DE2813247A1

DE2813247A1 - Verfahren zur herstellung von peptidase

Info

Publication number: DE2813247A1
Application number: DE19782813247
Authority: DE
Inventors: Hirofumi Hiraga; Koji Mitsugi; Ryuichi Miyajima; Kanagawa Yokohama
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1977-03-28
Filing date: 1978-03-28
Publication date: 1978-10-05
Also published as: US4228241A; JPS574309B2; JPS53118588A

Description

DA-13 111

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer bemerkenswert stark wirksamen Peptidase aus einem Koji-Schimmelpilz. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren, bei dem ein Koji-Schimmelpilz in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches Fettsäuren mit 14, 16, 18 oder 20 Kohlenstoffatomen, deren Derivate oder ein Pflanzenöl, welches diese Fettsäuren enthält, aufweist und die angereicherte Peptidase aus dem Kulturmedium gewonnen wird.

Ein Koji-Schimmelpilz wurde schon seit alter Zeit zum Brauen von Shoyu, japanischem Sake oder zum Vergären von Bohnenpaste in Japan angewendet und es ist gut bekannt, daß durch Koji-Schimmel erzeugte Peptidase die wichtigste Rolle bei diesem Brau- bzw. Gärverfahren spielt. Eines der größten Probleme der Shoyu-Brauerei besteht darin, daß es sich um ein zeitraubendes Verfahren handelt und gewöhnlich 6 bis 12 Monate erfordert.

Andererseits wurde bereits eine chemisch bearbeitete Sojasauce durch säurekatalysierte Hydrolyse von entfetteten Sojabohnen hergestellt, wobei die Hydrolyse unter strengen Bedingungen unter Anwendung einer großen Menge Chlorwasserstoffsäure bei hohen Temperaturen (100 bis 120⁰C) mehr als 6 Stunden durchgeführt wurde.

Wenn auch bei dem Verfahren der säurekatalysierten Hydrolyse die Hydrolyserate der entfetteten Sojabohnen außerordentlich hoch ist und die Sojabohnen praktisch vollständig hydrolysiert werden, so zeigt doch die chemisch bearbeitete Sojasauce schlechtere Qualität als durch ein Brauverfahren erhaltene Shoyu. Außerdem wurden bei dem bekannten Verfahren gegenüber Säurehydrolyse instabile wertvolle Substanzen, wie Tryptophan und Kohlenhydrate, die in entfetteten Sojabohnen vorliegen, unter Bildung von unerwünschten

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_ 5 —

Substanzen, wie störenden organischen Säuren und gefärbten Materialien, zersetzt.

In jüngerer Zeit hat man versucht, Shoyu mit Hilfe eines enzymkatalysierten Hydrolyseverfahrens (enzymatisches Verfahren) innerhalb kurzer Zeit, wie 2 bis 4 Wochen, herzustellen. Bei diesem Verfahren wurden entfettete Sojabohnen mit Hilfe eines aus Koji-Schimmeipilz erhältlichen Enzyms hydrolysiert und das gebildete Hydrolysat durch Milchsäuregärung und Hefegärung mit einem vorzugsweise shoyuähnlichen Geschmack versehen. Es ist jedoch zu betonen, daß die mit Hilfe des modifizierten enzymatischen Verfahrens erhaltene shoyuähnliche Gewürzsauce sowohl im Hinblick auf den Geschmack, als auch auf das Aroma wegen der langsamen Hydrolyserate von Proteinen zu Aminosäuren, speziell wegen der langsamen Freisetzungsrate von Glutaminsäure, schlechter als Shoyu ist. .

Es wäre zwar zu erwarten, daß man eine wässrige Lösung von Aminosäuren zur medizinischen Anwendung mit-Hilfe einer enzymkatalysiertenHydrolyse von reinen Proteinen, wie Milchcasein und Fibroin, herstellen kann, die praktische Anwendung einer solchen wässrigen Lösung von Aminosäuren wurde jedoch bisher nie verwirklicht. Einer der Gründe, der ihre praktische Anwendung verhindert, liegt zweifellos darin, daß die Hydrolyse des Proteins nicht weit genug fortgeschritten ist. Zu diesem Zweck muß ein Protein so vollständig zu den es aufbauenden Aminosäuren hydrolysiert werden, wie es durch die säurekatalysierte Hydrolyse ermöglicht wird.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Herstellung einer stark wirksamen Peptidase zur Verfügung zu stellen, die befähigt ist, Proteine praktisch vollständig in die Aminosäuren zu hydrolysieren. Diese und andere Aufgaben der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung deutlicher ersichtlich. :

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung einer Peptidase, bei dem ein Koji-Schimmelpilz in einem Nährkulturmedium gezüchtet wird, welches eine oder mehrere., insbesondere mehr als zwei, Fettsäuren mit 14, 16, 18 oder 20 Kohlenstoffatomen, deren Derivate oder ein pflanzliches Gl, welches diese Fettsäuren enthält, aufweist, und die angereicherte Peptidase aus dem Kulturmedium gewonnen wird.

Der erfindungsgemäß verwendete Koji-Schimmelpilz ist ein Fungus, der Aspergillus oryzae und Aspergillus soyae (Synonym von Aspergillus parasiticus) angehört und dieser Pilz ist aus einer handelsüblichen Schimmelpilz-Starterkultur, die in Japan verkauft wird, leicht erhältlich.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist es möglich geworden, unter den Fungi, die aus in Japan handelsüblichen Schimmelpilz-Starterkulturen erhältlich sind, einen Stamm zu selektieren, der zur Bildung einer stärker wirksamen Peptidase befähigt ist.

Im allgemeinen agglomerieren die Mikrobenzellen dieser Koji-Schimmelpilze unter Bildung von dicken quarkähnlichen Massen, wenn sie in einem flüssigen Medium gezüchtet werden, was für die Enzymbildung nicht wünschenswert ist.

Es ist daher vorteilhaft, einen Stamm auszuwählen, der zusätzlich zu seiner ausgezeichneten Fähigkeit, eine stärkere Peptidase zu bilden, in der Flüssigkeitskultur Mikrobenpellets bildet. Dieser Stamm ist aus einer handelsüblichen Schimmelpilz-Starterkultur (japanische Shoyu-Koji) mit Hilfe eines üblichen Einzelzellen-Kolonie-Isolationsverfahrens erhältlich.

So wurde beispielsweise Aspergillus oryzae Ferm-P 4149 (NRRL 11274) mit Hilfe der üblichen Einzelzellen-Kolonie-Isolations-Methode aus dem handelsüblichen Schimmelpilzstarter (hergestellt und vertrieben von Nihon Jozo Kogyo Co., Ltd.) selektiert. Der

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durch die Ferm-P-Nummer und die NRRL-Nummer identifizierte Stamm wurde bei dem Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science & Technology, Chiba-shi Chiba-ken, Japan und der Northern Utilization Research and Development Division, US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und ist von diesen Hinterlegungsstellen erhältlich.

Gemäß einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform wird eine künstliche Mutante, die eine stärkere Peptidase produziert, in einfacher Weise mit Hilfe eines üblichen Mutationsverfahrens induziert, wie durch UV- oder Röntgenbestrahlung oder durch Behandlung mit einem chemischen mutationsauslösenden Mittel, wie NG.

Das erfindungsgemäß eingesetzte Nährmedium muß kein Spezialnährmedium sein, sondern kann eines der üblichen Nährmedien darstellen, die für die Herstellung von proteolytischen Enzymen erhältlich sind und die eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, wie NHz₁NO_x, (NH/,^SO,. Harnstoff, Sojabohnen, Weizenkleie, Pep-

+ + 2+ 2+ 2+ 2+ tone und anorganische Ionen, wie K , Na , Ca ,Mg ,Mn , Zn ,

Fe²⁺, 50^2- oder PO^ enthalten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein flüssiges Kulturmedium angewendet, das 0,5 bis1,5Gew.-% Weizenkleie und 0,5 bis 1,5 % entfettete Sojabohnen enthält.

Die Peptidaseaktivität wird proportional der Konzentration dieser Substrate in gewissem Ausmaß erhöht, die Aktivität steigt jedoch nicht weiter an, wenn das Nährmedium mehr als 4 % dieser Substrate enthält, weil dann die Kulturbrühe dick und breiig wird und nicht mehr für die Enzymbildung geeignet ist.

Die Zugabe von Kohlenhydraten, wie Glucose, Saccharose, Stärke oder Melassen zu dem Medium ist für die Bildung von Peptidase nicht wirksam. Sie ist nur insofern wirksam, als die Menge der

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Mycelien des Fungus auf das zwei- Ms dreifache erhöht wird, jedoch die Peptidaseaktivität steigt dadurch nicht an.

Erfindungsgemäß wird ¥eizen oder ein Gemisch aus Weizen und Weizenkleie als ausgezeichnetes festes Medium eingesetzt.

Zusätze, die dem Nährmedium zugefügt werden, um die Enzymproduktion zu beschleunigen, sind die nachstehenden Fettsäuren mit 14, 16, 18 und 20 Kohlenstoffatomen, ihre Derivate sowie pflanzliche Öle, welche diese Fettsäuren als Bestandteile enthalten.

(1) Fettsäuren :

Myristinsäure (C^), Palmitinsäure (C^g), Stearinsäure (C₁₈), Ölsäure (C₁₈), Linolsäure (C^g), Arachidinsäure (C2q)·

(2) Zuckerester :

Saccharose-monomyristat, Saccharose-monopalmitat, Saccharosemonooleat, Saccharose-monostearat, Saccharose-distearat.

(5) Sorbitanester :

SorMtan-monopalmitat, Sorbitan-monooleat, Sorbitan-monostearat -

(4) Polyoxyäthylen-sorbitan-monopalmitat.

(5) Phospholipide dieser Fettsäuren :

Phosphatidyl-äthanolamin

CH₂OCO-R
R-COO-C-H ₀

CH₂-O-P-OCH₂CH₂-NH₂
OH

Phosphatidyl-cholin (Lecithin)

CH₀OCOR

I
R-COO-C-H _n

₅
OH
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worin R den Rest einer der vorstehend definierten Fettsäuren "bedeutet;
Eilecithin, Sojabohnenlecithin.

(6) Mono-, Di- und Triglyceride dieser Fettsäuren : Glycerinmonostearat.

(7) Pflanzliche Öle, welche diese Fettsäuren in Form der freien Säuren oder der Triglyceride als Bestandteile enthalten : Sojabohnenöl, Maisöl, Kokosnußöl, Saffloröl (mit hohem Ölsäuregehalt), Reiskleieöl, Rapssamenöl, Olivenöl, Baumwollsamenöl, Kapoköl, Sesamöl.

Gemäß der Erfindung werden eines oder mehr als zwei dieser Zusätze zugegeben, deren Mengen 0,5 bis 4,0 Gew.-% betragen. Unter diesen Zusätzen haben die Zuckerester der Fettsäuren spezielle Wirksamkeit, die Mycelien des Koji-Schimmelpilz in die Form von feinen Mikrobenkörnern (50 bis 500 um) in der Flüssigkeitskultur zu überführen, die im allgemeinen zur Enzymherstellung bevorzugt wird, da die Flüssigkeitskultur eines Koji-Schimmelpilzes weit einfacher durchgeführt werden kann und die Peptidaseaktivität erhöht wird, wenn die Mikrobenmycelien in Form von feinen Körnern vorliegen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden daher dem Nährmedium ein Zuckerester einer solchen Fettsäure und ein Pflanzenöl in nahezu der gleichen Menge zugegeben (0,5 bis 1,5 ?$)·

Erfindungsgemäß wird ein Koji-Schimmelpilz aerob in einem flüssigen Kulturmedium, welches diese Zusätze enthält, bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40⁰C und einem pH-Wert iin Bereich von 3,5 bis 8,5 während 2 bis 10 Tagen gezüchtet.

Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein Koji-Schimmelpilz in einem festen Kulturmedium, wie Weizenkleie oder einem Gemisch aus Weizenkleie und entfetteten Sojabohnen in ähnlicher Weise ge-

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züchtet, wie es bei dem in Japan durchgeführten KoJi-Verfahren erfolgt.

Das erfindungsgemäß als Peptidase bezeichnete Enzym ist eine Serie von Peptidasen, die aus einem Koji-Schimmelpilz erhältlich sind, welche verschiedene Arten von Peptiden und Proteinen, mit oder ohne Zugabe von proteolytischen Enzymen, wie Pepsin, Trypsin und anderen Mikrobenproteasen, in die sie aufbauenden Aminosäuren hydrolysieren können.

Anders ausgedrückt, besteht die erfindungsgemäß hergestellte Peptidase aus einem Gemisch von Peptidasen, die aus Koji-Schimmelpilzen erhältlich sind, wie verschiedenen Arten von Leucinamino-Peptidasen (LAPase), Carboxypeptidasen (CPase), Oligopeptidasen, Dipeptidasen, oi-Glutamylaminopeptidase (ccGAPase), Glutaminase, Peptidoglutaminase und Glutaminsäure umlagernde Peptidasen.

Die erfindungsgemäße Peptidase reichert sich nahezu in den feinen Mikrobenkörnern(Zellen) an, wenn diese in einer Flüssigkeitskultur gezüchtet v/erden. Die aus der Kulturbrühe abgetrennten, Peptidase enthaltenden feinen Mikrobenkörner können in vorteilhafter Weise als unbeweglich gemachtes Enzym eingesetzt werden.

Wenn gemäß einer Ausführungsform der Erfindung das erfindungsgemäße Verfahren durch Züchtung in einem festen Kulturmedium durchgeführt wird, so reichern sich die Peptidasen in dem festen Kulturmedium an und können aus diesem leicht mit Wasser oder Pufferlösungen extrahiert und danach mit Hilfe einer üblichen Methode aus dem rohen Extrakt gewonnen werden. Das rohe Enzym kann durch Ausfällen der Enzyme durch Zugabe von anorganischen Salzen, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, oder einem gekühlten organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Isopropanol oder Äthanol und durch Gewinnung des ausgefällten Enzyms, erhalten werden.

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Die Aktivität der erfindungsgemäß erhaltenen Peptidase wird als Gesamtpeptidaseaktivität gegenüber gereinigten Sojabohnenprotei nen, die durch Protease partiell hydrolysiert wurden, angegeben und nach folgender Methode bestimmt :

14 ml einer; 5 %±gen Lösung von gereinigtem Sojabohnenprotein mit einem Proteingehalt von 85 % (Ajipron S₂ der Ajinomoto Co., Inc.)». deren pH-Wert auf 7,0 eingestellt ist, werden in einen 100 ml-Erlenmeyerkolben gegeben, der mit einem Wattepfropfen verschlossen wird, und 15 Minuten auf 120⁰C erhitzt, um die Sterilisation durchzuführen* Zu dieser Substratlösung werden 6,0 g der Kulturbrühe des Koji-Schimmelpilzes (oder 6,0 ml der Enzymlösung) zugegeben und. das Gemisch wird 5 Tage lang unter gelegentlichem Vermischen durch Schütteln bei 4O⁰C stehengelassen. Nach 5-tägiger enzymatischer Reaktion wird der Kolben samt Inhalt während 100 Minuten auf 100⁰C erhitzt und danach wird das Reaktionsgemisch mit Hilfe von Filterpapier Nr. 5B einer normalen Filtration unterworfen, wobei ein klares Filtrat erhalten wird. Die Konzentration an Gesamtstickstoff (GN), des Formalstickstoffes (FN) und der

TT

freigesetzten: Glutaminsäure (G ) werden mit Hilfe der Kjeldahl-Methode, durch Formaltitration und durch die Glutaminsäure-dehydrogenase-Methode bestimmt.

Die Peptidaseaktivität wird ausgedrückt durch das Verhältnis FN/ GN und G /GN ( freigesetzter Anteil der Glutaminsäure ) in Prozent 'ausgedrückt.

Zusätzlich zu der Gesamtpeptidaseaktivität, die vorstehend angegeben ist, wird natürlich die Aktivität jeder Peptidase durch übliche Methoden bestimmt. Jede Peptidaseaktivität des erfindungsgemäß gebildeten Enzyms ist um das etwa 2- bis 6-fache höher als die_: vonEnzymen, die mit Hilfe eines üblichen Verfahrens hergestellt werden.

Sb sind beispielsweise die Aktivität von Glutaminase, LAPase und •-x-GAPäse um das 4- bis 6-fache, das 4- bis 5-fache bzw. das 2-bis 3-fache gegenüber in üblicher Weise erhaltenen Enzymen erhöht.

;■■-:■ r 809S.4Ö/Q35S

Da die Aktivität jeder einzelnen Peptidase stark erhöht ist, ist auch die Gesamtpeptidaseaktivität erhöht. So ist speziell die Peptidaseaktivität des Enzyms, das durch Züchtung eines Koji-Schimmelpilzes in einem flüssigen Kulturmedium, das sowohl ein pflanzliches Öl, als auch einen Zuckerester einer Fettsäure enthält, so stark, daß die Hydrolyse verschiedener Arten von Proteinen in die sie aufbauenden Aminosäuren so vollständig erfolgt, wie mit Hilfe des säurekatalysierten Hydrolyseverfahrens.

Durch Anwendung der erfindungsgemäß hergestellten Peptidase kann ein Aminosäuren enthaltendes Gewürz, welches mit Shoyu vergleichbar ist, hergestellt werden, wenn das mit Hilfe der enzymkatalysierten Hydrolyse von entfetteten Sojabohnen hergestellte Hydrolysat einer Reihe von Aroma- bzw. Geschmacksstoff bildenden Fermentationen, der Milchsäure- und Hefefermentation,unterworfen wird. Darüber hinaus ist mit Hilfe der erfindungsgemäßen Peptidase eine gereinigte wässrige Lösung von Aminosäuren erhältlich, die sich für medizinische Zwecke eignet.

Einzelne Ausführungsformen der Erfindung werden in den nachstehenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Zu 150 g Weizenkleie (hergestellt von der Nisshin Flour Milling Co., Ltd., Tokio) wurden 5,0 1 Wasser und 4,0 ml 30 %±ge NaOH zugegeben und das Gemisch wurde 1,0 Stunden auf 85°C erhitzt. Nach der Extraktion wurden 4,0 1 Weizenkleieextrakt durch Filtration des extraktierten Gemisches mit Filterpapier erhalten.

Dann wurde ein Grundmedium hergestellt, welches den Weizenkleieextrakt und die in Tabelle 1 gezeigten Bestandteile enthielt.

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TABELLE 1

. ;. Bestandteile Menge

Weiζeriklezeextrakt 25 ml

-,- Aölpron E₂ 0,75 g

KH₂PO₄ 0,25 g

: Wasser 25 ml

* : Rohp rot eingehalt 60 %

Zu 50 ml des Grundmediums wurde eine der Fettsäuren, deren Derivat oder eine solche Fettsäure enthaltendes Pflanzenöl in den in Tabellen 2 und 3 gezeigten Mengen gegeben und der pH-Wert jedes flüssigen Mediums wurde auf 6,0 eingestellt.

Dann wurde das flüssige Medium in einen 500 ml-Schüttelkolben gegeben ι
siert.

geben und durch 15 Minuten dauerndes Erhitzen auf 12O⁰C sterili-

Andererseits wurden 20 Stämme von Aspergillus oryzae, deren Mycel bei /der Züchtung in Flüssigkeitskultur in Form von Mikrobenpellets vorlag^ unter 100 Stämmen selektiert, die aus dem handelsüblichen Schimmelpilzstarter isoliert wurden (der Schimmelpilzstarter wird durch die NihonJozo Kogyo Co., Ltd. hergestellt und vertrieben). Unter diesen 20 Stämmen wurde Aspergillus oryzae Nr. 142 Ferm-P 4149 selektiert, der größere Wirksamkeit zur Peptidaseproduktion hat, als jeder andere Stamm.

Der Stamm Nr. 142 wurde dann auf einem Kartoffeldextrose-Schrägagar (pH 6,0) 3 Tage lang bei 3O⁰C gezüchtet, in das vorher hergestellte flüssige Medium eingeimpft und 2 Tage bei 31⁰C unter Schütteln gezüchtet (Schüttelausschlag 6,0 cm, 115 Schwingungen/min,

.':■;"; : 809840/0 95 5

Die Gesamtpeptidaseaktivität gegenüber reinem Sojabohnenprotein jeder Kulturbrühe wurde mit Hilfe der vorher beschriebenen Bestimmungsmethode bestimmt. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt.

TABELLE 2
Wirkungen der Fettsäuren und ihrer Derivate auf die

Fettsäure bzw. Fett- dem Medium züge- Peptidaseaktivität säurederivat setzte Menge {%) FN/GN (%) G /GN (%)

Keine - 55,0 59,0

(1) freie Fettsäuren :

Laurinsäure (CUp) Myristinsäure (C^^) Palmitinsäure (CUg) Stearinsäure (CUq) Ölsäure (CU₈) Linolsäure (CU₈) Arachidinsäure (C₂₀)

(2) Zuckerester :

Saccharose-monopalmitat Saccharose-distearat

(3) Sorbitanester : Sorbitan-monopalmitat

(4) Polyoxyäthylen-sorbitanmonopalmitat

(5) Phospholipide :

Eilecithin

Phosphatidylcholin Phosphatidyl-äthanolamin

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1,5	10,0	20,0
1,0	62,2	82,1
1,5	61,9	81,7
H	61,4	79,5
Il	58,3	75,8
It	58,0	72,2
1,0	62,6	73,6
1,0	60,7	72,2
1,0	60,8	82,1
1,0	62,1	77,9
1,0	61,5	75,0
3,0	60,2	82,6
1,0	58,0	65,3
1,0	57,5	64,3

Peptidaseaktivität	G^H/GN (96)
FN/GN (%)	77,8
60,9	84,6
60,6	81,8
62,5	89,0
62,7	84,1
61,1	81,7
62,3	83,9
61,1	81,9
62,1	72,5
60,9	85,5
62,5

TABELLE 3
Wirkung_von Pflanzenölen_auf_die_Bildung_von_Pe£tidase

Pflanzenöl (Hauptfettsäure)

SojabohnenÖl (Palmitat, Stearat)
Maisöl (Linolat, Oleat)
Kokosnußöl (Palmitat, Oleat)
Reiskleieöl (Oleat, Linolat)
Rapssamenöl (Oleat, Linolat)
Olivenöl· (Oleat)
Saffloröl (Oleat)
Kapoköl (Oleat, Linolat)
Sesamöl (Oleat, Linolat)
Baumwollsamenöl (Linolat, Palmitat)

(Dem flüssigen Kulturmedium wurde 0,5 % des Pflanzenöls zugesetzt) Beispiel 2

500 ml einer wässrigen Lösung, die 5 g NH^NO, und 10 g der in Tabelle 4 gezeigten Fettsäuren in Form des Natriumsalzes enthielt, wurden über 500 g Weizenkleie gesprüht. Das so erhaltene feste Medium wurde in einen 5,0 1-Erlenmeyerkolben gegeben und durch 30-minütiges Erhitzen auf 120⁰C sterilisiert.

Aspergillus oryzae Nr. 142, der vorher auf einem Kartoffeldextrose-Schrägagar 3 Tage bei 30⁰C gezüchtet worden war, wurde in das sterilisierte feste Medium eingeimpft und dieses 3 Tage lang bei 31⁰C stehengelassen.

Zu diesem Kulturmedium wurden 4,0 1 Wasser zugesetzt und das Gemisch wurde 48 Stunden bei 4⁰C stehengelassen, um das gebildete

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Enzym zu extrahieren. Nach dem Extraktionsvorgang wurden durch Filtration des Rohextrakts mit Hilfe von Diatomeenerde und eines Milliporenfilters 3,0 1 aseptischer Enzymextrakt erhalten.

Die Gesamtpeptidaseaktivität des aseptischen Extrakts gegenüber Sojabohnenprotein wurde bestimmt. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

TABELLE 4
¥irkung_d^r_Fettsäuren. §y£_£^ie Bildung der Pep_tidase

Fettsäure Peptidaseaktivitat

FN/GN (Ji) G^H/GN {%)

Keine Myristinsäure Palmitinsäure Stearinsäure Arachidinsäure Ölsäure

Beispiel 3

Stamm Nr. 142 wurde in dem in Tabelle 1 gezeigten flüssigen KuI-turmedium gezüchtet, das 0,5 % des Pflanzenöls und 0,5 % der Zuckerester der Fettsäuren enthielt, die in Tabelle 5 angegeben sind. Die Züchtung erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 1.

Die Peptidaseaktivitat der Kulturbrühe gegenüber reinem Sojabohnenprotein wurde bestimmt und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt .

50,3	47,6
53,9	53,3
57,4	55,3
56,8	56,4
55,1	52,9
53,3	51,5

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	TABELLE 5	Peptidaseaktivitat	60,0
V/irkung der		FN/GII (%) G^H/GN (56)	30,0
Zuckerestern		56,0	89,0
Pflanzenöl	Pflanzenöle bei gemeinsamer Anwendung mit	59,0	92,2
	. auf die Bildung von Peptidase	63,1	87,3
Keines	Zuckerester	62,8	70,0
Reiskleieöl		63,3	83,9
11	Keiner	58,0	91,3
Il	Keiner	62,0	92,3
υ	Di-, Tripalmitat	63,1	86,5
Il	Monostearat	62,4	85,2
Maisöl	Di-, Tristearat	63,2	38,5
Kokosnußöl	Monopalmitat	61,7	84,1
Rapssamenöl	Monopalmitat	62,3	87,9
Olivenöl	Il	61,9
Saffloröl	Il	62,7
Kapoköl	Il
Sesamöl	Il
Baumwollsamenöl	Il
Beispiel 4	It
It

20 1 des in Tabelle 6 unter (A) gezeigten Weizenkleieextrakt-Mediums wurden in einen 30 1-Krugfermenter gegeben und 20 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert.

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- 18 TABELLE 6

Weizenkleieextrakt-Medium	(p.H 6_r0]	(A)	-	1
Bestandteile	Mengen	10 1	(B)	g
	300 g	10	g
Weizenkleieextrakt	100 g	300
Ajipron Ep	200 g	100
KH₂PO₄	150 g	-	1
Sojabohnenöl	10 1	-
Ryoto-Zuckerester S-370*		10
Leitungswasser

* : Saccharose-di-, -tristearat, hergestellt von der Ryoto Co., Inc., Japan.

In das in dem Krugfermenter befindliche sterilisierte Medium wurden 400 ml einer Impfkulturbrühe von Aspergillus oryzae Nr. 142 eingeimpft, die durch Schüttelkultur in gleicher Weise wie in Beispiel 3 beschrieben wurde, gezüchtet worden war, und die Züchtung wurde aerob bei 30⁰C während 72 Stunden unter kräftiger Belüftung (1/1 V.V.M) und unter Rühren mit 100 Upm durchgeführt. Die erhaltene Kulturbrühe wurde dann durch Keiinfreifiltration der Kulturbrühe in eine feuchte Mikrobenkörnerfraktion von 2,0 kg (mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 75 %) und 17,5 1 einer KuIturfiltratfraktion getrennt.

Die enzymatischen Aktivitäten dieser beiden Fraktionen wurden bestimmt. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.

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TABELLE 7
Enzymaktivitäten

Aktivität
Enzymaktivität erfindungsgemäßer Wert Kontrollwert

Kulturfiltratfraktion :	1600 E/ml	63 %	400 E/ml
Proteaseaktivität bei pH 7,0	1770 "	96 %	480 "
Proteaseaktivität bei pH 9,5	Fraktion der feinen Mikrobenkörner :	29,0 E/ml
	Gesamtpeptidaseaktivität (FN/GN)	55,0 E/ml	56 %
" - ; (G^H/GN)		53 %
LAPa se-Aktivität	8,0 E/ml
Glutaminas eaktivität	10,0 E/ml

Die. Enzymaktivitäten des Kontrollversuches in Tabelle 7 sind die Aktivitäten der Kulturbrühe, die in gleicher Weise, jedoch unter ■Verwendung des. flüssigen Kulturmediums (B) gemäß Tabelle 6 erhalten wurde.

Die in Tabelle7 angegebene Glutaminaseaktivität wurde nach folgender Methode bestimmt :

Zu 3,0 ml einer 10 mM wässrigen Lösung von L-Glutaminase (es v/urde eine 0,05 m Phosphatpufferlösung vom pH 7,0 verwendet) wurde
0,2 g der feinen Mikrobenkörner gegeben, nachdem diese mit Hilfe einer aus Glas bestehenden Zerkleinerungsvorrichtung zerkleinert worden waren. Die Inkubationsreaktion erfolgte während 4 Stunden bei 37 G und: wurde dann durch Zugabe von 1 ml einer 4 J-Oigen Essigsäure Io sung unterbrochen.

Dann wurde die Menge der Glutaminsäure bestimmt, die in den klaren Filtrat des Reaktionsgemisches gebildet worden war. Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die Enzymaktivität, die bei :: V 809840/095S

37°C innerhalb von 60 Minuten 1 uMol L-Glutaminsäure freisetzt. Die in Tabelle 7 angegebene LAPase-Aktivität wurde nach folgender Methode bestimmt :

Zu 3,0 ml einer 1 mM wässrigen Lösung von Leucin-paranitroanilid (in einer 0,05 m Phosphatpufferlösung vom pH 7,0) wurde 0,2 ml einer Enzymsuspension zugesetzt, die durch homogenes Zerkleinern der feinen Mikrobenperlen mit Hilfe einer aus Glas bestehenden Homogenzerkleinerungsvorrichtung erhalten worden war. Nach 10-minütigem Stehenlassen bei 37°C wurde die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 1,0 ml einer 40 $igen Essigsäurelösung unterbrochen. Dann wurde die Menge des freigesetzten Paranitroanilids in dem klaren Filtrat des Reaktionsgemisches mit Hilfe der üblichen kolorimetrischen Methode durch Messung des Anstiegs der Absorption bei 405 nm bestimmt.

Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die Enzymaktivität, die zur Hydrolyse von 1 uM Leucin-paranitroanilid bei · 37⁰C während einer Minute befähigt ist. .

Andererseits wurden 21,0 1 angewärmtes-Leitungswasser und 23 g festes Natriumhydroxid zu 3,0 kg zerkleinerten, denaturierten entfetteten Sojabohnen gegeben. Nachdem das Gemisch gut gerührt worden war, wurde ein Anteil von 570 ml der klaren Filtratfraktion zu dem Gemisch gegeben und dieses wurde dann 5 Stunden bei 45°C stehengelassen. Durch Zentrifugieren des Reaktionsgemisches wurden 18,3 1 Sojabohnenextrakt (GN 1,09 g/dl) erhalten. Nach dem Konzentrieren dieses Extrakts auf 12 1 (GN 1,5 g/dl) wurde er in einen 20 1-Krugfermenter gegeben und durch 20 Minuten dauerndes Erhitzen auf 120°C sterilisiert.

Nachdem die Temperatur auf fast 45°C abgefallen war, wurde ein 720 g-Antei'l der feinen Mikroben fraktion zu dem sterilisierten Substrat gegeben und die enzymatische Reaktion wurde in dem Fermenter 5 Tage lang unter kräftigem Rühren bei 45°C durchgeführt. Dann wurde das Hydrolysat zentrifugiert, wobei ein unlös-

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licher Rückstand entfernt wurde. Auf diese Weise wurden 11,7 1 einer Hydrolysatlösung erhalten, die folgende Analysenwerte zeig te : GN : 1,47 g/dl; FN/GN : 68,5 %; G^H/GN : 110 % und NH₃-N/ GN : 13,6 %.

Diese Hydrolysatlösung hatte einen starken, delikaten Geschmack und eignete sich als Rohmaterial für ein Aminosäuregewürζ.

Ein Vergleich der Hydrolyserate dieser Hydrolysatlösung mit den hochwertigen Handelsprodukten Yamasa Shoyu (hergestellt von der Yamasa Shoyu Co., Ltd., Choshi-shi, Japan) und Mieki (handelsübliche chemisch bearbeitete Sojasauce, hergestellt durch Ajinomoto Co., Inc.) wird in Tabelle 8 gegeben.

TABELLE 8

Aminosäure-Gewürz Hydrolyserate

FN/GN '(%) G^H/GN (%) NH,-N/GN

Kontrollprobe * 52,0 56,0 13

erfindungsgemäße Enzym-Hydrolyselösung 68,5 110,0 13,6

Yamasa-Shoyu ' 55,5 70,5

Mieki 72,0 120,0

* Die Kontroilösung war eine Enzym-Hydrolyselösung, die in gleicher Weise wie erfindungsgeraäß, jedoch unter Verwendung des Mediums (B) für die Enzymproduktion, erhalten worden war.

Beispiel 5

Dem in Tabelle 1 gezeigten Grundmedium wurden 1,0 % Ryoto-Zuckerester p-1570 und 1,0 % gereinigtes Reiskleieöl zugesetzt und dann wurde Aspergillus oryzae Ferm-P 4149 in gleicher Weise· wie in

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Beispiel 1 in dem Medium gezüchtet.

500 ml der so erhaltenen Kulturbrühe wurden dann in 2 Fraktionen, d.h. in 400 ml einer klaren Filtratfraktion xmd 100 g einer feinen Mikrobenkörnerfraktion getrennt, was durch Keimfreifiltration erfolgte .

40 ml einer 5 %igen Lösung (pH 7,0) von gereinigtem Sojabohnenprotein mit einem Proteingehalt von 85 % (Ajipron S₂ der Ajinomoto Co., Inc.) wurden in einen 100 ml-Erlenmeyerkolben gegeben und 15 Minuten auf 12O⁰C erhitzt. Zu dieser Substratlösung wurde ein 10 ml-Anteil des klaren Filtrats und eine festgesetzte Menge der feinen Mikrobenkörner gegeben. Dann wurde das Gemisch 5 Tage lang bei 40⁰C stehengelassen und die Hydrolyserate des Sojabohnenproteins wurde gemessen.

Als Blindversuch wurde die.gleiche Inkubierung durchgeführt, wobei jedoch anstelle der Lösung von Ajipron S₂ sterilisiertes V/asser verwendet wurde, und die Werte von GN, FN des klaren Filtrats wurden bestimmt. Diese Werte wurden als Blindwerte abgezogen. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 1 aufgetragen. In Fig. 1 zeigen die Zahlenwerte der Abszisse das Verhältnis des Trockenzellengewicht: (TZG) zu der Konzentration von GN des Reaktionsgemisches an und die Zahlenwerte der Ordinate sind die prozentualen Werte der Verhältnisse von G^H/GN und FN/GN.

Wie in Fig. 1 gezeigt ist, erreicht die Hydrolyserate, ausgedrückt als FN/GN und G^H/GN Werte von 72 % bzw. 120 %, wenn mehr als 3 TZG/GN der feinen Mikrobenkörner verwendet werden und es ist zu bemerken, daß Sojabohnenprotein mit Hilfe des enzymatischem Verfahrens ebenso vollständig hydrolysiert werden kann, wie mit Hilfe der Säurehydrolysemethode.

Beispiel 6

Milchcasein mit einem GN-Gehalt von 14,7 % (hergestellt von Merk & Co., Inc.), Weizengluten (hergestellt von der Ezaki Glico Co.,

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Ltd.,Osaka, Japan) und Ajipron Sp wurden in destilliertem Wasser gelöst, wobei jeweils eine 5 %ige Lösung (pH 7,0) hergestellt .wurde.-

Je 40 ml dieser Proteinlösungen wurden in 100 ml-Erlenmeyerkolben gegeben und 15 Minuten lang auf 120⁰C erhitzt.

Danach wurden 3,4 g der feuchten feinen Mikrobenkörner (Feuchtigkeitsgehalt 75 %)t die in gleicher Weise wie in Beispiel 5 hergestellt worden waren, zu diesen drei Substratlösungen zugefügt. Die'Enzymreaktion würde 5 Tage bei 4O⁰C unter gelegentlichem Rühren durchgeführt. Danach wurde jeder Erlenmeyerkolben samt Inhalt 10 Minuten lang auf 100⁰C erhitzt und das erhitzte Reaktions-'gemisch wurde dann mit Filterpapier Nr. 5B filtriert, wobei ein klares Filtrat erhalten wurde. Die Hydrolyseraten wurden bestimmt und sind in Tabelle 9 angegeben.

	TABELLE	9	enzvmatisehen	Verfahren
Hvdrolvserate d	.er Proteine	bei dem	Hydrolyserate (90 G^H/GN (%:	) NH₃-N/GN (#)
Substrat	GN (g/dl)	FN/GN

Milchcas.ein	(E)*	0,634	72,4	137	8,3
	(A)**	Il	(72,0)	140	12,0
Weizengluten	(E)	0,520	71,3	232	27,5
	(A)	Il	(73,2)	234	20,1
Ajipron S₂	(E)	0,544	71,5	118	12,0
	(A)	Il	(72,0)	120	10,9

* (E) : Enzymatisehes Hydrolyseverfahren

**(A) : Säurehydrolyseverfahren (Hydrolyse mit 6n HCl bei 120⁰C während 24 Stunden)

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Die Aminosäuregehalte dieser Aminosäurelösungen wurden mit Hilfe eines Aminosäure-Autoanalysators■(Typ KLA 5 der Hitachi, Ltd., Tokio} bestimmt.. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengefaßt.

	Aminosäure-Analyse^	ι S₂	TABELLE '	(a)	;/dl\|^GK £	g/dl) X 10	CA)
	Ajipror	(B-Y	to	-		Viel ζ englut en	-
	CE)*	-	als Aminosäure £g	493	CE)	112
	85	390	Milchca sein	176	60	141
Try	39 0	165	CK)	233	127	237
Lys	165	510	. 128	469	117	237
His	•515	740	524	270	230	183
Arg	720	260	184	368	232	340
Asp	275	325	247	I 400	169	2 340
Thr	365	1 200	481	735	306	93 0
Ser	1 190	385	279	152	2 219	237
GIu	315	270	418	184	760	189
Pro	245	298	1 367	16	190	131
GIy	330	40	722	421	188	289
Ala	40	305	127	183	&8	117
Cy s	345	22	218 .	375	278	264
VaI	103	245	15	597	123	289
Met	328	477	420	230	238	237
I leu-	520·	185	195	311	423	361
Leu	180	320	371		199
Tyr	320	623	306
Phe	117
	226

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* : Enzymatisehes Verfahren

**: Säurefcatalysiertes Hydrolyseverfahren

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Leers eite

Claims

PATENTANWÄI T£ SCHIFF ν. F-CtNER STREHL SC H Ü BEL-HO PF EBBINGHAUS FINCK MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÜNCHEN ΘΟ POSTADRESSE: POSTFACH 35 O1 60, D-8000 MÖNCHEN 95 KARL -LUOWIS SCHIFF DIPL. CHEM. DR. ALEXANDER V. FÜNER DIPL. INS. PHTER STREHL DIPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜBEL-HOPJ= DIPL. ING. DIETER EBBINSHAUS DR. ING. DIETER FINCR TELEFON (Ο89) 18 50 54 TELEX 5-23565 AURO D TELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN Λ : 28. März 1978 AJINOMOTOCO., INC. DA-13 111 Verfahren zur Herstellung von Peptidase PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung einer zur Hydrolyse von Proteinen in die zugrundeliegenden Aminosäuren befähigten Peptidase aus einem Peptidase bildenden Fadenschimmel, der Aspergillus oryzae oder Aspergillus sojae angehört, durch Züchtung dieses Fadenschimmels in einem übliche Nährstoffe enthaltenden Kulturmedium bis zur Anreicherung der Peptidase und Gewinnung der Peptidase aus dem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet , daß man dem Kulturmedium eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren mit 14, .16,- 18 oder 20 Kohlenstoffatomen oder Derivate

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dieser Fettsäuren zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fettsäure Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure oder Arachidinsäure verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fettsäurederivate Zuckerester, Sor-Mtanester, Polyoxyäthylensorbitanester oder Glycerinester der Fettsäuren, Phospholipide oder Pflanzenöle, welche diese Fettsäuren als Bestandteile enthalten, verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pflanzenöl Sojabohnenöl, Maisöl, Kokosnußöl, Reisöl, Rapssamenöl, Olivenöl, Kapoköl, Sesamöl, Baumwollsamenöl oder Saffloröl verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phospholipid Phosphatidyl-äthanolamin, Phosphatidylcholin, Lecithin oder ein Gemisch dieser Verbindungen verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man ein flüssiges Kulturmedium verwendet, dem ein Fettsäure-Zuckerester zugesetzt ist, um die Zellen des Fungus in die Form von feinen Mikrobenperlen zu bringen.

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7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein flüssiges Kulturmedium verwendet, dem ein Gemisch aus Pflanzenöl und Zuckerester einer Fettsäure zugesetzt ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch g e kenn ζ e i c h η e t , daß man ein flüssiges Kulturmedium verwendet, dem 0,5 bis 4,0 Gew.-^ eines Gemisches aus Weizenkleie und entfetteten Sojabohnen zugesetzt sind.

9- Verwendung einer nach einem der Ansprüche 1 bis 8 hergestellten Peptidase zur Herstellung einer Aminosäurelösung durch Hydrolyse von Proteinen.

10. Verwendung nach Anspruch 9 zur Herstellung einer Aminosäuren enthaltenden Gewürzsauce.

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