本発明の方法により提供されるもう１つの利点はスブ
チリシンの最適結晶化速度は飽和よりはるかに低い塩濃
度、例えば0.05M〜0.6Mで達成されることである。

本発明の方法の融通性によつて、ハロゲン化物塩は濃
縮されたスブチリシン溶液に加えてもよいし、あるいは
この方法のより早い時期においてスブチリシン溶液にそ
れが濃縮される前に加えてもよい、と言う他の利点が得
られる。更にハロゲン化物塩はこの方法の更に早い時期
に、即ち醗酵混合物に添加してもよい。この方法によれ
ば従つてこのことに関して濃厚溶液から結晶性スブチリ
シンを製造する本発明の方法を商業的に使用するのに望
まれるプロセス設計に依存して様々の選択肢が与えられ
る。ハロゲン化物塩の濃厚溶液に対する添加は結晶形成
を更に精密に制御する場合に好ましいだろう。他の場合
には、特にハロゲン化物塩が処理されるスブチリシンに
対してこの方法の総収率を増加させることができる安定
化効果がある場合に、ハロゲン化物塩をこの方法の早い
時期に加えるのが好ましいだろう。

本発明は、もう１つの面として、スブチリシンを溶液
から結晶化させるのに有効な量でハロゲン化物塩を含有
するスブチリシン溶液を含む組成物を提供する。

図面の簡単な説明 第１図は本発明方法の好ましい態様の概略流れ図であ
る。

第２図は塩化ナトリウム及び塩化カルシウムの色々な
濃度に対するパーセント結晶回収率を描いているグラフ
である。

第３図は塩化ナトリウム中でのスブチリシンの結晶成
長の時間の関数としての依存性を描いているグラフであ
る。

発明及びその態様の詳しい説明 本発明の１態様による結晶性スブチリシンの製造は、
B.スブチリスの醗酵混合物を調製し、醗酵混合物から細
胞及び懸濁固体を除去してスブチリシン溶液を形成し、
その溶液をスブチリシン酵素が少なくとも40グラム／リ
ッター（g/l）の濃度で存在するように濃縮し、濃縮さ
れた溶液にハロゲン化物塩をスブチリシン結晶を形成す
るのに有効な量で添加し、そしてスブチリシンの結晶を
形成させることによつて行われる。本発明方法のこの態
様は第１図に概略図示される総合プロセスで例示、説明
されている。第１図はスブチリシン生成バクテリアの醗
酵、細胞及び懸濁固体の醗酵混合物からの分離、及び得
られたスブチリシン溶液の目的水準への濃縮の各基本工
程を示す。これらの醗酵、分離及び濃縮工程はこの技術
分野では周知であり、その実施に際しては常用の方法が
本発明のこの態様の実施に関連して用いることができ
る。次に、この態様においては結晶のスラリーを形成す
る結晶化工程を行うためにハロゲン化物塩と種結晶が加
えられる。結晶は次いで常用のフイルタープレス法で回
収することができ、洗浄された目的の製品を与える。こ
の製品は乾燥粉末形又は同粒体形を取ることもできる
し、あるいはより一般的な液状溶液形を取ることもでき
る。

細胞、種々の懸濁固体、及びスブチリシン製品の目的
溶液を含有する醗酵済み混合物はまずそのような細胞及
び懸濁固体をスブチリシン溶液から分離するために処理
される。これに関しては、濾過、遠心分離、ミクロ濾
過、回転真空濾過及び同様の方法等の常用の固−液分離
技術を用いることができる。通常約３〜20g/lの濃度で
存在する溶解スブチリシンを含有する溶液即ちブイヨン
から細胞及び固体が一旦除去されると、次に溶液中のス
ブチリシンを少なくとも約40g/l、好ましくは少なくと
も約60g/l、更に好ましくは少なくとも約80g/lの濃度ま
で濃縮することが必要である。約40g/l以下の濃度は通
常貧弱な又は不満足な結晶化収率をもたらしてしまうの
であまり望ましくない。この方法は一般的にはそれより
高濃度で最良かつ最も効率的に作用するのである。結晶
化工程で使用される濃縮溶液に達成可能なスブチリシン
の最高濃度を採用するのが好ましい。しかし、約100g/l
より高い濃度は多くのスブチリシン溶液には達成困難で
ある。ほとんどのスブチリシン溶液に対して実施時の最
適操作範囲は通常約90〜約100g/l、又はそれ以上であ
る。溶液の濃縮は限外濾過、蒸発、抽出、クロマトグラ
フィー、又は沈殿とそれに続く再溶解を含めて種々の常
用技術によつて達成することができる。使用すべき濃縮
技術又は同方法の選択は一部は本発明によりハロゲン化
物塩が醗酵混合物に又は濃縮されるべき溶液に加えられ
ているかどうかによつて影響されるだろう。

所定の条件の組について結晶化工程の完結後の棄却さ
れる母液中に残つているスブチリシンの量は結晶化工程
に供給される濃厚溶液においてより高出発濃度のスブチ
リシンが用いられるときに減少されることが観察され
た。即ち、結晶化の初めにおいて濃厚溶液中のスブチリ
シンの出発濃度が高いほど結晶化によつて回収される全
スブチリシンの割合は大きくなり、それによつて結晶制
スブチリシンの総収率が最高となり、かつ母液中に残つ
ている未結晶化スブチリシンの損失が最低となる。１例
を示すと、100g/lのスブチリシン濃度を有する結晶化装
置の供給原料溶液は、結晶化後、約15g/lの残留スブチ
リシン濃度を有する平衡している母液中に懸濁したスラ
リーとして約22％v/vの結晶固体を生成させる。これは
約100−（100−22）（15/100）の最大回収率、即ち総収
率88.3％を与える。比較すると、80g/lのスブチリシン
濃度を有する供給原料溶液は結晶化工程で約18g/lの残
留スブチリシン濃度を有する平衡母液中に約20％v/vの
結晶固体を生成させる。これは約100−（100−20）（18
/80）の最大回収率、即ち82％の総収率を与えるもので
ある。

濃厚溶液からのスブチリシンの結晶化はスブチリシン
結晶を形成させるのに有効な量のハロゲン化物塩を添加
することによつて達成される。本発明において有用なハ
ロゲン化物塩に塩化ナトリウム、塩化カルシウム、臭化
ナトリウム、沃化ナトリウム、塩化カリウム、沃化カリ
ウム、弗化ナトリウム、並びに結晶化されているスブチ
リシンと相溶性があるその他のハロゲン化物塩及びそれ
らの混合物がある。現在商業的使用に好ましいハロゲン
化物塩は塩化ナトリウムと塩化カルシウムである。スブ
チリシン結晶を形成させるのに有効なハロゲン化物塩量
は使用されている特定のハロゲン化物塩又は塩類に加え
て、溶解している特定のスブチリシン、その溶液中に存
在する他の物質、及びその溶液中のスブチリシンの濃度
に依存して変わ得る。本発明の方法について少なくとも
有効量の、かつ最適量のハロゲン化物をどう選択するか
は本発明の教示に従い、これらの因子を考慮すれば当業
者には明らかになるはずである。一般に、塩濃度は少な
くとも約0.01M（10mM）であるべきであり、好ましくは
約0.01〜約2M、更に好ましくは約0.02〜約1.5M、最も好
ましくは約0.03〜約1Mである。若干の溶液／塩の組み合
せの最適範囲は約0.02〜約0.18Mの範囲にあるが、一方
他の組み合せの場合は約0.1〜約0.7Mの範囲にある。塩
のこれらの量又は濃度はスブチリシンを溶液から結晶化
させるのに有効であるので、等しく本発明の組成物に適
用可能である。

理論で限定される訳ではないが、本発明により使用さ
れるハロゲン化物塩は硫酸アンモニウムのようなスブチ
リシンの従来からの沈殿剤とは違つた様式でスブチリシ
ンの結晶化を誘発すると考えられる。更に具体的に説明
すると、硫酸アンモニウムのような沈殿剤は溶液の濃度
が飽和水準に近いときにスブチリシン結晶の結晶化を誘
発する。それより高い水準ではそれら沈殿剤は非晶質の
スブチリシンを沈殿させる可能性がある。従来からの沈
殿剤とは対照的に、本発明により使用されるハロゲン化
物塩は比較的低い塩濃度でスブチリシンの結晶化を誘発
する。更に、前記のように、本発明によるハロゲン化物
塩の使用は2Mもの高塩水準でも、あるいは4Mであつても
スブチリシンの非晶質形の沈殿を誘発しない。非常に高
い塩濃度では、スブチリシンの結晶化は弱まるが、それ
ぞれ結晶性スブチリシンしか生成せず、非晶質のスブチ
リシンは沈殿しない。本発明はスブチリシンの非晶質形
を沈殿させる危険を取り除くものである。以上の説明か
ら分かるように、本発明の方法において最適結晶化はよ
り低い塩濃度で起り、これに対して総収率は非常に高い
塩濃度でより低くなる。

従来の沈殿剤の場合その水準を上げると、最後には非
晶質スブチリシン沈殿物の沈殿を引き起す可能性がある
のに対して、本発明のハロゲン化物塩ではその水準を上
げると結晶の形成を最適点まで高め、その点を越えると
結晶形成を徐々に減少させる。しかして、第２図を参照
すれば分かるように、塩化ナトリウムの場合約200〜600
mMで、また塩化カルシウムの場合は約50〜200mMで結晶
回収率が最大となつた。これらの塩濃度はこれら特定の
塩の、結晶化スブチリシンの収率を最良となす最適塩濃
度範囲である。第２図のデーターは限外濾過による濃縮
物（スブチリシン80g/lまで濃縮）からの供給原料に基
づく。この濃縮物はハロゲン化物塩と種結晶の添加前に
４倍容量の脱イオン水でデイア濾過（diafiltev）して
塩を除去したものであつた。第２図に見ることができる
ように、塩化ナトリウムはより広い操作範囲にわたつて
より高い可能収率を達成し、従つて本発明の方法の好ま
しい塩である。これら特定の塩のこれら最適範囲を越え
ると、結晶化スブチリシンの回収率は減少する。しか
し、これら塩のいかなる濃度においても非晶質スブチリ
シン沈殿物の形成は認められなかつた。塩化ナトリウム
の最適濃度は約200〜約600mMの範囲であることができ、
好ましくは約400〜約500mMである。これらの濃度は、言
い換えると、それぞれ約1.2〜3.5％、好ましくは約2.3
〜約2.9％である。塩化カルシウムの濃度は約50〜約200
mM、好ましくは約100〜約150mM、言い換えると、それぞ
れ約0.7〜約2.9％、好ましくは約1.5〜約2.2％であるこ
とができる。

必ず必要とされる訳けではないけれども、この結晶化
プロセスを促進するためにスブチリシンの種結晶を溶液
の重量に基づいて約10重量％以下の量で添加するのが好
ましい。種結晶の使用は結晶化の動力学的挙動をより有
利なものとなし、これは結晶性スブチリシンの総合収率
を増加させると思われる。結晶化を促す表面特性を有す
る結晶化用容器を用意することによつても核形成を促進
することができる。この性質は当業者には周知のもので
ある。所与のスブチリシン溶液、運転規模、工程条件等
について種結晶の最低有効量の使用は、従来の結晶化方
法における通り、当業者には明白であろう。また、本発
明の方法を連続法として実施する場合、結晶化装置中に
存在する結晶はその装置に入つて来る新しい濃厚溶液の
供給原料に対して種結晶として作用する。結晶の成長は
通常結晶化容器をおだやかに攪拌することによつて更に
促進される。当業者であればまた、目的の結晶化度が達
成されてしまうまでは、本発明の方法における溶液に結
晶化を抑制するかもしれないいかなる物質も、例えばプ
ロピレングリコール、蟻酸ナトリウム、硫酸ナトリウム
等を添加すべきでないことは分かるだろう。

結晶化中の温度は一般に約１〜約10℃、好ましくは約
３〜約５℃である。結晶化が行われるpHは酵素の種に依
存するが、酵素が安定である範囲でなければならない。
例えば、塩化ナトリウムとB.アミロリクエフアシエンス
スブチリシンについては、pHは一般に約5.2〜5.8、好ま
しくは5.3〜5.6である。約5.2より低い、又は約5.8より
高いpH水準では、そのスブチリシンは不安定となるだろ
う。この結晶化プロセスが実質的な完結まで、あるいは
目的の平衡状態まで進むための所要時間は勿論種々の工
程条件だけでなく、種結晶が使用されているかそれとも
使用されていないかにも左右される。種結晶を使用しな
い場合、平衡に達するのに約48時間の時間が典形的には
必要とされる。ここで、この平衡は溶液中の残留スブチ
リシンの濃度約20g/l未満に相当する。種結晶を使用す
る場合、時間は同じ平衡に達するのに約18時未満まで減
少する。

第３図は約80g/lのスブチリシンを含有する濃厚溶液
から結晶化させたスブチリシンの典形的な結晶化対時間
曲線を例証するものである。この場合、塩化ナトリウム
を沈殿用塩として濃厚溶液に加え、また種結晶を使用し
た。約16時間後追加の結晶成長量は実質的になかつた。

結晶化が本質的に完結すれば、通常の結晶回収技術が
用いることができる。しかして、製品は結晶含有スラリ
ーから遠心分離、沈降又は濾過で回収することができ
る。別法として、スラリーは固体製品を製造する方法へ
の供給原料として使用してもよい。

固体−ボール遠心分離及び板−フレームフイルタープ
レスでの濾過が製品の大規模回収に適した２つの周知の
技術である。両技術において、結晶スラリーは、粘度を
下げ、母液からの分離を良くするために、水でまず稀釈
される。遠心分離法においては、結晶はボール内の緻密
なケーキとして採収され、そのケーキは次にこれを水中
に再懸濁し、再遠心分離することによって洗浄される。
得られたケーキは、典形的には、望ましい液状製品形態
のスブチリシンを与えるために、プロピレングリコー
ル、蟻酸ナトリウム及び水を含む処方物に再溶解され
る。

フイルタープレス回収法においては、まず濾過助剤を
稀釈された結晶スラリーに加え、この混合物を予備被覆
済みの板−フレームフイルタープレスに送る。濾液とし
ての、結晶を含まない母液は捨てられる。次いでフイル
タープレースを通して数倍容量の水又は緩衝液を送るこ
とができ、それによつて結晶はほぼプラグ−フローの条
件下で効率的に洗浄される。十分に高い洗浄用緩衝液流
量においては、そのプロテアーゼ結晶の水中溶解度が低
い（３〜8g/l）ことから酵素活性の損失量は些少であ
る。結晶性酵素はプロピレングリコール、蟻酸ナトリウ
ム及び水を含有する緩衝液を用いて回収される。これら
の化学薬品は、結晶ケーキの効率的洗浄と併せて、製品
中の微生物量を非常に低くすることが見い出された。

次の実施例は例示説明のために与えられるもので、い
かなる意味でも開示されかつ特許請求される主題を限定
すると解してはならない。

実施例１ B.スブチリスの醗酵により製造されたB.アミロリクイ
フアシエンススブチリシンの混合物を濾過して細胞と懸
濁した固体を除去、部分的に濃縮されたスブチリシンの
ブイヨン又は溶液を生成させた。このスブチリシンブイ
ヨンを900mlのフアーマシア“セフアデツクス”（Pharm
acia“Sephadex"）Ｇ−25カラムで脱塩し、そして14mM
（0.206％）の塩化カルシウム二水和物と平衡させた。
元のブイヨンの導電率は44ms/cmであつたが、脱塩後は
3.9mS/cmに落ちた。この溶液を水でスブチリシン15.8g/
lから12.3g/lまで稀釈し、次いでアミコン（Amicon）攪
拌済みUFセル中で濃縮した約65g/lのスブチリシン酵素
を含有する濃厚物を製造した。この濃厚物の試料1mlを
氷浴中に入れたミクロフュージ（microfuge）管に入つ
ている色々な量の塩化ナトリウム及び塩化カルシウムと
マトリックス様に組み合せ、攪拌せずに静置した。

結晶化したスブチリシンを含むミクロフュージ管を医
用遠心分離機中で約5000rpmで４〜５分間回転させ、そ
の上層液をパスツールピペツト（pasteur pipette）を
用いてデカンテーシヨンにより除去した。そのペレツト
をまず100％プロピレングリコールに吸収させ、次いで
十分量の14mMの水性CaCl₂を全体で20％のプロピレング
リコールを与えるように加えた。上層液及びペレツトの
容量は重量で測定した。

結果を次表に示す。

上記の表において、ダツシユ記号（−）は結晶化製品
の有意量の回収はなかつたことを示す。

上記の実施例は、この場合の塩化ナトリウム及び塩化
カルシウムの最適濃度はそれぞれ約500mM及び約250mMで
あることを証明している。

実施例２ プロテアーゼ・B.アミロリクイロフアシエンスの変種
酵素（スブチリシン分子中の位置217においてアミノ酸
のロイシンを置換することによつて製造）を実施例１の
方法と同じ方法で醗酵させ、濾過し、濃縮し、結晶化さ
せた。

この場合は、プロテアーゼの細胞不含溶液を限外濾過
でスブチリシン69g/lまで濃縮した。濃厚物に色々な水
準の塩化ナトリウム及び天然酵素の種結晶を加えた。こ
の結果、次の処理済み酵素結晶の収率が達成された。

実施例３ 限外濾過により得られたスブチリシン溶液を99g/lま
で濃縮した。この常用溶液に種々のハロゲン化物塩を40
0mMで加え、かつ１％v/vの酵素種結晶を添加した。４℃
で６日間インキユベーシヨンした後に得られた結晶回収
率は次の通りであつた。

本明細書には好ましい態様だけを具体的に例証したけ
れども、本発明には、その精神と意図された範囲から逸
脱しない限り、上記の教示に照して添付請求の範囲内で
多くの改変及び変更が可能であることが分かるだろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−39782（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (20)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ｉ）スブチリシン生成性バクテリアの醗
   酵により製造された醗酵混合物から細胞及び懸濁固体を
   除去することによってスブチリシン溶液を調製する工
   程； （ii）スブチリシン溶液をそのスブチリシンが少なくと
   も約40g/lの濃度で存在するように濃縮することによっ
   て濃厚溶液を形成する工程；及び （iii）ハロゲン化物塩をスブチリシン結晶の形成を引
   き起こすのに有効な量で添加する工程 を含むスブチリシン結晶の製造法。
2. 【請求項２】醗酵混合物にハロゲン化物塩を添加する、
   請求の範囲第１項に記載の方法。
3. 【請求項３】スブチリシン溶液にハロゲン化物塩を添加
   する、請求の範囲第１項に記載の方法。
4. 【請求項４】濃厚溶液にハロゲン化物塩を添加する、請
   求の範囲第１項に記載の方法。
5. 【請求項５】濃縮工程（ii）をスブチリシンの濃度が少
   なくとも約80g/lとなるように実施する、請求の範囲第
   １項に記載の方法。
6. 【請求項６】塩が塩化ナトリウム又は塩化カルシウムで
   ある、請求の範囲第１項に記載の方法。
7. 【請求項７】塩が塩化ナトリウムであり、該塩を約400
   〜約500mMの塩化ナトリウムを含有する溶液を形成する
   ように添加する、請求の範囲第４項に記載の方法。
8. 【請求項８】塩が塩化カルシウムであり、該塩を約50〜
   約200mMの塩化カルシウムを含有する溶液を形成するよ
   うに添加する、請求の範囲第４項に記載の方法。
9. 【請求項９】濃厚溶液にスブチリシンの種結晶を添加す
   る工程を更に含む、請求の範囲第１項に記載の方法。
10. 【請求項１０】スブチリシン結晶を形成する工程（ii
    i）を約5.2〜約5.8のpHで実施する、請求の範囲第１項
    に記載の方法。
11. 【請求項１１】バクテリアがバチラスである、請求の範
    囲第１項に記載の方法。
12. 【請求項１２】バチラスからB.スブチリスである、請求
    の範囲第10項に記載の方法。
13. 【請求項１３】スブチリシンの濃度が約80〜約100g/lで
    ある、請求の範囲第５項に記載の方法。
14. 【請求項１４】塩が沃化ナトリウムである、請求の範囲
    第１項に記載の方法。
15. 【請求項１５】塩が塩化カリウムである、請求の範囲第
    １項に記載の方法。
16. 【請求項１６】塩が沃化カリウムである、請求の範囲第
    １項に記載の方法。
17. 【請求項１７】スブチリシン濃度が少なくとも約40g/l
    である濃厚スブチリシン溶液を形成する工程及びスブチ
    リシン溶液にハロゲン化物塩を添加する工程であって、
    その際ハロゲン化物塩の量は該溶液からスブチリシンを
    結晶化させるのに有効な量である工程を含む、スブチリ
    シンの精製法。
18. 【請求項１８】溶液中のハロゲン化物塩の濃度が約0.01
    〜約2Mであり、溶液中のスブチリシン濃度が少なくとも
    約40g/lである、請求の範囲第17項に記載の方法。
19. 【請求項１９】溶液中のスブチリシン濃度が少なくとも
    約40g/lであるスブチリシン溶液を含み、該スブチリシ
    ン溶液はハロゲン化物塩を該溶液からスブチリシンを結
    晶化させるのに有効な量で含有しているスブチリシン精
    製用組成物。
20. 【請求項２０】溶液中の塩濃度が約0.01〜約2Mであり、
    溶液中のスブチリシン濃度が少なくとも約60g/lであ
    る、請求の範囲第19項に記載の組成物。