DK157886B - Xyloseisomerase og fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Xyloseisomerase og fremgangsmaade til fremstilling deraf Download PDF

Info

Publication number
DK157886B
DK157886B DK071086A DK71086A DK157886B DK 157886 B DK157886 B DK 157886B DK 071086 A DK071086 A DK 071086A DK 71086 A DK71086 A DK 71086A DK 157886 B DK157886 B DK 157886B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
xylose isomerase
glucose
xylose
dsm
isomerase
Prior art date
Application number
DK071086A
Other languages
English (en)
Other versions
DK157886C (da
DK71086A (da
DK71086D0 (da
Inventor
Georg Skot
Hanne Guertler
Original Assignee
Novo Industri As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Industri As filed Critical Novo Industri As
Priority to DK071086A priority Critical patent/DK157886C/da
Publication of DK71086D0 publication Critical patent/DK71086D0/da
Publication of DK71086A publication Critical patent/DK71086A/da
Publication of DK157886B publication Critical patent/DK157886B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK157886C publication Critical patent/DK157886C/da

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90Isomerases (5.)
    • C12N9/92Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215Microorganisms
    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

DK 157886B
Opfindelsen angår en hidtil ukendt xyloseisomerase og en fremgangsmåde til fremstilling af en sådan xyloseisomerase.
Enzymer, der er i stand til at isomerisere glucose til fructose, dvs. glucoseisomeraser, kan fremstilles på basis 5 af et stort antal forskellige mikroorganismer, og enzymudbyttet og egenskaberne af enzymerne varierer fra art til art, og endog hyppigt fra stamme til stamme. I forbindelse med alle xylose-isomeraseproducerende stammer, som findes i naturen, kræves der xylose i mediet med henblik på maksimal enzymproduktion.
10 Alle beskrevne glucoseisomeraser er i princippet xy- loseisomeraser. Hvad angår enzymnomenklaturen er de desuden klassificeret som EC 5.3.1.5, og glucoseisomerase kan ikke findes i den officielle enzymnomenklatur. For tydelighedens skyld vil enzymet derfor i det følgende sædvanligvis blive benævnt 15 som xyloseisomerase, selv om den vigtigste anvendelse deraf er isomerisering af glucose til fructose.
Økonomien i forbindelse med fremstillingen af xylose-isomeraser afhænger i stort omfang af substratets pris og enzymudbyttet. De vigtigste enzymegenskaber, som er særligt 20 vigtige i forbindelse med den økonomiske anvendelse ved isome-riseringsprocessen, er et højt rensningsudbytte og en god evne til at blive konverteret til et immobiliseret produkt med tilfredsstillende fysiske og enzymkemiske egenskaber, f.eks. stabilitet ved høje temperaturer, resistens overfor fysisk tryk og 25 en høj halveringstid.
Ingen af de kendte xyloseisomeraser, herunder de kommercielle glucoseisomeraseprodukter, udviser de bedst mulige værdier af alle ønskværdige egenskaber. Det er ofte nødvendigt at indgå et kompromis.
30 Der er derfor gennemført en stor forskningsindsats på det område, der omfatter produktion af xyloseisomeraser, der hidrører fra forskellige mikrobiologiske kilder, og som er i stand til at isomerisere glucose til fructose. Denne forskningsindsats har manifesteret sig i patentlitteraturen, 35 som omfatter et enormt antal patenter, der dækker forskellige 2
DK 1 57886 B
mikrobielle kilder for xyloseisomerase. Både bakterier, f.eks. sådanne hørende til slægterne Streptomyces, Actinoplanes,
Bacillus og Flavobacterium, og svampe, f.eks. sådanne hørende til klassen af Basidiomyeeter, har været beskrevet i patent-5 litteraturen som xyloseisomeraseproducerende mikroorganismer. Følgende arter hørende til slægten Streptomyces har blandt mange andre været beskrevet i patentlitteraturen som xyloseisomeraseproducerende mikroorganismer.
S. flavovirens 10 S. achromogenus S. echinatus S. wedmorensis S. albus (US patent nr.3.616.221) 15 S. olivochromogenes S. venezuelae (US patent nr. 3.622.463) S. griseoflavus (US patent nr. 4.351.903) 20 S. glaucescens (US patent nr. 4.137.126) S. olivaceus (US patent nr. 3.625.828) S. galbus 25 _S. gracilis S. matensis S. niveus S. platensis - (ungarsk patent nr. 12.415)
DK 157886 B
3 S. violaceoniger (tysk patent nr. 2.417.642) S. acidodurans (US patent nr. 4.399.222) 5 S. phaeochromogenes S. fradiae S. roseochromogenes S. olivaceus S. californicus 10 S. vinaceus S. virginiae (japansk patent nr. 69.28.473)
Opfindelsens formål er således at tilvejebringe en xyloseisomerase, som kan fremstilles med et godt kompromis hvad 15 angår fermentationsudbytte, rensningsudbytte og evne af den producerede xyloseisomerase til at konverteres til et immobili-seret produkt med tilfredsstillende fysiske og enzymkemiske egenskaber.
Det har nu overraskende ifølge opfindelsen vist sig, 20 at bakterier, som hører til gruppen Streptomyces murinus, er xyloseisomeraseproducerende med højt gæringsudbytte, og det har yderligere vist sig, at xyloseisomerasen kan fremstilles med højt rensningsudbytte og en god evne til at blive konverteret til et immobiliseret produkt med tilfredsstillende fysiske og 25 enzymkemiske egenskaber med henblik på anvendelse i en industriel glucoseisomerisationsproces, og at konstitutive og glu-coserepressionsresistente stammer af gruppen Streptomyces murinus frembringer specielle fordele hvad angår gæringsøkonomi. I denne beskrivelse skal betegnelsen "gruppen Streptomyces 30 murinus" forstås som defineret i Rolf-Dieter HEITZERs doktordisputats "Numerische Taxonomie der Actinomyceten-Gattungen STREPTOMYCES und STREPTOVERTICILLIUM" (indleveret 27. januar 9
DK 157886 B
4 1981), rekvirerbar fra den biologiske afdeling i den tekniske højskole i Darmstadt, Tyskland. Dette betyder, at S. murinus DSM 40091, DSM 40240 (tidligere benævnt S. roseoluteus), NRRL 8171, FERM-P 3710, DSM 2352 og DSM 3253 alle hører til denne 5 Streptomyces murinus gruppe. Det har nu vist sig, at den xyloseisomerase, som fremstilles af disse i det foregående angivne seks medlemmer af gruppen, er immunologisk identiske, bestemt ved krydset tandem-immunelekroforese med antistoffer fremstillet mod xyloseisomerasen produceret ved hjælp af DSM 10 3252, hvilken kendsgerning understreger det nære taxonomiske slægtsskabsforhold mellem disse individuelle medlemmer af gruppen .
Xyloseisomerasen ifølge opfindelsen er således ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne.
15 Til trods for, at et enormt antal arter er kendt som xyloseisomerase-producenter, er ingen stamme af gruppen Streptomyces murinus kendt som xyloseisomerase-producent, og det har nu overraskende vist sig, at enhver af de testede stammer af gruppen Streptomyces murinus er udmærket egnet til fremstilling 20 af xyloseisomerase, som har de ovenfor angivne fordele.
Man kender ganske vist en kommerciel xyloseisomerase fremstillet ved hjælp af Bacillus coagulans, men det har vist sig, at xyloseisomerasen ifølge opfindelsen i den immobilise-rede tilstand udviser en højere værdi af den maksimale reak-25 tionshastighed og et mindre pH-fald under drift end xyloseisomerasen fra B. coagulans, jævnfør tabel I.
Man kender ganske vist også en kommerciel xyloseisomerase fremstillet ved hjælp af Actinoplanes missouriensis, men det har vist sig, at xyloseisomerasen ifølge opfindelsen i den 30 immobiliserede tilstand udviser en højere værdi- af den maksimale reaktionshastighed end xyloseisomerasen fra Actinoplanes missouriensis, jævnfør tabel I.
Man kender ganske vist også en kommerciel xyloseisomerase fremstillet ved hjælp af Streptomyces olivochromogenes, 35 der i den immobiliserede tilstand udviser lige så høj værdi af
DK 157886 B
5 den maksimale reaktionshastighed, som xyloseisomerasen ifølge opfindelsen, jævnfør tabel I, men det har vist sig, at stabilitets- og aktivitetsforholdene ved høj temperatur er betydeligt bedre i forbindelse med xyloseisomerasen fra S. murinus 5 end i forbindelse med den kendte xyloseisomerase fra S. olivo-chromogenes, jævnfør fig. 1.
Tabel I
Maksimal reaktionshastighed Vmax (μπιοί per minut per g enzymprotein) for fire glucoseisomeraser 10 Metalion- | | IActinoplanes |Streptomyces aktivatorer I S. murinus|B. coagulans|missouriensis|olivochromo-i analytisk I glucose- |glucose- |glucose- I genes glucose- blanding |isomerase |isomerase |isomerase_| isomerase_
I I I I
15 1 mM Co++ I 37.000 | 13.000 | 34.000 | 40.000 0,5 M Mg++ I_I_ 1_J_
III I
0,5 M Mg++ I 26.000 | 2.400 | 20.000 | 26.000
Metalionkombinationen 1 mM Co++, 0,5 M Mg++ frem-20 bringer de alt opnåelige Vmax værdier, men da Co++ aktivering ikke kan anvendes i industrielle processer, blev enzymerne også sammenlignet udelukkende under anvendelse af Mg++ aktivering.
Opfindelsen omfatter også en fremgangsmåde til fremstilling af en xyloseisomerase, og denne fremgangsmåde er 25 ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 2 angivne.
Man kan fremstille xyloseisomerasen ifølge opfindelsen ved hjælp af følgende stammer hørende til Streptomyces murinus gruppen: DSM 40091, DSM 40240, NRRL 8171, FERM-P 3710 eller DSM 3252. DSM er Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, 30 Gottingen, Tyskland. NRRL er Northern Regional Research Laboratory, USA. FERM er Fermentation Research Institute, Japan. Hvis
DK 157886B
6 xylose er til stede i mediet, er gæringsudbyttet tilfredsstillende, og man kan også fremstille en tilfredsstillende immobi-liseret xyloseisomerase.
Man kan fremstille xyloseisomerasen ifølge opfindel-5 sen ved hjælp af en stamme af Streptomyces murinus gruppen, som er konstitutiv hvad angår produktion af xyloseisomerase. I dette tilfælde er det ikke nødvendigt at inkorporere den dyre substratkomponent xylose i mediet, men enhver billig carbon-kilde, f.eks. glucose, er tilfredsstillende. Det har yderligere 10 overraskende vist sig, at det er muligt at finde virkelige konstitutive og glucoserepressionsresistente mutanter i S. murinus-gruppen; således er S. murinus DSM 3253, som er en virkelig konstitutiv og glucoserepressionsresistent mutant af S-·.--murinus DSM 3252, enestående i den forstand, at den pro-15 ducerer mere xyloseisomerase i medier med glucose end i medier med xylose, jfr. eksempel 1. Kendte mutantstammer af xylose-isomeraseproducerende Streptomyces-arter, som har været betegnet "konstitutive" (U.S.A. patent 4.399.222, eksempel 3 og U.S.A. Re 29.152, tabel 3), producerede alle højere enzymudbyt-20 ter i xyloseholdige medier end i medier uden den som induk- tionsmiddel fungerende xylose. Der henvises til eksempel 4, som repræsenterer en sammenligning mellem den xyloseisomerasepro-ducerende evne af en konstitutiv mutant, der hører til S. murinus gruppen, og som kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge 25 opfindelsen, og kendte "konstitutive" stammer af xyloseiso-meraseproducerende mikroorganismer, i relation til forskellige medier.
For at skabe et bedre overblik henvises til den følgende tabel II, der viser nogle betydningsfulde egenskaber 30 af'de Streptomyces murinus-stammer, hvortil der er henvist i denne beskrivelse.
Tabel II
DK 157886 B
7
Depo-
Depone- neret Inducer- Konsti- ringsnummer Speciel egenskab af os bar_tutiv 5 DSM 40091_Type stamme_x______ DSM 40240 Tidligere beteg net Streptomyces _roseoluteus_x____ DSM 3252 Isoleret fra 10 _jordprøve_x_ x_ DSM 3253 Muteret med hen blik på konsti- •_tutivitet_x__x NRRL 8171__x_ 15 FERM P-3710_ x_
Nogle taxonomiske egenskaber af fire stammer fra Streptomyces murinus-gruppen fremgår af den følgende tabel III.
Tabel III
Egenskaber, der tjener til at DSM DSM DSM DSM
20 differentiere Streptomyces. 3252 3253 40091 40240 TI Luft-mycelium, sporefarve R/Gr R/Gr R/Gr R/Gr 2. Pigment, melanoid -
3. Pigment, emvendt side - - Y/R Y/R
4. Pigment, opløselig - - + +
25 5. Morfologi af sporekæde S S S S
6. Sporeoverflade Sm Sm Sm Sm 7. Sukkerudnyttelse:
Arabinose (1%) + - +
Xylose (1%) + + + + 30 Inositol (1%) -
Mannitol (1%) + + + +
Rhamnose (1%) ---
Raffinose (1%) +
Fructose (1%) ++++ 35 Saccharose (1%) -
DK 157886 B
8 8. Metabolisering af organiske syrer
Oxalat (0,1%)
Malonat (0,3%) + - -
Lactat (1,0%) + (+) + 5 Citrat + + + nd
Gluconat + + + nd 5-ketogluconat (0,5%) nd nd
Acetat (0,1%) nd nd +
Butyrat (0,1%) nd nd + + 10 Succinat (0,1%) nd nd - nd
Adipat (0,1%) nd nd
Malat + + + + 9. Metabolisering af aromatiske forbindelser
Quininsyre - 15 p-hydroxybenzosyre (0,1%) + - - nd 10. Inhibitorer
Rose bengal (0,01%) nd nd +
Eosin y (1,00%) + nd + +
Toluidin-blåt (1.00%) nd nd - 20 Thalliumacetat (0,01 mg/ml) nd nd -
Te liur it (0,10 mg/ml) + nd +
Tetrazolium (0,10 mg/ml) nd nd - p. Aminosali- cylat (50,0 mg/ml) nd nd - + 25 Selenit (1.00 mg/ml) + nd + +
Na-Dodecyl- sulfat (0,10 mg/ml) - nd nd
Furan-2-carbon- syre-hydracid (0,01 mg/ml) nd nd + 30 Arsenit (0,10 mg/ml) - nd -
Pyronin (0,01%) nd
Thionin (0,01%) nd
Thiocyanat (50,0 mg/ml) nd 11. Ureaseaktivitet (2%) nd nd 35 12. Æggeblommereaktion (50 ml/1) nd 13. Hæcnolyse (70 ml/1) - nd nd 14. Resistens overfor lysozym (100 mg/1) nd nd - 15. Allantoin"(0,2%) + nd 40 16. Dekompos ition af aesculin (0,1%) - nd + + 17. Hydrolyse af casein (0,5%) - nd 18. Følsomhed overfor antibiotika
Cephaloridin (25 μg) + nd + + 45 Carbénicillin (100 μg) + nd + + '
Nitrofumatoin (100 μg) + nd nd nd
Gramaxin (30 μg) nd nd +
DK 157886 B
9 19. Aktivitet overfor antibiotika Bakterier:
Gram -
Escherichia coli - 5 Pseudononas aeruginosa nd nd
Pseudcmonas fluorescens _
Serratia marcescens - nd nd nd
Gram -t
Bacillus cereus - - + + 10 Bacillus circulans nd nd nd
Bacillus subtilis - nd + nd
Brevibacterium divaricatum - nd + nd
Staphylococcus aureus - nd + +
Streptococcus pyogenes - nd nd nd 15 Streptcmyces coelicolor - nd + nd Gærarter:
Candida albicans - nd + +
Sacch. cerevisiae - nd + nd
Svampe: 20 Aspergillus niger - nd + nd
Geotrichum candidum - - + +
Mucor ramannianis - nd + + 20. Vækst ved pH 9 nd 21. Resistens overfor NaCl 25 7% + + + + 10% -
22. Maksimal væksttemperatur 45°C 45°C 45°C 37°C
Betydningen af de i tabel III anvendte forkortelser er som følger: 30 + = positiv test (+) = tvivlsom = negativ test nd = ikke bestemt R = rød 35 Gr = grå Y = gul S = spiraler
Sm = glat
DK 157886 B
10 I modsætning til DSM 40091 (S. murinus typestammen) producerede DSM 3252 og DSM 3253 ikke antibiotica, jævnfør pkt.
19 i ovenstående tabel III. Fravær af antibiotica i kulturvæsken er væsentlig i forbindelse med produktion af enzymer til 5 næringsmiddelindustrien.
Med henblik på yderligere detaljer i forbindelse med prøverne i den ovenfor angivne tabel henvises til DSM-publika-tionen "Methoden zur Untersuchung von Streptomyceten und einigen anderen Actinomyceten" udgivet af Hans J. Kutzner, 10 Reiner M. Kroppenstedt og Felicitas Korn-Wendisch.
Under anvendelse af xyloseisomerasen ifølge opfindelsen kan man fremstille en immobiliseret xyloseisomerase. Det immobiliserede produkt kan fremstilles under anvendelse af mange forskellige immobiliseringsmetoder, der er kendt i anden 15 forbindelse, og det har vist sig, at de immobiliserede xylose-isomeraser har fremragende egenskaber i søjler til glucoseiso-merisering. Der henvises til eksempel 7.
Under anvendelse af xyloseisomerasen ifølge opfindelsen kan man foretage en isomerisering af glucose til fructose 20 ved, at en vandig opløsning af glucose isomeriseres ved hjælp af et opløseligt præparat af xyloseisomerase ifølge opfindelsen. I de tilfælde, hvor man foretrækker en fremgangsmåde, der gør brug af en opløselig xyloseisomerase, foregår isomerise-ringsprocessen tilfredsstillende.
25 Under anvendelse af xyloseisomerasen ifølge opfindel sen kan man foretage en isomerisering af glucose til fructose ved, at-en vandig opløsning af glucose isomeriseres ved hjælp af den immobiliserede xyloseisomerase. Det har vist sig, at man kan gennemføre en kontinuerlig glucoseisomerisering i industri-30 el målestok med en overlegen økonomi og en overlegen driftsstabilitet.
Opfindelsen skal nu illustreres ved de følgende eksempler.
DK 157886B
11
Eksempel 1-4 illustrerer gæring af xyloseisomerase; eksempel 5 og 6 illustrerer fremstilling af den immobiliserede xyloseisomerase, og eksempel 7 illustrerer anvendelsen af den immobiliserede xyloseisomerase.
5 Eksempel 1 Gæring i rystekolber I dette eksempel blev alle seks af de før angivne stammer af gruppen Streptomyces murinus gæret til fremstilling af xyloseisomerase. Hver af stammerne blev ved 37°C bragt til 10 at vokse på skråagarkulturer med følgende sammensætning udtrykt som g pr. liter destilleret vand.
Peptone (Difco) 6
Pepticase (Humco) 4 Gærekstrakt 3 15 Glucose 1
Oksekødsekstrakt 1,5
Agar 2,0 pH 7,3 5 ml af en suspension af celler fra hver stamme blev 20 derpå overført til 100 ml produktionsmedium i 500 ml Erlen- meyer-kolber med prelplader på bunden. Produktionsmedierne a og b (pH 7,2) bestod af følgende komponenter i de angivne mængder (udtrykt som g pr. liter postevand).
a: Majsstøbevand 60 25 (NH4)2S04 5 k2hpo4 1,5
Pluronic 0,3
Xylose 5
DK 157886B
12 b: Majsstøbevand 60 (f4>2S04 5 K nPO. 1,5 4
Pluronic 0/3 5 Glucose 5
Xylose og glucose blev autoklaveret separat og tilsat aseptisk efter afkøling til stuetemperatur. De podede kolber blev inkuberet ved 30°C. Efter 72 timers inkubering blev kulturvæskerne undersøgt for xyloseisomeraseaktivitet.
10 De fremkomne resultater er vist i den følgende tabel IV.
Tabel IV
Xyloseisomeraseproduktion s
Isomeraseaktivitet/ GINU/ml, gennemsnitsværdi 15 af 2-4 indbyrdes uafhængige gæringer.
Stamme Medium a Medium b _C0> 5% xylose)_(0,5% glucose) DSM 3252__2r_4_0^4_ DSM 3253 4j_6_5^3_ 20 DSM 40091_1^9_0^3_ DSM 40240_2j_8_OjJ_ NRLL 8171_ 2^6_0^4_ FERM-P 3710 2/8_0,3
En GINU er den enzymmængde, der isomeriserer 1 μιηοΐ 25 glucose til fructose pr. minut. Før isomeriseringen forbehandles prøverne med lysozym (2 mg/ml) ved 37°C i 30 minutter, og
DK 157886B
13 ++ ++
Mg og Co tilsættes i mængder, der er tilstrækkelige til at frembringe koncentrationer på henholdsvis 0,1 M og 0,002 M. Isomeriseringen finder sted ved 65°C i en 0,25 M maleat-stød-pude, der har pH 6,50, og som indeholder 5% glucose, 0,05 M 5 Mg++, 0,002 M Co++ og 0,05% CHCl^· Efter 20 minutters forløb standses reaktionen ved tilsætning af 0,1 M perchlorsyre. Den dannede fructose bestemmes derpå ved cystein-carbaxol-reaktio-nen (Lloyd et al., Cereal Chemistry 49, 544 (1972)).
Eksempel 2 10 Gæring i 1,5 1 fermentorer.
I dette eksempel dyrkedes DSM 3252 og DSM 3253 på skråagar som i eksempel 1, men ved 30°C. Efter inkubering én dag blev kolonierne høstet og anvendt til podning i 1,5 1 fermentorer. Gæringsmediet i fermentorerne omfattede: Majsstøbe-15 vand (40 g/1), (NH^^SO^ (4,5 g/1), I^HPO^ (1,5 g/1), skumdæmpningsmiddel (Pluronic 0,33 ml/1) og enten glucose (5 g/1) eller xylose (5 g/1), som tilsættes efter sterilisationen. pH blev indstillet på 7,0 med NaOH før sterilisationen. Fermentorerne arbejdede ved 30°C med en omrøring på 750 omdrejninger/min. og 20 en luftstrømningshastighed på 0,6 volumen/volumen pr. minut.
Efter 3 dage opnåedes følgende resultater, jfr. tabel V.
Tabel V
Stamme_DSM 3252_DSM 3253_
Kulhydrat Glucose Xylose Glucose Xylose 25 GINU/ml 0,35 3,20 4,78 4,87
Eksempel 3
DK 157886 B
14 Gæring i 1500 1 fermentor I dette eksempel bragte man DSM 3253 til at vokse på skråagar som i eksempel 1, men ved 30°C. Efter inkubering i 2 5 dage blev kolonierne overført til en steriliseret 30 'i fermentor, som indeholder majsstøbevand (12 kg), glucose (steriliseret separat, 1,5 kg) og skumdæmpningsmiddel (Pluronic, 50 ml).
Før steriliseringen blev pH indstillet på 7,0 med natriumhydroxid. Denne fermentor arbejdede ved 30°C med en omrøring på 10 200 omdrejninger/minut og en luftstrømningshastighed på 200 1/minut. Efter 25 timers forløb blev 150 1 fra denne fermentor podet i den 1500 1 fermentor, som indeholder majsstøbevand (60 kg), ammoniumsulphat (6,75 kg), kaliumdihydrogenphosphat (2,25 kg) og skumdæmpningsmiddel (Pluronic, 250 ml). pH blev indstil-15 let på 7,0 før steriliseringen ved 121°C i 60 minutter. Drifttemperaturen, omrøringen og beluftningen var henholdsvis 30°C, 190 omdrejninger/minut og 1000 1/minut. Efter 3 timers forløb tilsattes 8 kg glucose, og efter 10 timers forløb og derefter tilsattes glucose kontinuerligt med en hastighed på 0,5 kg/-20 time.
87 timer efter podningen indeholdt fermentoren 11,9 GINU/ml eller totalt 18 MGINU.
Eksempel 4
Komparative gæringer i rystekolber 25 Dette eksempel omfatter adskillige gæringer, nogle hørende til kendt teknik, nogle hørende til opfindelsen, alle i rystekolber. Gæringerne gennemføres i forskellige medier, som angivet i tabel VI. Gæringerne blev gennemført i to dage ved 30°C. Det procentvise forhold mellem udbytte på det glucosehol-
DK 157886 B
15 dige medium og udbyttet på det xyloseholdige medium fremgår af de søjler, der er betegnet "procentisk konstitutivitetsgrad".
Det bør bemærkes, at den "procentiske konstitutivitetsgrad" inkluderer resistens mod glucoserepression. Alle udbytter er ud-5 trykt som totalt GINU/ml, og de værdier, der er angivet i den følgende tabel, er gennemsnitsværdier af mellem 2 og 8 uafhængige gæringer.
16 DK 157886 B
li Sil S
IS]! S ' sserli 1 - ® * s s $ = &jh& * -r| r-4 ·Η - .ij— - — ... ——— — — 1 - —» ———· » "- 1 —— "
*J «ti S
HEti S-, O O CO W CO Ό S Si g| ΰ r~ o * * °1 " s-a § ^ ^ ^ d »5 _ ____________ S S <U oj Ν . Νΐ X d _ ιο in d r~ }H · G - vD pH rH rH P·* ΙΛ ojcj'P % · * % S3 2 o oooo S ^ W *“· O'
• » Λ H
I O h
•H O
i* H Qj ff 8¾ .* ro ^ & CQlDQ (8 .JÉ tø ________ - --- - - pH tø 4J--—-----
Λ1 »H φ O
J5 jj 4J O ή 16 c ·η o g
^ 3 .3 ^ 4J ΙΛ O Ift <N CO r-J
* 0 -P X ^ * H Hr-l S pi 3 <icq $ o\ °* i i k o) · o α,αι
® Cl« O' *j* O P- ΟΝ *β* pH
g ON^i-So fl, <* VO ro *' «I
S ·η «eH S w S ΐΐ o *>r o o o o U i 3«¥is l u il ~ttt;---------:--- S w ^ o o. a> »3 H 3 Λ H dP P w m 2 i-H g δ’^Ηο .. o d ru in 2 g
Bi 3 "hhHh s " ό ® °> d ** J3 «li £--^213¾^ ur ID VO » r~
2! S5 £ rJSISS I
-ri 4J ____________ > <0 02 ------ •H *”H *0 ,,
4j ej c W
p U 4> ti, I I Ω p» i &g §fksa s s s s s P s
H S 3.2 3 § 2 2 u ·3 o d* o O o O
li I SiS'S g d p —----------
9 ° I ( I -0 UJ
1 L^& 5 ^ S-SSSSi33 o OlftCnJJJ (rt *“* 2 W -H o 3 Φ ά G Cu +J .Jtf 4J £ tf 0 __________________ ?j X 5* P rtP 7j ^ VD σ* r-ι cm o 1Λ in co £ £ 3 B £ SS S Φ S rn *r rH nj rn Ch co 0> 1 , «I ϊ·.ϊ i · _______ g, g ——----- » si Sft8 5 s s s s s s a S fs s ^ irt '^“s do ^ o d (U d o O rH d
Si åd Si* I
g!>-------------
•H. *H
d4J fl _ O) 3 I I I HJ d M £ S ϋ til «-c d m n d vo in o -r o iui8ji«dæ +Jd o (N d in ru d d «r in WOincyti "il 1-1 cc u -H o 3 0) 5
OJOCU-PJi-UO B
Ό x____“__________ d aj •W Ό d CJl
Jj 2 fr'e i^S aid oo r~ d in eo d ru vo in ti S B & .3 o δ i? S S d «r -r ^ in d SSxffi’S'^i.SnT d ri d d d d ru ur d
Sd td S«i? B
(d -H 3 w _______ pH 4-1 ---------- 0) ki ω
u σ> «« c M
U°JjSsSS o ro vo r-4 ««* (N ON ro <N Γ; S^S'SS-p £ *· <* ^ o ® °i *t ® ® ;3H';9*h;3 2Bho ro O ^ ^ o O O <M ^ s3 Id Sj* I__________ ίο H1 ul ΙΛ ^ f** 5 ^pHHpHCOOnON^
Mddi'r-r-SSdd ΙΛ ιΛ i—Ι'ΉγΗι-ΗΗγΗΜ^'
rj (N fN ΓΗ (N rH pH H
DK 157886B
17
Mediet b' i spalte 4 er identisk med mediet b i spalte 1, med undtagelse af, at b' indeholder 1% glucose i stedet for 0,5% glucose. Medierne a' og a står i samme forhold til hinanden.
5 Den procentiske konstitutivitetsgrad, eksemplificeret for DSM 3253, spalte 11, beregnes som det procentiske forhold mellem udbytterne i GINU/ml på det glucoseholdige medium og på det xyloseholdige medium, dvs.
4,60 10 Af spalte 3 i relation til DSM 3253 fremgår det, at DSM 3253 producerer mere xyloseisomerase i medium b med glucose end i medium a med xylose. Ingen af de andre i skemaet figurerende stammer udviser dette ekstraordinære træk. Det fremgår også af tabellen, at den procentiske konstitutivitetsgrad af de 15 kendte "konstitutive" stammer er meget lav i sammenligning med den procentiske konstitutivitetsgrad af den konstitutive stamme DSM 3253, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Mediet B' i spalte 9 er fremstillet for at opnå en rimeligere beregning af den procentiske konstitutivitetsgrad.
20 Eksempel 5
Dette eksempel beskriver immobiliseringen af xyloseisomerase fremstillet ved hjælp af DSM 3252. En kulturvæske, som er fremstillet som beskrevet i eksempel 2 med xylose i mediet, blev centrifugeret, og supernatanten blev kasseret. Bund-25 fasen, som indeholder cellerne med xyloseisomeraseaktivitet, blev frysetørret.
6 g frysetørrede celler blev opløst i 150 g afioniseret vand med 3 g sprøjtetørret ægalbumin. pH blev indstillet fra 5,90 til 7,55, og 2,75 ml 50% opløsning af glutaraldehyd 30 blev tilsat for at tværbinde proteinerne. pH blev holdt på 7,5
DK 157886 B
18 i 35 minutter og derefter blev der fortyndet med 250 g afioniseret vand. Blandingen blev flokkuleret med 30 ml Superfloc C8351, et kationisk flokkuleringsmiddel, og 4,5 ml A130, et anionisk flokkuleringsmiddel. Det flokkulerede materiale blev 5 opsamlet ved filtrering, og filterkagen blev granuleret og tør ret. Aktiviteten af det tørrede granulat var 78,8 glucoseisome-raseenheder/g, hvorved aktivitetsenheden er defineret i NOVO-dokument F-850399.
Eksempel 6 10 Dette eksempel beskriver immobiliseringen af xylose- isomerase fremstillet ved hjælp af DSM 3253. En kulturvæske, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 2 med glucose i mediet, blev centrifugeret, og supernatanten blev kasseret. Celleslammet blev anvendt direkte til immobiliseringsforsøget.
15 6 g sprøjtetørret ægalbumin blev tilsat til 100 g celleslam med 8,9% tørstof. pH blev indstillet på 7,5 efter tilsætning af afioniseret vand til et totalt volumen af 1200 ml. 4,6 ml 50% glutaraldehyd blev tilsat, og pH blev holdt på 7.5 med tilsætning af NaOH-opløsning. 500 ml afioniseret vand 20 blev tilsat efter 1 times forløb, og blandingen blev flokkuleret med de samme flokkuleringsmidler som beskrevet i eksempel 5. Det flokkulerede materiale blev udvundet ved filtrering, g ^nuleret og tørret. Aktiviteten af det tørrede granulat var 184.5 glucoseisomeraseenheder/g, hvorved aktivitetsenheden er 25 defineret i NOVO-dokument F-850399.
Eksempel 7
Dette eksempel beskriver anvendelsen af det immobili-serede glucoseisomerase fremstillet ud fra DSM 3253. 11,7 g af det tørrede granulat fremstillet i eksempel 6 blev udblødt i
DK 157886 B
19 200 ml 45% w/w glucosesirup med pH 7,5 i to timer. Enzympartiklerne blev derpå overført til en med vandkappe forsynet søjle, og en 45% w/w glucosesirup med 0,4 g MgSO^, 7H20/1 og 2 mM NaHC03 med pH 7,5 blev kontinuerligt pumpet gennem søjlen ved 5 stuetemperatur. Efter 1 time blev søjletemperaturen hævet til 60°C, og strømningshastigheden blev indstillet således, at man opnåede en 41 - 44,5% konvertering til fructose. Aktiviteten voksede i løbet af de første 137 timers isomerisering. Strømningshastigheden af sirup efter 137 timers forløb var 0,88 g 10 siruptørstof pr. g enzym pr. time, og konventeringsgraden i den udgående sirup var 44,31. Forsøget blev afsluttet efter 328 timer, hvorved den endelige strømningshastighed af siruppen var 1,03 g siruptørstof pr. g enzym pr. time med en konverteringsgrad i den udgående sirup på 42,0%.

Claims (2)

1. Xyloseisomerase, kendetegnet ved, at den er identisk med den xyloseisomerase, som fremstilles ved en aerob, submers gæring af stammen Streptomyces murinus DSM 3253 på et 5 konventionelt medium, som indeholder carbon- og nitrogenkilder.
2. Fremgangsmåde til fremstilling af xyloseisomerasen ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man gennemfører en aerob, submers gæring af stammen Streptomyces murinus DSM 3253 på et konventionelt medium, som indeholder carbon- og nitrogenkilder, 10 hvorefter den således dannede xyloseisomerase udvindes.
DK071086A 1985-03-12 1986-02-14 Xyloseisomerase og fremgangsmaade til fremstilling deraf DK157886C (da)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK071086A DK157886C (da) 1985-03-12 1986-02-14 Xyloseisomerase og fremgangsmaade til fremstilling deraf

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK111185 1985-03-12
DK111185A DK111185A (da) 1985-03-12 1985-03-12 Xyloseisomerase, fremgangsmaade til fremstilling deraf, immobiliseret xyloseisomerase og fremgangsmaade til isomerisering af glucose til fructose
DK071086A DK157886C (da) 1985-03-12 1986-02-14 Xyloseisomerase og fremgangsmaade til fremstilling deraf
DK71086 1986-02-14

Publications (4)

Publication Number Publication Date
DK71086D0 DK71086D0 (da) 1986-02-14
DK71086A DK71086A (da) 1986-09-13
DK157886B true DK157886B (da) 1990-02-26
DK157886C DK157886C (da) 1990-07-30

Family

ID=8101126

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK111185A DK111185A (da) 1985-03-12 1985-03-12 Xyloseisomerase, fremgangsmaade til fremstilling deraf, immobiliseret xyloseisomerase og fremgangsmaade til isomerisering af glucose til fructose
DK071086A DK157886C (da) 1985-03-12 1986-02-14 Xyloseisomerase og fremgangsmaade til fremstilling deraf

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK111185A DK111185A (da) 1985-03-12 1985-03-12 Xyloseisomerase, fremgangsmaade til fremstilling deraf, immobiliseret xyloseisomerase og fremgangsmaade til isomerisering af glucose til fructose

Country Status (11)

Country Link
US (1) US4687742A (da)
EP (1) EP0194760B1 (da)
JP (1) JP2539373B2 (da)
KR (1) KR960013132B1 (da)
AT (1) ATE66248T1 (da)
CA (1) CA1316477C (da)
DE (1) DE3680802D1 (da)
DK (2) DK111185A (da)
ES (1) ES8703523A1 (da)
HU (1) HU196841B (da)
IN (1) IN161740B (da)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4894331A (en) * 1985-09-27 1990-01-16 Amgen Inc. Partial marker cassette mutagenesis of xylose isomerase
US5047511A (en) * 1989-08-28 1991-09-10 Pitman-Moore, Inc. Method for recovering recombinant proteins
US5219751A (en) * 1990-10-19 1993-06-15 Novo Nordisk A/S Novo Alle, Xylase isomerase purified from thermotoga maritima and thermotoga neapolitana
US5268280A (en) * 1990-10-19 1993-12-07 Novo Nordisk A/S Method for glucose isomerization using xylose isomerase purified from Thermotoga Maritima and Thermotoga Neapolitana
GB9502413D0 (en) * 1995-02-08 1995-03-29 Primalco Ltd Xylose isomerase
EP1230351A1 (en) 1999-11-10 2002-08-14 Novozymes A/S Fungamyl-like alpha-amylase variants
JP2002330763A (ja) * 2001-05-02 2002-11-19 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
US20110039311A1 (en) 2008-03-27 2011-02-17 Novozymes A/S Process for producing fermentation product from lignocellulose-containing material
EP2344650B1 (en) 2008-09-30 2014-04-23 Novozymes North America, Inc. Improvement of enzymatic hydrolysis of pre-treated lignocellulose-containing material with distillers dried grains
WO2010059413A2 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Novozymes, Inc. Polypeptides having amylolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20120028299A1 (en) 2008-12-30 2012-02-02 Novozymes North America, Inc. Enzymatic Hydrolysis Of Pretreated Lignocellulose-Containing Material With Dissolved Air Flotation Sludge
US20120276585A1 (en) 2009-12-21 2012-11-01 Cofco Corporation Method for producing fermentation products from lignocellulose-containing material
WO2011126897A2 (en) 2010-03-30 2011-10-13 Novozymes A/S Methods for enhancing by-products from fermentation processes
EP2591119B2 (en) 2010-07-07 2022-09-28 Novozymes North America, Inc. Fermentation process with GH61 polypeptides
AU2016293487B2 (en) 2015-07-13 2021-07-01 MARA Renewables Corporation Enhancing microalgal metabolism of xylose
EP4603591A3 (en) 2017-08-31 2025-10-22 Novozymes A/S Polypeptides having d-psicose 3-epimerase activity and polynucleotides encoding same
WO2025111274A2 (en) 2023-11-20 2025-05-30 Novozymes A/S Epimerase variants and polynucleotides encoding same

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US29152A (en) * 1860-07-17 August friedrich and conrad walter
NL147477B (nl) * 1965-05-11 1975-10-15 Agency Ind Science Techn Werkwijze voor het omzetten van glucose in fructose met behulp van een glucose isomeriserend enzym.
US3625828A (en) * 1969-04-16 1971-12-07 Miles Lab Process for production of glucose isomerase
US3622463A (en) * 1969-08-11 1971-11-23 Cpc International Inc Production of extracellular glucose isomerase by streptomyces
BE788843A (fr) * 1971-09-17 1973-03-15 Cpc International Inc Production de preparations enzymatiques d'isomerase de xylose (dextrose)
USRE29152E (en) 1971-09-17 1977-03-15 Cpc International Inc. Process for the enzymatic isomerization of dextrose to levulose
US3989596A (en) * 1974-03-28 1976-11-02 R. J. Reynolds Tobacco Company Aggregate of dried flocculated cells
US4137126A (en) * 1975-05-03 1979-01-30 Givaudan Corporation Process for preparing glucose isomerase using streptomyces glaucescens mutants
JPS5282783A (en) * 1975-12-27 1977-07-11 Mitsui Seitou Kk Production of fixed glucose isomeraze
US4399222A (en) * 1979-08-06 1983-08-16 A. E. Staley Manufacturing Company Carbohydrases from acidophilic streptomyces
ES485580A1 (es) * 1979-10-31 1980-08-01 Espanola Petrol Procedimiento de obtencion de glucosa-isomerasa
US4532208A (en) * 1983-05-05 1985-07-30 Uop Inc. Constitutive glucose isomerase producer
US4551430A (en) * 1983-10-27 1985-11-05 Uop Inc. Constitutive producer of a thermostable glucose isomerase
DK152764C (da) * 1985-06-14 1988-10-03 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt

Also Published As

Publication number Publication date
EP0194760A2 (en) 1986-09-17
EP0194760A3 (en) 1988-05-04
US4687742A (en) 1987-08-18
DE3680802D1 (de) 1991-09-19
ES552017A0 (es) 1987-02-16
DK111185A (da) 1986-09-13
DK157886C (da) 1990-07-30
KR860007375A (ko) 1986-10-10
ATE66248T1 (de) 1991-08-15
DK71086A (da) 1986-09-13
KR960013132B1 (ko) 1996-09-30
JP2539373B2 (ja) 1996-10-02
DK71086D0 (da) 1986-02-14
HUT40160A (en) 1986-11-28
HU196841B (en) 1989-01-30
DK111185D0 (da) 1985-03-12
CA1316477C (en) 1993-04-20
EP0194760B1 (en) 1991-08-14
ES8703523A1 (es) 1987-02-16
JPS61212285A (ja) 1986-09-20
IN161740B (da) 1988-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK157886B (da) Xyloseisomerase og fremgangsmaade til fremstilling deraf
US10968424B2 (en) Bacillus subtilis strain, culture method and use thereof
US3882635A (en) Method of producing cells of algae
NO134546B (da)
US3979261A (en) Production of glucose isomerase by bacillus coagulans
CN106754486B (zh) 一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法
US3843442A (en) Immobilized glucose isomerase
NO162347B (no) Fremgangsmaate for enzymatisk hydrolyse av raffinose.
SU655327A3 (ru) Способ получени глюкозоизомеразы
US4351903A (en) Process for obtaining glucose-isomerase
Sani et al. Isolation, partial purification and characterization of α-amylase from Bacillus subtilis
DK176108B1 (da) Levansaccharase-enzym, fremgangsmåde og mikroorganismer til fremstilling heraf og sammensætninger indeholdende dette
DK143714B (da) Fremgangsmaade til hydrolyse af lactose under dannelse af glucose og galactose
El-Sayed et al. Semicontinuous penicillin production by two Penicillium chrysogenum strains immobilized in calcium alginate beads
SU1125250A1 (ru) Штамм @ @ @ -82-продуцент холестериноксидазы
Colombo et al. Metabolic and genetic aspects of the relationship between growth and tetracycline production in Streptomyces aureofaciens
SU1705347A1 (ru) Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI, предназначенный дл получени 2Ъ-дезоксиаденозина
Park et al. Characterization of cell bound glucose isomerase of Streptomyces bikiniensis
SU1705338A1 (ru) Штамм дрожжей CaNDIDa ReQUINII - продуцент алкогольдегидрогеназы
JPH0248231B2 (ja) Shinkikishiranaazeoyobisonoseizoho
CN120173752A (zh) 一株假裸囊菌及其在秸秆低温堆肥中的应用
US2602043A (en) Method for producing tyrothricin
SU1171523A1 (ru) Способ получени мутантов бактерий-продуцентов полисахаридов
EP0320685A1 (en) A process for the obtention of thermostable alpha-amylases by culturing superproductive microorganisms at high temperatures
DK148360B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af uricase