DE1642625A1 - Verfahren zur Herstellung von Isoamylase durch Fermentation - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Isoamylase durch Fermentation

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Description

' HiYASHIBARA Go. Ltd., Okayama-shi / Japan
Verfahren zur Herstellung von Isoamylase durch Fermentation
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Isoamylase durch fermentation, wobei dieses Verfahren die Isoamylase durch Kultivierung eines Stamme von Escherichia intermedia in einem Kulturmedium, welches geeignete Mengen Kohlehydrate, andere Kohlenstoffquellen, . Stickstoffquellen, anorganische Substanzen und andere Nähmittel, welche für Mikroorganismen notwendig sind, umfaßt.
Neue Unterlagen (au. 7 ι 1 Abs. 2 Nr. 1 satz 3 des Ärwerungee·* * 4, fcisejft Oase POS-10887 - 2 -
209808/1436
Die Isoamylase ist als Enzym bekannt, welches die CX-1-6-Bindungen der Stärke, ohne Zugabe von Phosphorsäure, zersetzt. Die Herstellung dieses Enzyms unter Verwendung von Hefe wurde im einzelnen durch Maruo und Mitarbeiter (Symposia on Enz.Chem., 1949) berichtet. Sarüberhinaue berichtet Bender,und Mitarbeiter, daß das durch Aerobactera aerogenes hergestellte Enzym das durch einen Pullularia-Stamm gebildete Pullulanpolysaccharid zersetzt, der Isoamylase ähnliche Eigenschaften aufweist (H.Bender und K.Wallenfels: Bioehem.Z., 334, 79 bis 95 (1961)).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß ein Stamm von Eseherichia intermedia, welcher von dem Soden isoliert wurde, Isoamylase in dem Kulturmedium sammelt, und es wurde ein Verfahren zur technischen Herstellung desselben gefunden.
Bas nach der Erfindung zur Verwendung vorgesehene Kulturmedium kann synthetisiert werden oder aus natürlichen Substanzen bestehen. Es sollte Kohlehydrate, andere Kohlenstoffquellen, anorganische Substanzen und andere Nährmittel in geeigneten Mengen enthalten. Jede Kohlenstoffquelle und jede Stickstoffquelle, welche durch die vorliegenden Organismen verwendet werden können, sind in dem vorliegenden Kulturmedium brauchbar. Als Kohlenstoffquellen können Substanzen wie Maltose, Dextrin, Glucose, ν
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_ 3 —
Lactose, Pullulan, Stärkehydrolysate, Melaseearten und ähnliches verwendet werden. Die Konzentration der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium beträgt 0,5 bis 20#. Darüberhinaus können, sofern notwendig, organische Säuren und Aminosäure hierzu zugegeben werden und, sofern sie verwendet werden, betragen ihre Konzentrationen von 0,1 bis 0,5$ des Kulturmediums. Als Stickstoffquellen sind brauchbar Nitrate oder anorganische und organische Ammoniumsalze , wie Ammoniak, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumacetat usw., stickstoffhaltige, organische Substanzen, wie Harnstoff, Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, flüssige Maisauszüge, Caseinhydrolysat, Fischmehl und ihre Verdauungssubstanzen, Weizenkleie, Reiskleie, entfettete Sojabohnenabfälle oder ihre Verdauungssubstanzen, Chrysalishydrolyeat und ähnliche, Aminosäuren wie Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin, und ähnliche. Als
f.
anorganische Substanzen sind Kaliumhydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat und ähnliche verwendbar.
Die Konzentrationen dieser Stickstoffquellen und der anorganischen Substanzen im Kulturmedium sind beispielsweise wie nachfolgend:
- 4 -209808/U36
Pepton 1* Milch-Kaseinextrakt 0,1
Hefeextrakt 0,5 K2HPO4 0,05
K2HPO4 0,1 KCl 0,05
KCl 0,05 MgSO4-7H2O 0,001
MgSO4·7H2O 0,05 PeSO4'7H2O
PeSO4*7H2O 0,001 0,8#
Harnstoff 0,4# (NH4)2SO4 0,5
K2HPO4 0,1 CaCO5 0,1
KCl 0,05 K2HPO4 0,05
MgSO4'7H2O 0,05 KCl 0,05
PeSO4*7H2O 0,001 MgSO4*7H2O 0,001
PeSO4'7H2O
Die Fermentation wird unter aerobischen Bedingungen, wie Sehüttelkultur oder luftgemischte Submersionskultur, durchgeführt. Die Sehüttelkultur wird zuerst durchgeführt und kann nachfolgend zu einer stationären Kultur abgeändert werden, der pH des Kulturmediums ist 6-9 und die Temperatur der Kultur liegt zwischen 20 und 4-0 C· Die Kulturzeitdauer liegt gewöhnlich bei 24· bis 72 Stunden, und es wird eine bedeutende Menge Isoamylaee in dem Kulturmedium gesammelt. Nach Ablauf der Kultivierung kann der ganze kultivierte Liquor als Enzymlösung verwendet werden und das Enzym in und außerhalb der Zellen kann auf diese Weise vollständig verwendet werden oder die Flüesig-
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keit kann verwendet werden, nachdem die Zellen abfiltriert wurden, wie dies in den Beispielen aufgezeigt wird, wobei die Ammoniumsulfataussalzung des KuIturfiltrats die Absorption auf Oalciumphosphatgel und weiter die Reinigung durch Chromatographieren mit einer Diäthylaminoäthylcellulosekolonne durchgeführt werden kann.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne den Erfindungsbereich einzuschränken. Verschiedene Modifikationen dieser Erfindung können ohne Abweichen von dem Erfindungsbereich vorgenommen werden.
Beispiel 1
Escherichia intermedia (AIGC No. 21073) wurde als Impf-MikrοOrganismus verwendet. Der vorausgehend bezeichnete Mikroorganismus, der durch Impfen in dem Kulturmedium, das 0,5 Gew.* Maltose, 1 Gew.56 Pepton, 1 Gew.* Fleischextrakt und 0,5 Gew.56 NaNO, enthielt, kultiviert wurde, wurde in das Fermentationsmedium mit einem Verhältnis von 5 Vol.* geimpft. Es wurde das Fermentationsmedium der nachfolgenden Zusammensetzung verwendet und die Schüttelkultur wurde bei 3O0C durchgeführt.
Zusammensetzung des Fermentationsmediums} 5 Gew.5t Dextrin, 1 Gew.* Pepton, 0,5 Gew.* K2HPO4, 0,05 Gew.* MgSO^'THgO, 0,05 Gew.* KCl, 0,001 Gew.* FeSO4^H2O und 0,5 Gew.*
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NaNO,. Der pH wurde vor dem Sterilisieren auf 7t5 eingestellt. Das 48 Stunden kultivierte Fermentationsmediuni zeigte 11,1 Einheiten Isoamylaseaktivität. Die enzymatische Aktivität wurde wie folgt gemessen; 1 ml 0,5N Acetatpufferlösung bei pH 6,0 wurde zu 5ml einer 1#igen wäßrigen Lösung von löslicher glutinhaltiger Reisstärke, die nach dem Lindner-Verfahren hergestellt wurde, zugegeben und hierzu 1 ml Enzymlösung zugegeben. Man ließ die Lösung bei 400G 1 Stunde stehen. Zu 1 ml der Lösung werden 1 ml 0,01N Jodkaliumjodidlösung und Wasser zugegeben, um eine Gesamtmenge von 25 ml herzustellen. Extinktionskoeffizient bei 620 mu. wird gemessen. Zur Kontrolle wird der Extinktionskoeffizient der Lösung bei Beginn gemessen. Zunahme des Extinktionskoeffizienten war proportional zu der Enzymmenge, wenn sie im Bereich von ungefähr 0,1 lag. Unter diesen Bedingungen entsprach eine Zunahme des Extinktionskoeffizienten von 0,1 einer Enzymzunahme von 10 Einheiten.
Das durch Entfernen der Zellen aus dem Fermentationsmedium erhaltene Filtrat wurde mit einer wäßrigen Ammoniumsulfatlösung (0,15 bis 0,45 Sättigung) nach dem herkömmlichen Verfahren ausgesalzen. Das Wieder-Aussalzen wurde mit einer wäßrigen Ammoniumsulfatlösung (0,13 bis 0,40 Sättigung) durchgeführt. Nachfolgend wurde die Lösung auf Oalciumphosphat adsorbiert und weiterhin durch Chro-
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matographieren über eine DEAE-Cellulosekolonne gereinigt. Die spezifische Aktivität der Lösung zeigte eine ungefähr hundertfache Zunahme.
Die Aktivitäten und Gewinnverhältnisse in jeder Stufe wurden, wie nachfolgend aufgezeigt, bestimmt.
Bei der Bestimmung der Aktivität wird, wenn 1 ml Enzymlösung für die Reaktion verwendet wird, die Enzymmenge, die 0,1 Zunahme des Extinktionskoeffizienten zeigt, wie folgt dargestellt!
10 E /ml Enzymlösung
Die spezifische Wirksamkeit wird daher errechnet durch Dividieren des obigen Werts mit der Anzahl der Milligramm des in 1 ml der Enzymlösung vorhandenen Protein, weil ein reines Enzym Protein ist und die Reinheit des Enzyms in den Reinigungsstufen durch diese Aktivität aufgezeigt werden kann.
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Gesamt
volumen
(ml) 		Ge β sun t-
aktivi-
tät(Ein
heiten) 		spezifi
sche Ak
tivität 		Gewin-
nungs-
verh.
(*)
überstehende
Lösung von
Fleischbrühe 		3 000 33 000 0,88 100
Aussalzen I 230 26 730 14,2 81
Aussalzen II 50 23 100 18,1 70
Calciumphosphatgel 21 115 500 53,0 35
DEAE-Cellulose 10 6 600 99* 22
auf den ungefähr 112-fachen Wert angestiegen
Dieses gereinigte Enzym wies ungefähr 47 C als optimale Temperatur und ungefähr 6,0 als optimalen pH auf. Dar-Überhinaus setzte sich das vorliegend« Enzym mit ß-Grenzdextrin von Glykogen um. Es wurde als Isoamylase festgestellt.
Beispiel 2
Se wurde eine ähnliche Fermentation wie in Beispiel 1 durchgeführt, ausgenommen, daß die Schüttelkultur zunächst durchgeführt und nach 10 Stunden Kultur zur stationären Kultur umgewandelt oder gleichzeitig 0,1 Gew«% Toluol dem Kulturmedium zugegeben wurde. Das ^ermentationsnediuai wies 7,8 Einheiten Isoanylaseaktivität in Stunden nach dem Beginn der Kultivierung auf,
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Claims (3)

  1. Patentansprüche :
    1· Verfahren zur Herstellung von Isoamylase durch fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der Gruppe Escherichia intermedia zugehörigen Mikroorganismus in dem Kulturmedium so kultiviert, daß Isoamylase in dem Permentationsliquor hergestellt wird.
  2. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Kulturmediums und die Kultivierungstemperatur 6 bis 9, bzw. 20 bis 4O0C, sind.
  3. 3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mikroorganismus Escherichia intermedia ATOC Hr.21073 ist.
    Neue Unterlagen (Art 7 11 Aba. 2 Nr. I Set* 3 des Änderung««»··, v. 4. β. 19·ϊ|
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4734364A (en) * 1983-05-20 1988-03-29 Miller Brewing Company Production of dextrose and maltose syrups using an enzyme derived from rice
GB2192890A (en) * 1986-06-20 1988-01-27 Abm Chemicals Ltd Improvements in or relating to pullulanase production
JPH05236959A (ja) * 1992-02-28 1993-09-17 Yoshiyuki Takasaki プルラナーゼ、その製造法及び該酵素を用いる澱粉の 糖化法
JPH05236958A (ja) * 1992-02-28 1993-09-17 Amano Pharmaceut Co Ltd 新規イソアミラーゼ及びその製造法
BR9908422A (pt) 1998-03-04 2000-10-31 Genencor Int Pululanase modificada, ácido nucleico, vetor de expressão, microorganismo hospedeiro, processo para a produção de uma pululanase modificada em uma célula hospedeira, composição enzimática, processo para sacarificação de amido, e, b. licheniformis
JP4200335B2 (ja) * 2004-06-10 2008-12-24 パイオニア株式会社 情報記録媒体、並びに情報記録装置及び方法

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