DK141912B - Fremgangsmåde til selektiv udvinding af lipolytisk enzym. - Google Patents

Description

OD FREMLÆC6 ELSESSKRIFT 141912 (m) \fca/ DANMARK |E” lnt C| S c 12 " 9/20 • (21) Ansøgning nr. 26)9/75 (22) Indleveret den 10, jUTl. 1975 (23) Lebedag )0. Jun. 1975 (44) Ansøgningen fremlagt og

fremUeggolaeaskrlftat offentliggjort den 14. Jul. I98O

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begæret fra den

10. Jim. 1974, 477889, US

(71) gb FERMENTATION INDUSTRIES INC., Rt. 52N, Kings tree, S. Carolina, US.

(72) Opfinder: Gerard J. Moskowitz, 340 Checker Drive, Buffalo Grove, 1111“ nols 60090, US: John J. Como, 3126 Greenbriar Drive, Glenview, Illinois 60025, US: Louis I. Feldman, 9101 Waukegan Avenue, Morton Grove, 11= linois 6ΟΟ53, US.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Th. Ostenfeld Patentbureau A/s.

(54) Fremgangsmåde til selektiv udvinding af lipolytisk enzym.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til selektiv udvinding af lipolytisk enzym fra et fennenteringsmedium vundet ved dyrkning af en stamme af Mucor miehei og indeholdende det lipolytisk« enzym sammen med mælkekoagulerende enzym.

Det er kendt, at de fermenterede dyrkningsprodukter af Mucor mikroorganismer indeholder lipolytiske enzymer i blanding med andre enzymer såsom carbohydraser, proteaser og lignende,som omhandlet i beskrivelsen til USA-patent nr. 1.391.219.

I den senere tid har udvindingen af værdifulde og kommercielt vigtige mælkekoagulerende enzymer fra Mucor-arter været beskrevet.

Typiske arter, hvorfra sådanne enzymer, der sædvanligvis kaldes mikrobiologiske løbeenzymer, er blevet opnået, er Mucor pusillus som beskrevet i USA-patentskrifter nr. 3.151.039 og 3.212.905 samt Mucor miehei omhandlet i USA-patentskrifter nr. 3.549.390 og 3.763.011.

141912 I USA-patentskrift nr. 3.616.233 fjernes uønskede lipolytiske enzymer/ der fremstilles sammen med løbeenzymet i Mucor-arter, fra det ønskede løbeenzym ved inaktivering eller nedbrydning ved indstilling af pH-værdien på 2,0 - 3,5 ved 20 - 55°C. Ifølge tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.232.996 fjernes lipaseurenheder fra det ønskede løbeenzym ved indstilling på pH-værdi 4-6 efterfulgt af filtrering.

I beskrivelsen til dansk patentansøgning nr.1502/75 er omhandlet fremstillingen af et lipolytisk enzym-aromasystem ud fra Mucor miehei, som har den ønskelige egenskab at udvise større esterase- end lipase-lipolytisk enzymaktivitet. Det vil sige, at det udviser et EA/LA forhold på mere end én. En praktisk fremgangsmåde til udvinding af lipolytisk enzym med de forannævnte aromati-seringssystem-egenskaber vil derfor være af betydelig værdi for næringsmiddelindustrien.

Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, der er ejendommelig ved, at man behandler det fermenterede næringsmedium med fra ca. 0,5 til ca. 15 vægt% af et materiale i form af diatoméjord eller en lertype ved en pH-værdi fra ca. 4 til ca. 6 og derefter eluerer det lipolytiske enzym fra adsorptionsmidlet ved indstilling af pH-værdien i intervallet fra ca. 9 til ca. 11.

Det har overraskende og uventet vist sig, at selektiv udvinding af det ønskede lipolytiske enzym ud fra løbeenzymet opnås ved hjælp af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse i næsten kvantitative udbytter. Udbyttet af løbeenzym er også fremragende, hvorved det bliver muligt at bibeholde dette til anvendelse som et mælkekoagulerende enzym i overensstemmelse med de hidtidige ønsker.

De foretrukne diatoméjord-typer er "Celite"-filterhjælpemidler, der er tilgængelige i handelen fra Johns-Manville, og mest foretrukket "Filter-Cel". Det sidstnævnte materiale er den fineste "Celite"-type diatomit med en sigteanalyse på 1% tilbageholdt materiale på 150 mesh. Det er en naturlig diatomit, som er blevet selektivt knust, tørret, malet og luft-klassificeret. Dens kemiske analyse er gengivet nedenfor: 3 141912

Komponent %

Si02 85,8

Al203 3,8

Fe203 1,2 P205 0,2

Ti02 0,2

CaO 0,5

MgO 0,6

Na20 1,1 K20 1,1

Lermaterialer, som kan anvendes i overensstemmelse med opfindelsen, er montmorilloniter og hydratiserede aluminiumsilikater såsom bentonit og kaolin. Den foretrukne lertype er "Volclay", der er en vestlig bentonit, som er tilgængelig i handelen fra Whittaker, Clark & Daniels,

Inc.

De forannævnte adsorptionsmaterialer anvendes ved koncentrationer varierende fra ca. 0,5% til ca. 15%, og fortrinsvis fra ca. 1,0% til ca. 5%, beregnet efter vægt. Koncentrationer på mere end 15% er unødvendige .

Adsorptionstrinnet kan udføres ved grundig blanding med diatomS-jord eller lermateriale ved omgivelsernes temperatur. Det adsorberede materiale skilles dernæst fra det uadsorberede løbeenzymmateriale, såsom ved filtrering eller centrifugering. Det ønskede lipolytiske enzym kan dernæst elueres fra det fraskilte adsorptionsmateriale ved indstilling af pH-værdien i intervallet fra ca. 9 til ca. 11 og grundig blanding ved omgivelsernes temperatur. Det er vigtigt at elueringen sker i det angivne pH-interval, idet forsøg har vist at lipase her har en opløselighed fra ca. 80 til ca. 100%, mens opløseligheden falder brat ved pH-værdier under 9 og over 11.

I de fleste tilfælde er blanding såsom ved omrøring i ca. 15 minutter til ca. 2 timer passende for opnåelse af den ønskede adsorption og eluering. Blanding ved normal stuetemperatur såsom ca. 20 - ca.

25°C er passende, og der er ikke behov for at sænke eller forøge omgivelsestemperaturen under blandetrinnene.

Produktion af det lipolytiske enzym, som udvindes i henhold til fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan udføres ved konventionelle fermenteringsmetoder. Således inkuberes et næringsmedium indeholdende 4 141912 assimilerbar carbon, nitxogen og spormineraler med en kultur af en stamme af Mucor miehei, og fermenteres under submerse aerobe betingelser ved en pH-værdi fra ca. 3 til ca. 8 og en temperatur fra ca. 20 til ca. 50°C i ca. 2 til ca. 14 dage. Eksempler på stammer af Mucor miehei, som kan fermenteres på denne måde til fremstilling af det ønskede lipolytiske enzym, er offentligt tilgængelige uden begrænsninger under kodebetegnelserne NRRL A 13.131 og A 13.042 hos Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois.

Efter fermenteringen kan det lipolytiske enzym udvindes direkte fra mæsken eller fra den filtrerede mæsk eller fra et koncentrat af dyrkningsproduktvæsken. Således kan mæsken anvendes direkte,eller væsken kan filtreres, såsom til fjernelse af myceliet og andre faste stoffer, som resterer fra fermenteringen,eller dyrkningsproduktvæsken kan koncentreres, såsom ved fordampning til reduktion af det volumenmateriale, som skal håndteres,ved udvindingsmetoden ifølge den foreliggende opfindelse.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

Eksempel 1

Mucor miehei, NRRL 13.042, dyrkes under aerobe fermenteringsbetingelser ved 37°C, pH-værdi 6, i en produktionstank indeholdende følgende vandige næringsmedium: "Kaysoy" affedtet sojabønnemel 4,0%

Sprøjtetørret sød valle 4,0

Majsstivelse forflydiget med 16,0 bakteriel a-amylase

Vand 76,0 100,0%

Fermenteringssubstratet udvindes efter 77 timers fermentering, og det ønskede lipolytiske enzym udvindes dernæst på følgende måde: fermenteringssubstratet filtreres og inddampes til en koncentration på 24° Baumé. Det filtrerede og inddampede materiale indstilles dernæst på 3,0° Baumé med vand, og pH-værdien indstilles på 5,0 med 2N NaOH. Bentonit af typen "Volclay KWK" sættes dernæst til 125 g af det fortyndede inddampede materiale til en koncentration på 5 141912 2.5 vægt%. Blandingen omrøres i 1 time ved 25°C og filtreres dernæst i nærværelse af 2,0 vægt% "Hyflo Super-Cel" filterhjælpemiddel (diatomit med en sigteanalyse på 5% tilbageholdt på 150 mesh). Filtratets pH-værdi indstilles på 4,0 med 2N HC1, inddampes til 14,2 g og prøves for løbeenzym og lipolytisk enzym. Prøverne viser 72,7% løbeenzym udvundet og 0% lipolytisk enzym udvundet. Filterkagen, som resterer fra det foregående filtreringstrin (12,6 g),suspenderes i 100 ml vand, og pH-værdien indstilles på 10,0 med IN NaOH. Blandingen omrøres i 1 time ved 23 - 25°C. "Speedex" filterhjælpemiddel (diatomit) tilsættes dernæst til en koncentration på 3%, og blandingen filtreres. Dernæst indstilles pH-værdien på 4,0 med 2N HC1, inddampes til en koncentration på ca, 6 gange og prøves dernæst for lipolytisk enzym. Prøven viser udvinding af 127% lipolytisk enzym.

Eksempel 2

Udvindingsmetoden i eksempel 1 gentages,med den undtagelse at udgangsmaterialet fortyndes til 6,0° Baumé, og "Filter-Cel" diatoméjord anvendes i stedet for "Volclay". I et forsøg, hvor der anvendes 2.5 vægt% "Filter-Cel", udvindes 251% af den lipolytiske enzymaktivitet, og i et andet forsøg, hvor der anvendes 5,0 vægt% "Filter-Cel", udvindes 151% af den lipolytiske enzymaktivitet.

De lipolytiske enzymprøver i eksempel 1 og 2 ovenfor er målt på basis af enzymprøver af de som udgangsmaterialer anvendte filtrerede og inddampede materialer. Enzymprøverne foretages i overensstemmelse med de i dansk patentansøgning nr. 1502/75 angivne metoder og viser EA/LA forhold på mere end 1. Disse prøver viser, at der påvises mere lipolytisk enzym i det udvundne produkt end i udgangsmaterialet ved den anvendte prøvemetode.

Eksempel 3

Eksempel 1 og 2 gentages, bortset fra at fermenteringerne udføres med et vandigt næringsmedium indeholdende 12% enzymatisk nedbrudt majsstivelse, 1,5% sojabønnemel ("Nutrlsoy 300 C") og 3% tørret valle, og fermenteringssubstratet udvindes efter 114 timers fermentering. Ved hjælp af udvindingsmetoderne i eksempel 1 og 2 opnås i det væsentlige tilsvarende selektiv og kvantitativ udvinding af lipolytisk enzym.

6 141912

Eksempel 4

Fra en anden produktionstank, hvor Mucor miehei fermenteres under aerobe fermenteringsbetingelser i - passende næringsmedier, fortyndes det resulterende dyrkningsprodukt med et lige så stort volumen vand, og pH-værdien indstilles på 5,0 med N HC1. En portion af den fortyndede mæsk (300 g) behandles med (a) 5 vægt% "Volclay" og (b) en tilsvarende portion med 5 vægt% "Filter-Cel" som i hhv. eksempel 1 og 2. I begge tilfælde (a) og (b) tilsættes 2 vægt% "Hyflo Super-Cel" filterhjælpemiddel, materialet filtreres, og kagen opskylles med vand. Hver filterkage opdeles i tre lige store dele og opsamles i 100 ml vand pr. 25 g kage. pH-værdien af de tre dele indstilles på hhv. 10,0, 10,5 og 11,0 med 2N NaOH, og efter omrøring i en time ved 25°C filtreres materialet og opskylles med vand. Kombinationen af filtrat og opskyllet materiale indstilles på pH-værdien 5,2 - 5,5 med N HC1 og prøves.

LØbeenzym og lipolytisk enzym i den oprindelige fortyndede mæsk, i "Volclay"- og "Filter-Cel"-filtraterne og i de eluerede "Volclay"-og "Filter-Cel"-kager er anført nedenfor:

Prøvesubstrat LØbeenzym Lipolytisk enzym - _ % udbytte _% udbytte Mæsk 1:1 fortyndet 100 100 (a) 5% "Volclay"-filtrat. 54,4 10 (b) 5% "Filter-Cel"-filtrat 85,8 11,2 (a) "Volclay"-kage elueret ved pH-værdi 10,0 127 "Volclay"-kage elueret ved pH-værdi 10,5 118 "Volclay"-kage elueret ved pH-værdi 11,0 22,5 (b) "Filter-Cel"-kage elueret ved pH-værdi 10,0 62,2 "Filter-Cel"-kage elueret ved pH-værdi 10,5 121,0 "Filter-Cel"-kage elueret ved pH-værdi 11,0 36,7