DE1965281C3 - Proteolytisches Enzym und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

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Es ist bekannt, daß verschiedene Mikroorganismen proteolytische Enzyme bilden; eine Reihe solcher Mikroorganismen werden in industriellem Maßstab zu dem Zweck gezüchtet, die produzierten proteolytischen Enzyme zu gewinnen.

Es ist ferner bekannt, daß proteolytische Enzyme hochmolekulare Eiweißkörper sind oder zumindest zu einem hohen Prozentsatz aus solchen bestehen und daß diese Enzyme aufgrund ihrer komplizierten chemischen Struktur gewöhnlich nur unter genau definierten Bedingungen hinsichtlich des pH-Wertes, der Temperatur und gegebenenfalls Fremdstoffzusätzen, zum Beispiel Stabilisatoren und/oder Aktivatoren, beständig und proteolytisch wirksam sind. Für die industrielle Verwendung sind naturgemäß solche proteolytischen Enzyme am wertvollsten, bei denen die Grenzen, innerhalb derer sie beständig und wirksam sind, möglichst weite Bereiche von pH-Werten und Temperaturen umfassen. Solche Enzyme sollten einerseits möglichst unabhängig von Aktivatoren sein, andererseits durch Frerndstoffzus&tze nicht inhibiert v/erden

Es wurde nun gefunden, daß aus Kulturen von Mikroorganismen der Gattung Tritirachium album Limber ein extrazelluläres proteolytisches Enzym gewonnen werden kann, das sich in bezug auf die Bedingungen, unter denen es stabil und wirksam is?, vorteilhaft von den bisher aus Mikroorganismen gewonnenen proteolytischen Enzymen unterscheidet. Insbesondere besitzt es in wäßriger Lösung in einem außergewöhnlich weiten pH-Bereich eine überraschende Stabilität, ferner eine optimale proteolytische Wirkung bei Temperaturen, bei denen ein großer Teil der bisher bekannten proteolytischen Enzyme bereits in erheblichem Maße desaktiviert wird. Die Gewinnung extrazellulärer proteolytischer Enzyme aus Tritirachium-Arten ist bisher noch nicht beschrieben worden und ist somit neu.

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Gegenstände.

Das Kulturmedium wird nach den für die Züchtung derartiger Mikroorganismen allgemein bekannten Prinzipien zusammengestellt. Es enthält neben den üblichen mineralischen Nährsalzen eine oder mehrere Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff organischen Ursprungs und eine oder mehrere Quellen von assimilierbarem Stickstoff, wofür sowohl organische als auch anorganische Substanzen in Frage kommen. Geeignete Kohlenstoffquellen sind insbesondere Kohlehydrate und kohlehydrathaltige Rohprodukte wie z. B. Glukose, Saccharose, Stärke, Getreideschrot, Weizenkleie, Malzextrakte Sojabohnenmehl und Magermilchpulver. Der Kohlenhydratanteil kann in weiten Grenzen variiert werden; vorzugsweise werden Nährmedien mit einem Kohlehydratgehalt von 0,1 bis 20%, insbesondere von 0,2 bis 10%, verwendet. Man kann auch den Züchtungsprozeß in einem Medium mit einem niedrigen Kohlehydratgehalt beginnen und im weiteren Verlauf nach und nach weitere Kohlehydratmengen zusetzen.

Als anorganische Stickstoffquellen werden vorzugsweise Nitrate, wie z. B. Kaliumnitrat, Natriumnitrat und Calciumnitrat, oder Ammoniumverbindungen wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat und Ammoniumnitrat eingesetzt. Geeignete organische Stickstoffquellen sind beispielsweise Harnstoff, Peptone, Kasein, Albumin, Hefeextrakte, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser und Magermilchpulver. Es können aber auch unlösliche Proteine wie z. B. Keratine oder hitzedenaturierte Eiweiße verwendet werden. Eine Reihe der aufgezählten Nährmedienbestandteile wie insbesondere Magermilchpulver, Sojabohnenmehl, Hefeextrakte, Maisquellwasser oder Weizenkleie enthalten sowohl assimilierbaren Kohlenstoff als auch assimilierbaren Stickstoff in ausreichender Menge. Ebenso sind in diesen Produkten die für die Züchtung von Mikroorganismen notwendigen Spurenelemente gewöhnlich in genügender Menge enthalten.

Das Nährmedium wird vor Beginn des Anzuchtverfahrens auf einen pH-Wert zwischen 4,5 und 8 eingestellt; vorzugsweise arbeitet man im pH-Bereich zwischen 5,5 und 7,5. Durch den Abbau der Kohlehydrate tritt im Verlauf des Züchtungsprozesses gelegentlich eine starke Säurebildung auf. Um eine Absenkung des pH-Wertes unter den optimalen Bereich zu verhindern, können dem Nährmedium Puffersubstanzen, z. B. Phosphatpuffer oder Calciumkarbonat, zugesetzt werden. Ferner kann auch die Verwendung einer automatischen pH-Regeleinrichtung, die beim Absinken des pH-Werts unter den gewünschter! Bereich eine Zugabe

basisch reagierender Substanzen wie beispielsweise Alkalikarbonaten oder -Hydrogenkarbonaten auslöst, zweckmäßig sein.

Die Temperatur, bei der die Kultivierung durchgeführt wird, liegt zwischen 15° C und 32° C; vorzugsweise wird bei 25° C bis 28" C gearbeitet Vor Beginn des Zuchtprozesses wird das Nährmedium in üblicher Weise sterilisiert

Die Kultivierung der Mikroorganismen der Gattung Tritirachiurri album Limber erfolgt unter aeroben Bedingungen. Bei der Verwendung von Fermentern erfolgt die Belüftung durch Einleiten von Luft in die genährte Submerskultur. Die Luftmenge entspricht der bei bekannten Kultivierungsprozessen angewendeten. Gute Ausbeuten an dem erfindungsgemäßen proteolytischen Enzym werden normalerweise bei einer Kultivierungsdauer von 2 bis 5 Tagen erhalten.

Die Bestimmung der Ausbeute an dem erfindungsgemäßen proteolytischen Enzym erfolgt in Aniehnung an das von Anson beschriebene Verfahren (Journal of General Physiology, Band 22 [Jahrgang 1939], Seiten 79 bis 89). Bei der Charakterisierung des erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms bedeutet in dieser Beschreibung eine Aktivitätseinheit (im folgenden mit AE abgekürzt) diejenige Menge proteolytisches Enzym, die denaturiertes Rindet hämoglobin bei einem angegebenen pH-Wert und einer Temperatur von 35,5°C während 10 Minuten so weit abbaut, daß die mit 5%iger wäßriger Trichloressigsäurelösung nicht fällbaren Abbauprodukte beim Versetzen mit Phenolreagenz die gleiche Farbe geben wie eine 10-^b molare Tyrosinlösung. Die im folgenden abgegebenen Aktivitäten wurden, wenn nichts anderes angegeben ist, bei einem pH-Wert von 7,5 bestimmt.

Bei dem in den vorhergehenden Abschnitten beschriebenen Züchtungsverfahren wird das erfindungsgemäße proteolytische Enzym von den Mikroorganismen in die Kulturflüssigkeit abgegeben. Die Aufzucht des Mikroorganismus wird abgebrochen, wenn Proben zeigen, daß das erfindungsgemäße Enzym in der Kulturflüssigkeit wesentlich angereichert ist. Eine wirtschaftliche Gewinnung des erfindungsgemäßen Enzyms ist in der Regel möglich, wenn die Kulturflüssigkeit eine Aktivität von wenigstens etwa 150AE pro Milliliter aufweist. Natürlich ist es günstiger, wenn die Aktivität höher, etwa bei 200 bis 300 AE/ml, liegt. Für die Produktion des erfindungsgemäßen Enzyms im technischen Maßstab können durch Modifizierung des Züchtungsverfahrens auch Aktivitäten von 400 bis 500 AE/ml Kulturflüssigkeit erreicht werden.

Zur Isolierung des erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms wird die Kulturflüssigkeit in an sich bekannter Weise aufgearbeitet. Diese Aufarbeitung erfolgt zum Beispiel durch Abtrennen des .vlyzels, vorzugsweise durch Abzentrifugieren oder Abfiltrieren, und Abtrennen der gebildeten Enzyme aus dem wäßrigen Kulturfiltrat durch Salzfraktionierung, zum Beispiel mit Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid oder Natriumchlorid, oder durch Lösungsmittelfällung, zum Beispiel mit niederen aliphatischen Alkoholen wie Methanol, Äthanol, Propanol oder Isopropanol, mit Ketonen wie Aceton oder Butanon-(2), oder mit Polyäthylenglykol. Die weitere Aufarbeitung und Reinigung erfolgt dann gewöhnlich durch !Dialyse, Umfällung und/oder mit chromatographischen Methoden.

Das auf diese Weise isolierte erfindungsgemäße proteolytische Enzym ist ein weißes, kristallines, wasserlösliches, chromatographisch und elektrophoretisch einheitliches Material, das im pH-Bereich von 7 bis 12 eine proteolytische Aktivität von 240-270 AE/mg besitzt; diese Aktivität ist etwa doppelt so groß wie die von kristallisiertem Trypsin, dessen Aktivität in dem beschriebenen Testverfahren zu 130 AE/mg bestimmt wurde. Die proteolytische Aktivität gegen Hämoglobin wurde nach Anson bestimmt Dazu wurden 5 ml Hämoglobin (20 mg/ml), gelöst in 0,1 M Boratpuffer

ίο vom pH-Wert 7,5 und 5μg Enzym, gelöst in 0,1 ml 0,02 M Boratpuffer vom pH-Wert 7,5, 10 Minuten lang bei 35,5° C inkubiert Danach wurde mit 10 m! o,3 M Trichloressigsäurelösung gefällt zentrifugiert und /I₇₅₀ einer Mischung aus 5 ml Überstand, 10 ml 0,5 N Natronlauge und 3 ml Folin-Reagenz gemessen. Eine Aktivitätseinheit (AE) entspricht daher der Enzymmenge, die 1 μΜ Folin-positive Aminosäuren (berechnet nach einer Tyrosin-Eichkurve) freisetzt
Chemisch ist das erfindungsgemäße proteolytische Enzym dadurch charakterisiert daß es ein basisches Protein mit einem isoelektrischen Punkt bei pH 9,5 und einem Molekulargewicht von 20 000 ist

Die Bestimmung des isoelektrischen Punktes wurde mit Hilfe der isoeiektrischen Fokussierung nach VesterbergundSvensson(ActaChem.Scand.20, 820-834 [1966] ausgeführt. Dazu wurde auf eine 110 ml fassende Elektrolysesäule mit einem Sucrosegradienten von 0 — 50% Sucrose und einem pH-Gradienten von 7 — 10 22 mg des Enzyms aufgebracht Die Fokussierung erfolgte 46 Standen bei 900 V und 4°G Nach Beendigung der Fokussierung wurden 2-rnl-Fraktionen gesammelt und die Position des Enzympeaks im gebildeten pH-Gradienten bestimmt.

Die Elementaranalyse ergibt 41,4% Kohlenstoff, 7,1% Wasserstoff, 13,3% Stickstoff und 14% Schwefel. Die proteolytische Aktivität zeigt keine Abhängigkeit von der Gegenwart oder Abwesenheit irgendwelcher Kationen und wird auch durch Zusätze von Äthylendiaminintetraessigsäure oder Jodacetat nicht inhibiert.

Dagegen wird die proteolytische Wirksamkeit durch einen Zusatz von Phenylmethylsulfofluorid vollständig gehemmt. Diese Befunde deuten darauf hin, daß an dem proteolytisch aktiven Zentrum des erfindungsgemäßen Enzyms die Hydroxygruppe eines Serylrestes beteiligt ist, während eventuell vorhandene Mercaptogruppen für die proteolytische Aktivität nicht von Bedeutung sind.

Das Infrarotspektrum des erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms (Fig. 1) zeigt signifikante Absorptionsbanden bei 3300, 2970, 1645, 1537, 1514, 1452, 1405, 1238 und 1060 cm-¹.

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum (F i g. 2) weist ein Absorptionsmaximum bei 36 200 cm-' mit einer Extinktion von E \t. = 8,75 auf.

Das erfindungsgemäße proteolytische Enzym besitzt eine selektive proteolytische Wirksamkeit gegenüber denaturierten Proteinen wie z. B. denaturiertem Hämoglobin, Casein, Albumin, Fibringogen und Spezialgelatine. Native Proteine werden nicht oder nur unvollkommengespalten.

Das erfindungsgemäße proteolytische Enzym weist sowohl in festem als auch in gelöstem Zustand eine überraschend hohe Stabilität auf. In festem Zustand kann das Produkt bei +4"C mindestens 2 Jahre gelagert werden, ohne daß ein Aktivitätsverlust auftritt. In wäßriger Lösung in Gegenwart sehr geringer Mengen von Calciumionen (0,001-0,005 Mol/l) ist das erfindungsgcrnäßc Enzym in dem extrem weiten DK-Bereich

von 3,5 bis 12,5 stabil und proteolytisch wirksam. Die Stabilität des Enzyms wurde so bestimmt, daß 30 mg Enzym, gelöst in 20 ml 0,02 M Boratpuffer vom pH-Wert 7,5, der 0,001 M Calciumchlorid enthielt, 30 Tage lang bei 25°C inkubiert wurden. Alle 24 Stunden wurden 0,1 ml entnommen, mit 2,9 ml Puffer verdünnt und 0,1 ml davon (entsprechend 5 μg Enzym) in den oben beschriebenen Test nach A η s ο η eingesetzt. Innerhalb vom 30 Tagen findet unter diesen Bedingun-

Tabelle I: Relative Aktivitäten verschiedener protcolylischer l:nzyme in Abhängigkeil vom pH-Wert

gen kein Abfall der proteolytischen Aktivität statt. Die Abhängigkeit der proteolytischen Aktivität vom pH-Wert ist in Tabelle I zusammengestellt. Die angegebenen relativen Aktivitäten sind darin für das erfindungsgemäße proteolytische Enzym sowie für drei bekannte, aus Mikroorganismen der Gattungen Fusarium, Streptomyces und Bacillus gewonnene Enzyme in Prozent der maximalen Aktivität angegeben.

pH-Wert

3,5

5,5

Il

12

ReI. proteolyl. Aktivität des
erfindungsgemäßen
Tritirachium-Enzyms (%)

ReI. proteolyt. Aktivität
eines Fusarium-Enzyms (%)

ReI. proteolyt. Aktivität

eines Streptomyces-Enzyms (%)

ReI. proteolyt. Aktivität
eines Bacillus-Enzyms (%)

55 68 82 93 96 100 100 100 90 18

23 44 59 73 87 100 58 6

- - 38 51 75 100 57 43 -

40 50 70 92 98 100 96 85 77

Tabelle I zeigt deutlich, daß das erfindungsgemäße Enzym eine sehr gute proteolytische Wirksamkeit in einem wesentlich breiteren pH-Bereich besitzt als die bekannten Enzyme aus Fusarium-, Streptomyces- und Bacillus-Arten.

Wäßrige Lösungen des erfindungsgemäßen Enzyms, die 0,001 bis 0,005 Mol/l Calciumionen enthalten, sind im pH-Bereich der maximalen proteolytischen Aktivität über für derartige Enzyme überraschend lange Zeiträume stabil. So ist an einer 0,15%igen Lösung des erfindungsgemäßen Enzyms in einem auf pH 8 eingestellten und an Calciumionen 0,001 molaren Borat-Pufferlösung (0,02 molar) auch nach 40tägiger Aufbewahrung bei 25°C noch kein Aktivitätsverlust feststellbar. Die Aktivität dieser Versuchslösung ist auch nach 15tägiger Lagerung bei 4O⁰C noch unverändert.

Stärker alkalische Lösungen des erfindungsgemäßen Enzyms zeigen zwar bei längerer Lagerung einen Aktivitätsverlust, der aber weitaus geringer ist als der von Lösungen anderer bekannter Enzyme unter gleichen Bedingungen. Tabelle II enthält eine Zusammenstellung der Stabilitätsdaten von Lösungen des erfindungsgemäßen Enzyms bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen.

Tabelle Il

Stabilität von Lösungen des erfindungsgemäßen Enzyms

pH-Wert der Lösung
8 10 11

Restaktivität nach 80 Tagen 100 80 85

bei 25°C (in %)

Restaktivität nach 15 Tagen 100 45 40

bei 40⁰C (in %)

Restaktivität nach 4 Stunden 75 60 40

bei Src (in %)

Restaktivität nach 1 Tag 60 20 10

bei 53 C (in %)

Auch Lösungen des erfindungsgemäßen Enzyms mit pH-Werten im sauren Bereich weisen eine sehr gute Stabilität auf. So ist bei einem pH-Wert vcn 6,8

(Barbiturat-Pufferlösung) die proteolytische Aktivität nach 21tägiger Aufbewahrung bei 25° C noch unverändert; nach 21tägiger Lagerung bei 4O⁰C beträgt die Restaktivität noch 75%. Lösungen mit einem pH-Wert von 4,6 (Acetat-Pufferiösung) weisen nach 21 Tagen bei

25° C bzw. 40⁰C Restaktivitäten von 80% bzw. 65% auf.

Selbst im stark sauren Bereich bei pH 3 (Glycerin-Puf-

ferlösung) findet man nach 21 Tagen bei 25°C noch eine

Restaktivität von 70%.

Wie allgemein bekannt ist, nimmt die Stabilität von

Lösungen proteolytischer Enzyme mit steigender Temperatur ab. Andererseits nimmt die Aktivität von proteolytischen Enzymen mit steigenden Temperaturen zu, da auch enzymetische Reaktionen durch Temperaturerhöhungen beschleunigt werden. Diese beiden

entgegengesetzten Tendenzen bewirken, daß jedes Enzym ein Temperaturoptimum aufweist, dessen Lage natürlich von der Dauer der Testreaktion abhängt Bei den industriell verwendeten proteolytischen Enzymen wird es gewöhnlich in der 10 Minuten dauernden

Testreaktion nach A η s ο η bestimmt Die Lage dieses Temperaturoptimums kann ebenfalls als Maß für die Stabilität eines Enzyms dienen. In Tabelle III sind die Temperaturoptima für einige bekannte proteolytische Enzyme aus Mikroorganismen dem des erfindungsge-

mäßen Enzyms gegenübergestellt

Tabelle III

Temperaturoptima verschiedener proteolytischer Enzyme aus Mikroorganismen

Proteolytisches Enzym aus

Temperaturoptimum (10 Minuten) in C

Tritirachium album Limber 65-70

Streptomyces naraensis 40

Streptomyces griseus 40-60

Fortsetzung

Proteolytischcs Enzym aus

Temperdturoptimum (IO Minuten) in C

Fusarium sp.	50
Bacillus subtilis	55
Bacillus alcalophilus	60

Aus dieser Tabelle geht hervor, daß das Temperaturoptimum des erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms höher liegt als die Temperaturoptima bekannter proteolytischer Enzyme aus anderen Mikroorganismen. Bei 65° C beträgt die proteolytische Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms etwa 1200 AE/mg.

Aufgrund der beschriebenen guten Stabilitäts- und Aktivitätseigenschaften läßt sich das erfindungsgemäße proteolytische Enzym in allen Bereichen einsetzen, für die proteolytische Enzyme allgemein verwendet werden. Insbesondere kann es für Wasch- und Reinigungsmittel oder Fleckenentferner, ferner als Enthaarungsmittel in der Gerberei, aber auch in der Lebensmittelindustrie zur Herstellung von Proteinhydrolysaten sowie in der Serologie zum Nachweis von inkompletten Antikörpern verwendet werden. Besonders vorteilhaft für die Verwendung in der Lebensmittelindustrie und in der Serologie ist es, daß das erfindungsgemäße Enzym in fester bzw. gelöster Form eine so ausgezeichnete Stabilität besitzt, daß zur Stabilisierung wäßriger Lösungen im Gegensatz zu denen anderer Enzympräparate geringste, physiologisch unbedenkliche Mengen Calciumionen völlig ausreichend sind.

15 Entsprechende Werte wurden auch bei Verwendung eines wie folgt zusammengesetzten Nährmediüms erhalten:

2% Magermilchpulver
0,25% Natriumchlorid
0,28% Kaliumdihydrogenphosphat 0,07% Dikaliumhydrogenphosphat 0,05% Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,01% Calciumchlorid-dihydrat ad 100% destilliertes Wasser.

Beispiel 2 Kultivierung des Mikroorganismus

Das Anzuchtverfahren wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, jedoch enthält das Nährmedium 1% Ovalbumin anstelle des Casein-Peptons. In den nach 3,4, 5 und 6 Tagen entnommenen Proben werden die folgenden pH-Werte und Aktivitäten gefunden:

Zeit (Tage)

0 3 4 5 6

pH-Wert der KuI- 5,8 5,3 7,1 7,3 7,8 turflüssigkeit

Proteolytische Ak- 0 4,8 83,2 217,6 211,2 tivität

(in AE pro ml KuI-turflüssigkeit)

Beispiel 1
Kultivierung des Mikroorganismus

In einem sterilen 1000-ml-Erlenmeyerkolben werden 200 ml im Autoklaven bei 120° C 30 Minuten sterilisiertes Nährmedium, bestehend aus (alle Prozentangaben sind Gewichtsprozent)

1 % Pepton aus Casein
1% Glukose

0,28% Kaliumdihydrogenphosphat

0,07% Dikaliumhydrogenphosphat
0,05% Magnesiumsulfat-heptahydrat
0,01% Calciumchlorid-dihydrat
ad 100% destilliertes Wasser

B e i s ρ i e I 3 Kultivierung des Mikroorganismus

In einem Kleinfermenter werden unter steriler Bedingungen 101 der in Beispiel 1 beschriebener Nährlösung mit einer Submerskultur von Tritirachium album Limber (CBS-Nr. 747.69) beimpft. Die Kultur wächst bei 28° C unter Durchleiten von 51 Luft prc Minute und Rühren mit 450 Umdrehungen pro Minute In den nach verschiedenen Zeiten entnommener Proben werden die folgenden pH-Werte und Aktivitäten gefunden:

mit einer Submerskultur von Tritirachium album Limber (CBS-Nr. 747.69) beimpft und 6 Tage auf einer Schüttelmaschine mit 100 Ausschlägen pro Minute bei 28° C geschüttelt Nach 3, 4, 5 und 6 Tagen werden Proben entnommen und der pH-Wert und die proteolytische Aktivität bestimmt

Zeit (Tage)
0 3

pH-Wert der KuI- 5,9 7,3 7,7 7,8 7,9 turflüssigkeit

Proteolytische Ak- 0 76,8 129,6 179,2 201,6 tivität

(in AE pro ml Kulturflüssigkeit)

Zeit (Stunden) 0 24 48

60

73

pH-Wert der KuI-turflüssigkeit
Proteolytische Aktivität

(in AE pro ml KuI-turflüssigkeit)

5,9 4,5

7,1

7,6 7,8

2,8 84 134 217

In einem analogen Ansatz war der pH-Wert nach 9( Stunden 7,4; die proteolytische Aktivität betrug 290 AI pro ml Kulturflüssigkeit

Beispiel 4 Abtrennung des Rohenzyms

8,11 Kulturfiltrat mit einer proteolytischen Aktivitä von 121 AE/ml werden mit 2,02 g CaCl₂-2H₂O und se

viel festem Tris-hydroxymethyl-aminomethan versetzt, daß der pH-Wert 8,0 beträgt, und unter vermindertem Druck bei 25-28°C auf 940 ml eingeengt. Das Konzentrat wird durch Zentrifugieren geklärt und der Rückstand mit 200 ml einer auf pH 8,0 eingestellten, 0,1 molaren Pufferlösung (Tris-hydroxymethyl-aminomethan/Salzsäure), die außerdem 0,002 molar an Calciumchlorid ist, ausgewaschen. Das mit der Waschlösung vereinigte geklärte Konzentrat, das noch 90% der im eingesetzten Kulturfiltrat vorhandenen proteolytischen Aktivität enthält, wird bei 5°C mit 614 g Ammoniumsulfat versetzt und über Nacht bei dieser Temperatur stehengelassen. Der dabei erhaltene Niederschlag wird durch Dekantieren und Zentrifugieren abgetrennt und in 200 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird filtriert und über Nacht gegen strömendes entsalztes Wasser dialysiert. Das Dialysat wird zur Entfärbung mit einem schwach basischen Kondensationsprodukt aus Cellulose, Epichlorhydrin und Triäthanolamin behandelt und die erhaltene klare Enzymlösung gefriergetrocknet. Ausbeute 3,0 g Rohenzym mit einer proteolytischen Aktivität von etwa 180 AE/mg. Dieses Rohenzym ist bei +4⁰C mindestens 2 Jahre ohne Aktivitätsverlust haltbar und kann für die meisten technischen Verwendungszwecke ohne weitere Aufreinigung eingesetzt werden.

Beispiel 5
Reinigung des Rohenzyms

10 g des nach Beispiel 4 erhaltenen Rohenzyms werden in 95 ml 0,01 molarer Pufferlösung (Tris-hydroxymethyl-aminomethan/Salzsäure), die 0,002 molar an Calciumchlorid ist, gelöst und mit dieser Pufferlösung über eine schwach basische Ionenaustauschersäule aus mit Diäthylaminoäthan modifiziertem Dextrangel chromatographierL Als erste Komponente werden 3,4 g des reinen erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms (CBS-Nr. 747.69) eluiert, das durch Gefriertrocknung als weißes, kristallines Pulver erhalten wird und eine proteolytische Aktivität von 240—270 AE/mg aufweist. Anschließend wird ein Nebenprodukt eluiert (etwa 10% des aufgetragenen Rohenzyms), das aus mindestens 3 Komponenten besteht und eine proteolytische Aktivität von 40 - 50 AE/mg besitzt

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Proteolytisches Enzym, gewonnen aus Kulturen von Mikroorganismen des Stammes Tritirachium album Limber, mit folgenden Eigenschaften:

(a) Elementaranalyse: 41,4% Kohlenstoff, 7,!% Wasserstoff, 133% Stickstoff und 1,5% Schwefel,

(b) Molekulargewicht: 20 000, ι ο

(c) Infrarotspektrum (vergleiche F i g. 1) mit signifikanten Absorptionsbanden bei 3300,2970,1645, 1537,1514,1452,1405,1238 und 1060 cm-',

(d) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (vergleiche

Fig.2) mit einem Absorptionsmaximum bei 36 200 cm -' mit einer Extinktion E \T. = 8.75,

(e) Isoelektrischer Punkt bei einem pH-Wert von

9Ä

(f) Proteolytische Aktivität gegen Hämoglobin nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten bei pH 7,5 und 35,5°C: 240 - 270 AE/mg,

(g) Stabilität in gepufferter wäßriger Lösung im pH-Bereich von 8 bis 11 in Gegenwart von 1-S-IO-³ Mol/l Calciumionen bei 25°C über mindestens 30 Tage,

(h) Temperaturoptimum der proteolytischen Aktivität bei pH 8 bei 65 - 70⁰C.

2. Verfahren zur Herstellung des proteolytischen Enzyms gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen des Stammes Tritirachium album Limber in einem assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Nährmedium kultiviert und anschließend das proteolytische Enzym in an sich bekannter Weise abtrennt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen bei Temperaturen zwischen 15°C und 32°C, vorzugsweise zwischen 25° C und 28° C, kultiviert.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen in einem Nährmedium mit einem pH-Wert zwischen 5 und 8 kultiviert.