DE2524580C2 - Verfahren zur Gewinnung von lipolytischem Enzym - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von lipolytischem EnzymInfo
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Description
| Komponente | % |
| SiO2 | 85,8 |
| Al2O3 | 3,8 |
| Fe2O3 | 1,2 |
| P2O5 | 0,2 |
| TiO2 | 0,2 |
| CaO | 0,5 |
| MgO | 0,6 |
| Na2O | 1,1 |
| K2O | 1,1 |
das einen natürlichen Diatomit darstellt, welcher selektiv
geschürft, getrocknet, vermählen und mit Luft klassiert worden ist und auf einem 105/zm-Sieb einen
Siebrückstand von 1 % ergibt. ■
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorptionsmittelkonzentration
0,5 bis 15Gew.-% des Fermentationswachstumsproduktes beträgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert bei der
Adsorption 5 beträgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert bei der
Eluierung 10 bis 11 beträgt.
Inaktivierung oder Zerstörung mittels Einstellung des pH-Wertes auf 2,0-3,5 bei 20-550C entfernt Gemäß
der DE-OS 22 32 996 werden Lipaseverunreinigungen vom gewünschten Lab durch Einstellung des pH-Wertes
auf 4—6 und anschließendes Filtrieren entfernt
In der US-PS 40 65 580 wird die Herstellung eines lipolytischen Enzym-Aromatisierungssyslems aus Mucor
miehei beschrieben, das die wünschenswerte Eigenschaft
hat, eine größere lipolytische Este rase- als Lipaseenzymaktivität
zu zeigen; d. h, es zeigt ein EA/LA-Verhältnis
über 1. Somit wäre ein praktisches Verfahren zur Gewinnung von lipolytischem Enzym mit den genannten
Eigenschaften des Aromatisierungssystems für die Nahrungsmittelindustrie von großer Bedeutung.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines solchen Gewinnungsverfahrens.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verführen der eingangs
beschriebenen Art mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchsl.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die selektive
Gewinnung des gewünschten lipolytischen Enzyms aus dem Labenzym nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren in quantitativen Ausbeuten möglich ist. Auch die Labausbeute ist ausgezeichnet und ermöglicht dadurch
seine Verwendung als Milchkoaguliierungsenzym gemäß der bereits bekannten Praxis.
Die bevorzugte Diatomeenerde ist ein feiner Diatomit mit einem Siebrückstand von 1 % auf einem 105 μνη-Sieb.
Es ist ein natürlicher Diatomit, der selektiv geschürft, getrocknet, vermählen und mit Luft klassiert
wurde. Seine chemische Analyse wird wie folgt angegeben:
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven und quantitativen Gewinnung von lipolytischem Enzym
aus Lab aus dem Fermentationswachstumsprodukt von Mucor-Arten.
Bekanntlich enthält das Fermentationswachstumsprodukt von Mucor-Arten lipolytische Enzyme in Mischung
mit anderen Enzymen, z. B. Kohlenhydrasen und Proteasen (vgl. US-PS 13 91 219).
Neuerdings ist die Gewinnung wertvoller und technisch wichtiger Milchkoagulierungsenzyme aus Mucor-Arten
beschrieben worden. Typische Arten, aus weichen diese gewöhnlich als mikrobielles Lab (Rennet)
bezeichneten Enzyme erhalten werden, sind Mucor pusillus (vgl. US-PS 31 51 039 und 32 12 905) und Mucor
miehei (vgl. US-PS 35 49 390 und 37 63 010). Gemäß der US-PS 36 16 233 werden unerwünschte lipolytische Enzyme,
die zusammen mit dem Labenzym in Mucor-Arten gebildet werden, von dem gewünschten Lab durch
| Komponente | % |
| SiO2 | 85,8 |
| Al2O3 | 3,8 |
| Fe2O3 | 1,2 |
| P2O5 | 0,2 |
| TiO2 | 0,2 |
| CaO | 0,5 |
| MgO | 0,6 |
| Na2O | 1.1 |
| K2O | 1,1 |
Erfindungsgemäß verwendbare Tonmaterialien sind Montmorillonite und hydratisierte Tonerdesilicate, wie
Bentonit und Kaolin.
Die obigen Adsorptionsmaterialien werden in Konzentrationen von 0,5—15Gew.-°/o, vorzugsweise
1,0—5Gew.-% verwendet. Konzentrationen über 15%
sind unnötig.
Die Adsorptionsstufe kann erfolgen, indem man das Wachstumsprodukt aus der Fermentation der Mucor-Arten auf einen relativ niedrigen pH-Wert einstellt und gründlich mit der Diatomeenerde oder dem Ton bei Zimmertemperatur mischt. Dann wird dan adsorbierte Material vom nicht adsorbierten Labenzymmaterial
Die Adsorptionsstufe kann erfolgen, indem man das Wachstumsprodukt aus der Fermentation der Mucor-Arten auf einen relativ niedrigen pH-Wert einstellt und gründlich mit der Diatomeenerde oder dem Ton bei Zimmertemperatur mischt. Dann wird dan adsorbierte Material vom nicht adsorbierten Labenzymmaterial
z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt Anschließend kann das gewünschte iipoiytische Enzym
vom abgetrennten adsorbierten Material durch Einstellung auf einen relativ hohen pH-Wert und gründliches
Mischen bei Zimmertemperatur eluiert werden (vgl.
In den meisten Fällen ist ein Mischen, z. B. durch etwa 15 Minuten bis 2 Stunden langes Rühren, ausreichend,
um die gewünschte Adsorption und Eluierung zu errei-
chen. Ein Mischen bei Zimmertemperatur, z. B. etwa 20—25° C, ist geeignet, und man braucht die Temperatur
während der Mischstufen nicht zu verringern oder zu erhöhen.
Die Bildung des üpolytischen Enzyms, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen wird, kann
nach den üblichen Fermentationsverfahren erfolgen. So wird z. B. ein assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und
Spurenmineralien enthaltendes Nährmedium mit einer Kultur einer Mucor-Art, insbesondere Mucor miehei,
bebrütet und unter submersen aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von etwa 3—8 und einer Temperatur
von etwa 20—50°C für etwa 2—14 Tage fermentiert
Stämme von Mucor miehei, die in dieser Weise zur Bildung des gewünschten Üpolytischen Enzyms fermentiert
werden können, sind der Öffentlichkeit ohne Einschränkung unter den Bezeichnungen NRRL A13131 und
A13042 bei den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, HL verfügbar. Andere geeignete Stämme
von Mucor miehei und andere Mucor Arten, wie z. B. die Arten pusillus, hiemali, rouxii, genevensis, lamprosporus
und racemosus, sind dem Fachmann geläufig.
Nach der Fermentation kann das lipolytische Enzym direkt aus der Maische, aus der filtrierten Maische oder
aus einem Konzentrat der Gärbrühe gewonnen werden. So kann die Maische direkt verwendet werden, oder
man kann sie z. B. zur Entfernung des Mycels und von anderem festem, aus der Fermentation verbleibendem
Material filtrieren. Oder die Gärbrühe kann z. B. durch Verdampfen konzentriert werden, um das Volumen an
Material zu verringern, worauf sie nach dem erfindungsgemäßen Gewinnungsverfahren verarbeitet werden
kann.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Mucor miehei NRRL A13042 wurde unter aeroben Fermentationsbedingungen bei 37° C und einem pH-Wert
von 6 in einem Produktionstank gezüchtet, der das folgende wäßrige Nährmedium enthielt:
45
| entfettetes Sojabohnenmehl | 4,0% |
| sprühgetrocknete süße Molke | 4,0% |
| mit bakterieller x-Amylase | |
| verflüssigte Maisstärke | . 16,0% |
| Wasser | 76,0% |
100,0%
Die Fermentationsbrühe wurde nach 77-stündiger Fermentation geerntet und das gewünschte lipolytische
Enzym dann wie folgt gewonnen: die Fermentationsbrühe wurde filtriert und auf eine Konzentration von
24° Be eingedampft Dann wurde das filtrierte Evaporat mit Wasser auf 3,0° Βέ eingestellt, und der pH-Wert
wurde mit 2 N NaOH auf 5,0 eingestellt. Dann wurde Bentonit zu 125 g verdünntem Evaporat auf eine Konzentration
von 2,5Gew.-% zugefügt. Die Mischung wurde 1 Stunde bei 250C gerührt und dann in Anwesenheit
von 2,0Gew.-% Filterhilfe (Diatomit mit einem Siebrückstand von 5% auf einem 105/im-Sieb) filtriert.
Der pH-Wert des Filtrates wurde mit 2 N HCl auf 4,0 eingestellt, es wurde auf 14,2 g eingedampft und auf Lab
und lipolytisches Enzym analysiert. Die Analysen zeigten,
daß 72,7% Lab und 0% lipolytisches Enzym gewonnen waren. Der aus der vorangehenden Filterstufe verbliebene
Filterkuchen (12,6 g) wurde erneut in 100 cm3 Wasser suspendiert und mit 1 N NaOH auf einen pH-Wert
von 10,0 eingestellt Die Mischung wurde 1 Stunde bei 23—25° C gerührt Dann wurde. Filterhilfe (Diatomit)
auf eine Konzentration von 3% zugefügt und die Mischung filtriert Anschließend wurde der pH-Wert
mit 2 N HCl auf 4,0 eingestellt auf die sechsfache Konzentration eingedampft und auf lipolytisches Enzym untersucht
Die Analyse zeigte eine Enzymaktivität von 127%.
Das Gewinnungsverfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt wobei jedoch das Ausgangsmaterial auf
6,0° Be verdünnt und anstelle von Bentonit Diatomeenerde verwendet wurde. In einem Versuch unter Verwendung
von 2,5 Gew.-% Diatomeenerde wurden 251% lipolytische Enzymaktivität erhalten, in einem anderen
Versuch mit 5,0 Gew.-% Diatomeenerde wurden 151 % lipolytische Enzymaktivität erhalten.
Die lipolytischen Enzymbestimmungen in den obigen Beispielen 1 und 2 beruhen auf den Enzymbestimmungen
der filtrierten Ausgangsevaporate. Die Enzymbestimmungen erfolgten gemäß den Verfahren in der oben
genannten US-PS 40 65 580 und zeigen ein EA/LA Verhältnis
über 1. Diese Analysen zeigen, daß im gewonnenen Produkt mehr lipolytisches Enzym nach dem angewendeten
Analyseverfahren festgestellt wurde als im Ausgangsmaterial.
Beispiel 1 und 2 wurden wiederholt, wobei die Fermentationen mit einem wäßrigen Nährmedium erfolgten,
das 12% enzymatisch abgebaute Maisstärke, 1,5% Sojabohnenmehl und 3% getrocknete Molke enthielt,
wobei die Fermentationsbrühe nach 114-stündiger Fermentation
geerntet wurde. Gemäß den Gewinnungsverfahren von Beispiel 1 und 2 erhielt man eine ähnliche,
praktisch selektive und quantitative Gewinnung an lipolytischem Enzym.
Aus einer anderen Fermentation von Mucor miehei in einem Produktionstank unter aeroben Bedingungen in
einem geeigneten Nährmedium wurde das erhaltene Wachstumsprodukt mit einem gleichen Volumen Wasser
verdünnt und der pH-Wert mit 1N HCl auf 5,0 eingestellt.
Je 300 g der verdünnten Maische wurden mit (a) 5 Gew.-% Bentonit und (b) 5 Gew.-% Diatomeenerde
wie in Beispiel 1 bzw. 2 behandelt. In jeden Fall (a) und (b) wurden 2Gew.-% Filterhilfe (Diatomit) zugefügt,
das Material wurde filtriert und der Kuchen dann mit Wasser besprüht. Jeder Filterkuchen wurde in drei gleiche
Teile geteilt und in 100 cm3 Wasser pro 25 g Kuchen aufgenommen. Der pH-Wert der drei Anteile wurde mit
2N NaOH auf 10,0, 10,5 bzw. 11,0 eingestellt, und nach 1-stündigem Rühren bei 25° C wurde das Material filtriert
und mit Wasser besprüht. Kombiniertes Filtrat und Waschmaterial wurden mil IN HCl auf einen pH-Wert
von 5,2—5,5 eingestellt und analysiert.
Lab und lipolytisches Enzym in der ursprünglichen verdünnten Maische, im Bentonit- und Diatomeenerde· Filtrat und in den eluierten Bentonit- und Diatomeenerde-Kuchen waren wie folgt:
Lab und lipolytisches Enzym in der ursprünglichen verdünnten Maische, im Bentonit- und Diatomeenerde· Filtrat und in den eluierten Bentonit- und Diatomeenerde-Kuchen waren wie folgt:
Substrat
% Ausbeute Enzym
% Ausbeute
(a) 5% Bentonit-Filtrat 54,4 10
(b) 5% Diatomeenerde- 85,8 11,2 Filtrat
(a) beipH10,0eluierter 127
Bentonit-Kuchen
bei pH 10,5 eluierter 118
bei pH 11,0 eluierter 22,5
(b) Diatomeenerde-Kuchen, 62,2 beipHlO.Oeluiert
beipH10,5eIuiert
beipHll.Oeluiert
Claims (3)
1. Verfahren zur selektiven und quantitativen Gewinnung von üpolytischem Enzym aus Lab aus dem
Fermentationswachstumsprodukt von Mucor-Arten,
dadurch gekennzeichnet, daß man das Fermentationswachstumsprodukt mit Diatomeenerde-
oder Tonadsorptionsmitteln bei einem pH-Wert von 4 bis 6 behandelt und das lipolytische
Enzym aus dem Adsorptionsmittel durch Einstellen des pH-Wertes auf 9 bis 11 eluiert
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Tonadsorptionsmittel Bentonit oder Kaolin verwendet
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Diatomeenerde-Adsorptionsmittel
der folgenden Zusammensetzung verwendet:
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