DE2502896A1

DE2502896A1 - Verfahren zur herstellung von alpha-galactosidase

Info

Publication number: DE2502896A1
Application number: DE19752502896
Authority: DE
Inventors: Itiro Kagaya; Minoru Miura; Shogo Miyatani; Shigeyoshi Narita; Masami Sasaki; Yasunobu Suzuki; Shuji Tanaka; Kenichi Terayama; Masayuki Watanabe
Original assignee: Hokkaido Sugar Co Ltd
Current assignee: Hokkaido Sugar Co Ltd
Priority date: 1974-01-28
Filing date: 1975-01-24
Publication date: 1975-07-31
Also published as: GB1459364A; BE824881A; JPS574307B2; FR2259150A1; JPS50111280A; SU582773A3; US3894913A; FR2259150B1

Description

MÜULER-BORE · GROENINC4 ·ÜEUFEL· · SCHÖN · HERTEL

MÜNCHEN - BRAUNSCHWEIG - KÖLN

2 h. M. WS -

DR- W. MÜLLER-BOR&· BRAUNSCHWEIQ H. W. QROENINO, DlPL-INQ. · MÜNCHEN OR. P. DEUFEl., DlPL-CHEM.* MÜNCHEN DR. A. SCHÖN, DIPU-CHEM. · MÜNCHEN. WERNER HERTEL, DtPU-PHVS. · KÖLN

D/S/Gl - H 1212

Hokkaido Sugar Co., Ltd., Tok±o / Japan Verfahren zur Herstellung von cU-Galactosidase

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ä>Galactosidase durch Züchten eines Schimmelpilzes. Insbesondere befasst sich die Erfindung mit einem Verfahren zur Herstellung vonotrGalactosidase durch Züchten eines Schimmelpilzes, wobei die a^~Galactosidase-Aktivität des Enzyms erheblich durch die Zugabe bestimmter Typen organischer Säuren zu dem Medium erhöht wird, in welchem die Züchtung durchgeführt wird.

i^-Galactosidase ist als Enzym bekannt, welches Raffinose zu Sucrose und Galactose zu hydrolysieren vermag. Dieses Enzym wird in breitem Umfange bei der Zuckerrübenproduktion eingesetzt. Ferner wird es häufig als Reagens zur Bestimmung von Raffinosegehalten sowie als Reagens zur Bestimmung chemischer Strukturen von Verbindungen eingesetzt. Wird die öL-Galactosidase für die vorstehend erwähnten Zwecke verwendet, dann soll das Enzym eine starke äz-Galactosidase-Aktivität aufweisen, bezüglich der Invertaseaktxvität, die gleichzeitig auftritt, jedoch schwach ausgeprägt sein. Als Schimmelpilz, welcher ein Enzym zu erzeugen vermag, das eine starke oU-Galactosidase-Aktivität

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mit einer schwachen Invertaseaktivitat i-ⁿ sich vereinigt, ist Mortierella vinacea var. (Raffinoseverbraucher) (ATCC 20034) (ÜS-PS 3 647 625) bekannt. Andere Schimmelpilze, die ein ähnliches Verhalten zeigen, sind Stämme, welche zu dem Genus Absidia gehören, wie beispielsweise Absidia lichtheimi (Lucet et Costantin) Lendner (IFO 4009), Absidia lichtheimi (Lucet et Costantin) Lendner (IFO 4010) und Absidia reflexa van Tieghem (IFO 5874) sowie Stämme, die zu dem Genus Circinella gehören, wie beispielsweise Circinella muscae (Sorokine) Berlese et de Toni (Circinella sydowi Lendner) (IFO 4457) und Circinella mucoroides Saito (Circinella chinensis Naganishi et Kojiro) (IFO 4453) sowie Circinella muscae (Berlese et de Toni) nova typica coreanus (ATCC 20394), der kürzlich gefunden worden ist.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von λ-Galactosidase durch Züchten eines Schimmelpilzes, wobei bei diesem Verfahren die <i-Galactosidase-Aktivitat des Enzyms verbessert werden soll, das innerhalb der Myzeln des Schimmelpilzes erzeugt wird.

Diese Aufgabe wird bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens dadurch gelöst, dass ein Medium, das zum Züchten eines öL-Galactosidase-erzeugenden Schimmelpilzes eingesetzt wird, mit 0,2 bis 1,0 %, bezogen auf das Medium, an organischen Säuren, wie Zitronensäure, Milchsäure oder Glykolsäure, versetzt wird. Die ^-Galactosidase-Aktivität des anschliessend zu erzeugenden Enzyms lässt sich merklich durch die Zugabe dieser organischen Säuren als Promotoren zu dem bekannten Medium erhöhen. Die erhöhte λ-Galactosidase-Aktivitat wirkt sich bei dem Verwendungszweck, dem das Enzym zugeführt v/lrd, sehr vorteilhaft aus, da sie eine Verminderung der erforderlichen Enzyinmenge bedingt und auch die handhabung des Enzyms bei der in Frage kommenden Reaktion erleichtert.

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Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung sowie der Schilderung bevorzugter Ausführungsformen hervor.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass die oU-Galactosidase-Aktivität von Enzymen, die innerhalb der Myzeln bekannter Schimmelpilze erzeugt werden, merklich dadurch verbessert werden kann, dass bekannten Züchtungsmedien organische Säuren zugesetzt werden, wie beispielsweise Zitronensäure, Milchsäure oder Glykolsäure.

Das erfindungsgemasse Verfahren kann zwar auf alle &-Galactosidase-erzeugenden Schimmelpilze ausnahmslos angewendet werden, es ist jedoch besonders wirksam bei einer Anwendung auf Schimmelpilze des Genus Absidia sowie des Genus Circinella. Als Stämme des Genus Absidia, auf welche die Erfindung in wirksamer Weise anwendbar ist, seien Absidia lichtheimi (Lucet et Costantin) Lendner (IFO 4009), Absidia reflexa van Tieghem (IFO 5874), Absidia hyalospora (Saito) Lendner (IFO 8082), Absidia ramosa (Vuillemin) Lendner (IFO 8083), Absidia regnieri (Lucet et Costantin) Lendner (IFO 8084), Absidia griseola (ATCC 20430) sowie Absidia griseola var. iguchii (ATCC 20431) als Beispiele erwähnt. Beispiele für Stämme des Genus Circinella sind Circinella muscae (Sorokine) Berlese et de Toni (CV. Hesseltine) (IFO 6410), Circinella muscae (Sorokine) Berlese et de Toni (Circinella lydowi Lendner) (IFO 4457), Circinella mucoroides Saito (Circinella chinensis Naganishi et Kojiro) (IFO 4453), Circinella mucoroides Saito (K. Saito) (IFO 4455) und Circinella muscae (Berlese et de Toni) nova typica coreanus

(ATCC 20395).

Das zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens eingesetzte Medium wird in der Weise hergestellt, dass Kohlenstoff-

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quellen, Stickstoffquellen sowie anorganische Salze, die gewöhnlich zum Züchten von Schimmelpilzen verwendet werden, zusammengebracht werden, worauf bestimmte Induziermittel zugesetzt werden, wie Lactose, Galactose, Raffinose und Melibiose.

Als für diesen Zweck geeignete KohlenstoffqueIlen seien Stärke, Glucose, Glyzerin, Maltose, Dextrin, Sucrose sowie Invertmelassen erwähnt. Beispiele für Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Erdnusspulver, vermahlener Baumwollsamen, Maisflüssigkeit, Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Nitrate sowie Ammoniumsalze. Anorganische Salze, die sich für eine Verwendung in dem Medium eignen, sind beispielsweise Kochsalz, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisensülfat, Phosphate und Kalziumcarbonat. Gegebenenfalls können Vitamine zugesetzt werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens werden organische Säuren als Wachstumspromotoren für die OG-Galactosidase dem Grundmedium zugesetzt, das aus den vorstehend geschilderten wesentlichen Komponenten hergestellt wird. Jn zweckmässiger Weise fällt die Menge an derartigen zugesetzten organischen Säuren in einen Bereich zwischen 0,2 und 1,0 %, bezogen auf das Grundmedium. Die Erhöhung der uC-Galactosidase-Aktivität, welche erfindungsgemäss bei dem erzeugten Enzym angestrebt wird, wird dann nicht erhalten, wenn die Menge an zugesetzten organischen Säuren nicht in den vorstehend angegebenen Bereich fällt. Als organische Säuren, die sich für die Einmengung in das Grundmedium eignen, seien Zitronensäure, Milchsäure, Glykolsäure, Fumarsäure, Glutarsäure, Apfelsäure, Galacturonsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Maleinsäure sowie Brenztraubensäure erwähnt.

Aus wirtschaftlichen Erwägungen sowie im Hinblick auf eine optimale Erhöhung der oc-Galactosidase-Aktivität werden jedoch Zitronensäure, Milchsäure oder Glykolsäure am meisten bevorzugt.

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Der Schimmelpilz, der auf das Medium aufgeimpft wird, welches derartige fördernde Substanzen enthält, kann aerobisch nach einer üblichen Methode in seiner nicht-modifizierten Form gezüchtet werden. Der Schimmelpilz wird auf ein Medium aufgeimpft, welches in der Weise hergestellt wird, dass eine bestimmte Menge an oG-Galactosidase-Wachstumspromotoren einem Grundmedium zugesetzt wird, das aus geeigneten Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen sowie Induziermitteln besteht. Anschliessend wird unter Schütteln oder Belüften bei ungefähr 3O°C während einer Zeitspanne von 40 bis 72 Stunden gezüchtet, wobei der pH-Wert zwischen 5 und gehalten wird. Die Kulturbrühe, die anschliessend erhalten wird, wird nach einer bekannten Methode in einen flüssigen Anteil und in eine Myzelnmasse aufgetrennt. Nachdem die Myzelnmasse mit Wasser gewaschen worden ist, kann sie in nicht veränderter Form Zuckerrübenmelassen zugesetzt werden, so dass das darin enthaltene Enzym auf die Raffinose, die in den Zuckerrübenmelassen enthalten ist, einwirken und diese hydrolysieren kann. Die Myzelnmasse, die mit Wasser gewaschen worden ist, kann nach einer geeigneten Methode behandelt werden, um sie in eine gewünschte Anwendungsform zu überführen .

Wie aus den vorstehenden Ausführungen hervorgeht, vermag das erf indungsgemässe Verfahren die Gesamtmenge an o(/-Galactosidase zu erhöhen, die durch den Schimmelpilz erzeugt wird, und zwar lediglich durch Zusatz von organischen- Säuren zu dem Medium, das in üblicher Weise zum Züchten von Schimmelpilzen verwendet wird. Da das erzeugte Enzym eine stark verbesserte cC-Galactosidase-Aktivitat pro Gewicht des Enzyms zeigt und im wesentlichen keine Erhöhung der Invertaseaktivität festzustellen ist, wird der erhebliche wirtschaftliche Vorteil erzielt, dass die Konzentrationseinstellung der Zuckerrübenmelassen, die behandelt werden sollen, ohne Schwierigkelten vorgenommen werden kann, wobei die Enzymmenge, die zur Behandlung erforderlich ist, verringert werden kann.

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Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sowie Vergleichsbeispiele beschrieben. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die Erfindung nicht auf öle geschilderten Ausführungsformen beschränkt ist.

Beispiel 1

Ein Grundmedium wird in der Weise hergestellt, dass 1,0 % Lactose, 1,0 % Glucose, 1,0 % Maisflüssigkeit, 0,6 % (NH₄J₂SO₄, 0,3 % KH₂PO₄, 0,2 % MgSO₄.7H₂O und 0,2 % NaCl verwendet werden. Das Grundmedium wird in neun Portionen aufgeteilt, worauf eine der in der folgenden Tabelle I aufgeführten organischen Säuren in jeweils einer Portion in einer Menge von 0,7 % aufgelöst wird. Dann wird das aus jeder Portion bestehende Medium auf einen pH-Wert von 5,0 gebracht, worauf 0,3 % CaCO₃ zugesetzt werden. Auf 200 ml einer jeden Portion des auf diese Weise hergestellten Mediums wird Absidia hyalospora (Saito) Lendner (IFO 8082) in Form einer Sporensuspension in einer solchen Menge aufgeimpft, dass 1 χ 10 -Sporen pro ecm des Mediums gezählt werden. Dann wird unter Schütteln bei 30°C während einer Zeitspanne von 48 Stunden gezüchtet. Dabei wird mit 136 Upm gerührt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle I hervor.

Zu Vergleichszwecken wird das Züchten in der vorstehend beschriebenen Weise durchgeführt, mit der Ausnahme, dass keine organischen Säuren zugesetzt werden. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle I hervor.

Bezüglich der Werte in der Tabelle ist darauf hinzuweisen, dass die Werte der ct-Galactosidase-Aktivität in der Weise bestimmt werden, dass 1 ml der getesteten Myzelsuspension einer Mischung aus 0,5 ml einer 0,06m Melibiose und 0,5 ml einer 0,1m Phosphatpufferlösung (pH 5,2) zugesetzt werden, wobei die Reaktion bei

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4O°C während einer Zeitspanne von 2 Stunden durchgeführt und anschliessend die Reaktionsmischung in einem siedenden Wasserbad während 5 Minuten erhitzt wird, um das Enzym zu üiaktivieren. Dann werden 1 ml einer 1,8 %igen Ba(OH)₂.8H₂O-und 1 ml einer 2 %igen ZnSO₄.7H₂O-Lösung der Reaktionslösung zugesetzt, um von der Lösung das Protein abzuziehen, worauf die erhaltene Mischung zentrifugiert und die erhaltene proteinfreie überstehende Flüssigkeit auf ihren Glucosegehalt unter Anwendung des Glucostat-Verfahrens untersucht wird. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die aus Melibiose freigesetzte Glucosemenge sowie die Enzymkonzentration in einer proportionalen Beziehung bis zu 1000 ug Glucose stehen, wird die Suspension im voraus derartig verdünnt, dass sie in einen Messbereich fällt, welcher dieser Beziehung entspricht. Die Menge an freier Glucose wird mit der Anzahl der Verdünnungen multipliziert. Die <& -Galactosidase-Aktivität, die 1 ug Glucose unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen freisetzt, wird als 1 Einheit genommen. Die Werte der Invertaseaktivität werden in der Weise bestimmt, dass 1 ml der Myzelsuspension einer Mischung aus 0,5 ml einer o,06m Sucroselösung und 0,5 ml einer 0,1m Phosphatpufferlösung (pH 5,o) zugesetzt werden, worauf eine Reaktion unter den gleichen Bedingungen abläuft, wie sie bezüglich der Bestimmung der ck-Galactosidase-Aktivität eingehalten worden sind. Die erhaltene Reaktionslösung wird zur Entfernung von Protein zentrifugiert, worauf die proteinfreie überstehende Flüssigkeit auf ihren Invertzuckergehalt unter Anwendung des Somogyi-Nelson-Verfahrens untersucht wird. Die Invertaseaktivität, die 1 ug Invertzucker untier den vorstehend beschriebenen Bedingungen erzeugt, wird als 1 Einheit genommen.

Das Trockenmyzelgewicht wird in der Weise ermittelt, dass bei 105°C die Menge an Myzein getrocknet wird, die in 100 ml des Züchtungsmediums gewachsen sind, worauf anschliessend die getrocknete Myzelmasse gewogen wird.

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Tabelle I

Organische Restzucker Säure als Glucose (g/100 ml)	0,05	Trocken gewicht (g) der Myzeln in 100 ml	"^-Galactosi- dase-Aktivität Gesamt- Spezifi- aktivi- sehe Ak- tät (Ein- tivität heit/ml) (Ein heit/g^ bez.auf Trockenb.	600 '	I 365x1O⁴	Invertase aktivität Gesamt- Spezifi- aktivi- sehe Ak- tät, (Ein-tivität heit/ml) (Ein heit/g' beζ.auf Trockenb	6 796
Glykolsäure	0,05	1,36	185	900 ·	I 365x1O⁴	92	6 806
Zitronensäure	0,09	1,40	172	400 *	I 257x1O⁴	95	6 825
Milchsäure	0,18	1,34	168	600	835x1O⁴	91	6 527
Bernsteinsäure	0,03	1,30	108	800	758x1O⁴	85	6 509 .
Maleinsäure	0,06	1,37	103	900	688x1O⁴	89	6 555
Fumarsäure	0,07	1,35	92	900	634x1O⁴	88	6 480
Galacturon- säure	0,02	1,37	86	300	623x1O⁴	89	6 430
Apfelsäure	0,02	1,32	82	100	6O2x1O⁴	85	6 445
Weinsäure	0,07	1,33	80	500	~471x1O⁴	86	6 427
Vergleichs beispiel (keine Zugabe einer organi schen Säure)	1,37	64	88

Aus der vorstehenden Tabelle ist ersichtlich, dass dann, wenn die Züchtung in Gegenwart von· Glykolsäure, Zitronensäure oder Milchsäure durchgeführt wird, die oc-Galactosidase-Aktivität um ungefähr das Dreifache zunimmt und die Invertaseaktivität im wesentlichen unverändert bleibt, und zwar im Vergleich zu einer Züchtung, die in Abwesenheit einer derartigen organischen Säure durchgeführt worden ist.

Beispiel 2

Ein Grundmedium wird unter Einsatz von 1,0 % Lactose, 1,0 % Glucose, 0,3 % (NH₄J₂SO₄, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Pepton, 0,2 % K₃HPO₄,

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0,05 % MgSO₄.7H₂O, 0,002 % MnSO₄.416H₂O und 0,001 % Fe₂SO₄-VH₃O hergestellt. Das Grundmedium wird in zehn Portionen aufgeteilt, worauf jeweils eine der in der Tabelle II aufgeführten organischen Säuren in jeder Portion in einer Menge von 0,7 % aufgelöst wird. Dann wird das Medium aus jeder Portion auf einen pH-Wert von 5,8 eingestellt, worauf 0,3 % CaCO₃ zugesetzt werden. Auf 200 ml einer jeden Portion des Mediums wird Circinella muscae (Berlese et de Toni) nova typica coreanus (ATCC 20394) in Form einer Sporensuspension in einer Menge aufgeimpft, die 1 χ 10 -Sporen pro ecm des Mediums ergibt, worauf unter Schütteln bei 30°C während einer Zeitspanne von 48 Stunden gezüchtet wird. Es wird mit 136 üpm gerührt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle II hervor.

Zu Vergleichszwecken wird das Züchten unter Einhaltung der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise durchgeführt, mit der Ausnahme, dass keine organischen Säuren zugesetzt werden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II zusammengefasst.

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Organische Säure

Tabelle II

Restzucker Trocken- ^-Galactosidaseals Glucose gewicht Aktivität Spezifi-(g/100 ml) (g) der GesamtaV- sehe Ak-Myzeln in tivität tivität

Invertaseaktivi tat

Gesamt- Spezifiaktivi- sehe Ak-

	0,03	100 ml	(Einheit/ ml)	300	(Einheit/ g, bez.auf Trockenb.	_r973x1O⁴	tat (Ein heit/ ml)	tivität (Ein heit/g.^ bez.auf Trockenb	695
Z itronensäure	0,03	1,36	404	300	2,	703x1O⁴	64	4	702
Milchsäure	0,03	1,44	389	600	2	571x1O⁴	68	4	811
Glykolsäure	0,03	1,50	385	700	2	627x1O⁴	72	4	600
Fumarsäure	0,03	1,24	325	600	2	130x1O⁴	57	4	850
Glutarsäure	0,03	1,51	321	000	2	448x1O⁴	73	4	905
Apfelsäure	0,03	1 ,25	306	400	2	221x1O⁴	61	4	670
Galacturon- säure	0,03	1,33	295	600	2-	941x1O⁴	62	4	450
Weinsäure	0,03	1,42	275	500	1	004x1O⁴	63	4	920
Bernsteinsäure	0,03 0,03	1 ,28	256	100 000	2	561x1O⁴ 207x1O⁴	63	4	920 502
Brenztrauben säure Vergleichs beispiel (kein Zusatz einer organischen Säure)		1,48 1,45	231 175		1 1		73 65	4 4
Beispiel 3

Die Medien werden in der Weise hergestellt, dass die Arbeitsweise gemäss Beispiel 1 wiederholt wird, mit der Ausnahme, dass die Mengen (0,7 %) an Glykolsäure, Zitronensäure und Milchsäure gemäss Tabelle I auf 0,3 %, 0,5 %, 0,7 % bzw. 1,0 % abgeändert werden. Auf die Medien wird Absidia hyalospora (Saito) Lendner (IFO 8082) aufgeimpft und gezüchtet. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle III hervor. Zu Vergleichszwecken wird das Züchten in Abwesenheit von organischen Säuren durchgeführt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle III hervor.

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	Zuge setz te Menge, %	Rest zucker als Gluco se (g/ 100 ml)	Tabelle	III	115	900	892x1O⁴ 90	6	923
Organische Säure	0,3	0,03		160 175	800 600	1 200x1O⁴ 91 1 291x1O⁴ 92	6 6	791 765
	0,5 0,7	0,02 0,04		157	200	1 164x1O⁴ 92	6	815
Glycolsäure	1,0	0,03		140	200	1 016x1O⁴ 91	6	594
	0,3	0,03		156	300	1 133xiO⁴ 94	6	812
	0,5	0,03	Trok- üC-Galactosi- Invertase- ken- dase-AktiVität aktivität gew. Ges.- Spez. Ges. Spez. (g) d. Akti- Akti- Akti- Akti- Myzeln vität vität vität vität in 100 ml(Ein- (Einh./)Ein- XEinh./ heit/ml) g, bez. heit/ g, bez. auf ml) auf Trockenb) Trocken	171	000	1 213x1O⁴ 94	6	667
Zitronen"	0,7	0,04	1,30	151	700	1 084x1O⁴ 93	6	643
säure	1,0	0,04	1,34 1,36	164	500	1 219x1O⁴ 88	6	519
	0,3	0,02	1,35	183 188	800 400	1 351x1O⁴ 91 1 385x1O⁴ 92	6 6	691 765
	0,5 0,7	0,02 0,03	1,38	179	.900	1 323x1O⁴ 91	6	691
Milch säure	1,0	0,06	1,38	65	300	487x1O⁴ 89	6	642
		' 0,02	1,41
Vergleichs- beispiel (keine Zu gabe einer organischen Säure)		1,4O
	1,35
1,36 1,36
1,36
1,34

Aus der vorstehenden Tabelle ist ersichtlich, dass die o£-Galacto-, sidase-Aktivität dann am höchsten ist, wenn die Menge an zugesetzter organischer Säure in der Nähe von 0,7 % liegt, wobei die
Aktivität abnimmt, wenn die Menge bezüglich dieses Gehaltes zu-
oder abnimmt.

Beispiel 4 '

Die Medien werden in der Weise hergestellt, dass die in Beispiel 2

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beschriebene Arbeitsweise wiederholt wird, mit der Ausnahme, dass die Mengen (0,7 %) an Zitronensäure, Milchsäure und Glykolsäure gemäss Tabelle II auf 0,2 %, 0,4 %, 0,6 %, 0,8 % bzw. 1,0 % abgeändert werden. Auf die Medien wird Circinella muscae (Berlese et de Toni) nova typica coreanus (ATCC 20394) aufgeimpft und gezüchtet. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle IV hervor.

	Zuge	Vergleichs	Rest	Tabelle IV	oC Galactosi-	100	Spez.	bez.	888x1O⁴	Invertase-	63	Spe	Z.	bez.	437
Organische	setz	beispiel	zucker	Trok-	dase-Aktivität	900	Aktivi	Trok-	276x1O⁴	Aktivität	63		Aktivi	Trok-	468
Säure	te	(kein Zu	als	ken-	Ges.	100	tät	kenbasis)	8O8x1O⁴ A	Ges. -	66		tät	kenbasis)	552
	Menge	satz einer	Glu	gew. ,		200		1	614x10*	Aktivi	66			4	490
	(%)		cose,	g der	Akti	400	(Einh./	2	467x1O⁴	tät	64	(Einh./	4	571
			g/100 ml	Myzeln	vität	800	g,	2	698x1O⁴	(Einh./	64	g#	4	476
				in 100	(Ein	300	auf	2	147x1O⁴	ml)	66	auf	4	552
		organischen		ml	heit/	400	2	667x10*		68	4	474
		Säure)			ml)	500	1	357x1O⁴		67	4	467
	0,2		0,04			000	2	128x1O⁴	64	4	539
	0,4		0,03	1,42	268	200	2	736x1O⁴	68	4	755
	0,6	0,03	1,41	320	300	2	338x10	72	4	932
Zitronen säure	0,8	0,04	1,45	407	600	2	742x1O⁴	74	4	103
	1,0	0,03	1,47	384	200	1	5O8x1O⁴	73	4	000
	0,2	0,03	1,40	345	800	2	221x1O⁴	70	4	861
	0,4	0,03	1,43	242		2			5
Milch	0,6	0,03	1,45	311		2	Λ		5
säure	0,8	0,03	1,52	405	200	2	250x10*	63	4	468
	1,0	0,03	1 ,50	353
	0,2	0,04	1,41	300
	0,4	0,04	1,43	248		1			4
Glykol-	0,6	0,03	1,46	341
säure	0,8	0,03	1,45	397
	"1,0	0,04	1,46	366
		1,44	319

0,03
	1,41	176

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Beispiel 5

Auf die gemäss der Arbeitsweise von Beispiel 2 hergestellten Medien werden verschiedene Stämme des Genus Circinella sowie des Genus Absidia aufgeimpft und unter den gleichen Bedingungen, wie sie in Beispiel 2 geschildert worden sind, gezüchtet. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle V hervor (in den mit "o" gekennzeichneten Reihen). Zu Vergleichszwecken wird das Züchten in Abwesenheit von Zitronensäure durchgeführt. Die Ergebnisse gehen ebenfalls aus der Tabelle V hervor (in den Reihen, die mit "x" gekennzeichnet sind).

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Tabelle V

Zitronensäure ,

verwendet (o) oder nicht verwendet (x)

Circinella muscae (Sorokine) Berlese et de Toni (C.W. Hesseltine)(IFO 6410)

<n Circinella muscae (Soro-O kine) Berlese et de Toni *° (Circinella sydowi Lendner) (IFO 4457)

-* Circinella mucoroides (Saito) (Circinella chinensis Naganishi et Kojiro) (IFO 4453)

Circinella mucoroides Saito (K.Saito) (IFO 4455)

Absidia reflexa van Tieghem (IFO 5874)

Absidia regnieri (Lucet et Costantin) Lendner (IFO 8084)

Absidia lichtheimi (Lucet et Costantin) Lendner (IFO 4010)

Absidia lichtheimi (Lucet et Costantin) Lendner (IFO 4009)

Absidia ramosa (Vuillemin) Lendner (IFO 8083)

O X O

Trokken- gew., g der Myζein in 100 ml

1,36 1,38

1,40 1,41

1,37 1,37

1,35

1,38

1,42

1,43

1,35 .

1,37

1,40

1,42

1,40

1,41

1,32

1,31

OG-Galactosidase-Aktivität
Gesamt- Spezifiaktivität sehe Akti-(Einheit/ml) vität,(Einheit/g, bez.

Invertase-Aktivität Gesamtaktivität, (Einheit/ml)

200
000

000
500

500
000

400
600

500
500

000
700
500
600

600
000

300
200

auf Trockenb.)

318x1O⁴ 116x1O⁴

5O7x1O⁴ 23Ox1O⁴

799x10 693x10^

. 759x10^

. 1 606x10^

511x10^

983x10'

519x10'

180x10'

725x10 469x10^

669χ1θ' 461χ1θ'

396x10 032x104

120 123

94 98

92 99

94 99 109 119 108 120 121 150 120 151 106

127

Spezifische Aktivität, (Einheit/g, bez. auf Trockenb)

8 8

6 6

6

7 226 ,

6 963 ^

7 174 '

7 676.

8 8 8 8

TO 8

10

8

9

Aus der vorstehenden Tabelle ist ersichtlich, dass die OG-Galactosidase-Aktivität um wenigstens das Zweifache bei der Züchtung zunimmt, die in Gegenwart von 0,7 % Zitronensäure durchgeführt wird.

Beispiel 6 .

Ein Grundmedium aus 1,5 % Lactose, 0,5 % Glucose, 0,6 % (NH₄)^SO₄ 1,0 % Maisflüssigkeit, 0,4 % KH₃PO₄, 0,2 % MgSO₄.7H₂O und 0,2 % NaCl wird jeweils 0,6 % 12 verschiedener organischer Säuren, die in den Tabellen VI und VII aufgeführt sind und als Mittel zur Förderung der Bildung von oC-Galactosidase dienen, zugesetzt. Dann wird der pH-Wert unter Verwendung von NH₄OH auf 5,0 eingestellt, worauf 0,2 % CaCO₃ zugegeben werden. Jeweils 200 ml-Portionen des Mediums werden in Sakaguchi-Kolben überführt, die ein Innenvolumen von 1 1 aufweisen, und während einer Zeit-

spanne von 30 Minuten unter einem Druck von 1,2 kg/cm sterilisiert. Auf die Medien werden Sporensuspensionen von Absidia griseola var. iguchii (ATCC Nr. 20431) und Absidia griseola (ATGC Nr. 20430) in solchen Mengen aufgeimpft, dass 1 χ 10 Sporen/ccm des Mediums gezählt werden. Es wird bei 30°C während einer Zeitspanne von 60 Stunden auf einem sich hin- und herbewegenden Vibrator gezüchtet, der mit einer Amplitude von 7 cm und einer Geschwindigkeit von 136 üpm betrieben wird. Die mit dem zuerst genannten Schimmelpilz erhaltenen CC -Galactosidase-Aktivitäten gehen aus der Tabelle VI hervor, während die Aktivitäten, die unter Einsatz des letzteren Schimmelpilzes erhalten werden, in der Tabelle VII zusammengefasst sind.

509831/0815

Tabelle VI

Organische Säure	Rest zucker als Glu cose (g/100 ml)	0,06	Trockengew d. My- zeln (g/100 ml)	. COGalactosidase- Aktivifeät Ges.Ak- Spez. tivität Akti- (Ein- vität heit/ml) (Einh./g, bez.auf Trockenb.)	000	4	214x1O⁴	Invertaseakti- vi tat Ges.Ak- Spez. tivität Akti- (Ein- vität heit/ml) (Einh./ g,bez. auf Trok- kenb.)	0
Glykolsäure	0,08	0,07	1,196	504	700	3	86Ox1O⁴	0	0
Zitronensäure	0,06	0,02	1,209	466	900	3	73Ox1O⁴	0	0
Milchsäure	0,07	0,06	1,276	475	500	3	587x1O⁴	0	0
Apfelsäure	0,04	0,07	1,175	421	500	3	150x1O⁴	0	0
Fumarsäure	0,06	0,03	1,208	380	100	2	619X1O⁴	0	0
Weinsäure	0,08	1,394	365	400	2	388x1O⁴	0	0
Bernsteinsäure 0,04	1,300	310	100	2	293x1O⁴	0	0
Glutarsäure	1,370	314	900"	2	266x1O⁴	0	0
Malonsäure	1,273	291	500	2	O14x1O⁴	0	0
Maleinsäure	1,194	240	665	2	322x1O⁴	0	0
Brenztrau bensäure	1,325	307	200	2	749x1O⁴	0	0
Galacturon- säure	1,350	371	900	1	790x1O⁴	0	0
Vergleichs beispiel (Kein Zusatz einer organi schen Säure)	1,290	230	0

509831/0815

	Rest zucker als Glucose (g/100 ml)	0,03	0,04	Trocken- few.der Myzeln (g/100 ml)	Tabelle	VII	300	2	989x1O⁴	Invertase- aktivität Ges.Akti- Spez. vität Aktivi- (Einheit/ tat ml) (Einh./g, bez.auf Trocken basis)	0
Organische Säure	0,05	0,03	0,08	1,202		500	2	893x1O⁴	0	0
Glykolsäure	Zitronensäure 0,04	0,07	0,07	1,208	oC Galactosidase- Aktivität Spez. Ges.Akti- Aktivi- vität tat (Einheit/ (Einh./g, ml) bez.auf Trockenb.)	300	2	851x1O⁴	0	0
	Milchsäure	0,06	0,05	1,204	359	400	2	768x1O⁴	0	0
Apfelsäure	Bernsteinsäure 0,04	0,06	1,190	349	100	2	436x1O⁴	0	0
Fumarsäure	Glutarsäure	Vergleichs beispiel (Kein Zusatz 0,02 einer organi schen Säure)	1,203	343	300	2	145x1O⁴	0	0
Weinsäure	Malonsäure		1,246	329	700	1	841x1O⁴	0 .	0
Maleinsäure	1,237	293	000	1	785x1O⁴	0	O
Brenztrau bensäure	1,294	267	900	1	758x1O⁴	0	O
Galacturon- säure	1,228	227	100	1	564x1O⁴	0	0
1,260	231	200	1	795x1O⁴	0	0
1,260	215	600	2	237x1O⁴	0	0
1,223	197	200	1	384x1O⁴	0	0
1,280	226		0
273
177

509831/0815

- 18 Beispiel 7

Zu Aliquots des Grundmediums gemäss Beispiel 6 werden Zitronensäure, Milchsäure und Glykolsäure getrennt in wechselnden Mengen zugesetzt, die 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1,0 % entsprechen. Unter den gleichen Bedingungen werden Absidia griseola var. iguchii (ATCC Nr. 20431) und Absidia griseola (ATCC Nr. 20430) gezüchtet. Die unter Einsatz des ersteren Schimmelpilzes erhaltenen OG-Galactosidase-Aktivitäten gehen aus der Tabelle VIII hervor, während die unter Verwendung des letzteren Schimmelpilzes erzielten Aktivitäten in der Tabelle IX zusammengefasst sind.

S09831/0815

	Zuge	0,2	(kein Zusatz	Rest	Tabelle VIII	OC-Galactosi-	Invertase-	./	Spez. Ges	.Akti-Spez.	758x1O⁴	0	Akti
Organische	setz	0,4	einer organi	zucker	Trocken	dase-	Aktivität aktivität		Akti- vität	184x1O⁴	0	vität
Säure	te	0,6	schen Säure]	als	gew, der		Ges.Akti		vität (Ein-	930x1O⁴	0	(Einh./
	Menge,	0,8	I	Glucose	Myzeln,		vität		(Einh./heit/	769x10*	0	g,bez.
	%	IrO		(g/100	(g/100		(Einh		g₍	636x1O⁴	0	auf
		0,2	ml)	ml)	ml)		-bez. ml)	490x1O⁴	0	Trok-
		0,4				100	auf	105x1O⁴	0	kenb.)
		0,6				200	Trok-	73Ox1O⁴	0	0
		0,8				200	kenb.)	680x1O⁴	O	0
		1,0				700	2	517x1O⁴	0	0
	0,2	0,02		346	900	3	695x1O⁴	0	0
	0,4	0,05	1,255	401	500	3	404x1O⁴	0	0
	0,6	0,06	1 ,260	496	600	3	214x1O⁴	0	0
Zitronen säure	0,8	0,08	1,260	478	900	3	100x10	0	0
	IrO	0,09	1,270	462	900	2	914x1O⁴	0	0
		0,03	1,273	312	400	3			0
		0,06	1,255	390	400	3	A		0
	0,07	1,258	475	800	3	790x10*	0	0
Milch	0,08	1,276	469	000	3			0
säure	0,09	1,277	448	900	2			0
	. 0,02	1,275	320	800	3		0
	0,05	1,189	406		4		0
	0,08	1,195	504		4
Glykol- säure	0,09	1,196	487	900	3
	0,09	1,190	465			0
		1,190
Vergleichs				1
beispiel	0,03		230
		1,290

509831/081S

Organische
Säure

Zuge- Restsetzte zucker Menge, als % Glucose (g/ 100 ml)

Tabelle IX

Trok- oöGalaetQsikendase-Aktivität
gew. Ges.Akti-Spez.
d.My- vitat Aktivität
zein, (Einh./ (Einh»/g,
(g/100 ml) bez.auf
ml) Trockenb.)

Invertaseaktivität Ges.Akti- Spez.

vi tat {Einh./ ml)

Aktivität (Einh./

g,bez.

auf

Trok-

kenb.)

Zitronensäure

Milchsäure

Glykolsäure

0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

Vergleichsbeispiel
(kein Zusatz
einer organischen Säure)

0,03 0,03 0,04 0,05 0,08

0,02 0,02 0,03 0,04 0,04

0,02 0,03 0,05 0,06 0,06 1,226
1,244
1,260
1 ,265
1,265

1,203
1,204
1 ,204
1,205
1,208

1,200
1,202
1,202
1,207
1,208

263 000
305 500
385 400
380 500
350 200

261 500
295 600
343 300
325 100

300 600

270 400
338 4OO
359 300
349 500.
325 700

2 145x10

2 456x1O⁴

3 O59x1O⁴ 3 OO8x1O⁴ 2 768x1O⁴

2 174x1O⁴ 2 455x1O⁴ 2 851x1O⁴ 2 698x1O⁴ 2 488x1O⁴

2 253x1O⁴ 2 815x1O⁴ 2 989x1O⁴ 2·896χ1Ο⁴ 2 696x1O⁴

0,02 1,280 177 200 1 384x10

0 0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0 ■0

Diese Tabellen zeigen deutlich, dass die Menge an einer organischen Säure, die als Mittel zur Begünstigung der Erzeugung von oO-Galactosidase zugesetzt worden ist, in dem Bereich zwischen 0,2 und 1,0 % geeignet ist, und dass die Menge an gebildeter oC-Galactosidase allmählich mit ansteigender Menge an organischer Säure über die obere Grenze von 1,0 % hinaus abnimmt.

509831/0815

Claims

- 21 Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von OC-Galactosidäse durch Züchten eines Schimmelpilzes, dadurch gekennzeichnet, dass einem Grundmedium ungefähr 0,2 bis ungefähr 1,0 %, bezogen auf das Grundmedium, einer organischen Säure zugesetzt werden, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Zitronensäure? Milchsäure, Glycolsäure, Fumarsäure, Glutarsäure, Apfelsäure„ Weinsäure, Bernsteinsäure, Brenztraubensäure, Galacturonsaurep Malonsäure und Maleinsäure besteht, und der Schimmelpilz in dem Medium unter Bedingungen gezüchtet wird, welche es dem Schimmelpilz gestatten, 00 -Galactosidase zu erzeugen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der eingesetzte Schimmelpilz eine Spezies ist? die zu dem Genus Circinella gehört.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der eingesetzte Schimmelpilz eine Spezies ist, die zu dem Genus Absidia gehört.

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ORIGINAL HMSFEGTED