DE2417291C3 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von a-Galactosidase durch Kultivierung
eines Mikroorganismus in einem Milieu, welches mindestens einen Zucker enthält, der mindestens eine a-D-Galactopyranosylbindung
aufweist.
Es ist allgemein bekannt, daß α-Galactosidase, ein
Enzym, welches Galactose enthaltende Oligosaccharide zu hydrolysieren vermag, d. h. Zucker, die mindestens
eine a-D-Galactopyranosylbindung enthalten
(das sind also blähende Zucker, wie z. B. Stachyose oder Raffinose), eine wichtige industrielle Rolle auf
dem Gebiet der Herstellung von Nahrungsmittel auf der Basis von Hülsenfrüchten und bei der Herstellung
von Rübenzucker spielen kann.
Von den Hülsenfrüchten werden insbesondere Sojabohnen in großen Mengen zur Ernährung von Vieh
verwendet. Außerdem ersetzt es mehr und mehr vollständig oder einen Teil der Nahrungsmittel auf
Fleischbasis und Milchprodukte, die für den Menschen bestimmt sind. Die Assimilationsschwierigkeiten,
die auf die Anwesenheit von nicht-resorbierbaren Oligosacchariden zurückgehen, und die Blähungserscheinungen
können weitgehend durch eine Behandlung des Ausgangsmaterials, wie z. B. entfettetes Sojamehl,
mit Hilfe von enzymatischen Präparaten mikrowellen Ursprungs, die «-Galactosidase enthalten,
beseitigt werden.
Weiterhin wird die Erzeugung von Saccharose aus Zuckerrüben durch die Anwesenheit von Raffinose
gestört, welche die normale Kristallisation von Saccharose inhibiert. Ein bekanntes Verfahren zur Erhöhung
der Ausbeute an Saccharose bei Verwendung von Zuckerrüben als Ausgangsmaterial besteht darin,
den Melassen oder behandelten Rüben a-Galactosidase zuzusetzen, welche die Raffinose in Saccharose
und Galactose zersetzt.
Es ist bekannt, daß gewisse Mikroorganismen in Medien, die ein Galacto-OIigosaccharid, wie z. B.
Raffinose oder Lactose, enthalten, gute Erzeuger von a-Galactosidase sind. Für die Kultivierung solcher
Mikroorganismen sind verschiedene Kulturmedien bekanntgeworden, die z. B. auf einer Zusammensetzung
aus Sojapulver, Reiskleie und Wasser basieren und die an Raffinose angereichert sind.
Aus der US-PS 3 562113 ist es bekannt, zur Erzeugung
von a-Galactosidase den Mikroorganismus E. coli subsp. communior ATCC 7009 zu verwenden.
Aus der DE-AS 1642581 ist für den gleichen Zweck
die Verwendung des Mikroorganismus Mortierella vinacea var Raffinoseverwerter ATCC 20034 zu verwenden.
Zwar ver/nögen diese Mikroorganismen beträchtliche Mengen a-Galactosidase zu erzeugen,
trotzdem läßt die Bildungsgeschwindigkeit zu wünschen übrig. Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde,
ein Verfahren zu schaffen, das eine raschere Bildung von a-Galactosidase ermöglicht. Zur Lösung dieser
Aufgabe wird das in den vorstehend beschriebenen Ansprüchen beschriebene Verfahren vorgeschlagen.
Wie in der US-PS 3562113 berichtet wird, kann bei dem dort beschriebenen Verfahren eine a-Galactosidaseaktivität
von 22250 U/50 ml Kulturmedium erreicht werden. Bei Verwendung des Mikroorganismus
Penicillium duponti ATCC 10518 wird unter gleichen Versuchsbedingungen jedoch eine Aktivität
von 28000 U/50 ml Kulturmedium erreicht. Noch günstiger fällt ein Vergleich des erfindungsgemäßen
Verfahrens mit dem aus der DE-AS 1642581 bekannten Verfahren aus. Hierzu wurden die Mikroorganismen
M. vinacea ATCC 20034 und P. duponti ATCC 10518 unter Verwendung von Stachyose als
Substrat verglichen. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wurde in einer Zeit von 24 st eine Aktivität
von 45 000 U/l erreicht, während bei Verwendung des in der DE-AS 1642581 genannten Mikroorganismus
erst in 72 st eine Aktivität von nur 1800 U/l erreicht wurde. (1 U = 1 μg an reduzierenden Gruppen, die
aus einer 0,05 %igen Stachyoselösung bei einem pH von 6,2 in 30 min bei 55° C in Freifcjit gesetzt werden.)
E<n besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß als Nährmedium
ein Wasser verwendet werden kann, das beim Bleichen von Gemüse, insbesondere weißen Bohnen, vor
der Verarbeitung in Konserven gedient hat. Es hat sich gezeigt, daß die gebildete a-Galactosidase nicht
von Invcrtase begleitet ist, die unglücklicherweise Saccharose von Zuckerrüben abbaut. Außerdem ist
auch keine Lipase enthalten, welche den Geschmack und den Geruch von Produkten auf Sojabasis in ungünstiger
Weise beeinträchtigen.
Vorzugsweise ist das Kulturmedium ein Bleichwasser von weißen Bohnen, das gegebenenfalls konzentriert
ist. Es kann je Liter Wasser 6 bis 20 g Trockenfeststoffe enthalten, die zu 30-40 Gew.% aus
Zuckern, 2-5 Gew.% gesamtem Stickstoff, 12-20
Gew,% Mpiden und 13-18 Gew.% Asche besteht.
Die Zucker können zu 30-40% aus Stachyose, 40-50% Saccharose, 7-9% Raffinose und 1,5 bis
3,5% reduzierenden Zuckern bestehen.
Der pH des Mediums kann auf einen Wert zwischen 6 und 7 eingestellt werden. Die Fermentation kann
unter Rühren während 24 bis 48 Stunden bei einer Temperatur von 40 bis 50° C ausgeführt werden.
Das Enzym wird in den Zellen des Mikroorganismus synthetisiert. Wenn das Mycel, beispielsweise
durch Filtration, vom Kulturmedium abgetrennt wird, dann findet man keine extracellulare a-Galactosidase
im Filtrat. Als enzymatisches Präparat kann man das Mycel selbst oder einen Mycelextrakt gewinnen. Im
ersten Fall wird vorteilhafterweise das vom Medium abgetrennte und gewaschene Mycel zerrieben. Im
zweiten Fall kann man das Mycel in einem Puffer bei einem pH zwischen 5,5 und 7,5 homogenisieren und
zentrifugieren, worauf man den Überstand abtrennt. Die a-Galactosidaseaktivität des letzteren ist genauso
gut wie diejenige des Mycels selbst. Ein kleiner Unterschied kann sich auf Grund gewisser Verluste während
der Homogenisation ergeben. Das Mycel wie das Enzym können in einer lyophilisierten Form konserviert
werden, wobei ihre Eigenschaften nur gering verschlechtert werden.
Das Verfahren gestattet die Herstellung einer Biomasse, deren Trockengewicht je Litsr Kulturbouillon
in der Größenordnung von 2 bis 3 g liegt. Wenn man eine a-Galactosidaseaktivitätseinheit (U) als diejenige
Menge Enzym definiert, die 1 μg reduzierende Gruppen von einer 0,05%igen Stachyoselösung in 30
Minuten in Freihe;t setzt, dann ergibt sich, daß die
Aktivität des nicht-homooenisier'en Mycels, das
durch das erfindungsgemäß·; Verfahren erhalten wird,
45000 U/g trockenes Mycel erreiche kann und daß
die Aktivität des Mycels nach der homogenisierung 42000 U/g trockenes Mycel erreichen kann. Diese
Aktivität eröffnet vorzügliche industrielle Perspektiven. Anwendungsversuche, nämlich die Verwendung
des lyophilisierten Enzyms für die Behandlung einer Sojamilch und die Verwendung des lyophilisierten
Mycels zum Abbau von Raffinose in einem Zuckerrübensaft haben durchaus vorzügliche Resultate ergeben.
Die vorliegende Erfindung wird nun an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert:
Ein Bleichwasser von weißen Bohnen (Phaseolus vulgaris) zeigt die folgende Zusammensetzung:
Stachyose 1,0 g/l
Stachyose 1,0 g/l
Raffinose 0,2 g/l
andere Zucker 1,6 g/l
Gesamtstickstoff 0,4 g/l
Lipide 1,7 g/l
Asche 1,1 g/l
Der pH dieses Wassers wird auf 6,5 eingestellt und in 2 Liter-Flaschen in einer Menge von 500 ml je Flasche
abgefüllt. In die Flaschen wird ein Inoculum des Pilzes Penicillium duponti (Talaromyces thermophilus)
(ATCC 10518, CBS 23658) eingebracht. Die
inoculierten Flaschen werden in einem Schüttler mit 120 Drehbewegungen/min 24 Stunden lang bei 45 ° C
bewegt. Die Kulturbouillon wird durch Absaugen auf einer gewöhnlichen Glasfritte abfiltriert. Das Mycel
wird in einer Menge von 2,7 g Trockenfeststoffe/l Bouillon erhalten. Ein Versuch an Stachyose ergibt,
daß die p-Galactosidaseaktivität des so erhaltenen
Mycels 45 000 U/g trockenes Mycel beträgt, wobei eine Aktivitätseinheit (U) definiert ist als die Enzym«
menge, die in 30 Minuten aus einer 0,05%igen Sm-' chyciselösung 1 μg reduzierende Gruppen in Freiheit
setzt.
Ein Bleichwasser von weißen Bohnen besitzt die
ι'i folgende Zusammensetzung:
Stachyose 1.2j»/l
Raffinose 0,31>/1
andere Zucker 2,1 jj/1
Gesamtstickstoff 0,4 g/l
'· Lipide 1,3 g/l
Asche 1,8 g/l
in diesem Wasser wird der Pilz Penicillium duponti
(ATCC 10518) unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 kultiviert. Das während einer 48stündi-
-1» gen Kultivierung erhaltene Mycel macht 2,9 g Trokkenfeststoffe
je Liter Kultur aus. Nch Lyophilisierung des Mycels zeigt dieses eine an Stachyose getestete
Aktivität von 39000 U/g Trockenfestsloffe.
r, Beispiel 3
Ein Bleichwasser von weißen Bohnen, welches die gleiche Ausgangszusammensetzung wie in Beispiel 2
aufweist, wird einer Konzentrierung unterworfen, während der das Volumen auf die Hälfte verringert
i» wird. Der Pilz Penicillium duponti (ATCC 10518)
wird in diesem Medium kultiviert, welches die doppelte Konzentration an Nährelementen enthält, wie
das in Beispiel 2 genannte Medium. Die Fermentationsbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 1.
i> Das nach 48 Stunden Kultivierung erhaltene Mycel
enthält 5,5 g Trockenfeststoffe je Liter Kulturmedium. Nach Lyophilisierung besitzt das an Stachyose
getestete Mycel eine Aktivität von 34000 U/g Trokkenfeststoffe.
Ein Mycel von Penicillium duponti (ATCC 10518) wird gemäß Beispiel 1 hergestellt. Dieses Mycel wird
in einem 0,05 m Acetatpuffer mit pH 6 homogenisiert. ■»>
Hierauf wird mit 23000 U/min 60 Minuten lang zentrifugiert.
Der Überstand wird gewonnen. Die Aktivität des Überstands gegenüber den folgenden Substraten
wird getestet.
Saccharose
Raffinose
Stachyose
4. 4-Nitrophenyl-/3-D-glucopyranosid
5. 2-Nitrophenyl-/3-D-galactopyranosid
6 2-Nitrophenyla-D-galactopyranosid
6 2-Nitrophenyla-D-galactopyranosid
7. Azocoll
8. Olivenöl
Bei den Substraten 1,5,7 und 8 wird keinerlei Aktivität
festgestellt. Der Überstand enthält keine Invcrtase,
keine /3-Galactosidase, keine Protease und keine Lipase. Er enthält eine a-Galactosidase und eine /S-Glucosidase.
Die a-Galactoseaktivität des Überstands bei Stachyose ist 42 000 Ü gemäß obiger Definition.
Es wird ein Mycel von Penicillium duponti (ATCC 10518) hergestellt, wie es in Beispiel 2 beschrieben
ist. Dieses Mycel wird in einem 0,05 m Acetatpuffer
mit pH 6 homogenisiert. Hierauf wird 3(J Minuten lang mit 23000 U/min zentrifugiert. Die a-Galactasidaseaktivität
des Überstands beträgt, an Stachyose getestet, 40000 U.
B ei spie! 6
Zu 500 ml Sojamilch, die 3,7% Stachyose enthält, werden 100 mg des Enzyms oder Überstands zugegeben,
das bzw. der gemäß Beispiel 4 hergestellt und dann lyophilisiert worden ist. Die enzymavische Behandlung
wird während 30 Minuten bei 55° C durchgeführt. Nach der Behandlung ist der Gehalt an Stachyose
in der Sojamilch auf 40% reduziert, jedoch ist der Geschmack der Milch praktisch nicht verändert.
7m 200 ml eines Zuckerrübensafts, der 22% Saccharose
und 2% Raffinose enthält, werden 1 g des gemäß Beispiel 1 hergestellten Mycelszugegeben. Die
enzymatische Behandlung wird während 24 Stunden fortgesetzt, wobei fortlaufend der Abbau der Raffinose
beobachtet wird. Nach ungefähr 1 Stunde sind 40%, nach ungefähr 2 '/, Stunden 60% und nach ungefähr
4 Stunden 80% abgebaut. Nach 8 Stunden ergibt sich eine Stabilisierung bei etwa 85%.
Claims (7)
1. Verfahren zur Herstellung von a-Galactosidase durch Kultivierung eines Mikroorganismus
in einem Medium, welches mindestens einen Zukker enthält, der mindestens eine a-D-Galactopyranosylbindung
aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man den Pilz Penicülium duponti
in wäßriger Suspension kultiviert und das so erhaltene Mycel gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, daß als Kulturmedium ein Bleichwasser von weißen Bohnen
verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium 6 bis 20 g
Trockenfeststoffe/l Wasser enthält und daß die Trockenfeststoffe 30 bis. 40 Gew.% Zucker und
2 bis 5 Gew.% Stickstoff enthalten.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zucker zu 30 bis 40% Stachyose,
40 bis 50% Saccharose, 7 bis 9% Raffinose und 1,5 bis 3,5% reduzierenden Zuckern
bestehen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des Mediums auf einen
Wert zwischen 6 und 7 eingestellt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß während der Fermentiemng
das Medium auf eine Temperatur von 40 bis 50° C gehalten wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation 24 bis 48
Stunden durchgeführt wird.
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