DD297161A5

DD297161A5 - Enantioselektive herstellung von s-2r[ind1], 2r[ind2]-1,3-dioxolan-4-methanol und derivaten hiervon

Info

Publication number: DD297161A5
Application number: DD90343334A
Authority: DD
Inventors: Barend W Groen; Adriaan J Duine; Arie Geerlof
Original assignee: Stamicarbon B. V.,Nl
Priority date: 1989-08-09
Filing date: 1990-08-08
Publication date: 1992-01-02
Also published as: EP0412585A1; US5182209A; NL8902035A

Abstract

Die Erfindung betrifft die enantioselektive UEberfuehrung einer Enantiomerenmischung von * der Formel, worin R1 und R2 unabhaengig Wasserstoff, eine gegebenenfalls verzweigte Alkylgruppe oder Aryl bedeuten oder R1 und R2 zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gegebenenfalls substituierten carbocyclischen Ring bilden, wobei das Produkt dieser UEberfuehrung mit einem der Enantiomeren angereichert ist, was dadurch erzielt wird, dasz die Enantiomerenmischung der Einwirkung eines enantioselektiven Enzyms ausgesetzt wird, wobei ein mit S-Enantiomer angereichertes * durch Verwendung einer geeigneten PQQ-abhaengigen Alkoholdehydrogenase als enantioselektives Enzym hergestellt wird. Formel

Description

Enantioselektive Herstellung von S-2R₁,2R₂-1,3-Dloxolan-4-methanol und Derivaten hlevon

Diese Erfindung bezieht sich auf die enantioselektive Überführung einer Enantiomerenmischung von 2 R,,2 R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol der Formel:

^ O

C— C^- CH₂OH H₂ H

worin R₍ und R₂ unabhängig Wasserstoff, eine gegebenenfalls verzweigte Alkylgruppe oder Aryl bedeuten oder R₁ und R₂ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gegebenenfalls substituierten carbocyclischen Ring bilden, wobei d. »Produkt dieser Überführung mit einem der Enantiomere angereichert ist, was dadurch erzielt wird, daß diese Enantiomerenmischung der Einwirkung eines enantioselektiven Enzyms ausgesetzt wird.

Ein derartiges Verfahren ist aus EP-A-244-912 bekannt. Gemäß dieser Patentanmeldung kann ein mit R-Enantiomer angereichertes Produkt von einer Enantiomerenmischung der obengenannten Verbindung erhalten werden, indem eine derartige Mischung der Einwirkung eines Enzyms ausgesetzt wird, das von einer großen Zahl von Mikroorganismen stammen kann. Gemäß diesem Verfahren ist es hauptsächlich das S-Enantiomer der betreffenden Verbindungen, das in die R-2 R₁₍2 R₂-1 ,S-Dioxolan^-carbonsäure übergeführt wird, so daß also ein mit R-Enantiomer angereichertes 2 Ri,2 R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol zurückbleibt. In dieser Anmeldung ist auch angegeben, daß das Oxidationsprodukt, das einen Überschuß an R-2 R|,2 R₂-1,3-Dioxolan-4-carbonsäure enthält, zum entsprechenden Alkohol reduziert werden kann, in dem dio Menge an S-2 Rj,2 R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol überwiegt.

Für viele Anwendungen, insbesondere zur Verwendung als Ausganosverbindung für die Herstellung von pharmazeutischen Verbindungen, ist es erwünscht, S-2 Ri,2 R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol zur Verfügung zu haben. Für diesen Zweck ist es erwünscht,

imstande zu sein, ein mit S-Enantiomer angereichertes Produkt direkt aus einer Enantiomerenmischung von 2 R.,2R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol zur Verfügung zu haben. Für diesen Zweck ist es erwünscht, imstande zu sein, ein mit S-Enantiomer angereichertes Produkt direkt aus einer Enantiomerenmischung von 2R_l(2R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol herzustellen. Dies kann beispielsweise mittels eines enantioselektiven enzymatischen Verfahrens erzielt werden.

Es wurde nun ein Verfahren zur enantioselektiven Überführung einer Enantiomerenmischung von 2Ri,2R₂-1,3-Dioxolan-

4-methanol der Formel:

- CH₂OH

worin R₍ und R₂ unabhängig Wasserstoff, eine gegebenenfalls verzweigte Alkylgruppe oder Aryl bedeuten oder Ri und R₂ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gegebenenfalls substituierten carbocylischen Ring bilden, wobei das Produkt dieser Überführung mit einem der Enantiomere angereichert ist, was dadurch erzielt wird, daß diese Enantiomerenmischung der Einwirkung eines enantioselektiven Enzyms ausgesetzt wird, wobei - und dies kennzeichnet die Erfindung -mit S-Enantiomer angereichertes 2R₁,2R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol unter Verwendung einer geeigneten PQQ-abhängigen Alkoholdehydrogenase als enantioselektives Enzym verwendet wird.

R₁ und R₂ stellen im wesentlichen H, ein C,-C₁₀-(Cyclo)alkyl oder ein C₆-C₁₀-Aryl, vorzugsweise C_e-Aryl, dar oder R₁ und R₂ bilden zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen carbocylischen Ring mit 4 bis 10, vorzugsweise 5 oder 6C-Atomen. R₁, R₂ und/oder der carbocyclische Ring, den sie zusammen mit dem C-Atom, an das sie gebunden sind, bilden, können mit Halogenatomen, nied.(C,-C₄)Alkyl oder nied.(C,-C₄)Alkoxy substituiert sein. Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende sogenannte PQQ-abhängige Alkoholdehydrogenase ist an sich beispielsweise aus der Dissertation „Quinoprotein (PQQ-containing) Alcohol Dehydrogenase" von J. A. Duine (PhD-Thema, Delft, 19. September 1985) und von B.W. Groen et al. in Biochem. J. 234 (1986), S.611 ff., bekannt. POQ bedeutet Pyrrolochinolinchinon, d.h. 2,7,9-Tricarboxy-1 H-pyrrolo-[2,3f]chinolin-4,5-dion. Geeignete PQQ-abhängige Alkoholdehydrogenasen sind beispielsweise Pseudomonas testosteron! oder Gluconobacter suboxydans. Die PQQ-abhängige Alkoholdehydrogenase, die von Pseudomonas testosteron! stammt oder davon erhalten wird, ist für das vorliegende Verfahren außerordentlich geeignet. Die Pseudomonas testosteronl-Mikroorganismen können durch das von B.W. Groen et al., loc. cit. beschriebene Verfahren gezüchtet werden, aber auch durch jedes andere geeignete Züchtungsverfahren. Derartige Züchtungsverfahren sind allgemein so bekannt und wurden so oft in Patentschriften und wissenschaftlichen Veröffentlichungen beschrieben, daß es überflüssig ist, diese Züchtungsverfahren in diesem Zusammenhang zu beschreiben. Das Enzympräparat, wie es In der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht durch Reinheit und dgl. beschränkt und kann sowohl eine rohe Enzymlösung als auch ein gereinigtes Enzym sein, doch es kann auch aus (permeabiliosierten und/oder immobilisierten) Mikrobenzellen, die die gewünschte Aktivität aufweisen, oder aus einem Homogenat von Zellen oder ganzen Zellen mit einer derartigen Aktivität, bestehen. Das Enzym kann auch in immobilisierter Form oder in chemisch modifizierter Form verwendet werden. Wenn eine gewisse unerwünschte gegenteilige Enzymaktivität im verwendeten Enzympräparat vorhanden ist, ist es empfehlenswert, diese unerwünschte Aktivität zu eliminieren oder zu unterdrücken, um maximale Enantioselektivität zu erhalten. Die Erfindung ist durch die Form in der das Enzym für die vorliegende Erfindung verwendet wird, in keiner Weise beschränkt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann auch eine PQQ-abhängige Alkoholdehydrogenase verwendet werden, die von einem Mutanten von Pseudomonas testosteroni oder von genetisch modifizierten Mikroorganismen stammt. Vorzugsweise wird eine PQQ-abhängige Alkoholdehydrogenase verwendet, die von Pseudomonas testosteroni ATCC15666, ATCC 15667, NCIB 8893, NCIB 8955 oder NCIB 10808 stammt oder erhalten wird. Gemäß Jin Tamaoko et al., Int. J. Syst. Bact. 37, S. 52ff., soll Pseudomonas testosteroni als Comamonas testosteroni klassifiziert werden. Die betreffenden Organismen sind in dieser Anmeldung als Pseumonas testosteroni angegeben. Im wesentlichen werden 1 bis 200mg Zellen (Trockengewicht) pro Gramm R,S-Substrat verwendet. Wie aus der Veröffentlichung von B.W. Groen et al. (loc. cit) hervorgeht, ist die PQQ-abhängige Alkoholdehydrogenase, wie sie beispielsweise von Pseudomonas testosteron! erhalten werden kann, hinsichtlich der Oxidation einiger Alkohole nicht in allen Fällen aktiv: für Aktivität muß eine ausredende Menge PQQ vorhanden sein. Wenn bei der Züchtung des Mikroorganismus nicht genug PQQ ν rhanden ist, ist es für Oxidationszwecke erwünscht, es in ausreichenden Mengen zuzusetzen. Meistens beträgt die Menge PQQ 0,5 bis 2 Äquivalente in bezug auf das Enzym. Für optimale Ergebnisse wird eine Mindestmenge von 1 Äquivalent verwendet. Anstelle von PQQ können auch PQQ-Analoga, wio Monoester von PQQ (in Stellung 2), 4-Hydroxy-PQ (PQ bedeutet Pyrrolochinolin) oder 5-Hydroxy-PQ nach Oxidation, 3-Methyl-PQQ, 3-Äthyl-PQQ, 3-Propyl-PQQ, N-Methyl-PQQ N-Äthyl-PQQ, 8-Methyl-PQQ oder das PQQ-Acetonaddukt und andere Aldehyd- und Ketonaddukte, wie von J. A. Jongejan, B.W. Groen und J. A. Duine in „PQQ and Quinoproteins" (J. A. Jongejans und J. A. Duine, Autoren) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1989, S. 205-216, beschrieben, verwendet werden.

Enantioselektive enzymatische Überführungen sind an sich bekannt. Die Enantioselektivität liegt in einem Unterschied der Überführungsrate zwischen den betreffenden Enantiomeren. Es werden Reaktionsprodukte erhalten, die mit einem der Enantiomere angereichert sind. Für praktische Zwecke ist es im allgemeinen erwünscht, daß eines der Enantiomere in einem großen Überschuß erhalten wird. Dies wird dadurch erzielt, daß die Überführung bei einem bestimmten Überführungsgrad beendet wird. Für enantioselektive enzymatische Hydrolysen ist dies von Qu-Ming Gu et al. in Tetrahedron Letters 27 (1986), 5203ff., und allgemeiner von Ghing-Shih Chen et al. in J. Am. Chem. Soc. 104 (1982), 7294 ff., beschrieben. Die in diesen Publikationen beschriebene allgemeine Doktrin enantioselektiver enzymatischer Überführungen gilt auch für das vorliegende Verfahren.

Gemäß dem vorliegenden Verfahren oxidiert die PQQ-abhänglge Alkoholdehydrogenasc das R-Enantiomer von 2 R₁,2 R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol bei einer rascheren Rate unter Bildung des S-Enantiomers der entsprechenden 2 Ri,2R₂-1,3-Dioxolan-4-carbonsäure, so daß auch ein mit S-2Ri,2R₂-1,3-Dloxolan-4-methanol angereichertes Reaktionsprodukt erhalten wird. Die Überführungsraten der Enantiomere scheinen sich beträchtlich zu unterscheiden, so daß bei 50%iger Überführung einer racemischen Mischung bereits ein Enantiomerüberschuß von mehrals90%des2Ri,2R₂-1.3-Dioxolan-4-mothanolserhalten werden kann, während ein Enantiomerüberschuß von mehr als 95% bereits in einer Überführung von 50 bis 55% erzielt werden kann. Die In der Reaktion verwendeten Zellen können ohne erheblichen Aktivitätsverlust von der Reaktionsmischung abgetrennt und in einer nachfolgenden Überführung wiederverwendet werden.

Gemäß dem vorliegenden Verfahren wird das S-Enantiomer vorzugsweise aus 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol hergestellt. Ein Enantiomerüberschuß an S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol von mindestens 95% kann erhalten werden. Das S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol ist ein wichtiges Ausgangsprodukt für die Herstellung von pharmazeutischen Mittoln, Pflanzenschutz- und/oder landwirtschaftlichen Schädlingsbekämpfungsmitteln, wie auch in einer Veröffentlichung von J. Jurczak et al. in Tetrahedron 42 (1986), 447ff., angegeben ist. Die R- und S-Enantiomere von 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol sind wichtige chirale Cj-Synthone in organischen Synthesen. Beispiele von Synthesen komplexerer Strukturen von derartigen C₃-Synthonen sind ß-Rezeptorblocker und sn-Glycerylphosphorylcholin (GPC).

Racemisches 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol kann auf die Weise hergestellt werden, die für die Herstellung von Acetaten durch säurekatalysiertes Koppeln von Glycerin und Aceton bekannt ist. Für Verbindungen der oben angegebenen Formel, worin Ri und R₂ nicht beide eine Methylgruppe bedeuten, muß Glycerin mit dem betreffenden Aldehyd oder Keton gekoppelt worden. pH und Temperatur, bei welchen das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, sind nicht kritisch. Im wesentlichen beträgt der pH 5 bis 9 und die Temperatur 15°C bis 50⁰C.

Die Erfindung wird durch die folgenden Br'-.piele weiter erläutert, ohne durch diese Beispiele beschränkt zu sein. In diesen Beispielen wurden die Analysen der Reaktionsprodukte, insbesondere was die Bestimmung des enantiomeren Überschusses (ee) betrifft, unter Anwendung der im nachstehenden beschriebenen Methode (TAGIT-Methode) durchgeführt. Falls erwünscht, ist es möglich, den Selektivitätswert für die Reaktion mit Hilfe der Formeln von Chen et al. (J. Am. Chem. Soc. 104,7294 ff. [19821) zu berechnen. Für Überführungsbestimmung wurde Säulentrennung über einer Aminex HPX-87 H HPLC-Säule mit 0,01 η H₂SO₄ als mobiles Lösungsmittel und Glycerinnachweis auf Basis des Brechungsindex verwendet. Alle Analysen wurden unter Verwendung von Proben durchgeführt, die zu verschiedenen Zeitpunkten aus den Reaktionsmischungen der Versuche entnommen wurden, wobei die Mengen, in Abhängigkeit von der Überführung, 10 bis 50ml für die Überführungsbestimmung und 10 bis 50ml für ee-Bestimmung betrugen.

Bei der ee-Bestimmung werden die Proben zweimal mit je 20ml Dichlormethan extrahiert, worauf 200μΙ des nach Extrakteindampfung erhaltenen Rückstandes in 5ml Diäthyläther gelöst werden. Danach werden der Ätherlösung 0,35g Tosylchlorid und etwa 0,5g Kaliumhydroxidpulver zugesetzt und die erhaltene Lösung wird 15min bei Raumtemperatur gerührt. Das Tosyladditionsprodukt von 2R,,2R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol wird dann durch Extraktion mit Diäthyläther und Wasser isoliert, worauf die Ätherfraktion mit Wasser gewaschen und eingedampft wird. Das erhaltene Tosyl-2 R_t,2 R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol wird dann in 2,0ml n-Butylamin gelöst und 1 h auf 100⁰C erhitzt. Anschließend wird das Reaktionsprodukt durch Extraktion mit Diäthyläther und Wasser isoliert, worauf die Ätherfraktion viermal mit Wasser gewaschen und eingedampft wird. Dieser Rückstand wird in 1,0ml Acetonitril gelöst, worauf 2,5 μΙ der erhaltenen Lösung mit 50 μΙ Acetonitril und 1 mg 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-ß-glucopyranosylisothiocyanat (TAGIT) gemischt werden. 5 min nach dem Mischen wird die ee unter Verwendung einer Umkehrphasen (C₁₈)-Säule mit 60/40 Methanol/Wasser als Eluierungslösungsmittel bestimmt. Diese Methode zur Bestimmung des Enantiomerüberschusses hat sich als sehr geeignet erwiesen. Sie ergibt eine ausgezeichnete Trennung der R- und S-Enantiomere von 2 R|,2 R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol (in modifizierter Form), wie in den Fig. 1.1,1.2 und I.3 illustriert, die als Probenchromatogramme dieser Trennung beigefügt sind. Fig. 1.1 bezieht sich auf das Racemat, für I.2 wurde das im Handel erhältliche S-Enantiomer (Janssen Chimica) verwendet, und I.3 bezieht sich auf das gemäß der Erfindung nach 56%iger Überführung erhaltene Produkt.

Beispiel I Pseudomonas testosteron! (American Type Culture Collection Nr. 15667) wurde in einem Fermenter enthaltend 20 ml Mineralsalzmedium (Zusammensetzung pro I entmineralisiertem Wasser: 15,4g K₂HPO₄ · 3H₂0,4,52g KH₂PO₄,

0,5g MgCI₂ · 6H₂0,3g (NH₄I₂SO₄,15mg CaCI₂,15mg FeSO₄ 7H₂O und die Spurenelemente Cu, B, Mn₁Zn, Mo), dem nach

Sterilisation 100ml Äthanol zugesetzt worden waren. Der pH betrug 7,0. Der Fermenterinhalt wurde bei 20⁰C gehalten und mit

einer Geschwindigkeit von 350UpM gerührt. Die Belüftungsrate betrug 3,51 pro min. Nach 80h Züchtung wurden dio Zellen durch Zentrifugieren geerntet. Ein Teil dieser Zellen (Naßgewicht 11 g) wurde in 100ml tris/HCI-Puffer (5OmM, pH 7,5), dem 5,3μΜοΙ PQQ zugesetzt worden waren, suspendiert. Nachdem die Zellen mit PQQ gesättigt waren, wurden 1,81 des gleichen

Puffers und 20g R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol zugesetzt. Während der Inkubation wurde die Zellsuspension

belüftet (1,0I Luft pro min) und gerührt (400UpM), wobei der pH durch Titrieren mit 0,2 η NaOH bei 7,5 gehalten wurde. Die

Temperatur wurde bei 28⁰C gehalten. Während dieser Oxidation wurden in regelmäßigen Intervallen Proben entnommen, die auf die oben beschriebene Weise

analysiert wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Probe	Überführung (%)	ee (S-Enantiomer) (%)
1	15	17
2	32	45
3	45	75
4	56	99

Somit gab es in bezug auf Probe 4 eine 56%ige Überführung von 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol und der enantiomere Überschuß (ee) des S-Enantiomers von 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol betrug 99%.

Beispiel II

Unter Anwendung der in Biochem. J. (1986) 234,611 ff., beschriebenen Reinigungsmethode wurde PQQ-abhängige Alkoholdehydrogenase von Psaudomonas testosteron! ATCC15667, gezüchtet wie in Beispiel I beschrieben, gewonnen. Das isolierte Enzym wurde in 20ml Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0; BOmM) gelöst und mit 10OnMoI PQQ gesättigt. Danach wurden 1,01 mMol Kaliumferricyanid und 0,BmMoI R,S-2,2-Dimothyl-1,3-dioxolan-4-methanol zugesetzt. Der pH der Lösung wurde durch Titrieren mit 0,1 η NaOH hei 8,0 gehalten. Nach Reduktion des Ferricyanids wurde die Reaktionsmischung analysiert. Es gab eine 51%ige Überführung von S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol, wobei das S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol mit einem ee-Wert von 99% erhalten wurde.

Beispiel III

Die von Pseudomonas testosteron! ATCC15667 erhaltene Alkoholdehydrogenase (siehe Beispiel II) wurde in 20 ml Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0; 5OmM) gelöst und mit 10OnMoI PQQ gesättigt; danach wurden überschüssiges Kaliumferricyanid und 0,BmMoI 2,2-Pentylen-1,3-dioxolan-4-methanol zugesetzt. Nach Oxidation von etwa 50% des Substrats wurde die Reaktion abgebrochen und die Reaktionsmischung analysiert. Die Überführung schien 64% zu betragen und der Enantiomerüberschuß des S-Enantiomers war 99%.

Beispiel IV Beispiel III wurde mit 2,2-Butylen-1,3-dioxolan-4-methanol anstelle von 2,2-Pentylen-1,3-dioxolan-4-methanol wiederholt. Die Überführung betrug 53% und der Enantiomerüberschuß des S-Enantiomers 99%. Beispiel V

Ein 2,Ol Erlenmeyer-Kolben, gefüllt mit 500ml Mineralsalzmedium (siehe Beispiel I), 2,5ml Äthanol und 2μΜοΙ PQQ₁ wurde mit Pseudomonas testosteronl ATCC15667 angeimpft. Sowohl PQQ (filtersterilisiert) als auch Äthanol waren nach Sterilisierung durch Erhitzen des Mediums zugesetzt worden. Die Züchtungstemperatur betrug 28°C und Schütteln erfolgte bei 200 UpM. Nach 36h wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet, worauf sie in 100 ml Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0; 5OmM) suspendiert wurden. Nach Zusatz von 1,0g R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol wurde das Reaktionsmedium bei 28⁰C inkubiert, wobei geschüttelt wurde (200UpM). Nach 24 h wurde das Reaktionsmedium analysiert. Die Überführung betrug 54% und der ee-Wert für das S-Enantiomer 96%.

Beispiel Vl Unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel V wurden Pseudomonas testosteron! ATCC15666, NCIB 8893 bzw. NCIB10808

gezüchtet und jeweils die erhaltene PQQ-abhängige Alkoholdehydrogenase für enantiospezifische Oxidation von

R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol, wie in Beispiel IV beschrieben, verwendet mit ähnlichen Ergebnissen hinsichtlich der Enantioselektivität. Beispiel VII

Unter Anwendung der in Agric. Biol. Chem. 42 (1978), 2045-2056, beschriebenen Reinigungsmethode wurde von Gluconobacter suboxydans ATCC 621 gewonnene, gereinigte, membrangebundene PQQ-abhängige Alkoholdehydrogenase in 20 ml Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0; 5OmM) gelöst und mit 10OnMoI PQQ gesättigt. Danach wurden überschüssiges Kaliumferricyanid und 0,5mMol R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol zugesetzt. Nach Oxidation von etwa 60% des Substrates wurde die Reaktion abgebrochen. Es gab eine 64%ige Überführung in S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol mit 96% enantiomeren Überschuß.

Beispiel VIII Pseudomonas testosteronl ATCC 15667 wurde in einem Fermenter enthaltend 51 eines mineralsalzhaltigen Mediums, wie in Beispiel I beschrieben (pH = 7), gezüchtet, dem nach Sterilisieren 25 ml Äthanol als Kohlenstoffquelle zugesetzt wurden. Am Ende der exponentiellen Wachstumsphase wurde der pH auf 7,5 erhöht. Danach wurden 150 mMol R,S-2,2-Dimethyl-

1,3-dioxolan-4-methanol und 2,5 mg PQQ zugesetzt, während der pH durch Titrieren mit 0,2 η NaOH bei 7,5 gehalten wurde. Nach

Oxidation von 57% des zugesetzten Substrats wurden die Zellen abzentrifugiert und das verbleibende Substrat durch Extraktion

isoliert. Der enantiomere Überschuß des S-Enantiomers von 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol betrug £99,5%.

Beispiel IX

Die von Beispiel VIII verbliebenen Zellen wurden wiederverwendet. Zu diesem Zweck wurden die Zellen in 1,01 tris/HCI-Puffer (5OmM, pH 7,5) suspendiert, dem 20g R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol zugesetzt wurden. Nach Oxidation von 54% des Racemats blieb das S-Enantiomer von R,S-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol mit einem enantiomeren Überschuß von 97% zurück.

Claims

1. Verfahren zur enantioselektiven Überführung einer Enantiomerenmischung von 2R₁₍2R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol der Formel:

^Ri^ ^^R2

C^ CH₂OH

worin R₁ und R₂ unabhängig Wasserstoff, eine gegebenenfalls verzweigte Alkylgruppe oder Aiyl bedeuten oder R₁ und R₂ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gegebenenfalls substituierten carbocylischen Ring bilden, wobei das Produkt dieser Überführung mit einem der Enantiomere angereichert ist, was dadurch erzielt wird, daß die Enantiomerenmischung der Einwirkung eines enantioselektiven Enzyms ausgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß ein mit S-Enantiomer angereichertes 2 Ri,2 R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol unter Verwendung einer geeigneten PQQ-abhängigen Alkoholdehydrogenase als enantioselektives Enzym hergestellt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß S-2 R₁,2R₂-1,3-Dioxolan-4-methanol mit einem Enantiomerüberschuß von mindestens 95% hergestellt wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß mit S-Enantiomer angereichertes 2.2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol hergestellt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym eine PQQ-abhängige Alkoholdeyhdrogenase verwendet wird, die von Pseudomonas testosteronl stammt oder davon erhalten wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym PQQ-abhängige Alkoholdehydrogenase verwendet wird, die von Pseudomonas testosteron! ATCC 15666,15667, NCIB 8893, NCIB 8955 und/oder NCIB 10808 stammt oder davon erhalten wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym eine PQQ-abhängige Alkoholdehydrogenase verwendet wird, die von Gluconobacter suboxydans stammt oder davon erhalten wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym eine PQQ-abhängigo Alkoholdehydrogenase verwendet wird, die von Gluconobacter suboxydans ATCC 621 stammt oder davon erhalten wird.