DE2552871B2 - Optisch aktive Di- und Monoacetylester des Cyclopent-l-en-3,5-diols, optisch aktives Cyclopent-l-en-33-diol und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Optisch aktive Di- und Monoacetylester des Cyclopent-l-en-3,5-diols, optisch aktives Cyclopent-l-en-33-diol und Verfahren zu deren Herstellung

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Description

OCOCH3
CH3OCO
10
15
4. 3^-Diacetoxy-(S)-trans-cyclopent-l-en der Formel
Il
OCCH3
H3CCO
5. (SHrans-Cyclopent-l-en-SS-diol der Formel
OH
der mindestens einen Bestandteil aus der Gruppe
(1) einen Diacetylester des (R)-trans-Cyck>pent-len-3,5-diols,
(2) einen Diacetylester des (S)-trans-Cyclopent-len-3,5-diols und
(3) einen Diacetylester des cis-Cyclopent-l-en-3,5-diols,
enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man den Diacetylester des Cyc!opent-l-en-3£-dioIs der Einwirkung eines Mikroorganismus oder Enzyms mit einer Selektivität hinsichtlich seiner Geschwindigkeit der Hydrolyse der Acetyloxygnippe mit (R)-Konfiguration und der Acetyloxygruppe mit (S)-Konfiguration des genannten Diacetylesters unterwirft, wobei der Mikroorganismus eine Hefe der Species Saccharomyces und das Enzym ein in den Schalen von Citrusfrüchten enthaltenes hydrolytisches Enzym, ein vom faserartigen Fungus bzw. Pilz des Genus Aspergiilus oder dem Siofrwechseiprodukt davon erhaltenes hydrolytisches Enzym oder ein in Weizenkeimen enthaltenes hydrolytisches Enzym sind.
2. S.S-Diacetoxy-iRHrans-cyclopent-l-en der Formel
H3CCO O
3. S-Acetoxy-S-hydroxy-iRJ-trans-cyclopent-1 -en der Formel
OH
H3CCO O
HO
6. ^SJ-Acetoxy-SiRHiydroxycyclopent-l-en der Formel
OH
H3CCO O
Die Diacetylester von Cyclopent-l-en-S.S-diolen der folgenden Formel I
OCOCH3
CH3OCO
weisen die folgenden drei Klassen von Stereokonfigurationsisomeren auf, nämlich:
I-A Ein Diacetylester von (R)-trans-Cyclopent-l-en-3,5-diol (im folgenden manchmal als (R)-trans-Diester bezeichnet) der folgenden Formel I-A
50 OCOCH3
(I-A)
55 CH3OCO
I-B Diacetylester von (S)-trans-Cyclopent-l-en-3,5-diol (im folgenden manchmal als (S)-trans-Diester bezeichnet) der folgenden Formel I-B
OCOCH3
(I-B)
CH3OCO' I-C Ein Diacetylester vom cis-Cyclopent-l-en-SjS-diol
(im folgenden manchmal als cis-Diester bezeichnet) der folgenden Formel I-C
OCOCH3
OCOCH
>3
(I-C)
H3COCO
H,COCO
10
15
20
Die vorstehenden (R)-trans-Diester der Formel I-A und (S)-trans-Dieser der Formel I-B sind optisch aktive Verbindungen, jedoch sind die cis-Diester der Formel I-C optisch inaktive Verbindungen (meso-Isomere).
Wie aus den Stereokonfigurationsisomeren der vorstehenden Diester hervorgeht, weisen die Monoester und Diole, die beispielsweise durch Hydrolyse der vorstehenden Diester erhalten werden, ebenfalls die folgenden Stereokonfigurationsisomeren auf.
Monoacetylester
H-A Monoacetylester von (R)-trans-Cyclopent-l-en-3,5-diol (im folgenden manchmal als (R)-trans-Monoester bezeichnet).
H-B: Monoacetylester von (S)-trans-Cyclopent-len-3,5-diol (im folgenden manchmal als (S)-trans-Monoester bezeichnet).
H-C ^SJ-Acetoxy-^R^hydroxy-cydopent-1 -en (im folgenden manchmal als 3(S)-cis-Monoester bezeichnet).
H-D ^RJ-Acetoxy-^SJ-hydroxy-cyclopent-1 -en (im folgenden manchmal als 3(R)-cis-Monoester bezeichnet).
Alle vorstehenden Verbindungen H-A bis H-D sind optisch aktiv.
IH-A (R)-trans-Cyclopent-l-en-3,5-dioI (im folgenden manchmal als (R)-trans-Diol bezeichnet).
HI-B (S)-trans-Cyclopent-l-en-3,5-diol (im folgenden manchmal als (S)-trans-Dio! bezeichnet).
IH-C cis-Cyclopent-l-en-S^-diol (im folgenden manchmal als cis-Diol bezeichnet).
Darunter sind die vorstehenden trans-Diole HI-A und IH-B optisch aktive Verbindungen, jedoch wird das vorstehende cis-Diol HI-C durch dieselbe Formel wie diejenige des vorstehenden Diesters I-C ausgedrückt und ist eine optisch inaktive Verbindung.
Es ist bekannt, Diacylester von Cyclopent-l-en-3,5-diol beispielsweise durch solche Methoden herzustellen, wie (i) Behandlung von l,4-Dibromcyclopent-2-en in der Wärme mit einem Kaliumsalz einer aliphatischen Carbonsiäure, wie Kaliumacetat; (ii) Behandlung von l,4-Dibromcyclopent-2-en in einer aliphatischen Carbonsäure mit einem Silbersalz dieser Carbonsäure unter Erwärmung und (iii) Umsetzung von 1,4-Dibromcyclopent-2-en mit einem Tetraäthylammoniumsalz der genannten aliphatischen Carbonsäure in Aceton (L N. Owen und S m i t h, J. Chem. Soc. (1952) 4035].
Darüber hinaus können diese Diacylester auch nach einem Verfahren hergestellt werden, das darin besteht, daß man eine Lösung von l,4-Dibromcyclopent-2-en in einem in Wasser schwer löslichen organischen Lösungsmittel mit einer wäßrigen Lösung eines Metallsalzes der
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b5 genannten aliphatischen Säure in Gegenwart einer kationischen oberflächenaktiven Verbindung umsetzt [T.Toru, S.Kurozumi et aL, Synthesis (1974) 867.]
Wenn jedoch das l,4-Dibromcyclopent-2-en kristallisiert und getrennt wird, ist es zwar möglich, das cis-Isomere, jedoch nicht das trans-Isomere abzutrennen. Es ist daher nicht möglich, den trans-Diacetylester (I-A+1-B) durch die vorstehenden Verfahren direkt herzustellen.
Obwohl es einerseits — wenn auch mit Schwierigkeiten verbunden — möglich ist, das cis-Isomere und das trans-Isomere durch genaue fraktionierte Destillation aus dem nach den vorstehenden verschiedenen Methoden hergestellen Diacetylester (I) zu trernen, war es unmöglich, das optisch aktive trans-'somere des Diacetylesters (I) nach einer dieser Methoden zu trennen.
Es ist daher Ziel der Erfindung, aus einem Diacetylester des optisch inaktiven Cyclopent-l-en-3,5-diols [Diacetylester (I)] optisch aktive Diacetylester oder optisch aktive Monoester desselben oder optisch aktives Cyclopent-l-en-3,5-dioI herzustellen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den vorstehenden Verbindungen (R)-trans-Diester (I-A), (S)-trans-Diester (I-B), (R)-trans-Monoester (H-A), (S)-trans-Monoester (H-B), 3(S)-cis-Monoester (H-C), (R)-trans-Diol (HI-A) und (S)-trans-Diol (HI-B). Ein derartiges Verfahren soll auch in der Lage sein, die optische Reinheit einer Dioder Monoes*.erzusammensetzung, die mindestens einen entweder der genannten optisch aktiven trans-Dioder -Monoester oder cis-Monoester enthält, weiter zu erhöhen.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Diacetylesters des Cyclopent-l-en-3,5-diols, seines optisch aktiven Monoacetylesters oder seines optisch aktiven Diols aus einem Diacetylester des Cyclopent-l-en-3,5-diols der Formel
OCOCH3
CH3OCO
der mindestens einen Bestandteil aus der Gruppe
(1) einen Diacetylester des (R)-trans-Cyclopent-l-en-3,5-diols,
(2) einen Diacetylester des (S)-trans-CycIopent-l-en-3,5-dioIs und
(3) einen Diacetylester des cis-Cyclopent-l-en-3,5-diols,
enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Diacetylester des Cyclopent-l-en-3,5-diols der Einwirkung eines Mikroorganismus oder Enzyms mit einer Selektivität hinsichtlich seiner Geschwindigkeit der Hydrolyse der Acetyloxygruppe mit (R)-Konfiguration und der Acetyloxygruppe mit (S)-Konfiguration des genannten Diacetylesters unterwirft, wobei der Mikroorganismus eine Hefe der Species Saccharomyces und das Enzym ein in den Schalen von Citrusfrüchten enthaltenes hydrolytisches Enzym, ein vom faserartigen Fungus bzw. Pilz des Genus Aspergillus oder dem Stoffwechselprodukt davon erhaltenes hydrolytisches Enzym oder ein in Weizenkeimen enthaltenes hydrolytisches Enzym sind.
Weiterhin können erfindungsgemäß die Diacetyl-
ester, die mindestens einen Diacetylester des (R)-trans-Cyclopent-l-en-33-diols [(R)-trans-Diester (1-A)] oder einen Diacetylester des (S)-trans-Cyclopent-l-en-3,5-diols [(S)-trans-Diester (1-B)] enthalten, in einem Kulturmedium der Einwirkung entweder eines Mikroorganismus oder eines Enzyms, der bzw. das eine Selektivität in der Hydrolysegeschwindigkeit zwischen der Acetoxygruppe der (R)-Konfiguration und der Acetoxygruppe der (S)-Konfiguration aufweist unterworfen werden, um mindestens den genannten (R)-trans-Diester (I-A) und den genannten (S)-trans-Diester (I-B) im genannten Medium als Ester oder Diole von unterschiedlichen Acrylierungsgraden anzusammeln, wodurch der genannte (R)-trans-Diester (I-A) und (S)-trans-Diesier (I-B) selektiv hydrolysiert werden und gcwfinschtenfalls mindestens eines der genannten selektiv hydrolysieren (R)-trans-Isomeren und (S)-trans-Isomeren aus dem Kulturmedium abgetrennt und gewonnen wird.
Ausgangsmateriaüen für das erfindungsgemäße Verfahren können auch diejenigen sein, die V) den (R)-trans-Monoester (H-A) und 2') den (S)-trans-Monoe3ter (H-B) und zusätzlich 3') dencis-Diester(I-C) enthalten.
Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Ausgangsmaterial kann das Verhältnis von (R)-trans-Diester zu (S)-trans-Diester jeden gewünschten Wert aufweisen.
Wird als Ausgangsmaterial ein Diacetylester des cis-Cyclopent-l-en-3^-diols der Einwirkung der vorste- jo henden Mikroorganismen oder Enzyme unterworfen, so können das cis-Cyclopent-l-en-S.S-diol (MI-C) oder seine Monoester (H-C und/oder H-D) im Kulturmedium angereichert werden.
Als Verfahren zur Hydrolyse von Estern mit Mikroorganismen waren zwar bisher bekannt, beispielsweise die Hydrolyse der Cyclopentenonderivate mit der Saccharomyces-Species, wie von William J. Marsheck und Musateru M i y a η ο [s. Biochimica et Biophysica Acta, 316, 363 (1973)] angegeben, die Hydrolyse des 15-Desoxyprostaglandin-Ei-äthylesters mit Backhefe, wie von Charles J. S i h et al. [s. Journal of Chemical Society, Chemical Communication, 240 (1970)] beschrieben oder die Hydrolyse des Prostaglandin-Eimethylesters mit Rhizopus oryzae, wie von Charles J. S i h et al. [s. Journal of American Chemical Society, 97, 857 (1975), 97,865 (1975)] veröffentlicht Die Hydrolyse der Diacetylester des Cyclopent-l-en-3,5-diols mit Mikroorganismen war jedoch nicht bekannt So handelt es sich beispielsweise auch bei den aus Helvetica Chimica Acta, Band 56/1, Seite 449, Formel I, 1973 dargestellten Verbindungen allenfalls um eine racemische Mischung der (S)-Isomeren und (R)-Isomeren.
Eine erfindungsgemäß bevorzugt verwendbare Hefe der Saccharomy-ces-Species ist die der Gattung Saccharomyces cerevisiae, die als im Handel erhältliche Bäckerhefe bekannt ist
Besonders vorteilhaft als in den Schalen von Citrusfrüchten enthaltenes hydrolytisches Enzym ist Citrusacetylesterase, während als hydrolytisches Enzym, das aus einem faserartigen Pilz oder Fungus bzw. Fadenpilz erhalten wird, ein solches aus Aspergillus niger oder dessen Stoffwechselprodukt besonders geeignet ist Weiterhin ist Weizenkeimlipase als in Weizenkeimen enthaltenes hydrolytisches Enzym besonders geeignet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die folgenden Verbindungen:
Diacetylester von (R)-srans-Cyclopent-l -en-3,5-diol der Formel
Il
OCCH3
H3CCO O
Monoacetylester von (RHrans-Cyclopent-1-en-3,5-diol der Formel
OH
H3CCO O
Diacetylester von (SJ-trans-Cyclopent-l-en-3,5-diol der Formel
H3CCO
(S)-trans-Cyclopent-l-en-3,5-diol der Formel OH
HO
SiSJ-Acetoxy-SiRJ-hydroxycyclopent-l-en der Formel
OH
Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen sind als Ausgangsmaterialien für Produkte wertvoll, die bei der Herstellung von Prostaglandin oder seiner Analoga, Insbesondere von Verbindungen vom Prostaglandin Ε-Typ, verwendet werden. Da Prostaglandin pharmakologische Aktivitäten, wie eine hypotensive Aktivität, eine Aktivität der Kontraktion der glatten Muskulatur, eine antiinflammatorische Aktivität, eine Aktivität der
Inhibierung der Blutplättchenaggregation und eine Aktivität der Inhibierung der Magensekretion aufweist, fand es auf dem Gebiet der Medizin und Arzneimittel große Beachtung. Darüber hinaus sind die Cyclopentendiole und deren Derivate, die nach dem erfindungsge- r, mäßen Verfahren erhalten werden, auch als Zwischenprodukte für Duftstoffe oder landwirtschaftliche Chemikalien vom Pyrethroidtyp und deren Analoga wertvoll.
1. Verwendung einer Hefe, die der Saccharomyces- (() Species angehört
Erfindungsgemäß ist es möglich, wenn ein Kulturmedium, das den Diacetylester (I) enthält, mit einer Hefe angeimpft wird, die der Saccharomyces-Species angehört, vorzugsweise Bäckerhefe, durch Ausnutzung der ir> Selektivität im Hinblick auf die Hydrolyse der (R)- und (S)-Stellungen des; trans-Diesters im Kulturmedium mindestens eine Verbindung anzureichern aus der Gruppe, bestehend aus (i) dem Diacetylester des
(RJ-trans-Cyclopent-l-en-S.S-diolsßRJ-trans-Diester (1-A)], (ii) dem Monoacetylester des (R)-trans-Cyclopent-l-en-3,5-diols [(R)-trans-Monoester (H-A)] und (iii) dem (S)-trans-Cyciopent-l-en-3,5-diol [(S)-trans-Diol (HI-B)}
Somit kann erfiridungsgemäß mindestens eine dieser Verbindungen I-A, H-A und III-B, die im Kulturmedium angereichert wurden, daraus abgetrennt und gewonnen werden. Andererseits ist es auch gewünschtenfalls möglich, die Zusammensetzung, die in einer erhöhten Konzentration mindestens eine der vorstehenden Verbindungen I-A, H-A und III-B enthält, zu gewinnen. Alle diese Verbindungen I-A, H-A und III-B sind optisch aktive Stereokonfigurationsisomere.
Da ferner beide Verbindungen I-A und II-A Isomere darstellen, die in das (R)-trans-Diol (IH-A) überführbar sind, wird es möglich, durch Abtrennung der vorstehenden Verbindungen I-A und H-A von der Verbindung HI-B schließlich das (R)-trans-Diol und das (S)-trans-Diol zu trennen.
Als mit den vorstehenden Hefen anzuimpfendes Kulturmedium kann jegliches üblicherweise verwendetes zur Anwendung gelangen, solange es Hefen kultivieren bzw. züchten kann.
Verwendbar sind beispielsweise diejenigen, die in Kobo no Bunrui Ivoteiho (Identification methods of yeasts) Todai Shuppankai, S.38 und Pan Kobo (Baker's yeast), Tomotaro Sato, ed, Korinshoin, genannt werden. Ein solches Kulturmedium ist ferner auchinR-P.Lanzilotta, D.G.Brudley und K. M. McDonald, Applied Microbiology, 27, 130 (1974); W.J. Marsheck und M. Miyano, Biochim, Biophysica Acta, 316,363 (1973) erwähnt
Bei der Verwendung von ruhenden Zellen, wie Hefe, kann jegliche wäßrige Lösung, in der die Zellen ruhend verbleiben können, wie entionisiertes Wasser oder eine Pufferlösung als Lösung, in der die Zellen dispergiert werden, verwendet werden. Jedoch ist das Verfahren, bei dem eine wäßrige Lösung, die Glucose und monobasisches Natriumphosphat enthält, verwendet wird, auf Grund seiner hohen Umwandlung des Substrats bevorzugt
Als Verfahren zur Animpfung der vorstehenden Hefen können Verfahren wie die folgenden genannt werden.
(1) Ein Verfahren der Animpfung eines das Substrat b5 enthaltenden Kulturmediums mit den Hefezellen und Durchführung der Züchtung der Zellen darin.
(2) Ein Verfahren der Durchführung der Züchtung der
Hefezellen durch stufenweise Zugabe des Substrats, während das Zellenwachstum erfolgt.
(3) Ein Verfahren, das darin besteht, daß man zunächst die Hefezellen züchtet und danach letztere als ruhende Zellen mit dem Substrat in Berührung bringt.
Unter diesen Verfahren ist (3) auf Grund seiner hohen Umwandlung des Substrats bevorzugt. Das Substrat wird in einer solchen Konzentration, die das Wachstum der Hefezellen erlaubt, verwendet, wobei die bevorzugte Konzentration etwa 0,05 bis 25 Gewichts-%, bezogen auf die Kulturflüssigkeit bzw. -brühe, beträgt. Andererseits beträgt, wenn die ruhenden Zellen nach dem Verfahren (3) verwendet werden sollen, die Konzentration des Substrats geeigneterweise etwa 1,0 bis 20 Gewichts-%, bezogen auf das Gewicht der Hefezellen.
Wie vorstehend erwähnt, besitzen die Hefen, die der Saccharomyces-Species angehören, und insbesondere Bäcker-Hefe, eine Selektivität hinsichtlich ihrer Geschwindigkeiten der Hydrolyse der Acetoxygruppen der (R)- und (S)-Konfigurationen von insbesondere trans-Isomeren des vorstehenden Diacetylesters (I). Jedoch wurde als Folge der durchgeführten Untersuchungen gefunden, daß die Hydrolyse-Geschwindigkeit des cis-Isomeren die schnellste war, während die Hydrolyse-Geschwindigkeit des (S)-trans-Isomeren und des (R)-trans-Isomeren in der angegebenen Reihenfolge langsamer waren.
Somit wird es erfindungsgemäß möglich, den vorstehend genannten optisch inaktiven Diester (I) durch Nutzbarmachung dieses Unterschiedes in den Hydrolyse-Raten und durch geeignete Einstellung der Reaktionszeit, beispielsweise der Inokulationszeit der genannten Hefe, und der Bedingungen der Inokulation optisch zu spalten.
Weiterhin folgt aus dem Vorstehenden, daß das erfindungsgemäße Verfahren in seiner Anwendung nicht auf Substrate beschränkt ist, die optisch inaktiv sind, d. h. eine Mischung bestehend aus gleichen Mengen des trans-Isomeren und des cis-Isomeren, sondern auch auf solche angewandt werden kann, in welchen das eine oder das andere etwas weniger beträgt, d. h. ein Substrat von niedriger optischer Reinheit Ein Substrat dieser Art kann beispielsweise dadurch erhalten werden, daß man den Unterschied in den Hydrolyse-Raten ausnützt durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf einen Diacetylester des Cyclopent-l-en-33-diols, in dem das trans-Isomere reichlich vorhanden ist, und dann dieses gewinnt
Somit kann ein optisch aktives Isomeres von hoher optischer Reinheit dadurch erhalten werden, daß man die vorliegende Erfindung gemäß der vorstehend beschriebenen Weise wiederholt anwendet
Wenn beispielsweise ein Diacetylester des Cyclopentl-en-3,5-diols als Substrat verwendet wird, verschwindet der cis-Diester (I-C) in 9 bis 12 Stunden beispielsweise bei einer Züchtungstemperatur von 32° C, während die cis-Isomeren des Monoacetylesters des genannten Diols (II-C, H-D), die gleichzeitig gebildet werden, einen maximalen Wert innerhalb 3 bis 6 Stunden aufweisen und in 17 bis 20 Stunden verschwinden. Andererseits verschwindet etwa eine Hälfte des trans-Isomeren des Diacetylesters des genannten Diols (I-A und I-B) in etwa 12 Stunden, während die trans-Isomeren des Monoacetylesters des genannten Diols (II-A und H-B), die gleichzeitig gebildet werden, einen maximalen Wert in etwa 12 bis 15 Stunden aufweisen.
Wie vorstehend erwähnt, hydrolysiert die Hefe, die der Saccharomyces-Species angehört, und insbesondere Bäcker-Hefe, das (S)-trans-Isomere mit einer höheren Geschwindigkeit als das (R)-trans-lsomere.
Bei der Hydrolyse der trans-Diester in der vorstehend beschriebenen Kultur ergibt sich dementsprechend, daß beispielsweise, wenn die Kultur 17 Stdn. durchgeführt wird, in der Zusammensetzung der im Kulturmedium anwesenden Diester und Monoester der trans-Isomeren die (R)-trans-Isomeren beträchtlich angereicherter sind als die (S)-trans-Isomeren. Andererseits wird die Zusammensetzung der Diole reicher an (S)-trans-Isomeren. Wenn die Kultivierungszeit über 17 Stdn. verlängert wird, schreitet die Hydrolyse weiter fort, und die Mengen der Diester und Monoester von trans-Isomeren nimmt nach und nach ab. Andererseits nimmt die Menge der trans-Diole zu. In etwa 30 Stdn. beispielsweise wird die Zusammensetzung der Diester und Monoester im Kulturmedium noch reicher an (R)-trans-Isomeren, wobei etwa 70 bis 90% solche Isomeren sind. Im Falle der Zusammensetzung der Diole andererseits wird das Verhältnis von (S)-trans-Isomeren zu (R)-transisomeren noch näher als das bei 17 Stdn. Züchtung beobachtete. Dieser Trend wird bei Verlängerung der Züchtungszeit noch ausgeprägter.
Wie aus dem Vorstehenden hervorgeht, wird es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, verschiedene optisch aktive Verbindungen, beispielsweise durch Steuerung der Züchtungszeit, zu erhalten.
Als im erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Züchtungszeit werden etwa 12 bis 120 Stunden bevorzugt, wobei etwa 24 bis 72 Stunden besonders bevorzugt sind.
Obwohl die Züchtungstemperatur jegliche sein kann, die es den Hefezellen erlaubt, zu überleben, wird eine Temperatur von 25 bis 45° C bevorzugt
Zur Erhöhung der Umwandlungsrate ist es bevorzugt, daß das Substrat, wie beispielsweise die vorstehenden Diester und Monoester, gleichförmiger in der Kulturflüssigkeit dispergiert ist Es ist bevorzugt, beim gleichmäßigen Dispergieren eines wasserunlöslichen Substrats in der Kulturflüssigkeit die Kulturflüssigkeit zu bewegen. Es ist besonders bevorzugt, entweder eine Rührschaufel oder einen Propeller zu verwenden und die Kulturflüssigkeit heftig zu bewegen, um das Substrat in der Kulturflüssigkeit als Teilchen kleinerer Größe gleichmäßig zu dispergieren.
Die Isolierung des Produktes kann leicht in üblicher Weise erfolgen. Beispielsweise kann das Rohprodukt leicht dadurch erhalten werden, daß man das Produkt aus der Kulturflüssigkeit mit den üblichen organischen Lösungsmitteln, beispielsweise Äthylacetat, Äther, Chloroform, Benzol, Hexan und Cyclohexan, extrahiert und danach die Extrakte in üblicher Weise behandelt Bei der Durchführung der wirksamen Gewinnung des Produktes ist es erwünscht, sich der Aussalzmethode und der kontinuierlichen Extraktionsmethode zu bedienen. Die Säulenchromatographie-Methode oder die Dünnschichtchromatographie-Methode wird zur Reinigung des Rohproduktes verwendet
Anderersiets kann der so isolierte trans-Diester oder trans-Monoester, dessen optische Aktivität erhöht wurde, als Ausgangsmaterial verwendet werden, oder das vorstehende Diol oder der Monoester, dessen optische Reinheit in einem größeren Ausmaß erhöht wurde, kann ebenfalls nach Acylierung mit Hilfe einer geeigneten Methode und Umwandlung zu dessen Monoester oder Diester als Ausgangsmaterial verwendet werden, und eine weitere Erhöhung der optischen Reinheit kann dadurch erzielt werden, daß man erneut die erfindungsgemäße Züchtungsmethode anwendet, worauf sie in üblicher Weise getrennt werden.
r) Es wird somit nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren ermöglicht, mindestens eine der Verbindungen (i) (R)-trans-Diester (I-A), (ii) (R)-trans-Monoester (H-A) und (iii) (S)-trans-Diol (HI-B) oder die genannten optisch aktiven Diester, Monoester oder Diole, in denen
ίο wenigstens eine dieser Verbindungen in einer noch höheren Konzentration enthalten ist, zu erhalten.
Die Verbindungen I-A, H-A und HI-B, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, sind nach an sich bekannten Verfahren ineinander überführbar, wie z. B. durch alkalische Hydrolyse und Acylierung. Weiterhin kann das geschützte 4-Hydroxycyclopent-2-en-l-on von diesen Verbindungen nach einer geeigneten Methode abgeleitet werden. Wenn anschließend dieses geschützte 4-Hydroxycyclopent-2-en-l-on «, /3-dialkyIiert wird, kann leicht eine Verbindung vom Prostaglandin Ε-Typ erhalten werden.
2-1. Verwendung von (A) dem hydrolytischen Enzym,
das in der Schale von Citrusfrüchten enthalten ist,
oder (B) dem hydrolytischen Enzym, erhalten vom
faserartigen Fungus, der dem Genus Aspergillus
angehört, oder seinem Stoffwechselprodukt
Wenn erfindungsgemäß ein Kulturmedium, enthaltend den vorstehenden Diacetylester (I), angeimpft wird
jo mit (A) dem hydrolytischen Enzym, das in der Schale von Citrusfrüchten enthalten ist oder (B) dem hydrolytischen Enzym, das vom faserartigen Fungus, der dem Genus Aspergillus angehört, oder seinem Stoffwechselprodukt erhalten wird, ist es möglich, unter Nutzbarmachung der Unterschiede in den Hydrolysegeschwindigkeiten dieser Enzyme (A) und (B) bei der Hydrolyse der Acetoxygruppen der (R)- und (S)-Konfigurationen des Diacetylesters (I), insbesondere seiner trans-Isomeren, im genannten Kulturmedium mindestens eine der Verbindungen anzureichern aus der Gruppe bestehend aus (i) dem (S)-trans-Diester (I-B), (ii) dem (R)-trans-Monoester (H-A) und (iii) dem 3(S)-Acetoxy-5(R)-hydroxycyclopent-l-en, d.h. dem vorstehenden 3(S)-cis-Monoester (H-C).
Somit ist es erfindungsgemäß möglich, auch unter Verwendung der vorstehenden Enzyme (A) oder (B) und indem man in derselben Weise arbeitet wie in dem Fall, bei dem die vorstehenden Hefen, die der Species Saccharomyces angehören, verwendet werden, mindestens eine der vorstehenden Verbindungen I-B, II-A und H-C abzutrennen und zu gewinnen. Es ist ferner auch möglich, gewünschtenfalls die genannte Diesterzusammensetzung oder Monoesterzusammensetzung, die mindestens eine dieser Verbindungen in einer höheren Konzentration enthält, zu gewinnen.
Als das vorstehende hydrolytische Enzym (A) wird vorteilhafterweise das als Citrusacetylesterase bekannte Enzym verwendet [vergL »Archiv. Biochem.«, 15, 415 (1947)].
Das in der enzymatischen Reaktion verwendete Enzym kann in Form eines Enzyms, erhalten durch die übliche Enzym-Reinigungsmethode, eines roh gereinigten Enzyms, erhalten durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat oder einem organischen Lösungsmittel, oder eines rohen Enzyms, wie ein zerstoßenes Produkt der Schalen von Citrusfrüchten oder ein Extrakt davon, verwendet werden.
Andererseits ist mit Vorteil als das vorstehende
hydrolytische Enzym (B) das hydrolytische Enzym, hergestellt aus Aspergillus niger ATTCC 9142 (Hinterlegungsinstitut: American Type Culture Collection, Maryland, USA), verwendbar. Somit können die in diesen enzymatischen Reaktionen verwendeten hydrolytischen Enzyme in jeglicher von solchen Formen vorliegen, wie das Enzym, erhalten durch die übliche Enzym-Reinigungsmethode, das roh gereinigte Enzym, erhalten beispielsweise durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat oder einem organischen Lösungsmittel, oder ein Rohenzym, wie eine Kultur, Kulturflüssigkeit oder Zellen oder Mikroorganismen, sowie deren Extrakte.
2-2. Verwendung des hydrolytischen Enzyms (C),
das in Weizenkeimen enthalten ist
Erfinclungsgemäß ist es auch möglich, ein Kulturmedium, das den Diacetylester (I) enthält, mit einem hydrolytischen Enzym (C) anzuimpfen, das in Weizenkeimen enthalten ist, und unter Ausnutzung in gleicher Weise, wie vorstehend beschrieben, der Selektivität in den hydrolytischen Raten im Kulturmedium mindestens eine der Verbindungen von (i) (R)-trans-Diester (I-A), (ii) (R)-trans-Monoester (H-A) und (iii) 3(S)-cis-Monoester (H-C) anzuhäufen.
Demnach können die vorstehenden optisch aktiven Verbindungen I-A, H-A und H-C unter Verwendung des Enzyms (C) isoliert werden, indem man in derselben Wjise, wie vorstehend beschrieben, arbeitet. Die Diester- oder Monoester-Zusammensetzungen, die diese Verbindungen in einer höheren Konzentration enthalten, können ebenfalls hergestellt werden.
Als solches Enzym (C) ist mit Vorteil beispielsweise Weizenkeimlipase (Glycerinester-Hydrolase EC Nr. 3.1.1.3) verwendbar. Es kann auch ein Enzym jeglicher Form, hergestellt wie im Falle des vorstehenden Aspergillus niger, verwendet werden.
3. Es ist somit erfindungsgemäß möglich, einen Diester, Monoester oder ein Diol, enthaltend mindestens eines der vorstehenden optischen Isomeren, in einer höheren Konzentration herzustellen durch Animpfen des vorstehenden Diacylesters (I) mit entweder den vorstehend unter 1 beschriebenen Hefen der Saccharomyces-Species oder den vorstehend unter 2-1 und 2-2 beschriebenen hydrolytischen Enzymen (A), (B) und (C), wonach diese hergestellten Diester, Monoester oder Diole aus dem Kulturmedium abgetrennt werden. Im Falle des Diols kann dieses nach einer wie vorstehend beschriebenen geeigneten Methode in einen Diester oder Monoester überführt werden, und der Monoester kann gegebenenfalls in den Diester überführt werden, der dann erneut mit den vorstehenden Hefen oder dem hydrolytischen Enzym (A), (B) oder (C) angeimpft werden kaiüj, um eine Zusammensetzung von noch höherer optischer Reinheit herzustellen. Dies bedeutet, daß es erfindungsgemäß möglich ist, das erfindungsgemäße Verfahren durch geeignete Kombination der vorstehenden Hefen oder Enzyme und Durchführung des Arbeitsganges so oft als möglich durchzufahren.
Als Reaktionslösung, mit der das Enzym (A), (B) oder (C) angeimpft wird, kann jegliche verwendet werden, die die Aktivität des Enzyms beibehalten kann, wie entionisiertes Wasser oder eine Pufferlösung. Verwendbare Pufferlösungen sind beispielsweise diejenigen, die in »Data for Biochemical Research« von R. M. C. Dawson, D.CElliott, W.H.EIliott und K. M. Gones, Oxford, Clarendon Press, 1969, Seite 475 genannt sind. Obwohl als lonenkonzentration der Pufferlösung diejenige, die eine wesentliche enzymatische Aktivität erlaubt, zufriedenstellend ist, ist eine molare Konzentration von 1 χ 10~5 bis 5,0 bevorzugt.
-, Andererseits ist der ρκ-Wert zufriedenstellend, der eine wesentliche enzymatische Aktivität erlaubt. Besonders bevorzugt ist jedoch ein pH-Wert im Bereich von ±2,0 um den optimalen pH- Wert des verwendeten Enzyms.
Obwohl andererseits die Konzentration des Sub-
Ki strats, wie beispielsweise des Diacetylesters (I) oder des vorstehenden Monoesters, jegliche sein kann, die eine wesentliche enzymatische Aktivität ermöglicht, ist eine Konzentration bevorzugt in der Größenordnung von 1 χ 10-4 bis 25,0 Gewichts-%, bezogen auf die Reak-
Γ) tionsflüssigkeit, wobei eine Konzentration in der Größenordnung von lxlO~3 bis 5,0 Gewichts-% besonders bevorzugt ist.
Die Reaktionszeit, während der diese Enzyme verwendet werden, ist vorzugsweise eine von beispielsweise etwa 6 bis 120 Stunden, jedoch ist eine Zeit von 12 bis 48 Stunden besonders bevorzugt. Als Reaktionstemperatur ist diejenige zufriedenstellend, die das Fortschreiten der enzymatischen Reaktion ermöglicht, jedoch ist eine Temperatur von 25 bis 45° C bevorzugt.
2r> Zur Erhöhung der Hydrolyse-Rate des Ausgangsmaterials zum gewünschten Produkt ist es erfindungsgemäß erwünscht, daß das Substrat möglichst gleichmäßig in der Reaktionsflüssigkeit dispergiert ist, und somit wird vorzugsweise die Reaktionsflüssigkeit bewegt bzw.
jo gerührt, um das Substrat, welches eine wasserunlösliche Verbindung ist, gleichmäßig zu dispergieren. Es ist besonders bevorzugt, eine Rührschaufel oder einen Propeller zu verwenden und heftig zu rühren bzw. zu bewegen, um eine gleichmäßige Dispersion des Substrats in der Reaktionsflüssigkeit als Teilchen von kleinstmöglicher Größe zu erzielen.
Wie im Falle der Verwendung von Hefe (vorstehend unter 1) beschrieben, kann die Isolierung des gewünschten Produktes in üblicher Weise leicht erfolgen durch eine Methode der Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel oder eine Methode der Abtrennung des Produktes durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes oder eines synthetischen Absorbens. Beispielsweise kann das Rohprodukt des gewünschten Cyclopentenderivats dadurch erhalten werden, daß man das Produkt aus der Reaktionsflüssigkeit mit einem üblichen organischen Lösungsmittel, beispielsweise Äthylacetat, Äther, Chloroform, Benzol, Hexan und Cyclohexan, extrahiert,
so wonach die Extrakte in üblicher Weise, wie Entfernung des Lösungsmittels durch Verdampfung, behandelt werden.
Um die Gewinnung des Produktes wirksam durchzuführen, ist die Anwendung des Aussalzens und der kontinuierlichen Extraktionsmethode noch bevorzugter. Die Reinigung des Rohproduktes erfolgt mit Hilfe solcher Methoden, wie Säulenchromatographie, präparative Dünnschichtchromatographie und präparative Gaschromatographie.
Die Hefen, wie die vorstehende Bäcker-Hefe, besitzen das Merkmal, daß, obwohl die Ausbeute des gewünschten optisch aktiven Produktes im allgemeinen niedrig ist, wenn diese Hefen verwendet werden, das erhaltene Produkt in sehr hoher optischer Reinheit erhalten werden kann. Andererseits ist ein Merkmal des Verfahrens unter Verwendung der vorstehenden Enzyme (A), (B) und (C), daß, obwohl die optische Reinheit des gewünschten Produktes niedriger ist, als
anwesend waren. Dies zeigt die Anwesenheit eines Enantiomeren in einer Menge von 90% e.e. [enantiomerem Überschuß] an. Somit beträgt die maximale wenn Bäcker-Hefe verwendet wird, die Monoester, in denen die vorstehende optische Aktivität erhöht wurde, in einer außerordentlich hohen Ausbeute erhalten werden können. Darüber hinaus bestehen derartige Vorteile, wie beispielsweise, daß, da im Falle der Methode unter Verwendung dieser Enzyme die Reinheit des Enzyms erhöht werden kann, Nebenreaktionen außer der gewünschten Hydrolyse aufgehalten bzw. verhindert werden können. Darüber hinaus ist es möglich, diese Enzyme auf einem Trägermaterial, d. h. als immobilisierte Enzyme, zu verwenden.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich die Teile auf das Gewicht.
Verfahren zur Bestimmung der absoluten Konfiguration
(a) Bestimmung der absoluten Konfiguration von Cyclopent-1 -en-3,5-dioI
Es wurde Bäcker-Hefe verwendet, und die Züchtung des Substrats 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en (Molverhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem = 54:46) wurde 17 Stunden durchgeführt, um ein Produkt zu erhalten, welches durch Säulenchromatographie getrennt wurde, um Cyclopent-1-en-3,5-diol (Molverhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem = 55 :63) mit [«]■„"= — 44° zu erhalten. Die vorstehenden cis/trans-Verhältnisse wurden durch Gaschromatographie und NMR bestimmt. Die Bestimmung der absoluten Konfiguration des so erhaltenen Diols wurde wie folgt durchgeführt
Dieses Diol wurde zunächst in an sich bekannter Weise in das Dibenzoat überführt, welches dann durch alkalische Hydrolyse in das Monobenzoat überführt wurde. Dieses wurde dann in 4-BenzoyIoxycyclopent-2-en-l-on durch Oxydation mit Chromsäure unter Verwendung von Aceton als Lösungsmittel überführt (es wurde vorab bestätigt, daß keine Veränderungen in der absoluten Konfiguration der Substituent-tragenden Kohlenstoffatome als Foige der vorstehenden verschiedenen Reaktionsstufen auftraten).
Bei der Untersuchung des Zirkulardichroismus des erhaltenen Produktes wurde ein negativer Cotton-Effekt ([θ]226= -47 900°, c=3,2xlO-5) beobachtet Es wurde somit gefunden, daß dieses Produkt, von dem bekannt ist, daß es eine negative Chiralität nach der Exciton-Chiralitäts-Methode [H. H ar ad a und K. Nakanishi, »Accounts Chem. Res.«, 5, 257 (1972) und dort genannte Literatur] aufweist, eine S-Konfiguration besitzt.
D. h, es wurde gefunden, daß das trans-Isomere von Cydopent-l-en-3,5-diol, das einen negativen Wert für den [α]™-Wert aufweist, S-Konfiguration besitzt Es ist klar, daß das cis-Isomere desselben Diols optisch inaktiv ist
(b) Bestimmung der absoluten Konfiguration
von 3,5-Acetoxycyclopent-l-en und trans-3-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-1 -en
Es wurde Bäcker-Hefe verwendet, und die Züchtung des Substrats, 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en (Molverhältnis von eis- zu trans-lsomerem = 54 :46), wurde 30 Stunden durchgeführt, um ein Produkt zu erhalten, das durch Säulenchromatographie getrennt wurde, um trans-S.S-Diacetoxycyclopent-l-en mit [«]?= +199°
■-) und trans-S-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-l-en mit [«]?= +199° zu erhalten. Unter Verwendung dieser Verbindungen wurde deren absolute Konfiguration wie folgt bestimmt.
Wenn das vorstehende trans-S.S-Diacetoxycyclopent-1-en in an sich bekannter Weise alkalisch hydrolysiert wurde und in trans-Cyclopent-l-en-3,5-diol überführt wurde, wies es einen [«]?= +186° auf. Es wurde somit gefunden, daß das trans-Cyclopent-1-en-3,5-diol mit einer positiven spezifischen Drehung eine
r, absolute Konfiguration aufweist, die derjenigen des trans-lsomeren entgegengesetzt ist, welches eine negative spezifische Drehung aufweist [Daß keine Veränderung in der absoluten Konfiguration des Substituent-tragenden Kohlenstoffs während der vor-
2(i stehenden Stufe der alkalischen Hydrolyse auftritt, geht aus »Helv. Chim. Acta«,53,739 (1970) hervor.]
Es wurde daher gefunden, daß das vorstehende trans- Isomere von S^-diacetoxycyclopent- l-en,daseine positive spezifische Drehung aufweist, R-Konfiguration
2") besitzt
Indem man in ähnlicher Weise mit dem vorstehenden trans-3-Acetoxy-5-hydroxycyclopent-1 -en vorging, wurde das entsprechende Diol mit einer positiven spezifischen Drehnung erhalten. Somit wurde gefunden,
ja daß diese Verbindung R-Konfiguration besitzt
(c) Bestimmung der absoluten Konfiguration von
cis-3-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-1 -en
Das trans-S-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-l-en, erhalten unter Verwendung von Bäcker-Hefe, und dessen absolute Konfiguration als R-Konfiguration bestimmt wurde, wurde durch Oxydation mit Chromsäure in
4(i 4-Acetoxycyclopent-2-en-l-on überführt Die spezifische Drehung dieser Verbindung wurde zu +74° ermittelt.
Getrennt wurde die Züchtung des Substrats 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en (Molverhältnis des cis-Isomeren 5 zu trans-Isomerem=54 :46) 22 Stunden unter Verwendung von Citmsacetylesterase durchgeführt, um ein Produkt zu erhalten, welches durch Säulenchromatographie getrennt wurde, um S-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-1-en zu erhalten. Dieses wurde weiter der
so Gaschromatographie unterworfen, um das cis-lsomere allein zu erhalten. Dieses cis-3-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-1-en wurde ähnlich wie vorstehend beschrieben oxydiert, um 4-Acetoxycyclopent-2-en-l-on, dessen spezifische Drehung —15° betrug, zu erhalten.
Wenn somit die vorstehenden zwei Verfahrensweisen
. verglichen werden, ergibt sich, daß die 3-Stellung des vorstehenden cis-3-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-1 -ens, d.h. der Kohlenstoff, an dem die Acetoxygruppe gebunden ist, S-Konfiguration aufweist, und somit
to wurde die Verbindung als das cis-3(S)-Acetoxy-5-(R)-hydroxycyclopeiit-1-en ermittelt
Methode zur Bestimmung der optischen Reinheit
Das NMR-Spektrum von trans-3-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-l-en mit [a]^=+229°, erhalten unter Verwendung einer Kultur von 3,5-Diacetoxycyclopentl-en mit Bäcker-Hefe, wurde in Gegenwart von
Tris-(3-trifluonnethylhydroxymethylen-d-camphorato)-europium (III) [vergL C C H i η c k 1 e y, »J. Am. Chem. Soc.«,91,5160(1969)undG.M.Whitesides, D.W. Lcwis, ibidem, 92, 697? (1970)] gemessen. Als Folge davon wurde gefunden, daß zwei Klassen von optisch aktiven Verbindungen in einem Verhältnis von 95:5 anwesend waren. Dies zeigt die Anwesenheit eines Enantiomereo in einer Menge von 90% e.e. [enantiomerem Überschuß] aa Somit beträgt die maximale spezifische Drehung des trans-Acetats 255°.
Andererseits wurde das vorstehende trans-Monoacetat mit [α]?= +229° (90% e.e.) acetyliert und in das trans-a^-Diacetoxycyclopent-1 -en mit [«] f = + 208° Oberführt Somit wird die maximale spezifische Drehung des trans-Diacetats 231 °.
Darüber hinaus wurde das CycIopent-l-en-3,5-diol (cis-Isomeres zu trans-Isomerem=34:66) mit [«]"= —81° (bezogen auf das trans-Isomere), das bei der Züchtung von 3^-Diacetoxycyclopent-l-en mit Bäcker-Hefe abgetrennt wurde, in ähnlicher Weise in ein diacetyliertes Produkt in üblicher Weise überführt Dieses wies einen [<x]" = — 73° auf. Somit wird die maximale spezifische Drehung des trans-Diols 237°.
Unter Verwendung der maximalen spezifischen Drehung vom erhaltenen Diacetat, Monoacetat und Diol, die wie vorstehend beschrieben berechnet wurde, können die optischen Reinheiten (% e.e.) der verschiedenen, in den verschiedenen Fällen getrennten Verbindungen durch Messung ihrer spezifischen Drehungen ([«] 1S) berechnet werden.
Beispiel 1
(Verwendung von Bäcker-Hefe) (1) Kultur (48stündiger Züchtung)
(2) Trennung und Reinigung des Produktes
Nach Beendigung der Züchtung wurden die Zellen aus der Kulturflüssigkeit unter Verwendung einer Zentrifuge abgetrennt Nach der Zugabe von Ammoniumsulfat zu der überstehenden Flüssigkeit wurde sie einer Aussalzbehandlung unterworfen und dann fünfmal unter Verwendung von je 21 Äthylacetat extrahiert Die so erhaltenen Extrakte wurden mit dem durch getrennte Extraktion der Zellen mit Äthylacetat erhaltenen Extrakt vereinigt, wonach die vereinigten Extrakte mit Glaubersalz getrocknet wurden. Das Lösungsmittel wurde dann abdestilliert, wobei 7,23 g eines Rohproduktes erhalten wurden.
Als dieses Produkt der Dünnschichtchromatographie unterworfen wurde (Entwicklungslösungsmittel: eine Mischung aus 50 Teilen Äthylacetat und 50 Teilen Benzol), wurden Flecken hauptsächlich bei einem RrWert von 0,58, 0,25 und 0,04 als Folge der Kultur erhalten.
Als dieses Rohprodukt durch trockene Säulenchromatographie gereinigt und gesammelt wurde, wurden 132 mg (Ausbeute 0,6%) einer Flüssigkeit entsprechend einem Rf-Wert von 0,58,520 mg (Ausbeute 3,2%) einer Flüssigkeit entsprechend dem Rf-Wert von 0,25 und 2,62 g (Ausbeute 25,2%) einer Flüssigkeit entsprechend dem Rf-Wert von 0,04 erhalten.
to
15
20
25
30
35
27Og handelsübliche Bäcker-Hefe, 90 g Glucose, 67,5 g monobasisches Natriumphosphat und 1,81 entionisiertes Wasser wurden in einen abtrennbaren 5-l-Rundkolben eingebracht, und nach der Herstellung einer homogenen Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen. Zu dieser Lösung wurden dann 18 g 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en (Verhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem = 54 :46) als Substrat gefügt wonach 48 Stunden bei 32" C unter heftigem Rühren mit einem Rührpropeller gezüchtet wurde.
50
55
(3) Identifizierung des Produktes
Die Eigenschaften der Flüssigkeit, die dem Rf-Wert von 0,58 entsprach, waren wie folgt:
IR-Spektrum (Flüssigkeitsfilm, cm-1): 1735,1240,1035
NMR-Spektrum (60 MHz, CCl4, ppm): 2,00 (6H, s), 2^1 (2H, t, J=6Hz), 5,73 (2H, t j=6Hz), 6,06 (2H, s)
Massen-Spektrum (7OeV, m/e, %):
141 (M+-COCH3.2), 125(73), 124(65), 99 (27), 82 (100) 43(80)
[«]«= +215° (C=0,023,CH3OH)
Diese Eigenschaften bestätigen, daß dieses Produkt das (RJ-trans-S^-Diacetoxycyclopent-l-en (93% e.e.) ist.
Die Eigenschaften der Flüssigkeit, die dem Rf-Wert von 0,25 entspricht, sind die folgenden:
IR-Spektrum (Flüssigkeitsfilm, cm-'):
3350,1730,1430,1375,1355,1250,1150,1120
NMR-Spektrum (60 MHz, CCl4, ppm): 2,00 (3H, s), 2,10 (2H, m\ 4,35 (1H, s), 430(lH,m),5,75(lH,m),6>00(2H,m)
Massen-Spektrum (7OeV, m/e, %):
99 (M+-COCH3,3), 82 (100), 43 (80) [«] g> = + 258° (C=0,032, CH3OH)
Diese Eigenschaften bestätigen, daß dieses Produkt SiRJ-Acetoxy-SiRJ-hydroxycyclopent-l-en (100% e.e.) ist
Die IR-, NMR- und Massen-spektroskopischen Daten der Flüssigkeit die dem Rf-Wert von 0,04 entspricht waren in Übereinstimmung mit denjenigen eines authentischen Cyclopent-l-en-3^-diols, einer bekannten Verbindung. Somit wurde diese Flüssigkeit als Cyclopent-l-en-3,5-diol identifiziert Darüber hinaus wurde gefunden, daß dieses Cyclopent-l-en-3,5-diol ein Verhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem von 17 :9 und [«]S> = -15° (C-0,072, CH3OH) aufwies und seine optische Reinheit 10% e.e. betrug.
60
65 Beispiele 2 bis 5 (Verwendung von Bäcker-Hefe)
Das Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch die Inkubationszeiten 30,17,10 und 5 Stünden betrugen. Die Abtrennung und Reinigung des Produktes und seine Identifizierung wurden in genau derselben Weise durchgeführt
Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.
809 545/308
Incuba- 17 25 W]1S 52 871 (% e. e.) 18 (% e. e.)
Tabelle I tionszeit (% e. e.) +199° -37°
Beispiel Nr. S.S-Diacetoxycyclopent-l-en +199° (78) (19)
(SUL) (86) +143° 3,5-Dihydroxycyclopent-l-en -44°
30 Ausbeute +185° S-Acetoxy-S-hydroxycyclo- (56) (32)
(%) (80) pent-1-en + 0° Ausbeute -24°
2 17 t 2,5 +45° Ausbeute (%) (28)
c. 0 (21) (%) -17° t 8,2 -
3 10 t 9,1 +8° t 5,4 c. 2,1
c. 0 (6) c. 0 t 6,3
4 5 L 14,9 t 11,5 c. 5,5
c. 1,1 c. 0 L 3,9
5 t 16,8 t 6,2 c. 6,7
c. 10,8 c. 4,7 Spur
t 1,7
c. 7,0
»t« = trans-Isomeres, »c« = cis-Isomeres
Das Verhältnis von trans-Isomerem zu cis-Isomerem wurde gaschromatographisch bestimmt
Beispiel 6 (Verwendung von Bäcker-Hefe)
In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 300 g derselben handelsüblichen Bäcker-Hefe, 100 g Glucose, 75 g monobasisches Natriumphosphat und 2,01 entionisiertes Wasser in einen 51-Rundkolben eingebracht, wonach nach der Herstellung einer homogenen Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen wurde. Zu dieser Lösung wurden dann 20 g 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en (Verhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem =54:46) als Substrat zugegeben, wonach die Kultivierung bzw. Züchtung 30 Stunden bei 32° C unter heftigem Rühren unter Verwendung eines Rührpropellers durchgeführt wurde. Nach Beendigung der Züchtung wurden die Zellen aus der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt, wonach die Kulturflüssigkeit mit Äthylacetat wie in Beispiel 1 extrahiert wurde, um 9,13 g eines Rohproduktes zu erhalten.
Als dieses Rohprodukt durch Säulenchromatographie gereinigt wurde, wurden 932 mg 3(R)-Acetoxy-5(R]hhydroxycyclopent-1-en (80% e.e.) mit [<x]if- +208° (C=0,062, CH3OH) und 1,62 g Cyclopent-l-en-3,5-diol (31% e.e.) mit einem Verhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem von 3:7 mit [<x]!?=-46° (C=0,065, CH3OH) erhalten.
Beispiel 7 (Verwendung von Bäcker-Hefe)
In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 300 g derselben im Handel erhältlichen Bäcker-Hefe, 100 g Glucose, 75 g monobasisches Natriumphosphat und 2,01 entionisiertes Wasser in einen abtrennbaren 5-!-Rundkolben eingebracht, wonach nach Herstellung einer homogenen Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen wurde. Zu dieser Lösung wurden dann 20 g 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en (Verhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem=54 :46) als Substrat gefügt, wonach die Züchtung 17 Stunden bei 32° C unter heftigem Rühren unter Verwendung eines Rührpropellers erfolgte. Nach Beendigung der Züchtung wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 mit Äthylacetat extrahiert, wobei 10,23 g eines Rohproduktes erhalten wurden.
Als dieses Rohprodukt durch Säulenchromatographie
gereinigt wurde, wurden 1,93 g (R)-trans-3,5-Diacetoxycyclopent-1-en (86% ce.) mit [«]?"= +201° (C=0,081, CH3OH), 2,08 g SiRyAcetoxy-SiRHiydroxycyclopent-1-en (73% e.e.) mit [α]?=+192° (C=0,069, CH3OH) und 133 g Cyclopent-l-en-3,5-diol mit einem Verhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem von 5:6 (37% e.e.)mit[«]g>- -53° (C=0,061,CH3OH)erhaltea
Beispiel 8 (Verwendung von Bäcker-Hefe)
In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurden 30 g derselben im Handel erhältlichen Bäcker-Hefe, 10 g Glucose, 7,5 g monobasisches Natriumphosphat, 200 ml entionisiertes Wasser und 3,0 g 3,5-Diacetoxycyclopentl-en als Substrat in ein gläsernes Minigefäß eingebracht, wonach 24 Stunden bei 32° C unter Rühren mit einem Rührpropeller gezüchtet wurde. Nach Beendigung der Züchtung wurde die Kulturflüssigkeit mit Äthylacetat extrahiert und mit Glaubersalz getrocknet Bei der Entfernung des Lösungsmittels durch Destillation wurden 2,1 g des Rohproduktes erhalten. Dieses Rohprodukt wurde wie in Beispiel 1 der Dünnschichtchromatographie unterworfen [Entwicklungslösungsmittel: Äthylacetat/Benzol-Mischung (50/50)], und der Teil mit dem Rf-Wert=0,25 wurde abgekratzt, um 95 mg SiR^Acetoxy-SfRHdl pent-1-en zu erhalten.
Beispiel 9
(Verwendung von Citrusacetylesterase) (1) Herstellung der Citrusacetylesterase
Die Schalen von Mandarinenorangen bzw. Mandarinen wurden in einem Mixer zerkleinert, mit einer 0,2-prozentigen wäßrigen Natriumchloridlösung extrahiert und zur Abtrennung und Entfernung des Schalenrückstands zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat gesättigt, um eine Proteinfraktion auszufällen, die durch Zentrifugieren isoliert wurde. Diese Proteinfraktion wurde gegen entionisiertes Wasser dialysiert Die erhaltene Enzymlösung wurde so, wie sie erhalten wurde, als Citrusacetylesteraselösung in der folgenden Züchtungsreaktion verwendet.
(2) Züchtung
20 ml der vorstehenden Enzymlösung, 3,0 g 3,5-Diacetoxycyclopsnt-l-en als Substrat und 180 ml einer 0,05-molaren Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem PH-Wert von 7,0 wurden in einem 1-1-Erlenmeyer-Kolben suspendiert und 22 Stunden bei 32° C unter heftigem Rühren unter Verwendung einer Rührschaufel umgesetzt
- (3) Abtrennung und Reinigung des Produktes
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsflüssigkeit mit etwa 200 ml Äthylacetat extrahiert und mit Glaubersalz getrocknet Das Lösungsmitte! wurde abdestilliert, wobei 237 g eines Rohproduktes erhalten wurden. Eine sehr kleine Menge dieses Produktes wurde der Dünnnschjchtchromatographie unterworfen [Entwicklungslösungsmittel: Äthylacetat/Benzol-Mischung (50/5O)J wobei Flecken bei Rf=0,54 und Rf=0,27 erhalten wurden.
Dieses Rohprodukt wurde dann der Säulenchromatographie unter Verwendung von Siliciumdioxydgel unterworfen. Unter Eluierung nach der Methode des Konzentrationsgradienten unter Verwendung von 50 Teilen Benzol und 50 Teilen Äthylacetat wurden 1,49 g eines Produktes, das dem Rf-Wert von 0,54 entsprach, und 0^1 g eines Produktes, das dem Rf-Wert von 0,27 entsprach, erhalten.
(4) Identifizierung des Produktes
Da das Produkt mit dem Rt-Wert von 0,54 in Übereinstimmung mit getrennt hergestelltem authetischen 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en hinsichtlich IR-, NMR- und Massen-Spektrum war, wurde es als das 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en identifiziert [«] f = -7,4°.
Da das Produkt mit dem Rf-Wert von 0,27 hinsichtlich seiner IR-, NMR- und Massen-Spektren mit dem Produkt mit dem Rf-Wert von 03, erhalten nach der Methode von Beispiel 1, in Übereinstimmung war, wurde es als das S-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-l-en identifiziert, [λ] » = + 7,7°.
Da gaschromatographisch gefunden wurde, daß beide Produkte Mischungen des cis-Isomeren und des trans-Isomeren darstellten, wurde zur Bestimmung der absoluten Konfiguration das 3-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-1-en gaschromatographisch getrennt (Verhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem=56 :44). Da es klar ist, daß das cis-3,5-Diacetoxycyclopent-l-en optisch inaktiv ist, wurde die Trennung des vorstehend erhaltenen 3,5-Diacetoxycyclopent-l-ens (Verhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem=54 :46) nicht durchgeführt jedoch wurde aus dem vorstehenden [α]?-Wert die Konfiguration des trans-Isomeren als S-Konfiguration ermittelt, und seine optische Reinheit betrug 7% e.e.
Andererseits wiesen das trans-S-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-1-en und das cis-S-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-1-en, die durch Trennung erhalten wurden, die Werte [«]!?= +21° bzw. [«] g7= -15° auf. Es wurde so gefunden, daß das trans-Isomere R-Konfiguration aufwies und seine optische Reinheit 8% e.e. betrug und daß das cis-Isomere SfSJ-Acetoxy-SiRJ-hydroxycyclopent-1-enwar.
Beispiel 10
(Verwendung von Citrusacetylesterase)
2,0 ml der nach der Methode (1) von Beispiel 9 erhaltenen Enzymlösung, 101 mg 3,5-Diacetoxycyclopent-1-en als Substrat und 2,0 ml einer 0,05-molaren Natriumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 wurden suspendiert und über Nacht bei 32° C unter heftigem Rühren unter Verwendung einer Ruhrschaufel umgesetzt Nach Beendigung der Reaktion wurde wie unter (3) von Beispiel 9 beschrieben extrahiert, wonach der Extrakt mit Glaubersalz getrocknet wurde und das Lösungsmittel durch Destillation entfernt wurde, um 89 mg eines Rohproduktes zu erhalten. Dieses Produkt wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie
to unter Verwendung einer Äthylacetat/Benzol-Mischung (50/50) gereinigt um 40 mg einer Flüssigkeit vom
Rf-Wert =0,54 und 35 mg einer Flüssigkeit vom Rf-Wert=0,27 zu erhalten.
Da für beide Verbindungen deren IR- NMR- und
Massen-Spektren in Übereinstimmung waren mit denjenigen mit denselben Rf-Werten, die nach dem Verfahren von Beispiel 9 erhalten wurden, wurde die Verbindung mit dem Rf-Wert von 0,54 als das 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en und die Verbindung mit dem Rf-Wert von 0,27 als das S-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-1-en identifiziert
Der [oi\*$- Wert des vorstehenden 3,5-Diacetoxycyclopent-1-ens betrug etwa -6°, während der [ix]!?-Wert des vorstehenden Monoacetats etwa +4° betrug.
Beispiel 11
(Verwendung von Zellen des Genus Aspergilbs niger) (1) Herstellung der rohen Enzymlösung
Fünf Platinösen voll von Aspergillus niger ATCC 9142 wurden 72 Stunden bei 30°C in 2£1 einer Kühlflüssigkeit gezüchtet die folgende Zusammensetzung (pro 1) aufwies: 20 g Glucose, 1,5 g Monokaliumphosphat 1,5 g Magnesiumsulfat-heptahydrat 1,0 g Ammoniumnitrat 1,0 g Lactoalbumin, 2,0 g Maiswasser (flüssig), 0,5 g Hefeextraktpulver, 0,5 g L-Glutaminsäure und 10 mg Zinksulfat-heptahydrat Der pH-Wert wurde jnit 30%-iger NaOH-Lösung auf 7 eingestellt Die Brühe
"wurde anschließend einer Schallbehandlung unterworfen. Die mit 035 bis 0,6 g Ammoniumsulfat ausgesalzene Fraktion wurde gemäß dem Verfahren von Fukuraoto et al. [»J. Gen. Appln. MicrobioU, 9, 353 (1973)] erhalten, und sie wurde als rohe Enzymlösung bei der folgenden Züchtung verwendet
(2) Züchtung
3 ml der vorstehenden rohen Enzymlösung und 200 mg 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en als Substrat wurden in 6,0 ml einer Phosphorsäure-Pufferlösung mit einer Konzentration von 0,1 Mol (ph=5,6) suspendiert und 24 Stunden bei 320C unter heftigem Rühren unter Verwendung einer Rührschaufei umgesetzt
(3) Abtrennung und Reinigung des Produktes
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung fünfmal unter Verwendung von je 10 ml Äthylacetat extrahiert wonach die Extrakte vereinigt und mit Glaubersalz getrocknet wurden. Durch Entfernung des Lösungsmittels durch Destillation wurden 100 mg eines Rohproduktes erhalten. Bei der dünnschichtchromatographischen Analyse eines sehr kleinen Teils davon [Entwicklungslösungsmittel: Äthylacetat/Benzol-Mischung (50/50)] wurden Flecken bei einem Rf-Wert von 0,58 und 0,25 sichtbar.
Als dieses Rohprodukt der präparativen Dünnschichtchromatographie unterworfen wurde [Entwick-
lungslösungsmittel: Äthylacetat/Benzol-Mischung
(50/5O)J wurden 63 mg einer Verbindung, die dem RrWert von 0,58 entsprach, und 38 mg einer Verbindung, die dem Rf-Wert von 0,25 entsprach, erhalten.
(4) Identifizierung des Produktes
Die IR-, NMR- und Massen-Spektren der Verbindung, die dem Rf-Wert von 0,58 entsprach, und der Verbindung, die dem Rf-Wert von 0,25 entsprach, waren in Übereinstimmung mit denjenigen von 3,5-Diacetoxycydopent-1-en bzw. S-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-1-en.
Das vorstehende Diacetat und Monoacetat wiesen einen [a]f=-30° bzw. [<x]l°= +107° auf, und beide Verbindungen waren gemäß gaschromatographischer Analyse eine Mischung aus dem eis- und dem trans-Isomeren. Somit wurde zur Bestimmung der absoluten Konfigurationen das Monoacetat gaschromatographisch abgetrennt (Verhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem=47 :53).
Da offensichtlich das cis-Diacetat optisch inaktiv ist, wurde die Trennung des Diacetats (Verhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem=62 :38) nicht durchgeführt, und es wurde aus seinem vorstehenden [*]g-Wert gefunden, daß das trans-Isomere, das darin enthalten war, S-Konfiguration aufwies und daß seine optische Reinheit 34% e.e. war.
Da die trans-Monoacyl-Verbindung und die cis-Monoacyl-Verbindung, die durch Abtrennung erhalten wurden, einen [«]!?= +210° bzw. [<x]f=- 9" aufwiesen, wurde die Konfiguration der trans-Monoacyl-Verbindung als R-Konfiguration und ihre optische Reinheit zu 81% e.e. ermittelt, während die cis-Monoacyl-Verbindung als das ^SJ-Acetoxy-^RJ-hydroxycyclopent-l-en ermittelt wurde.
Beispiel 12 (Verwendung von Aspergillus niger)
3,0 ml einer rohen Enzymlösung von Aspergillus niger, hergestellt gemäß (1) von Beispiel 11, und 213 mg 3-Acetoxycyclopent-l-en als Substrat wurden in 6,0 ml einer 0,05-molaren Essigsäure-Pufferlösung mit einem PH-Wert von 5,6 suspendiert Die Reaktion wurde dann 24 Stunden bei 32° C unter heftigem Rühren unter Verwendung einer RUhrschaufel durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit Äthylacetat wie in Beispiel 11 beschrieben extrahiert, wonach der Extrakt mit Glaubersalz getrocknet wurde. Bei der Entfernung des Lösungsmittels durch Destillation wurden 65 mg des Rohproduktes erhalten.
Dieses Rohprodukt wurde dünnschichtchromatographisch, wie unter (3) von Beispiel 11 beschrieben, analysiert, wobei 35 mg einer Verbindung, die dem Rf-Wert von 0,58 entsprach, und 23 mg einer Verbindung, die dem Rf-Wert von 0,25 entsprach, erhalten wurden.
Aus den jeweiligen Rf-Werten dieser Verbindungen wurde erstere" als das 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en und letztere als das S-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-l-en identifiziert.
Der [θί]ί°-Wert der ersteren Verbindung betrug etwa — 25° und derjenige der letzteren etwa + 87°.
Beispiel 13
(Verwendung von Weizenkeimlipase) (1) Züchtung
50 mg einer im Handel erhältlichen Weizenkeimlipase Typ 1 (Glycerinesterhydrolase) EC Nr. 3.1.13 und 300 mg 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en als Substrat wurden in 100 ml einer O,lm-Essigsäui-e-Pufferlösung mit ίο einem pH-Wert von 5,0 suspendiert und die Reaktion wurde 24 Stunden bei 320C unter heftigem Rühren unter Verwendung einer Rührschaufel durchgeführt.
(2) Abtrennung und Reinigung des Produktes
Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsprodukt fünfmal unter Verwendung von jeweils 100 ml Äthylacetat extrahiert, wonach der Extrakt mit Glaubersalz getrocknet wurde. Das Lösungsmittel wurde dann abdestilliert, wobei 270 mg eines Rohproduktes erhalten wurden.
Eine sehr kleine Menge dieses Produktes wurde dünnschichtchromatographisch analysiert [Entwicklungslösungsmittel : Äthylacetat/Benzol-Mischung (50/50)], wobei Flecken bei Rf-Werten von 0,58 und 0,25 erhalten wurden.
Als dieses Rohprodukt durch präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung desselben Entwicklungslösungsmittels wie vorstehend getrennt wurde, wurden 190 mg einer Verbindung, die dem
jo Rf-Wert von 0,58 entsprach, und 70 mg einer Verbindung, die dem Rf-Wert von 0,25 entsprach, erhalten.
(3) Identifizierung des Produktes
Die Verbindung, die dem Rf-Wert von 0,58 entsprach, und diejenige, die dem Rf-Wert von 0,25 entsprach, wurden gemäß ihren IR-, NMR- und Massenspektren als das 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en bzw. das 3-Acetoxy-5-hydroxycyclopent-1 -en identifiziert
Die spezifischen Drehwerte [«] ! D° des vorstehenden Diacetats und des Monoacetats betrugen +49° bzw. + 3°, und gemäß der gaschromatographischen Analyse wurde gefunden, daß sie Mischungen der eis- und trans-Isomeren darstellten.
Das heißt, aus der Tatsache, daß das Verhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem des Diacetats 28 :12 betrug und daß das cis-Isomere optisch inaktiv ist, wurde aus dem vorstehenden [«]??-Wert gefunden, daß das im Diacetat enthaltene trans-Isomere /?-Konfigura tion und 70% e. e. aufwies.
Andererseits betrug das Verhältnis von cis-Isomerem zu trans-Isomerem des Monoacetats 88:70. Diese:, Monoacetat wurde in an sich bekannter Weise acetyliert und in das Diacetat überführt Aus der Tatsache, daß dieses einen [α] 'S-Wert von +9° aufwies, wurde das trans-Monoacetat des vorstehenden Monoacetats als die R-Konfiguration und 4% e. e. aufweisend befunden.
Ferner wurde das vorstehende Monoacetat mit Chromsäure in Aceton oxydiert und in 4-Acetoxycyclo pent-2-en-l-on überführt. Aus der Tatsache, daß der [λ] !,"-Wert -1° für diese Verbindung betrug, wurde berechnet, daß die folgende Ungleichheit zwischen den optischen Isomeren des cis-Isomeren und des trans-Isomeren des vorstehenden Monoacetats besteht d. h.:
(SJ-trans-Monoacetat-SiSJ-Acetoxy-SiRJ-hydroxycyclopent-1-en > (R)-trans-Monoacetat + 3(R)-Acetoxy-SiSVhydroxycyclopent-1 -en.
Wenn man ferner berücksichtigt, daß, wie vorstehend angezeigt, (R)-trans-Monoacetat > (S)-trans-Monoacetat, dann gilt:
SiSVAcetoxy^RJ-hydroxycyclopent-l-en > 3(R)-Acetoxy-SiSJ-hydroxycyclopent-1 -en.
Demzufolge wurde gefunden, daß das cis-Monoacetat SfSJ-Acetoxy-SfRJ-hydroxycyclopent-1 -en ist.
Beispiel 14
(Verwendung von Weizenkeimlipase)
Unter Verwendung von 1,0 g 3,5-Diacetoxycyclopent-1-en vom [λ]?1=—7,4°, erhalten in Beispiel 9, als Substrat wurde die Züchtung und Trennung und Reinigung des Produktes, wie unter (1) von Beispiel 13 angegeben, durchgeführt, um 250 mg einer Verbindung, die dem Rf-Wert von 0,58 entsprach, d. h. 3,5-Diacetoxycyclopent-1-en, und 325 mg einer Verbindung, die dem Rf-Wert von 0,25 entsprach, d. h. 3-Acetoxy-S-hydroxycyclopent-1-en, zu erhalten.
Der [λ] -Wert des Diacetats betrug +26°, während derjenige des Monoacetats +5° betrug. Andererseits war das Verhältnis von cis-isomerem zu trans-Isomerem im Falle des Diacetats 72:25 und im Falle des Monoacetats 60 :40. Es wurde somit gefunden, daß die optische Reinheit des ersteren 45% e. e. betrug.
Aus den vorstehenden Ergebnissen folgt, daß wenn ein optisch inaktives 3,5-Diacetoxycyclopent-l-en als Substrat verwendet wird und ein wiederholtes Züchtungsverfahren durchgeführt wird, bei dem das Substrat zunächst der Einwirkung von Citnisacetylesterase und danach das erhaltene Diacetat von erhöhter optischer Aktivität der Einwirkung von Weizenkeimlipase unterworfen wird, es möglich wird, ein Diacetat und Monoacetat mit viel höheren optischen Aktivitäten zu erhalten.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Diacetylesters des Cyclopent-l-ena^-diols, seines optisch aktiven Mon jacetylesters oder seines optisch aktiven Diols aus einem Diacetylester des Cyclopent-l-en-S^-diols der Formel
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