DE1965281A1 - Neues proteolytisches Enzym und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

E. M e r ο lc 23, Dezember 1969

Aktiengesellschaft

Darmstadt

Neues protoolytisches Enzym urld Verfahren zu seiner Herstollung

Es ist bekannt, daß verschiedene Mikroorganismen proteolytische Enzyme bilden; eine Reihe solcher Mikroorganismen werden in industriellem Maßstab zu dem Zweck gezüchtet, die produzierten proteolytischen Enzyme zu gewinnen.

Es ist ferner bekannt, daß proteolytische Enzyme hochmolekulare Eiweißkörper sind oder zumindest zu einem hohen Prozentsatz aus solchen bestehen, und daß diese Enzyme aufgrund ihrer komplizierten chemischen Struktur gewöhnlich nur unter genau definierten Bedingungen hinsichtlich des pH-Wertes, der Temperatur und gegebenenfalls Premdstoffzusätzen, zum Beispiel Stabilisatoren und/oder Aktivatoren, beständig und proteolytisch wirksam sind. Für die industrielle Verwendung sind naturgemäß solche proteolytischen Enzyme am wertvollsten, f bei denen die Grenzen, innerhalb derer sie beständig und wii*ksam sind, möglichst weite Bereiche von pll-Vr'erten und Temperaturen umfassen» Solche Enzyme sollten einerseits möglichst unabhängig von Aktivatoren sein, andererseits durch Fremdstoffzusätze nicht inhibiert werden.

Es wurde nun gefunden, daß aus Kulturen von Mikroorganismen der Gattung ^rj.tir/u:hiu_M ein extrazelluläres proteolytischos Enzyia gewonnen worden kann, das sich in Bezug auf die BefJ iii<-,un/^r,c>n, untur dciiuu oh stabil utui wirksun ist, vorteilhaft

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von don bisher aus Mikroorganismen gewonnenen proteolytischen Enzymen ι-terscheidot. Insbesondere besitzt es in wäßriger Lösung in einem außergewöhnlich weiten pH—Bereich eine überraschende Stabilität, ferner eine optimale proteolytische V/irkung bei Temperaturen, bei denen ein großer Teil der bisher bekannten proteolytisohen Enzyme bereits in erheblichem Maße deaktiviert wird. Die Gewinnung extrazellulärer proteolytischer Enzyme aus Tritirachium- Arten ist bisher noch nicht beschrieben worden und ist sorait neu.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein neues, von Mikroorganismen der Gattung Tritirachium produziertes protoolytisches Enzym, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es in wäßriger Lösung in Gegenwart von Calciumionen in einem pll-üereich von 3,5 bis 12,5 stabil und proteolytisch wirksam ist und seine optimale proteolytische Wirksamkeit bei Temperaturen von 65 - 70⁰C entfaltet. V/eitere Charakteristilca des erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms können der folgenden 13eschreibung entnommen werden.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines proteolytischen Enzyms,' das dadurch gekennzeichnet ist, daß Mikroorganismen der Gattung Tritlrachiua unter aeroben Bedingungen in einem assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenden Nährmedium bis zu einer wesentlichen Anreicherung des proteolytischen Enzyms kultiviert werden und anschließend das proteolytische Enzym aus diesen Kulturen in an sich bekannter Weise abgetrennt wird.

Zur Gewinnung dos erfindungsgemäßen proteolytischen Enzyms werdon Mikroorganismen der Gattung Tritirachium, insbesondere der beim "Centraalbureau voor Schimmelcultures" in Uaarn, Niederlande, hinterlegte Stamm Tritirachium albua LIMüF.l: in

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mm ,J —

eiiieu ivulturuediun gezüchtet. Dieser Stanua wurde aus ruit Hornspäncu gedüngter Qartcnerde isoliert. Die Gattung Tritirachium ist in Mycologia, Band 32 (Jahrgang 1940), Seiten 23 - 30 beschrieben und charakterisiert.

Das Kulturmedium wird nach den für die Züchtung derartiger Mikroorganismen allgemein bekannten Prinzipien ziisammengestellt« Es enthält neben den üblichen mineralischen Nährsalzen eine oder mehrere Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff organischen Ursprungs und eine oder mehrere Quellen von assimilierbarem Stickstoff, wofür sowohl organische als auch anorganische Substanzen in Frage kommen. Geeignete Kohlenstoffquellen sind insbesondere Kohlenhydrate und kohle- _% " hydrathaltige Rohprodukte wie z.B. Glukose, Saccharose, Stärke, Getreideschrot, Weizenkleie, Malzextrakt«, Sojabohnenraehl und Magermilchpulver. Der Kohlenhydratanteil kanu in weiten Grenzen variiert werden; vorzugsweise werden N&hrmedien nit einem Kohlenhydratgehalt von 0,1 bis 20 #, insbesondere von 0,2 bis 10 ',Ό verwendet. Man kann auch den Züchtungsprozess in einem Medium mit einem niedrigen Kohlenhydratgehalt beginnen und im weiteren Verlauf nach und nach weitere Kohlenhydratinengen zusetzen.

Als anorganische Stickstoffquellen werden vorzugsweise Nitrate, wie z.B. Kaliumnitrat, Natriumnitrat und Calciumnitrat, oder Ammoniumverbindungen wie beispielsweise Ammonlumchlorid, Ammoniumacetat und Ammoniumnitrat eingesetzt· Geeignete organische Stickstoffquellen sind beispielsweise Harnstoff, Peptone, Kasein, Albumin, Hefeextrakte, Sojabohnenaehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Maisquellwasser und Magermilchpulver. Es können aber auch unlösliche Proteine wie z.B. Keratine oder hitzedenaturierte Eiweiße verwendet werden. Eine Reihe der aufgezählten Nähroedienbestundteile wie insbesondere MagemiiIchpulver, Sojabohnenmehl, llefeüxtrakte, Maisqut-llwasser oder V/eizenkleie enthalten sowohl

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assimilierbaren Kohlenstoff als auch assimilierbaren Stickstoff in ausreichender Menge." Ebenso sind in diesen Produkten die für die Züchtung von Mikroorganismen notwendigen Spurenelemente gewöhnlich in genügender Menge enthalten.

Das Nährinediun wird vor Beginn des Anzuchtverfahrens auf einen pll-Uert zwischen 4,5 und 8 eingestellt; vorzugsweise arbeitet nan iia pH-Bereich zwischen 5,5 und 7,5. Durch den Abbau der Kohlenhydrate tritt im Verlauf des Züchtungsprozesses gelegentlich eine starke Säurebildung auf. Um eine absenkung des pll-Vcrtes unter den optimalen bereich zu verhindern, können dem Nährmedium Puffersubstanzen, z.B. Phosphat puff ei- oder Calciumkarbonat, zugesetzt werden. Ferner kann auch die Verwendung einer automatischen pll-iiegeleinrichtung, die beim Absinken des pII-Y/erts unter den gewünschten Bereich eine Zugabe basisch reagierender Substanzen wie beispielsweise Alkalikarbonaten oder -hydrogenkarbonaten auslöst, zweckmäßig sein.

Die Temperatur, bei der die Kultivierung durchgeführt wird, liegt zwischen 15⁰G und 32⁰G; vorzugsweise wird bei 2ö°G bis 23 C gearbeitet. Vor Beginn des Zuclitprozesses wird das Nährmedium in üblicher \feise sterilisiert.

Die Kultivierung der Mikroorganismen der Gattung Tritirachium erfolgt unter aeroben Bedingungen. Bei der Verwendung von Fermentern erfolgt die Belüftung durch Einleiten von Luft in die gerührte Submerskultur. Die Luftnenge entspricht dei* bei bekannten Kultivierungsprozessen angewendeten. Gute Ausbeuten an dem erfindungsgemäßen proteolytischen Enzym wex*den normalerweise bei einer Kultivierungsdauer von 2 bis 5 Tagen erhalten.

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Die Bestimmung der Ausbeute an dem erfindungsgemäßen proteolytischon Enzym erfolgt in Anlehnung an das von ANSON beschriebene Verfahren ^Journal of General Physiology, Band 22 (Jahrgang 1939), Seiten 79 bis 89/„ Bei der Charakterisierung des orfindungsgemäiien pröteolytiachen Enzyms bedeutet in dieser Beschreibung eine Aktivitätseiuheit (im Folgenden mit AE abgekürzt) diejenige Menge proteolytisches Enzym, die denaturiertos Hinderhäcioglobin bei einem angegebenen pH-Wert und einer Temperatur von 35,5 C während 10 Minuten so weit abbaut, daß die mit 5 ^iger wässeriger Trichloressigsäurelösung nicht fällbaren Abbauprodukte beim Versetzen mit Phenolreagenz die

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gleiche Farbe geben wie eine 10 molare Tyrosinlösung. Die ' im rolgendon angegebenen Aktivitäten wurden, ivenn nichts ™ anderes angegeben ist, bei einem pH-Wert von 7,5 bestimmt.

13ei dem in den vorhergehenden Abschnitten beschriebenen Züchtungsverfahren wird das erfindungsgemäße proteolytische Enzym von den Mikroorganismen in die Kulturflüssigkeit abgegeben. Die Aufzucht dos Mikroorganismus wird abgebrochen, wenn Proben zeigen, daß dae erfindungsgemäße Enzym in der Kulturflüssigkeit wesentlich angereichert ist. Eine wirtschaftliche Gewinnung des erfindungsgemäßen Enzyms ist in der Hegel möglich, wenn die Kulturflüssigkeit eine Aktivität von wenigstens etwa 150 AE pro Milliliter aufweist. Natürlich ist es günstiger, wenn die Aktivität höher, etwa bei 200 bis 300 AE/eiI, liegt. Für die Produktion des erfindungsgemäßen Enzyms im technischen Maßstab können durch Modifizierung des Züchtungsverfahrens auch Aktivitäten von 400 bis 500 AE/inl Kulturflüssigkoit erreicht werden.

Zur Isolierung des erfindungsgemäflen proteolytischen Enzyms wird die Kulturflüssigkeit in an sich bekannter Veise aufgearbeitet. Diese Aufarbeitung erfolgt zum Beispiel durch Abtrennen des Myzels, vorzugsweise durch Abzontrifugieren odor Abf iltriorcn, und Abtrennen der gobIMoton länzywe aus dom v;a;ii»rigon KuI turf iltt\i t durch Sa Iz fraktionierung, zuu Ueiwpii'l

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-G-

uit Ammonium« ^ xat, .Auiraoniuiachlorid oder Natriumchlorid, oder durch Löe iigSEixitelfälluiig, zum Beispiel mit niederen aliphatischen Alkoholen wie Methanol, Aethanol, Propanol oder Isopropanol, mit Ketonen wie Aceton oder Butanon-(2), oder nit Polyäthylenglykol. Die weitere Aufarbeitung und Reinigung erfolgt dann gewöhnlich durch Dialyse, Umfällung und/oder mit chromatographischen Methoden.

Das auf diese Veise isolierte erfindungsgomäße proteolytische Enzym ist ein weißes, kristallines, wasserlösliches, chromatographisch und elektrophoretisch einheitliches Material, das im pH-Bereich von 7 bis 12 eine proteolytische Aktivität von 240 - 270 AE/mg besitzt; diese Aktivität ist etwa doppelt so groß wie die von kristallisiertem Trypsin, dessen Aktivität in dem beschriebenen Testverfahren zu 130 AE/mg bestimmt wurde.

Chemisch ist das erfindungsgemäße proteolytische Enzym dadurch charakterisiert, daß es ein basisches Protein mit einem isoelektrischen Punkt bei etwa pH 9,5 und einem Molekulargewicht von 20000 - 30000 ist.

Die Elementaranalyse ergibt 41,4 5* Kohlenstoff, 7,1 '_/β Wasserstoff, 13,3 5» Stickstoff und 1,5 # Schwefel. Die proteolytische Aktivität zeigt keine Abhängigkeit von der Gegenwart oder Abwesenheit irgendwelcher Kationen und wird auch durch Zusätze von Aethylendiamintetraessigsäure oder Jodacetat nicht inhibiert, Dagegen wird die proteolytische Wirksamkeit durch einen Zusatz von Phenylmethylsulfofluorid vollständig gehemmt. Diese Befunde deuten darauf hin, daß an dem protoolytisch aktiven Zentrum des erfindungsgemäßon Enzyms die Hydroxygruppe eines Serylrestes beteiligt ist, während eventuell vorhandene Mercaptogruppen für die protoolytische Aktivität nicht von Bedeutung sind.

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Das infrarotspektrun des erfindungsgeiaäßen proteolytisehen linzyus (Figur i in der Anlage) zeigt signifikante Absorptionsbanden bei 3300,2970, 1645, 1537, 1514, 1452, 14.05, 1238 und 10Ü0 cm .

Das Ültraviolott-Absorptionsspektrum (Figur 2 in der Anlage) weist ein Absorptionsmaximum bei 36200 cm" mit,einer Extinktion von E* ^rJ_m = 8,75 auf.

Das eriindungsgeraäße proteolytische Enzym besitzt eine selektive proteolytische Wirksamkeit gegenüber denaturierten Proteinen wie z.B. denaturiertem Hämoglobin, Casein, Albumin, Fibrinogen und Spezialgelatine. Native Proteine werden nicht oder nur unvollkommen gespalten.

Das erfindungsgemäße proteolytlsohe Enzym weist sowohl in festem als auch in gelöstem Zustand eine überraschend hohe Stabilität auf. In festem Zustand kann das Produkt bei 4-4⁰C mindestens 2 Jahre gelagert werden, ohne daß ein Aktivitätsverlust auftritt· In wässriger Lö&ung in Gegenwart sehr geringer Mengen von Calciumionen (0,001 - 0,005 Mol/l) ist das erfindungsgemäße Enzym in dem extrem weiten pll-üereich von 3,5 bis 12,5 stabil und proteolytiech wirksam; die Abhängigkeit der proteolytisehen Aktivität vom pH-Wert ist in Tabelle I zusammengestellt. Die angegebenen relativen Aktivitäten sind darin für das erfindungsgemfiße proteolytitfche Enzym sowie "

für drei bekannte, aus Mikroorganismen der Gattungen Fusarltm, Streptomyces und Bacillus gewonnene Enzyme in Prozent der maximalen Aktivität angegeben·

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Tabelle I: Itelative Aktivitäten verschiedener proteolytischer Enzyme in Abhängigkeit vom pll-U'ert

pII-V.rert	3,2	4	5	5,5	0	7	8	9	10	11	12	12,5
rel.proteolyt.Aktivi tät des erfindungsge- aäßen Tritirachium-	4	15	55	68	82	93	96	100	100	100	90	18
Cnzyins (Jl)	-	-	-	-	23	44	59	73	87	100	58	6
rel.proteolyt.Aktivi tät eines Fusarium-	-	—	-	38	51	75	100	57	43	-		-
Snzyms («β)	-	15	40	50	70	92	96	100	96	85	77	-
rel.proteolyt.Aktivi tät eines Streptomyces-Enzyms
(i'O
rel.proteolyt.Aktivi tät eines Bacillus-
Enzyms (#)

Tabelle I zeigt deutlich, daß das erfindungsgomäßo Enzym eine sehr gute proteolytische Wirksamkeit in einen wesentlich
breiteren pII-Bereich besitzt als die bekannten Enzyme aus
Fusariua-, Streptomyoes- und Bacillus-Arten.

Wässrige Lösungen des erfindungsgemäßen Enzyms, die 0,001 bis 0,005 Mol/l Calciumionen enthalten, sind in pH-Bereich der
maximalen proteolytischen Aktivität über für derartige Enzyme überraschend lange Zeiträume stabil. So :j.st an einer 0,15 ',ii
Lösung des erfindungsgemäßen' Enzyms in einem auf pH 8 eingestellten und an Calciumionen 0,001 molaren Borat-Pufferlösung (0,02 molar) auch nach 40-tagiger Aufbewahrung bei 25⁰C noch
kein Aktivitätsverlust feststellbar. Die Aktivität dieser Ver suchslösung ist auch noch 15-tägiger Lagerung bei 40°C noch
unverändert.

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Stärker alkalische Losungen des erf in dungs gemäß en Enzyias zeigen xu'ur bei längerer Lagerung einen Aktivitätsverlust, der aber \veitaus geringer ist als der von Lösungen anderer bekannter ünzyiae unter gleichen Bedingungen* Tabelle II enthält eine Zusammenstellung der Stabilitätsdaten von Lösungen des erfindungsgcuüßen Enzyms bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen.

Tabelle II: Stabilität von Lösungen des erfindungsgeinäßen Enzyms.

pll-Uert der Lösung	8	10	ii
luftaktivität nach 3ü Tagen bei 25°C (in Ji)	100	80	85
ilestaktivität nach 15 Tagen bei 400C (in tf)	100	45	40
Restaktivität nach 4 Stunden bei 53°C (in 5ί)	75	60	40
Restaktivität nach 1 Tag bei 330C (in ?»)	60	20	10

Auch Losungen des erlindungsgonäßen Enzyms mit pll-Vorten im sauren JJereich weisen eine sehr gute" Stabilität auf. So ist bei einem pH-Wert ron ö,ö (liurbiturat-Pufferlösung) die protoolytisoho Aktivität nach 21-tägiger Aufbewahrung bei 2ö 0 noch unverändert; nach 21-täglg«r Lagerung bei 40⁰C beträft die Reataktivität nor>.h"TO ^c/o. Losungen ait einem

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pll-Vert von 4,6 (Acetat-Pufferlösung) weisen nach 21 Tagen bei 25°: bzw. 40°U liestalctivitäten von 80 'S bzw. G5 <i auf. Selbst im stark sauren Bereich bei pH 3 (Glycin-Pufferlösung) findet man nach 21 Tagen bei 2o°C noch eine Ilestaktivität voa 70 </„

Wie allgemein bekannt ist, nimmt die Stabilität von Losungen proteolytischer Enzyme mit steigender Temperatur ab. Andererseits nimmt die Aktivität von proteolytischen Enzymen mit steigenden Temperaturen zu, da auch enzymatisehe Reaktionen durch Temperaturerhöhung beschleunigt werden· Diese beiden entgegengesetzten Tendenzen bewirken, daß jedes Enzym ein Temperaturoptimum aufweist, dessen Lage natürlich von der Dauer der Testreaktion abhängt. Bei den industriell verwendeten proteolytischen Enzymen wird es gewöhnlich in der 10 Minuten dauernden Testreaktion nach Anson bestimmt. Die Lage dieses Temperatüroptimums kann ebenfalls als Maß für die Stabilität eines Enzyms dienen. In Tabelle III sind die Temperaturoptima für einige bekannte proteolytische Enzyme aus Mikroorganismen dem des erfindungsgemäßen Enzyms gegenübergestellt.

Tabelle III: Temperaturoptima verschiedener proteolytischer Enzyme aus Mikroorganismen.

Proteolytisches Enzym	Temperatüroptimum
aus	(10 Minuten) in 0C
Tritirachiu» album Limber	65 -* 70
Streptomyces naraensis	40
Streptomyces grisous	40 - 60
Fusarium sp. ■	50
Bacillus subtilis	55
Bacillus alcalophilus	60

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Aus dieser Tabelle geht hervor, daß das Tenperaturoptinium des eriiudungsgoEiäßen proteolytischen Enzyms höher liegt als die Teraperaturopticia bekannter proteolytiseher Enzyme aus anderen Mikroorganismen· Bei 65°C beträgt die proteolytische Aktivität des erfindungsgeniäßen Enzyms etwa 1200 AE/mg.

Aufgrund der beschriebenen guten Stabilitäts- und ^ktivitätseigenschaften läßt sich das erfindungsgemäße proteolytische Enzym in allen Bereichen einsetzen, für die proteolytische Enzyme allgemein verwendet werden· Insbesondere kann es für Wasch- und Reinigungsmittel oder Fleckenentferner, ferner als Enthaarungsmittel in der Gerberei, aber auch in der Lebens» raittelindustrie zur Herstellung von Proteinhydrolysaten sowie in der Serologie zum Nachweis von inkompletten Antikörpern verwendet werden. Besonders vorteilhaft für die Verwendung in der Lebensmittelindustrie und in der Serologie ist es, daß das erfindungsgemäße Enzym in fester bzw« gelöster Form eine so ausgezeichnete Stabilität besitzt, daß zur Stabilisierung wäßriger Lösungen im Gegensatz zu denen anderer Enzympräparate geringste, physiologisch unbedenkliche Mengen-Caleiumionen völlig ausreichend sind· Als Y/asch- und Ileinigungsmittelzusatz sowie als Enthaarungsmittel kann außer dem reinen erfindungsgemäßen Enzym auch das aus dem Kulturfiltrat von Tritiraohiua-Arten analog dem folgenden Beispiel. 4 isolierte Ilohenzym, das eine proteolytisohe Aktivität von 160 bis 230 AE/mg aufweist, mit Erfolg verwendet werden. *

Beispiel 1 Kultivierung des Mikroorganismus

Iu einem sterilen 1000 al-Erlenmeyerkolben werden 200 al im ' Autoklaven bei 120⁰C 30 Minuten sterilisiertes Nähraedium, bestehend aus (alle Prozentangaben sind Gewichtsprozent)

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1 ^ι,Ό Pepton aus Casein 1 ^ι/Ό Glukose 0,28 ^ι,Ό Küliumdihydrogcuphosphat 0,07 ^c/e Dilcaliuiahydrogenphosphat 0,05 ¹Jo Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,01 i» Calciuiachlorid-dihydrat ad 100 ^c/e destilliertes Wasser

mit einer Submerskultur von Tritirachium album LBIBEIl beimpft und Q Tage auf einer Schüttelaaschine mit 100 Ausschlägen pro Minute bei 28⁰G geschüttelt. Nach 3,4,5 und 6 Togen werden Proben entnommen und der pll-Wert und die proteolytische Aktivität bestimmt·

Zeit (Tage)	0	3	4	5	6
pH-Wert der
Kulturflüssig	5,9	7,3	7,7	7,8	7,9
keit
Proteolytische
Aktivität	0	76,8	129,6	179,2	201,6
(in ΛΕ pro ml Kulturflüssig keit)

Entsprechende Werte wurden auch bei Verwendung eines wie folgt zusammengesetzten Ntthrmediums erhalten:

2 <i 0,25 «ί 0,28 $· 0,07 f. 0,05 # 0,01 # ad 100

Magerailchpulver

Natriumchlorid

Kaliumdihydrogenphosphat

Dikaliumhydrogenphoephat ^c/* Magnesiumsulf a t-heptahydrat # Calciumchlorid-dihydrat ^cl* destilliertes Vasser.

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Beispiel 2

KultivLoruiu^r, dos Milcrooi'gauisnius

IKaS Anzuchtverfahren wird vflo in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, jedoch enthält das Niihrmodiura i ^j Ovalbunin anstelle des Cusoin-Peptons. In den nach 3, 4, ΰ und 6 Tagen entnommenen Proben worden die folgenden pll·-¹·/orte und Aktivitäten gefunden:

Zeit (Tage)	0	3	4	5	6
pH-Wert der
Kulturflüsöig-	5,8	5,3	7,1	7,3	7,8
keit
Proteolytische
Aktivität	0	4,8	S3,2	217,6	211,2
(in AE pro ml Kulturflüssig- keit)

DeispieI 3

Kultivierung des Mikroorganismus

In einem Kleiniermentor iTerden unter sterilen Bedingungen 10 1 der in Beispiel 1 beschriebenen Nährlösung mit einer Subwerskultur von fritlrachium album LBDJEIl beimptt. Die Kultur wächst bei 28°ü unter Durchleiten von 5 1 Luft pro Hinute und Rühren mit 430 Umdrehungen pro Minute» In den nach verschiedenen Zeiten entnommenen Proben werden die folgonderi pH-Werte und Aktivitäten gefundan:

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Zeit !Stunden)	ü	24	48	60	73
pll-'/ert der Kulturflüs3ig- koit	5,9	4,0	7,1	7,6	7,8
Proteolytische Aktivität (in AE pro ml Kulturflüssig keit)	0	2,8	84	134	217

In einem analogen Ansatz war der pH-Wert nach 90 Stunden 7,4; die proteolytischo Aktivität betrug 290 AE pro al Kulturflüssigkeit·

Beispiel 4

Abtrennung; dos Itohenzyms.

8,1 1 ICulturfiltrat mit einer proteolytischen Aktivität von 121 AE/ml werden mit 2,02 g CaCl₂ · 2 HgO und soviel festem Trie-hydroxymethyl-aminomethan versetzt, daß der pli-Y/ort 8,0 betragt, und unter vermindertem Druck bei 25 - 28°C auf 940 ml eingeengt. Das Konzentrat wird durch Zentrifugieren geklärt und der Rückstand mit 200 ml einer auf pH 8,0 eingestellten, 0,1 molaren Pufferlösung (Tris-hydroxyiaethyl-aminoniothan/Salzsäuro), die außerdem 0,002 molar an Calciumchlorid ist, ausgewaschen· Das mit dor Waschlösung vereinigte geklärte Konzentrat, das noch 90 ^l/o der im eingesetzten ICulturfiltrat vor— handonen proteolytisehen Aktivität enthält, wird boi 5°ü uit 614 g Ammoniumsulfat versetzt und Über Nacht bei dieser Temperatur stehengelassen. Del· dubei erhaltene Niederschlag

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v/ird durch Dekantieren und Zentrifugieren abgetrennt und in 200 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird filtriert und über Nacht gegen strömendes entsalztes Y/asser dialysiert. Das Dialysat· wird zur Entfärbung axt ECTEOIA-Cellulose behandelt und die erhaltene klare Enzymlösung gefriergetrocknet« Ausbeute 3,0 g Hohenzym mit einer proteolytischen Aktivität von etwa 180 ΛΕ/mg. Dieses Uohenzym ist bei + 4⁰C mindestens

2 Jahre ohne Aktivitätsverlust haltbar und kann für die meisten technischen Verwendungszwecke ohne weitere Aufreinigung eingesetzt werden.

Beispiel 5 Reinigung des ltohonzyms

10 g des nach Deispiel 4 erhaltenen Rohenzyms werden in 95 ral 0,01 molarer Pufferlösung (Trie-hydroxymethyl-aminomethan/Salzsäure), die 0.002 molar an Calciumchlorid ist, gelöst und mit dieser Pufferlösung über eine schwach basische Ionenaustauschersäule aus nit Diätliylaminoäthan modifiziertem Dextrangel chromatographiert. Als erste Komponente werden 3,4 g des reinen erfindungsgeiaäßen proteolytischen Enzyms eluiert, das durch Gefriertrocknung als weißes, kristallines Pulver erhalten wird und eine proteolytische Aktivität von 240 - 270 λ ΛΕ/mg aufweist. Anschließend wird ein Nebenprodukt eluiert (etwa 10 ^cjt des aufgetragenen Rohenzyms), das aus mindestens

3 Komponenten besteht und eine proteolytische Aktivität von 40 - 50 AE/rag besitzt.

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Claims (1)

1. Proteolytisches Enzym, gewonnen aus Kulturen von Mikroorganismen der Gattung Tritirachiun und mit folgenden Eigenschaften:

   (a) Elementaranalysei etwa 41,4 ^c/o Kohlenstoff, 7,1 ^c/e Wasserstoff, 13,3 '/O Stickstoff und 1,5 # Schwefel.

   (b) Molekulargewicht: 20000 bis 30000.

   (c) Infrarotspektrum (vgl. Figur 1 in der Anlage) mit signifikanten Absorptjonsbanden bei 3300, 2970, 1645, 1537, 1514, 1452, 1405, 1238 und 1060 cm"¹.

   (d) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (vgl. Figur 2 in der Anlage) mit einem Absorptionsmaximum bei -36 200 cm" mit einer Extinktion E. '* =8,75.

   (e) Isoelektrischer Punkt bei einem pH von etwa 9,5.

   (f) Proteolytische Aktivität im pH-Bereich von 3,5 bis 12,5.

   (g) Stabilität in gepufferter wässriger Lösung im pH-Bereich von 8 bis 11 in Gegenwart von 1 - 5 · 10~ Mol/l Calciumionen bei 25 C über mindestens 30 Tage.

   (h) Temperaturoptimum dor proteolytischcn Aktivität bei pH 8 bei 65 - 70⁰C.

   Verfahren zur Herstellung eines proteolytisehen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattung Tritirachiuia in einem assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthaltenen Nährmedium kultiviert und anschließend das proteolytische Enzym in an sich bekannter Weise abtrennt.

   3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Tritirachiun album LBIBEIl verwendet.

   4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen bei Temperaturen zwischen 15°C und 32°C, vorzugsweise zwischen 25⁰C und 28⁰C, kultiviert.

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   5. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch ^kennzeichnet, daß ti die Mikroorganismen in einen Näliraediuu nit einen pll-Vert zwischen 5 und 8 kultiviert.

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