CN103889997B - 水解酶酶底物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明基于所述水解酶的新底物提供用于检测样品中水解酶的存在或总量的新方法，也提供了高灵敏度的用于检测这类水解酶的新的构思和方法。

Description

水解酶酶底物及其应用
交叉引用相关申请
该申请要求2011车1月18日提交的申请号为No.61/433,909的美国临时申请的优先权，该临时申请的内容全部被引用包含于该申请中。
技术领域
本发明主要涉及某种水解酶酶底物及其应用。特别地，本发明提供了作为一些水解酶底物的新化合物，借所述水解酶将水解酶底物转变成容易检测到的水解产物，例如，通过这里所述的酶催化方法。
背景技术
在许多生物化学系统中，酶被广泛用作灵敏的标签，包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)系统，以及核酸分析，例如PCR和测序系统。酶经常被间接地检测到，基于它们的活性，通常基于它们的底物至产物的转换，或辅因子之间的转换，例如氧化态和还原态之间。
在一些实例中，待检测的酶连接在高度特异的络合或结合剂上，例如抗体。当抗体结合在待检测的目标分子上时，抗体复合体可以通过观察连接着它的酶标的存在而被检测到；基于其活性，所述酶容易被检测到。在其它系统中，待表达的寡核苷酸通过连接编码可以作为标签的酶的核酸来被标记。当寡核苷酸被表达时，包含利于检测酶标的蛋白产物，又是基于酶的活性。
酶活性的检测提供了非常有效的信号放大。目前并非检测通常小量的酶(或目标化合物)，而是寻找酶的活性，即它对已知的可以加入相对大量的底物的作用。单独的酶分子可以催化大量的底物分子的转化(例如，酶每分钟可以催化107个反应：THE IMMUNOASSAYHANDBOOK，3rded.by David Wild，Elsevier Press，pg194(2005)免疫测定指南，第3版，大卫·怀尔德(David Wild)主编，爱思唯尔出版社(Elsevier)出版，194页(2005))，因此实际检测到的形式可以是酶形成的产物，或底物的消失，或酶消耗的辅因子，而不是酶本身。固在观察酶活性时，人们检测大量的底物或产物分子而非酶本身，这提供了高度放大的信号。
许多这样的酶标是已知的：包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶在内的大部分通常用于免疫测定(例如：ELISA)的酶标。其它已经使用的酶标包括乙酸激酶、荧火虫荧光素酶、黄嘌呤氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。识别号194-195(Id.at194-195)。
然而，仍然需要新的方法来标记生物化学种类从而有利于极小量的检测，因此需要新的酶标系统。也仍然需要方法来检测痕量水解酶，该酶在其它体系中不只是作为标签。本发明提供了这样的方法以及在这些方法和条件中使用的化合物和成分。
发明内容
一方面，本发明提供了某些水解酶的底物、包含这些底物的成分，以及用这些底物来确定水解酶的存在的方法，该水解酶能够水解所述底物。在一些实施例中，水解酶可以用作试验系统的标记例如ELISA，例如，或者编码水解酶的核酸可以连接在待表达的寡核苷酸上，在这种情况下所述寡核苷酸的表达产生包含所述功能水解酶的多肽：这里描述的成分和方法有助于在这些或其它系统中检测所述水解酶。
一方面，本发明提供下述化学式的化合物，所述化合物是目标水解酶的底物。
其中：
A是芳香族或杂环芳香族基团，1-烯烃或1-炔烃，每一个被任意取代。
每个R是独立的H或任意取代的C1-C4烷基或C6-C10芳基；
n为1-4的整数；
X是包含底物组成部分的基团，
其中底物组成部分包括作为水解酶底物的分子片段，并且其中水解酶的活性能够水解所述化学式的化合物(I)从而形成化合物(II)和(III)：
在这些化合物中，A可以是芳香族或杂环芳香族基团，例如，从N、O和S中选择的任意包含多达3个作为环成员的杂原子的5-6原子芳香环；或具有8-10个环成员的双环系统，其中多达4个可以是从N、O和S中选择的杂原子。在一些实施例中，A是苯基或萘基。A可以是这里所述任意取代的，通常具有多达3个选自这里所述的适合芳基和杂环芳基基团的取代基。
在另外的实施例中，A是烯基或炔基基团，通常包含2-10个碳原子且最好是2-6个碳原子。在这些实施例中，A可以被这里描述的合适的达到允许这种取代的一定大小的化合价的烷基基团的基团取代，。通常，在这些实施例中A被多达三个的取代基所取代。
在这些化合物具体的实施例中，n是1。因为A是芳基、杂环芳基、1-烯烃或1-炔烃，因此，当n是1时，化合物如化学式所示：
这些实施例朝着所示羟基基团的进行氧化，因为A基团使化学式IIB中的乙醇成为苯甲基的、烯丙基的、炔丙基的，或相似的活化的羟基。这些化合物特别适合芳基醇氧化酶、醇脱氢酶和/或芳基醇脱氢酶的氧化。在这些化合物的一些实施例中，R是H，且氧化产物是醛，例如，当A是苯基组成部分时，产物将是苯甲醛。
这些实施例也特别适合用于放大检测信号且本质上提高灵敏度的循环系统中。所述循环系统需要另一种酶参与，所述酶氧化水解反应的起始产物(上面所示的乙醇IIB)从而形成化学式II-ox的氧化产物；以及还原氧化产物至乙醇IIB的还原酶的参与。
这产生了可以放大来自化学式I所示底物的起始水解的有效信号的循环系统。所述循环可以用任何合适的试剂来实施，例如Guillen and Evans，Appl.EnvironmetalMicrobiol.，60(8)：2811-17(1994)中所述的芳基醇氧化酶和芳基醇脱氢酶。所述循环可用于检测小量或低水平的感兴趣的水解酶，例如，在毫摩尔的(millimolar)、微摩尔的(micromolar)、纳摩尔的(nanomolar)、微微摩尔的(picomolar)、毫微微摩尔的(femtomolar)、阿托摩尔的(attomolar)或甚至低于阿托摩尔的(attomolar)如仄普托摩尔的(zeptomolar)或幺科托摩尔(yoctomolar)的水平。
在本系统中，循环过程增加了可被检测到并且对应酶活性水平的水解物的量。并非只检测酶直接作用形成的水解产物，所述水解产物可能已经具有良好的灵敏度，人们还可以检测来自循环反应的副产物，所述副产物产生于氧化反应或氧化产物(铜或醛)后续的反应，因为起始水解产物在氧化形式和还原形式之间循环。上面所示的循环反应可以产生大量这样的副产物，例如，氧化反应中产生的H2O2，还原反应中产生的NAD+或NADP+。此外或者作为选择，人们可以监测循环反应系统运行时涉及的还原反应中的NADH或NADPH的消耗。由于循环反应，这些可检测的形式的量可以大大多于水解酶底物的量，因此使用这种循环方法可以显著地提高灵敏度。
在一些实施例中，以O2作为氧化剂通过芳基醇氧化酶来完成氧化，并产生H2O2作为副产物。可以检测H2O2来确定反应中水解酶的存在或数量。在本领域中用于确定小量H2O2的方法是众所周知的。用来测定H2O2的试剂包括过氧化物酶、氨基安替比林(例如，4-氨基安替比林(4-AA))、苯酚和/或苯胺类似物。例如，可以用Trinder反应，需要苯酚或苯胺类似物、过氧化物酶如辣根过氧化物酶，以及4-AA。这种方法可以在不需要还原酶或循环反应的情况下实施。
在一些实施例中，在试验环境中包含还原酶，通常还包括经常大大地过量的脱氢酶(芳基醇脱氢酶、醇脱氢酶)和还原辅因子(例如，NADH，NADPH)。在循环反应中，辅因子被氧化形成NAD+或NADP+，并且可以通过本领域中熟知的方法来测定这种氧化形式(NAD+或NADP+)的存在或还原形式(NADH的NADPH)的消失。反应混合物还包含氧化化学式(II)或(IIb)的乙醇的酶，因此结果可以是这里进一步描述的循环试验系统。
各种各样的试剂和/或酶，包括水解酶、醇氧化酶、芳基醇氧化酶、醇脱氢酶，和/或芳基醇脱氢酶，可以任何合适的形式提供和/或使用。在一些实施例中，各种各样的试剂和/或酶以单独的形式提供和/或使用。在另外的实施例中，各种各样的试剂和/或酶以混合的形式提供和/或使用。
下面提供了本发明具体实施例的更多详细说明，用以说明其范围和操作。
附图说明
图1.1说明本发明中具有苯甲基取代的半乳糖的酶底物与β-半乳糖苷酶反应而释放苯甲醇的反应，苯甲醇随后被芳基醇氧化酶和氧气氧化成苯甲醛和过氧化氢。
图1.2说明被β-半乳糖苷酶水解从而释放烯丙醇的含有石蜡的半乳糖苷酶底物，烯丙醇随后被氧化成醛和过氧化氢。
图2说明被β-半乳糖苷酶水解产生苯甲醇的苯甲基半乳糖苷酶底物，以及随后另一种酶(芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶)对苯甲醇的氧化。酶催氧化消耗辅因子，NAD+或NADP+，NAD+或NADP+在氧化步骤被还原产生NADH或NADPH。
图3说明使用芳基醇氧化酶和氧气氧化由水解酶产生的苄基醇，其作用于本发明的水解酶底物以产生苯甲醛和过氧化氢，苯甲醛随后被还原成苯甲醇。还原使用NADH或NADPH以及醇脱氢酶，产生NAD+或NADP+。
图4说明作为水解酶底物的苯甲基磷酸酯，被碱性磷酸酶水解产生磷酸和苯甲醇。苯甲醇随后被芳基醇氧化酶和氧气氧化产生苯甲醛和过氧化氢；可以通过监测过氧化氢来测定反应速率以及因此检测和/或确定目前碱性磷酸酶的数量。
图5说明作为乙酰酯酶水解酶底物的苯甲基酯，释放苯甲醇，苯甲醇随后被另一种酶如芳基醇氧化酶和氧气氧化。反应产物包括苯甲醛和过氧化氢，可以通过本领域已知的方法测定。
图6说明作为α-氨基酸酯酶水解酶底物的α-氨基酸的苯甲基酯。酶促反应释放苯甲醇，随后被另一种酶如芳基醇氧化酶和氧气氧化。反应产物包括苯甲醛和过氧化氢，可以通过本领域已知的方法测定。
图7说明作为羧酸酯酶水解酶底物的苯甲基酯，释放苯甲醇，随后被另一种酶如芳基醇氧化酶和氧气氧化。反应产物包括苯甲醛和过氧化氢，可以通过本领域已知的方法测定。
图8说明图1所示的β-半乳糖苷酶底物，以及说明使用还原酶(芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶)还原图1产生的苯甲醛的选择，提供循环酶系统。还原步骤再生苯甲醇并产生氧化的辅因子(NAD+或NADP+)，因此可以监测还原辅因子的消耗率或氧化辅因子的产生率来测定目前β-半乳糖苷酶的数量。作为选择或此外，如图8所示，Trinder反应可用于测定产生的过氧化氢，从而确定目前β-半乳糖苷酶的数量。
图9说明作为水解酶底物与碱性磷酸酶反应产生磷酸和苯甲醇的苯甲基磷酸酯。苯甲醇随后被芳基醇氧化酶和氧气氧化产生苯甲醛和过氧化氢，如图4所示。图9进一步说明使用还原酶(芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶)还原苯甲醛，提供循环酶系统。还原步骤再生苯甲醇并产生氧化的辅因子(NAD+或NADP+)，因此可以监测还原辅因子的消耗率或氧化辅因子的产生率来测定目前碱性磷酸酶的数量。作为选择或此外，如图8所示，Trinder反应可用于测定产生的过氧化氢，从而确定目前碱性磷酸酶的数量。
图10说明典型的AAO/AAD循环系统中芳基醇的检测。
图11说明典型的AAO/AAD循环系统中碱性磷酸酶的检测。
发明的详细说明
本发明提供高效酶活性检测系统的水解酶底物。所述底物包括识别部分，使它们被感兴趣的酶特异性识别，并且可以作为水解酶底物部分发挥作用。识别部分共价连接在可被水解酶作用切除的分子片段上。与这些底物的适合的实例在图1-9中描述。
为公开充分，且不作为限制，将本发明的详细说明分为以下部分。
A.定义
除非另有规定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的意思。本文所引用的所有专利、申请、公开申请以及其它出版物通过引用全文包含于此。如果本部分解释的定义与通过引用包含于此的专利、申请、公开申请以及其它出版物相反或别的不一致，那么本部分解释的定义胜过通过引用包含于此的定义。
正如这里所使用的，“a”或“an”意思是“至少一个”或“一个或多个”。
正如这里所使用的，“样品”指的是可能包含分析物试验需要的分析物的任何物质。样品可以是生物样品，例如生物液体或生物组织。生物液体的例子包括尿、血液、细胞质、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊髓液、泪液、粘液、羊水或类似物。生物组织是细胞的聚集体，通常是与它们的细胞间质以特别形式连接形成人类、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料，包括结缔、上皮、肌肉和神经组织。生物组织的例子还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和单个细胞(多个细胞)。
正如这里所使用的，“血液样品”指的是整个血液样品或从中提取的细胞质或血清部分。更好地，血液样品指的是人类血液样品例如全血或从中提取的细胞质或血清部分。此外更好地，血液样品是试验前预处理的，通过大体上去除所有血红蛋白(即红血细胞)从而排除或显著降低来自血红蛋白分子的氧化干扰。
正如这里所使用的术语“全血”指的是还没有分组的包含细胞和液体成分的血液样品。正如这里所使用的，“全血”指的是新抽出的在其凝结之前进行试验的血液，或通常抽出的血液样品，其可能被抽入一次性采血管中并且可能含有抗凝血剂如肝素锂、EDTA等，或在常规临床试验的过程中加入了一种或多种其它的标准临床试剂。
正如这里所使用的，短语“大体上所有的血红蛋白已被去除”指的是血液样品，其中，样品中所有含有血红蛋白的红血细胞的优选地至少约50％、60％或70％，更优选地，至少约80％、90％或95％，并且最优选地，至少约96％、97％、98％、99or100％已被去除，从而排除或显著降低来自血红蛋白的氧化干扰。
正如这里所使用的，术语“细胞质”指的是液体，全血的非细胞成分。随使用的分离方法而定，细胞质可以完全没有细胞成分，或可以包含不同数量的血小板和/或小量的其它细胞成分。细胞质包含各种各样的凝固因子如纤维蛋白原，因此术语“细胞质”不同于下面所解释的“血清”。
正如这里所使用的，术语“血清”指的是全哺乳动物血清，例如全人血清。更进一步地，正如这里所使用的，“血清”指的是凝固因子(例如纤维蛋白原)已被去除的血浆。
正如这里所使用的，术语“液体”指的是可以流动的任何成分。因此液体包含半固体、糊糊、溶液、含水混合物、凝胶、乳液、奶油和其它此类成分。
正如这里所使用的，术语“疾病”或“失调”指的是生物体中由例如传染或遗传缺陷引起并具有可辨症状的特征的疾病状态。
正如这里所使用的，“接触”意思是将两种或多种成分放在一起。“接触”可以通过在液体中或半流体混合物中混合所有成分实现。当一种或多种成分在固体表面如固体组织部分或底物上被放入一种或多种其它成分中相互接触时，“接触”也可以实现。
正如这里所使用的，术语“发色底物”指的是可以作为反应的供体或受体参与特别的酶促反应并在反应过程中改变颜色的化学成分。例如，髓过氧物酶通过向供体分子借两个氢原子将过氧化氢转变成水。当供体分子是发色底物时，发色底物的氧化使底物变成可检测的颜色。例如，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)在还原态时无色而在氧化态时呈蓝色或在二元胺状态时呈黄色。
正如这里所使用的，术语“非发色辅底物”(non-chromogenic co-substrate)指的是参加与发色底物相同的酶促反应但在反应过程中不改变颜色的化学成分。在上述例子中，过氧化氢是非发色辅底物，因为水和过氧化氢都是无色的。
正如这里所使用的，术语“比较”通常指为了说明两个或多个值之间的相似性或差别而进行的分析。优选地，“比较”指的是数量上的比较如，例如从另一个值中减去一个值、计算两个值的比例、计算一个值对另一个值的百分比，或者组合这些类型的计算来产生单一的数。正如这里所使用的，“比较”进一步指人类做的比较、电脑或其它数据处理器做的比较，以及人类和电脑或其它数据处理器联合做的比较。
正如这里所使用的，除非另外说明，术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括直链、支链及环单价烃基，以及这些的组合，当它们没被取代时仅含有C和H。例子包括甲基、乙基、异丁基、环己基、环戊基、2-丙烯基、3-丁烯基，以及类似物。在每个这样的基团中碳原子的总数有时在此说明，例如，当基团可以含有多达10个碳原子时，它可以表示为1-10C或表示为C1-C10或C1-10。正如在异烷基基团中，当允许杂原子(例如通常的N、O和S)替代碳原子时，例如，数量描述基团，虽然还是写作例如C1-C6，但表示的是基团中碳原子的数量与在所述环或链中作为碳原子取代而包含在内的这类杂原子的数量的总和。
通常，本发明的烷基、烯基和炔基取代包括1-10C(烷基)或2-10C(烯基或炔基)。优选地，它们包括1-8C(烷基)或2-8C(烯基或炔基)。有时它们包括1-4C(烷基)或2-4C(烯基或炔基)。单独的基团可以包括多于一种类型的重键，或多于一个重键；当它们包含至少一个碳碳双键时，这种基团包含在术语“烯基”的定义中，以及当它们包含至少一个碳碳三键时，这种基团包含在术语“炔基”中。
正如这里所使用的，术语“1-烯烃”和“1-炔烃”分别指的是通过与烯烃或炔烃组成部分的邻近碳原子形成双键或单键的碳原子连接基础分子的烯烃或炔烃。
烷基、烯基和炔基基团的取代经常在这种取代化学上具有意义时发生。通常取代包括，但不局限于卤基、＝O、＝N-CN、＝N-OR、＝NR、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR2、OOCR、COR以及NO2，其中每个R是独立的H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C3-C8杂环基、C4-C10杂环烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基，并且每个R任意被卤基、＝O、＝N-CN、＝N-OR’、＝NR’、OR’、NR’2、SR’、SO2R’、SO2NR’2、NR’SO2R’、NR’CONR’2、NR’COOR’、NR’COR’、CN、COOR’、CONR’2、OOCR’、COR’以及NO2取代，其中每个R’是独立的H，或选自C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C3-C8杂环基、C4-C10杂环烷基、C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基的未被取代的基团。烷基、烯基和炔基基团也可以被C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基取代，其中每一个可以被适合其具体基团的取代基取代。如果取代基团在相同或邻近原子上包含两个R或R’基团(例如-NR2或-NR-C(O)R)，那么两个R或R’基团可以随意与取代基团中它们连接的原子在一起形成具有5-8个环成员的环，如R或R’本身所允许的，所述环可被替代，并且可以包含另外的杂原子(N、O或S)作为环成员。
“杂烷基”、“杂烯基”、“杂炔基”及其类似物相似地定义为相应的烃基(烷基、烯基和炔基)基团，但术语“杂”指的是在骨架残基中含有1-3个O、S或N杂原子或它们的组合的基团；因此相应烷基、烯基和炔基基团至少一个碳原子被指定的杂原子取代从而形成杂烷基、杂烯基或杂炔基基团。烷基、烯基和炔基基团的杂原子典型的和优选的大小通常与对应的烃基基团相同，并且在杂原子上可能存在的取代基与上述烃基基团的取代基相同。由于化学稳定性的原因，还要理解的是，除非另有说明，除了在含硝基或磺酰基的基团中存在于N或S上的桥氧基之外，这样的基团不包含多于两个邻近的杂原子。
当这里所述的“烷基”包括环烷基和环烷基烷基基团时，术语“环烷基”在这里可能用来特指通过环碳原子连接的碳环形非芳香族基团，以及“环烷基烷基”可能用来描述通过烷基连接体连接到分子上的碳环形非芳香族基团。类似地，“杂环基”(或“杂环烷基”的等同术语)可能用来描述含有至少一个作为环成员的杂原子并通过可能是C或N的环原子连接在分子上的非芳香族环形基团；并且“杂环烷基”可能用于描述通过连接体连接在另一个分子上的这种基团。适合于环烷基、环烷基烷基、杂环基以及杂环烷基基团的大小和取代基与上述烷基基团的相同。正如这里所使用的，这些术语还包括含有一个或两个双键的环，如果环不是芳香族的。
正如这里所使用的，“酰基”包括含有连接在羰基碳原子两个可用化合价位置之一上的烷基、烯基、炔基、芳基或芳基烷基的基团，而杂酰基指的是相应的基团，其中除了羰基碳以外至少一个碳原子已被选自N、O和S的杂原子取代。因此杂酰基包括，例如，-C(＝O)OR以及-C(＝O)NR2还有-C(＝O)-杂芳基。
酰基和杂酰基基团通过羰基碳原子的公共化合价连接在任何基团或分子上。通常，它们是C1-C8酰基基团，包括甲酸基、乙酰基、特戊酰和苯甲酰，以及C2-C8杂酰基基团，包括甲氧乙酰基、乙酯基和4-吡啶基。烃基基团、芳基基团以及包含酰基或杂酰基基团的这类基团的杂合型可以被这里所述的通常适合每种酰基或杂酰基基团对应成分的取代基所取代。
“芳香族的”组成部分或“芳基”组成部分指的是单环的或融合双环的具有熟知的芳香族化合物结构特征的组成部分。类似地，“杂芳香族的”和“杂芳基”指的是C5-C6单环的或C8-C10融合双环的具有一个或多个选自O、S和N的作为环成员的杂原子的环系统。杂原子的包含允许了5元环和6元环中的芳香族化合物结构特征。典型的杂芳香族系统包括单环C5-C6芳香族基团例如吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、恶唑基和咪唑基，以及通过将这些单环基团之一与苯基环或任何所述杂芳香族单环基团融合产生C8-C10双环基团而形成的融合双环组成部分如吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、异喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、pyrazolopyridyl、喹唑啉基、喹喔啉基、噌嗪基，及其类似物。任何就贯穿环系统的电子分布而言具有芳香族化合物结构特征的单环的或融合环双环的系统都包含在这个定义中。它也包括双环基团，其中至少与分子剩余部分直接连接的环具有芳香族化合物结构特征。通常，所述环系统包含5-12个环成员原子。单环的杂芳基优选包含5或6个环成员，而双环的杂芳基优选包含8、9或10个环成员。
芳基和杂芳基组成部分可以被多种取代基取代，包括C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C8环烷基、C5-C12芳基、C1-C8酰基以及这些取代基的杂合型，其中每个取代基本身可以被进一步取代；其它芳基和杂芳基组成部分的取代基包括卤基、OR、NR2、SR、SO2R、SO2NR2、NRSO2R、NRCONR2、NRCOOR、NRCOR、CN、COOR、CONR2、OOCR、COR以及NO2，其中每个R是独立的H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8杂烯基、C2-C8炔基、C2-C8杂炔基、C3-C8杂环基、C4-C10杂环烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C7-C12芳基烷基，或C6-C12杂芳基烷基，并且每个R随意地被上述烷基基团的取代基取代。如果取代基团在相同或邻近原子上包含两个R或R’基团(例如-NR2或-NR-C(O)R)，那么两个R或R’基团可以随意地与取代基团中它们连接的原子在一起形成具有5-8个环成员的环，如R或R’本身所允许的，所述环可被替代，并且可以包含另外的杂原子(N、O或S)作为环成员。在芳基或杂芳基基团上的取代基团当然可以被这里所述的适合这些取代基的每一类或取代基的每个成分的基团进一步取代。因此，例如，芳基烷基取代基可以在芳基一部分上被这里所述的芳基基团典型的取代基取代，并且它可以在芳基一部分上被这里所述的典型的或适合芳基基团的取代基进一步取代。
类似地，“芳基烷基”和“杂芳基烷基”指的是芳香族的和杂芳香族的通过连接基团如亚烃基结合它们的附着点的环系统，所述连接基团包括取代的或未取代的、饱和的或未饱和的、环化的或开环的连接体。通常连接体是C1-C8烷基或它的杂合型。这些连接体也可以包含羰基基团，因此使它们能够提供作为酰基或杂酰基组成部分的取代基。芳基烷基或杂芳基烷基基团中的芳基或杂芳基环可以被与上述芳基基团的取代基相同的取代基取代。优选地，芳基烷基基团包括被上面规定的芳基基团的基团取代的苯基环及未被取代或被一个或两个C1-C4烷基基团或杂烷基基团取代的C1-C4亚烃基，其中烷基或杂烷基基团可以随意地环化形成诸如环丙烷、二氧戊环或氧杂环戊烷的环。类似地，杂芳基烷基基团优选包含被上述典型的芳基基团取代基随意取代的C5-C6单环的杂芳基基团及未被取代或被一个或两个C1-C4烷基基团或杂烷基基团取代的C1-C4亚烃基，或者它包含随意取代的苯基环或C5-C6单环杂芳基以及未被取代或被一个或两个C1-C4烷基或杂烷基基团取代的C1-C4杂亚烃基，其中烷基或杂烷基基团可以随意地环化形成诸如环丙烷、二氧戊环或氧杂环戊烷的环。
芳基烷基或杂芳基烷基基团被描述为随意地取代，那么取代可以在基团的烷基或杂烷基一部分上或在基团的芳基或杂芳基一部分上。随意出现在烷基或杂烷基一部分上的取代基通常与上述烷基基团的取代基相同；随意出现在芳基或杂芳基一部分上的取代基通常与上述芳基基团的取代基相同。
这里所使用的“芳基烷基”基团如果未被取代，那么它们是烃基基团，并且通过环和亚烃基或类似连接体中的碳原子总数来描述。因此，苯甲基是C7-芳基烷基基团，而苯乙基是C8-芳基烷基。
“上述“杂芳基烷基”指的是包含通过连接基团连接的芳基基团的组成部分，并且不同于“芳基烷基”的是至少芳基组成部分的一个环原子或连接基团中的一个原子时选自N、O和S的杂原子。杂芳基烷基基团在这里根据环和结合的连接体中的原子总数来描述，并且它们包含通过杂烷基连接体连接的芳基基团；通过烃基连接体如亚烃基连接的杂芳基基团；以及通过杂烷基连接体连接的杂芳基基团。因此，例如，C7-杂芳基烷基将包括吡啶基甲基、苯氧基和N-吡咯基甲氧基。
这里使用的“亚烃基”指的是二价的烃基基团；因为它是二价的，所以它可以和两个其它的基团连接在一起。通常它指的是-(CH2)n-其中n是1-8并且优选n是1-4，虽然有所规定，但亚烃基也可以被其它基团取代，并且可以是其它长度，并且公共的化合价不需要在链的对立端。因此，-CH(Me)-和-C(Me)2-也可以作为亚烃基被提及，环形基团例如环丙基-1，1-二基也可以。亚烃基基团被取代，包含这些的取代基通常出现在这里所述的烷基基团上。
通常，包含在取代基中的任何烷基、烯基、炔基、亚烃基、酰基，或芳基或芳基烷基基团或这些基团之一的任何杂合型本身可以随意被另外的取代基取代。如果所述取代基没有另外说明，那么这些取代基的性质与所述有关原始取代基本身的性质相似。因此，其中的实施例，例如，R7随意地被烷基取代，在具有化学意义且本质上不破坏所提供的烷基的大小限制的情况下，这个烷基可以随意地被R7实施例中列出的剩下的取代基取代；例如，被烷基或烯基取代的烷基会简单地扩大这些实施例的碳原子的上限，不包括在内。然而，被芳基、氨基、烷氧基、＝O，及其类似物取代的烷基将包含在本发明的范围内，并且这些取代基基团的原子不计入用于描述所述烷基、烯基等基团的数目中。其中没有规定取代基的数目，每个这样的烷基、烯基、炔基、酰基或芳基基团根据其可用的化合价可以被许多取代基取代；特别是，例如，这些基团的任何一个可以在其任何的或全部的可用化合价上被氟原子取代。
这里使用的“杂合型”指的是基团如烷基、芳基或酰基的衍生物，其中所选碳环形基团的至少一个碳原子已被选择N、O和S的杂原子取代。因此烷基、烯基、炔基、酰基、芳基以及芳基烷基的杂合型分别是杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂酰基、杂芳基以及杂芳基烷基。要理解的是，除了桥氧基基团与N或S连接形成硝基或磺酰基基团之外，通常不超过两个N、O或S原子连续连接。
这里使用的“随意取代的”表示具体的基团或所述基团可以不具有非氢取代基，或所述基团可以具有一个或多个非氢取代基。如果没有另外规定，可能存在的这样的取代基的总数与所述基团未取代形式上存在的H原子数量相等。如果随意取代基通过双键连接，例如羰基(＝O)，那么所述基团占用两个可用化合价，因此根据可用化合价的数目，可能包含的取代基的总数减少。
这里使用的“卤基”包括氟代、氯代、溴代和碘代。氟代和氯代常常是首选。
这里使用的“氨基”指的是NH2，但是如果氨基被描述为“取代的”或“随意取代的”，那么该术语包括NR’R”，其中每个R’和R”是独立的H，或是烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳基烷基基团或这些基团之一的杂合型，并且每个烷基、烯基、炔基、酰基、芳基或芳基烷基基团或这些基团之一的杂合型被这里所述的适合相应基团的取代基随意取代。术语还包括形式，其中R’和R”连在一起形成3-8元环，所述环可以是饱和的、未饱和的或芳香族的，含有1-3个独立选自N、O和S的作为环成员的杂原子，并且被所述适合烷基基团的取代基随意取代，或者，如果NR’R”是芳香基团，那么它被所述的杂芳基基团典型的取代基随意取代。
这里使用的“氨基酸”指的是氨基取代的羧酸化合物；典型的例子是20个常见的α氨基酸，及其在羧酸的β或γ位置具有胺的类似物。这里使用的“α氨基酸”指的是化学式为HO2C-CH(NH2)-Ra的氨基酸，其中Ra是随意取代的C1-C6烷基基团，或随意取代的芳基或芳基烷基基团，或随意取代的杂芳基或杂芳基烷基基团。具体的例子包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、精氨酸、天冬酰胺和脯氨酸。
这里使用的“糖类”指的是通常在分支或不分支的糖链中含有一个或多个糖的碳水化合物组成部分。当n是整数时，例如1-1000或3-50或5-25，糖类的一般化学式为(CH2O)n。典型的例子是葡萄糖、蔗糖、淀粉和纤维素。这些糖类可以是单糖、双糖或多糖；术语“低聚糖”用来描述由大约3-25个糖基组成的糖类，通常在不分支糖链中。
“水解酶底物的识别成分”或“识别组成部分”指的是酶底物分子的一部分，其十分类似于水解酶天然底物中使水解酶结合到酶底物分子上的一部分。
正如这里所使用的，“酯酶”指的是在称为水解的含水化学反应中将酯分解为酸和醇的酶。大范围的不同的酯酶区别于它们的底物特异性、它们的蛋白结构及它们的生物学功能而存在。典型的酯酶包括乙酰酯酶、硫醇酯水解酶、磷酸单酯水解酶(或磷酸单酯酶)、磷酸二酯酶、三磷酸单酯水解酶、硫酸酯水解酶(硫酸酯酶)、二磷酸单酯水解酶、磷酸三酯水解酶、核酸外切酶(脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶)以及核酸内切酶(脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶)。还计划包含具有保守氨基酸替换或功能片段，本质上不会改变其活性的酯酶。
正如这里所使用的，“糖苷水解酶(也称为糖苷酶)”指的是催化糖苷键水解从而释放更小的糖的酶。糖苷水解酶通常作为催化O-或S-糖苷水解的酶被归类于EC3.2.1中。糖苷水解酶也可以根据水解反应的立体化学结果进行分类：因此它们可以分为固定酶或转化酶。糖苷水解酶也可以被分为外切或内切活性，取决于它们分别是在寡糖链/多糖链的(通常非还原)末端或中间发挥作用。糖苷水解酶还可以被分为基于序列的方法或基于结构的方法。典型的糖苷水解酶包括β-半乳糖苷水解酶(也称为beta-gal或β-gal)、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、乳糖酶、淀粉酶、几丁质酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、神经氨酸苷酶、转化酶、透明质酸酶和溶菌酶。还计划包含具有保守氨基酸替换或功能片段，本质上不会改变其活性的糖苷水解酶。
正如这里所使用的，“磷酸酯酶”指的是通过水解磷酸单酯形成磷酸离子和具有自由羟基基团的分子而将磷酸基团从其底物中去除的酶。基于它们的底物特异性，磷酸酯酶可以细分为，例如酪氨酸特异的磷酸酯酶、丝氨酸/苏氨酸特异的磷酸酯酶、双特异性磷酸酯酶、组氨酸特异的磷酸酯酶以及脂质磷酸酯酶。典型的磷酸酯酶包括碱性磷酸酯酶(ALP、ALKP)。还计划包含具有保守氨基酸替换或功能片段，本质上不会改变其活性的磷酸酯酶。
正如这里所使用的，“醇氧化酶”指的是催化下列化学反应的酶：
这种酶类的系统名是醇：氧氧化还原酶。这种酶也称为乙醇氧化酶。还计划包含具有保守氨基酸替换或功能片段，本质上不会改变其活性的醇氧化酶。
正如这里所使用的，“芳基醇氧化酶”指的是催化下列化学反应的酶：
这种酶类的系统名是芳基醇：氧氧化还原酶。通常使用的其它名字包括白藜芦醇氧化酶及阿姆.醇氧化酶(arom.alcohol oxidase)。还计划包含具有保守氨基酸替换或功能片段，本质上不会改变其活性的芳基醇氧化酶。
.正如这里所使用的，“芳基醇脱氢酶”指的是催化下列化学反应的酶：
这种酶类的系统名是芳基醇：NAD+氧氧化还原酶。其它通常使用的名称或例子包括p-羟基苯甲醇脱氢酶、苯甲醇脱氢酶以及松柏醇脱氢酶。还计划包含具有保守氨基酸替换或功能片段，本质上不会改变其活性的芳基醇脱氢酶。
正如这里所使用的，“醇脱氢酶(ADH)”指的是发生在许多生物体中随着NAD+至NADH的还原促进醇和醛或酮之间的相互转变的一组脱氢酶。还计划包含具有保守氨基酸替换或功能片段，本质上不会改变其活性的醇脱氢酶。
这里使用的术语“评估”打算包括在获得样品中存在的分析物的数量或浓度的绝对值的意义上，也在获得样品中分析物的水平的指数、比率、百分比、图像或其它指示值的意义上的定量和定性计算。评估可以是直接的或间接的，并且实际检测到的化学形式当然不需要是分析物本身，而可以是例如它的衍生物或一些进一步的物质。
正如这里所使用的，“结合试剂(或结合剂)”指的是以期望的亲和性和/或特异性与目标或分析物结合的任何物质。结合试剂的非限制性例子包括细胞、细胞的细胞器、病毒、微粒、微粒子、分子，或其聚集体或复合体，或分子的聚集体或复合体。
正如这里所使用的，“抗体”不但包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、双特异抗体、由抗体片段产生的多特异抗体、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白，以及包含所需特异性抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它结构。抗体包括任何种类的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且所述抗体不需要是任何特别的种类。
正如这里所使用的，术语“特异性结合”指的是结合试剂的特异性，例如，抗体，因此它优选结合在限定的分析物或目标上。在其它潜在目标存在的情况下，结合试剂或抗体对特别分析物或目标的识别是这种结合的一个特征。在一些实施例中，特异性结合分析物的结合试剂避免结合待测样品中其它干扰部分或组成部分。
这里使用的术语“避免结合”指的是特别结合试剂的特异性，例如，抗体或抗体片段。避免结合在特别的组成部分的结合试剂、抗体或抗体片段通常包含特异性，因此，大的百分比的特别的组成部分将不会被这样的结合试剂、抗体或抗体片段结合。所述百分比通常位于利用结合试剂或抗体检测特异目标的试验中与干扰组成部分交叉反应的可接受的百分比的范围内。目前公开的结合试剂、抗体或抗体片段经常避免结合约90％以上的干扰组成部分，尽管明确考虑和首选更高的百分比。例如，目前公开的结合试剂、抗体或抗体片段避免结合约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，以及约99％或更多的干扰组成部分。偶尔，目前公开的结合试剂、抗体或抗体片段避免结合高于约70％，或高于约75％，或高于约80％，或高于约85％的干扰组成部分。
正如这里所使用的，“哺乳动物”指的是任何哺乳类物种。这里使用的术语“哺乳动物”经常指的是人、人类对象或人类患者。
正如这里所使用的，术语“对象”不局限于具体物种或样品类型。例如，术语“对象”可以指患者，并且经常是人类患者。然而，这个术语不局限于人类，因此包括多种哺乳动物物种。
正如这里所使用的，核酸杂交反应的“强度”容易被本领域普通技术人员之一确定，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。一般而言，更长的探针要求更高的特异退火温度，而更短的探针需要更低的温度。当互补链存在于低于它们解链温度的环境中时，杂交通常取决于变性核酸序列的再退火的能力。探针和杂交序列之间所需的同源性级别越高，可以使用的相对温度也越高。因此得出结论，越高的相对温度将使反应条件更加严格，而越低的相对温度则相反。更多杂交反应严格性的描述和解释，参见最新分子生物学指南(Ausubel et al.eds.，Wiley Interscience Publishers，1995)；分子克隆：实验室手册(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis eds.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2d ed.1989)；Wood et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：1585-1588(1985)。
这里使用的术语“分离的”指的是从其原始环境中除去的材料，并且改变了其天然状态。例如，分离的多肽可以与载体结合，并且还是“分离的”，因为多肽不在其原始环境中。
正如这里所使用的，“测试物(或候选化合物)”指的是化学上定义的化合物(例如，有机分子、无机分子、有机/无机分子、蛋白、肽、核酸、寡核苷酸、脂类、多糖、糖类，或这些分子的混合物如糖蛋白等)或化合物的混合物(例如，测试化合物库、天然提取物或培养悬浮液等)，其对目标的作用视公开的和/或这里要求的方法而定。
正如这里所使用的，高通量筛选(HTS)指的是测试大量样品的方法，例如用于确定“命中”的多种对抗疾病靶标的化学结构的样品，(参见，例如Broach，et al.，Highthroughput screening for drug discovery，Nature，384：14-16(1996)；Janzen，etal.，High throughput screening as a discovery tool in the pharmaceutical industry，Lab Robotics Automation：8261-265(1996)；Fernandes，P.B.，Letter from the societypresident，J.Biomol.Screening，2：1(1997)；Burbaum，et al.，New technologies forhigh-throughput screening，Curr.Opin.Chem.Biol.，7：72-78(1997))。HTS进行样品准备、试验程序及后续大量数据加工的操作是高度自动化和计算机化的。
正如这里所使用的，“植物”指的是典型地产生胚胎、包含叶绿体、具有纤维素细胞壁及缺乏运动能力的任何植物界的各种光合作用的真核多细胞生物。
正如这里所使用的，“动物”指的是动物界多细胞生物，具有运动能力、非光合作用的新陈代谢、明显的应激反应、有限的生长和固定的身体结构的特征。动物的非局限性例子包括鸟类例如鸡、脊椎动物例如鱼和哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、奶牛、公牛、绵羊、山羊、马、猴子和其它非人类灵长类。
正如这里所使用的，“细菌”指的是具有未分区的环状DNA及约70S的核糖体的小原核生物(大约1微米的线性尺寸)。细菌蛋白合成不同于真核生物的蛋白合成。许多抗细菌的抗菌素干扰细菌的蛋白合成而不影响感染的寄主。
正如这里所使用的，“真细菌”指的是除了古细菌外细菌的重要分支。大部分革兰式阳性细菌、蓝细菌、支原体、肠杆菌，假单胞菌及叶绿体是真细菌。真细菌的细胞质膜包含酯联的脂类；在细胞壁中(如果存在)含有肽聚糖；并且在真细菌中没有发现内含子。
正如这里所使用的，“古细菌”指的是除了真细菌外细菌的重要分支。古细菌有三个主要类别：极端嗜盐菌、产甲烷菌和硫依赖型极端嗜热菌。古细菌在核糖体结构、内含子的占有(在一些情况下)以及其它包含膜成分在内的特征不同于真细菌。
正如这里所使用的，“病毒”指的是由DNA或RNA和蛋白包被组成的生者的专性胞内寄生物，但非细胞特征。病毒直径在约20nm至约30nm的范围内。I类病毒(巴尔的摩分类)具有双链DNA作为它们的基因组；II类病毒具有单链DNA作为它们的基因组；III类病毒具有双链RNA作为它们的基因组；IV类病毒具有正义单链RNA作为它们的基因组，所述基因组本身起mRNA的作用；V类病毒具有用作mRNA合成模板的反义单链RNA作为它们的基因组。VI类病毒具有正义单链RNA基因组，但在复制和mRNA合成过程中具有DNA中间体。多数病毒通过它们在植物、动物和原核生物中引起的疾病得到识别。原核生物的病毒叫做噬菌体。
正如这里所使用的，“真菌”指的是不对称聚集生长，无根、茎或叶，并且缺乏叶绿素或其它光合作用所需色素的真核生物的分支。每种生物(叶状体)从单细胞的到细丝状的，并具有被含有葡聚糖或壳质或两者的细胞壁包围的分支的躯体结构(菌丝)。
正如这里所使用的，NAD+指的是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或合适的衍生物例如乙酰-NAD+或硫代-NAD+。NADH指的是NAD+的还原形式及合适的衍生物例如乙酰-NADH或硫代-NADH。NADP+指的是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或合适的衍生物例如乙酰-NADP+或硫代-NADP+。NADPH指的是NADP+的还原形式及合适的衍生物例如乙酰-NADPH或硫代-NADPH。
B.水解酶
酶是作用于底物从而产生产物的起催化作用的蛋白。产生水解作用的酶或水解酶是通过加入水催化化学键水解的酶。例如，催化下列反应的酶是水解酶：A-B+H2O→A-OH+B-H。在酶化学中，水解酶通常分类为酶EC编号分类中的EC3。还打算包含具有保守氨基酸替换或功能片段，本质上不会改变其活性的水解酶。
基于它们可以作用的化学键，水解酶可以进一步分为几个亚类：例如，EC3.1.：酯键(酯酶、核酸酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、磷酸酯酶)；EC3.2.：糖(糖苷水解酶)；EC3.3.：醚键；EC3.5.：碳-氮键，不同于肽键；EC3.6.：酸酐(酸酐水解酶，包括解螺旋酶和GTP酶)；EC3.7.：碳-碳键；EC3.8.：卤键；EC3.9.：磷-氮键；EC3.10.：硫-氮键；EC3.11.：碳-磷键；EC3.12.：硫-硫键；EC3.13.：碳-硫键。
这里所述方法可以适用于任何合适的水解酶，即在加入水分子后将底物分子分解为其中之一是羟基化有机分子的两种产物的任何酶。糖苷酶、酯酶、脂肪酶、核酸酶和磷酸酯酶是典型的例子。糖苷酶水解糖基化的醇产生糖和自由的醇。酯酶水解酯产生羧酸和自由的醇。磷酸酯酶通常水解磷酸酯产生磷酸(或二磷酸或三磷酸)和醇。
一些特别感兴趣的糖苷酶包括β-D-糖苷酶。一些特别感兴趣的酯酶包括α-氨基酸酯酶、羧酸酯酶、乙酰酯酶，及其类似物。一些特别感兴趣的磷酸酯酶包括可以轻易结合载体或抗体的碱性磷酸酶、磷酸二酯酶，及其类似物。众所周知的用于ELISA试验中的牛碱性磷酸酶是一个合适的例子。
C.水解酶底物
本发明的水解酶底物通常包含以可切除连接与被酶识别为其底物部分的识别组成部分相连接的醇。识别组成部分提供了所选水解酶特异的水解酶底物，例如，识别组成部分使底物对所选水解酶的转化敏感，而在可比的比率上不容易遭到典型系统中可能存在的其它酶的转化。
一些特异水解酶的识别组成部分的例子如图1-9所示。图1.1所示的底物的半乳糖基环为识别组成部分，使苯甲基的底物可被β-D-半乳糖苷酶特异性识别及水解。类似地，图4中底物的磷酸使水解酶底物特异地对碱性磷酸酶的水解作用敏感；图5中底物的乙酰酯提供了被乙酰酯酶选择性识别的底物；以及图6中底物的α-氨基酸酯提供了被α-氨基酸酯酶活性选择性水解的底物。
通常，水解酶底物不是别的酶或这里所述试验方法中使用的酶(芳基醇氧化酶、醇脱氢酶、芳基醇脱氢酶等)的底物；仅在底物被合适的水解酶水解之后，它才作为这里所述试验系统中使用的氧化和/或还原酶的底物。
本发明的水解酶底物包括化学式(I)的化合物：
其中：
A是芳香族或杂芳香族基团，1-烯烃或1-炔烃，每一个被任意取代；
每个R是独立的H或任意取代的C1-C4烷基或芳基；
n为1-4的整数；
X是包含底物组成部分的基团，其中底物组成部分包括水解酶底物的识别成分，并且其中水解酶的活性能够水解所述化学式(I)的化合物从而形成可检测化学式II的产物：
在一些实施例中，水解酶与化学式(I)的水解酶底物的反应产生化学式(II)的化合物和化学式(III)的副产物：
在这些化合物中的“X”包括具体的感兴趣的水解酶的识别组成部分。化学式(III)的副产物的例子可参见图1-9。这些包括半乳糖、磷酸、羧酸、氨基酸，及其类似物。
在本发明的水解酶底物的一些实施例中，A是随意取代的芳香族或杂芳香族基团。合适的芳香族基团包括苯基和萘基。合适的杂芳香族基团包括，例如，吡啶基、嘧啶碱基、三嗪基、吲哚基、咪唑基、苯并咪唑基、吡唑基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、恶唑基、异恶唑基、噻唑基和异噻唑基。这些芳基和杂芳基基团可被这里所述的进一步取代，或者它们可以不被取代。
在本发明的水解酶底物的其它实施例中，A是1-烯烃或1-炔烃。在一些实施例中，它是化学式(IV)的1-烯烃：
其中波浪线表示A与化学式(I)中的-[CH(R)]n-O-X连接的点，并且每个G、G’和G”是独立的H或随意取代的选自组C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基、芳基和杂芳基的基团。在这些实施例的某一个中，A是化学式(IVb)的基团：
其中G、G’和G”是化学式(IV)所规定的。这类化合物的例子在实施例中显示为HDEGP。
在水解酶底物的其它实施例中，A是化学式(V)的1-炔烃：
其中波浪线表示A与化学式(I)中的-[CH(R)]n-O-X连接的点，并且G是H或随意取代的选自组C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基、芳基和杂芳基的基团。在一些这样的实施例中，G可以被苯基随意取代。
在任何前面提到的实施例中，例如，R可以是H、甲基或苯基。在优选的实施例中，R是H，因此化学式(II)的产物是初级醇。当n是1时，当A是苯基时产物变成苯甲醇，当A是1-烯烃时产物是烯丙醇，或当A是1-炔烃时产物是炔丙醇。优选的实施例包括其R是H且n是1的化合物。
在本发明的水解酶底物的一些实施例中，X包含糖类，例如，单糖或双糖。在一些实施例中，X是D-半乳糖基环或另一个D-糖例如葡萄糖、阿洛糖、甘露糖、木糖、古洛糖、塔罗糖、阿卓糖、艾杜糖、核糖果胶糖、来苏糖，及其类似物。在一些实施例中，水解酶底物是化学式(VIa)或(VIb)的化合物：
其中R2是H或-CH2OQ，并且每个Q是独立的H或单糖、双糖或寡糖，并且A、R和n是化学式(I)所规定的。在一些实施例中，每个Q是H；在一些实施例中，n是1；R可以是H，及在一些实施例中，R2是-CH2OH或H。
在其它的实施例中，水解酶底物是化学式(VII)的酯：
其中R3是H或随意取代的芳基、杂芳基、C1-C8烷基、C3-C8环烷基，或C3-C8杂环烷基基团，并且A、R和n是化学式(I)所规定的。
这些化合物中的R3如果作为感兴趣的水解酶的识别组成部分，那么R3可以大不相同。在具体的实施例中，R3选自甲基、乙基和苯基组，或它实质是氨基酸例如HO2C-R3是α-氨基酸。因此-R3可以是化学式-CH(NH2)-Raa的组，其中Raa是20个常见基本氨基酸之一的侧链。在一些这样的实施例中，n是1。
在其它实施例中，水解酶底物可以是化学式(VIII)的化合物：
其中Z是N、S、S＝O、P或P-OH，并且R4是O、羟基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基，或芳基。这些可以是，例如，磷酸酯酶底物，例如，化学式I的化合物，其中X包含磷酸基团，因此化学式(VII)中的Z是P-OH。这些的例子将是化学式(IX)的化合物：
或它的盐。
在前面提到的水解酶底物中，n可以是1；并且无论在哪，A可以是芳基基团，它可以是随意取代的苯基基团。在这些实施例中，苯基基团可以不被取代，或者它可以被选自卤基、羟基、CN、NO2、COOR’、CONR’2、NR’2、OR’、随意取代的C1-4烷基、SR’、SO2R’或SO2NR’2的1-3个基团取代，其中每个R’是独立的H或随意取代的C1-4烷基，并且在相同或邻近的原子上的两个R’可以在一起形成随意取代的C3-C8杂环的环。
在水解酶底物另外的实施例中，A可以是化学式(X)的基团：
其中波浪线表示A与化学式(I)中的-[CH(R)]n-O-X连接的点，并且每个G是独立的H或随意取代的选自C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基、芳基和杂芳基的基团组。
在任何前面提到的实施例中，烷基、烯基、炔基及杂环基团的随意取代基可以是如下所示的；或者它们可以选自卤基、桥氧基、CN、NO2、COOR”、CONR”2、NR”2、OR”、随意取代的C1-4烷基、SR’、SO2R”或SO2NR”2，其中每个R”是独立的H或C1-4烷基。同样地，芳基和杂芳基基团的随意取代基可以是本文定义中所述的基团，或者它们可以选自卤基、CN、NO2、COOR”、CONR”2、NR”2、OR”、随意取代的C1-4烷基、SR’、SO2R”或SO2NR”2，其中每个R”是独立的H或C1-4烷基。
在任何前面提到的水解酶底物的优选实施例中，R是H；并且n是1。
本发明的底物的优选水解酶包括糖苷酶、酯酶、β-D半乳糖苷酶、α-氨基酸酯酶、以及磷酸酯酶。合适的酯酶可以是羧酸酯酶、乙酰酯酶或α-氨基酸酯酶。
D.水解酶底物成分
本发明的水解酶底物可以与除了水解所述底物的水解酶之外的至少一个另外的酶联合使用。所述另外的酶通过将水解酶作用的起始产物，化学式(II)的化合物，转变成另一种物质，从而促进起始产物的有效检测。因此，包含上述水解酶底物的成分和至少一种另外的酶作为检测和/或定量感兴趣的水解酶的存在的试验系统的组分是可用的。类似地，水解酶底物与这里所述方法的一些实施例中所需的其它物质的组合对这些试验也是可用的并且也是本发明的一方面。
因此在另一方面，本发明提供任何这里所述的水解酶底物与这里所述的另外的酶，或可用于检测或定量水解酶底物被水解酶水解的产物的酶辅因子，或用于水解酶底物水解产物的检测的试剂所组成的成分。
因此在一些实施例中，本发明提供包含上述水解酶底物与至少下列一种的组合的成分：
识别并水解所述水解酶底物的水解酶，所述酶可以以结合识别原件例如抗体的形式存在，或者它可以以在检测前将被表达为功能酶的多核苷酸序列的形式存在；
可以将水解酶在本发明的水解酶底物上作用产生的化学式(II)的产物转变成新的化学形式的另外的酶，经常通过氧化反应(例如，芳基醇氧化酶、醇脱氢酶或芳基醇脱氢酶)；
另外的酶所使用的能够有利于转变水解酶在本发明的水解酶底物上作用产生的化学式(II)的产物的辅因子，例如可以促进化学式II的化合物氧化成化学式A-C(＝O)-R(II-ox)的羰基化合物的NAD+或NADP+；以及
用于检测另外的酶在将化学式(II)的产物转变另一化学形式时产生的副产物的试剂，例如，用于在化学式IIB的芳基醇氧化形成化学式A-C(＝O)-R(II-ox)的羰基化合物时产生的过氧化氢的检测的试剂；和/或
能够有利于将化学式(II)的化合物氧化形成的羰基化合物转变成另一种利于检测的化学形式的酶或辅因子，例如，这里所述的将羰基化合物转变回化学式(II)的醇的还原酶，或这种还原酶的辅因子。
在一些实施例中，水解酶不包含在这些试剂组合中，因为例如，水解酶可以直接连接在靶标上被检测。所述组合可以与含有水解酶的单独样品接触而配备。例如，水解酶可以是由编码感兴趣靶标也编码所述水解酶的核酸产生的融合蛋白的部分。作为备选，水解酶可以包含在试剂组合中，并且与样品接触的反应混合物将常常含有所述水解酶，所述水解酶可以与指向感兴趣靶标的特异识别部分如抗体连接或结合。
在一些实施例中，本发明提供上述任何实施例的水解酶底物的组合，以及特定底物的对应的水解酶，即能够酶切特定的水解酶底物从而产生可检测的产物化学式(II)。在一些实施例中，芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子是所述酶切反应的产物，芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子具有所述化学式(II)的结构：
其中A、R和n是如化学式(I)所定义的。
在一些这样的实施例中，水解酶是酯酶、磷酸酯酶或糖苷酶。在特定的实施例中，水解酶选自乙酰酯酶、氨基酸酯酶、羧酸酯酶、核酸酶、磷酸二酯酶、脂肪酶和磷酸酯酶组成的集合。例如，水解酶可以是碱性磷酸酶。
在一些特定的实施例中，水解酶可以是碱性磷酸酶、α-氨基酸酯酶、半乳糖苷酶或β-糖苷酶。
I在一些这些实施例中，所述组合进一步包括能够氧化水解酶催化的酶切反应所产生的芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子的氧化试剂。在一些这样的实施例中，氧化试剂是在氧存在时能够氧化芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子产生芳基醛分子或不饱和脂肪醛分子(如果R是H)及H2O2的芳基醇氧化酶或醇氧化酶。
如果使用了氧化试剂并且H2O2可以作为氧化反应的副产物产生，那么在一些实施例中，组合也包含用于检测和/或测量H2O2的试剂。合适的试剂在本领域是众所周知的，包括那些在Trinder反应中所使用的试剂。因此合适的试剂包括过氧化物酶例如辣根过氧化物酶；苯酚例如苯酚；安替比林例如4-氨基安替比林(4-AA)，和/或苯胺类似物。已知在这些修饰的Trinder反应中使用的一些合适的苯胺类似物包括ADOS、ADPS、ALPS、DAPS、DAOS、TOOS、MAOS以及MAPS。可用于本发明的方法的合适的Trinder反应成分，参见，例如，美国专利号5,156,955。
在这些组合的一些实施例中，氧化化学式(II)的化合物形成羰基化合物(当R是H时为醛；当R不是H时为酮)的氧化试剂是能够在NAD+或NADP+存在时氧化芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子产生羰基化合物和NADH或NADPH的芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶。在这些实施例中，所述组合通常进一步包含作为辅因子促进氧化反应并被氧化反应转变成NADH或NADPH的NAD+或NADP+。通常在这些实施例中，所述组合进一步包含测量这种氧化反应产生的NADH或NADPH的试剂。
本发明的组合成分包括水解酶底物与NADH或NADPH和/或能够在NADH或NADPH存在时还原芳基醛分子或不饱和脂肪醛分子(化学式II-ox的化合物，其中R是H)的芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶。这些组合通常还包括能够氧化如上所述的化学式II的起始产生的水解产物形成羰基化合物(例如，化学式II-ox)的氧化酶。优选地，氧化酶不同于还原芳基醛或不饱和脂肪醛的酶，并且不同的酶优选不共用相同的辅因子。在一个优选的实施例中，氧化酶是利用O2促进化学式(II)的化合物氧化的醇氧化酶或芳基醇氧化酶，而还原酶是利用NADH或NADPH将醛还原回化学式II的醇的脱氢酶。
如果使用了这类附加的氧化酶和还原酶，那么就形成了循环反应系统(参见，如，图3)，因此能够实现信号放大从而大大增加试验系统的灵敏度。所述循环反应系统可以通过测量过氧化氢产生、测量还原反应中NADH或NADPH的消耗，和/或测量还原反应中NAD+或NADP+的形成来监控。在这些成分的一些实施例中，组合还包括用于测量的H2O2试剂。用于测量的H2O2的合适的试剂可以包含过氧化物酶、安替比林、苯酚例如2-氯酚、2，4-二氯苯酚、4-氯酚、2，6-二氯苯酚和/或苯胺类似物例如DMA、TOOS、TOPS、ADOS、ALOS、ADPS、ALPS、DAPS、DAOS、HDAPS、HDAOS、MAOS、MAPS或EMAE中至少一种。
在前面提到的组合的一些实施例中，水解酶底物包含至少部分β-糖苷酶底物分子，并且水解酶是β-糖苷酶。在其它实施例中，水解酶底物包含磷酸酯，并且水解酶是碱性磷酸酶。在其它实施例中，水解酶底物包含β-半乳糖苷基团并且水解酶是β-半乳糖苷酶。在其它实施例中，水解酶底物是酯，并且水解酶是α-氨基酸酯酶、羧酸酯酶，或乙酰酯酶。
在一些这样的成分中，所述组合包括任何本文所述的水解酶底物及至少下列之一：
a)在氧存在时能够氧化芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子产生芳基醛分子或不饱和脂肪醛分子及H2O2的芳基醇氧化酶或脂肪醇氧化酶；和/或
b)NADH或NADPH；和/或
c)能够在NADH或NADPH存在时还原芳基醛分子或不饱和脂肪醛分子的芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶；和/或
d)测量的试剂H2O2。
另一方面，本发明提供用于定性和/或定量测定水解酶数量的试剂盒，所述试剂盒包括本文所述的任何作为本发明目的的合适的水解酶底物的化合物以及任意地任何上述组合成分。在一些实施例中，任何一个上面所示的组合以试剂盒的形式提供。所述试剂盒可以包含单独包装的组合的成分，或者它可以包含在单一容器中预先混合的组合的实施例成分的混合物，其中所述成分是混合相容的。所述试剂盒还可以包含一个或多个有利于试验系统标准化的标准，以及用水解酶底物或组合成分进行试验的操作指南。
任何前面提到的组合可以包含在试验中，用于待产生或检测的靶标的分离和/或产生系统中。所述靶标是待检测或定量的分析物，或者待产生和检测或定量的产物，并且上述组合和试剂盒可以包含对靶标特异的组成部分，例如PCR引物或抗体。在一些实施例中，靶标是无机分子、有机分子和/或它们的复合体。在一些实施例中，靶标是选自氨基酸、肽、蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、维生素、单糖、寡糖、碳水化合物、脂质及其复合体组成的集合中的有机分子。
任何合适的醇氧化酶都可以用在现有的组合中。例如，可以使用美国专利号7,160,708、5,166,329、4,956,290、4,729,956以及4,619,898中公开的和/或权利要求的醇氧化酶。在另一个例子中，可以使用Janssen and Ruelius，Biochim.Biophys.Acta.，151(2)：330-42(1968)，and Suye，Curr.Microbiol.，34(6)：374-7(1997)中公开的醇氧化酶。
任何合适的芳基醇氧化酶都可以用在现有的组合中。例如，可以使用美国专利号3,183,235、3,290,326和6,835,212，以及美国专利申请US2009/053780A1中公开的和/或权利要求的芳基醇氧化酶。在另一个例子中，可以使用Farmer et al.，Biochem.J.74：257-62(1960)and Guillen and Evans，Applied and Enviromental Microbiology，60(8)：2811-2817(1994)中公开的芳基醇氧化酶。
任何合适的芳基醇脱氢酶都可以用在现有的组合中。例如，可以使用美国专利号4,020,070、5,182,209、6,262,295、7,750,135，以及美国专利申请US2009/017510A1、US2009/186900A1、US2006/074060A1和JP2147956A中公开的和/或权利要求的芳基醇脱氢酶。在另一个例子中，可以使用Suhara et al.，Arch.Biochem.Biophys.，130(1)：422-9(1969)，以及Yamanaka and Minoshima，Agric.Biol.Chem.，48：1161-1171(1984)中公开的芳基醇脱氢酶。
任何合适的醇脱氢酶都可以用在现有的组合中。例如，可以使用美国专利号7,750,135、7,354,751、6,552,249、6,432,688、6,255,092、6,225,099、5,908,924、5,855,881、5,695,973、5,445,943、5,385,833、5,344,777、5,162,516、5,162,203、4,241,184、4,131,727以及4,111,751中公开的和/或权利要求的醇脱氢酶。在另一个例子中，可以使用Yakushi and MatsushitaAppl Microbiol Biotechnol.，86(5)：1257-65(2010)以及YinAlcohol AlcoholSuppl.，2：113-9(1994)公开的醇脱氢酶。
本发明的组合可以系统中实施，例如免疫测定、蛋白测序、核酸扩增、杂交或测序。典型的免疫测定包括夹心型或竞争型试验，酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀反应、免疫染色、测流免疫测定、u-捕获试验、抑制测定和活性测定。典型的核酸测序技术包括使用水解酶，例如碱性磷酸酶，产生信号读出的DNA测序技术。参见，例如，Patel andNash，Biotechniques，18(2)：328-33(1995)。
本发明的组合可以用于任何合适的试验形式或组合中。在一些实施例中，本发明的组合可以用于混杂试验形式中。在其它的实施例中，本发明的组合可以用于同类试验形式中。典型的同类试验形式包括克隆酶供体免疫测定(CEDIA)、放大免疫分析技术(EMIT)、脱辅基酶激活免疫测定(ARIA)、辅因子标记免疫分析以及抑制剂标记免疫分析。参见，例如，美国专利号4,708,929、5,120,653、5,244,785和5,362,625、WO96/41172A1，以及Jenkins，J.Immunol.Meth.，150：91-97(1992)。
E.使用水解酶底物的方法
另一方面，本发明提供使用上述水解酶底物和/或组合检测样品中水解酶的存在或数量的方法，所述方法在一些实施例中用于检测样品中靶标分子的存在或数量。靶标分子可以与水解酶结合，例如，其中酶起标记的作用；或者水解酶可以与对靶标分子特异的结合部分连接或结合，例如，特异性识别和结合靶标分子的抗体，或具有另一个组成部分例如作为夹心试验部分的另一种酶的靶标分子复合体。在一些实施例中，水解酶本身可以是待检测或定量的化学种类。
水解酶通常可以任何合适的组成存在于样品中。它常常是溶液或悬浮液，主要是水溶液的，并包含维持适合水解酶发挥功能的pH值的合适的缓冲溶液。为确定的水解酶选择合适的温度、pH值，和浓度以及其它参数属于普通的技术水平。
在一些实施例中，本发明提供评估样品中水解酶的活性和/或数量的方法，所述方法包括：
a)用具有化学式(I)的结构的水解酶底物接触含有或可能含有水解酶的样品：
在所述水解酶，如果存在于所述样品中，酶切所述底物产生芳基醇分子或具有化学式(II)的结构的不饱和的脂肪醇分子以及具有化学式(III)的结构的化合物的情况下：
以及
其中A、R、n和X是以上化学式(I)所定义的；并且
b)评估所述芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子的存在和/或数量，从而评估所述样品中所述水解酶的活性和/或数量。
通过任何方便的方法，可以直接或间接地评估所述芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子的数量或存在。在一些实施例中，醇的存在或数量通过将其转化为本文所述的羰基化合物得到检测，通常通过酶性氧化作用。所述氧化可以使用本文所述的多种酶(例如，芳基醇氧化酶；醇脱氢酶；芳基醇脱氢酶)来实现。水解酶底物可以是任何上述的那些，如果它被选为适合待测水解酶的底物并且因此包含对所述水解酶特异的识别部分，那么它能被所述水解酶水解。
因此，所述方法是包括用水解酶底物单独地或在上述任何组合中地接触样品的试验。选择试验条件使水解酶，如果存在的话，水解所述水解酶底物产生上面详述的产物。通常，包含相对于可能存在的酶的数量超量的水解酶底物，因此产物的数量可以超过酶的数量，由此提高了有效信号强度并使试验更加灵敏，并给出大体上线性的产物生成速率。
I要理解的是本文所述的试验可以是定量或定性的。定性上，人们可以检测形成的产物从而证明水解酶的存在，常常通过方便的确认一些产物已经形成的颜色变化或光谱光度测量试验。如果需要定量结果，那么为了解释试验数据往往有必要测试一种或多种标准，其通常反映产物形成的速率而不是直接描述酶的数量。因此为了从产物生成速率的数据来确定存在的水解酶数量，经常有必要用试验测试除了待测样品外的至少一种且通常多于一种的具有已知水解酶数量的标准样品。这种标准化方法在本领域普通技术人员中是众所周知的。
在这些方法的一些实施例中，水解酶是酯酶，或糖苷酶。在一些实施例中，水解酶是选自乙酰酯酶、氨基酸酯酶或羧酸酯酶组成的集合中的酯酶；在一些实施例中，所述酶是核酸酶、磷酸二酯酶、脂肪酶或磷酸酯酶。在一些特定的实施例中，水解酶是碱性磷酸酶。在另外的特定的实施例中，水解酶是α-氨基酸酯酶；或β-糖苷酶。
在这些方法的一些实施例中，评估芳基醇分子或不饱和的脂肪醇分子的存在和/或数量的步骤包括用氧化试剂氧化芳基醇分子或不饱和的脂肪醇分子。其中R是H，氧化产物是醛；其中R是烷基或芳基，氧化产物是酮。在一些优选实施例中，n是1且R是H，因此氧化产物是化学式A-CHO的醛，其中A如化学式(I)所描述。
.在一些这样的实施例中，通过使用芳基醇氧化酶或脂肪醇氧化酶在氧存在的情况下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子产生H2O2并评估H2O2的存在和/或数量来评估芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子的存在和/或数量。在本领域中评估过氧化氢的存在或数量的方法是众所周知的，并且包括Trinder反应的变化形成。在一些这样的实施例中，包含过氧化物酶、苯酚、安替比林，和/或苯胺类似物中至少一种的试剂被用来检测H2O2的存在和/或数量。合适的试剂，例如，在美国专利号5,156,955中有讨论。
在备选的方法中，通过使用芳基醇脱氢酶或脂肪醇脱氢酶在NAD+或NADP+存在的情况下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子产生NADH或NADPH，并评估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或数量来评估芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子的存在和/或数量。在本领域中使用NAD+/NADH或NADP+/NADPH监测反应的方法是众所周知的，并方便地用于这些分析方法中。
在一些实施例中，芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子的存在和/或数量的评估通过：
a)使用芳基醇氧化酶或脂肪醇氧化酶在氧存在的情况下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子产生芳基醛分子或不饱和脂肪醛分子和H2O2；
b)使用芳基醇脱氢酶或脂肪醇脱氢酶在NADH或NADPH存在的情况下还原芳基醛分子或不饱和脂肪醛分子从而形成反应环，其中还原的芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子被芳基醇氧化酶或脂肪醇氧化酶在氧存在的情况下氧化产生另外的芳基醛分子或不饱和脂肪醛分子和H2O2；以及
c)评估H2O2的存在和/或数量，或NADH、NADPH、NAD+或NADP+的数量。
在这些实施例中，使用了两种不同的酶，一个将醇氧化成醛的酶，及另一个将醛还原回醇的酶。不同的酶使用不用的辅因子并产生不同的副产物；并且同时作用的两种不同酶的组合提供了导致水解酶底物初始水解信号的有效放大的循环试验系统。由循环的氧化/还原组合产生的副产物的数量可以远远超过使用的水解酶底物的数量。因此，这个系统引进了两个放大步骤，从酶的数量到水解的底物的数量的初始放大；以及通过将水解的底物循环在氧化态和还原态之间所提供的进一步放大。
H2O2存在的数量可以通过已知的方法例如上述Trinder反应来测量，存在的辅因子的数量也可以。也可以在这些方法中监测过氧化氢的产生及NAD+/NADH或NADP+/NADH产生的速率。
在这些方法的一些实施例中，水解酶底物包含至少β-糖苷酶底物分子的部分(识别部分)，并且水解酶是β-糖苷酶。
在其它的实施例中，水解酶底物包括至少碱性磷酸酶底物分子(例如，随意取代的苯甲基磷酸)的部分，并且水解酶是碱性磷酸酶。
这里所述的方法可以作为检测靶标存在的分析试验或靶标分离方法的一部分使用；或者作为靶标分子生产过程的一部分使用。如上所述，所述靶标分子可以是有机的或无机的或复合体。在一些实施例中，靶标是选自氨基酸、肽、蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、维生素、单糖、寡糖、碳水化合物、脂质及其复合体所组成的集合中的有机分子。
在一些实施例中，所述方法用于免疫测定、蛋白测序、核酸扩增、杂交或测序中。在一些实施例中，所述方法用于RNA或DNA测序系统中。在这些实施例中，碱性磷酸酶是优选的水解酶。
任何合适的醇氧化酶可以用于本方法中。例如，可以使用美国专利号7,160,708、5,166,329、4,956,290、4,729,956以及4,619,898中公开的和/或权利要求的醇氧化酶。在另一个例子中，可以使用Janssen and Ruelius，Biochim.Biophys.Acta.，151(2)：330-42(1968)以及Suye，Curr.Microbiol.，34(6)：374-7(1997)中公开的醇氧化酶。
任何合适的芳基醇氧化酶可以用于本方法中。例如，可以使用美国专利号3,183,235、3,290,326和6,835,212，以及美国专利申请US2009/053780A1中公开的和/或权利要求的芳基醇氧化酶。在另一个例子中，可以使用Farmer et al.，Biochem.J.74：257-62(1960)以及Guillen and Evans，Applied and Enviromental Microbiology，60(8)：2811-2817(1994)中公开的芳基醇氧化酶。
任何合适的芳基醇脱氢酶可以用于本方法中。例如，可以使用美国专利号4,020,070、5,182,209、6,262,295、7,750,135，和美国专利申请US2009/017510A1、US2009/186900A1、US2006/074060A1，以及JP2147956A中公开的和/或权利要求的芳基醇脱氢酶。在另一个例子中，可以使用Suhara et al.，Arch.Biochem.Biophys.，130(1)：422-9(1969)以及Yamanaka and Minoshima，Agric.Biol.Chem.，48：1161-1171(1984)中公开的芳基醇脱氢酶。
任何合适的醇脱氢酶可以用于本方法中。例如，可以使用美国专利号7,750,135、7,354,751、6,552,249、6,432,688、6,255,092、6,225,099、5,908,924、5,855,881、5,695,973、5,445,943、5,385,833、5,344,777、5,162,516、5,162,203、4,241,184、4,131,727，以及4,111,751中公开的和/或权利要求的醇脱氢酶。在另一个例子中，可以使用Yakushi andMatsushita，ApplMicrobiol Biotechnol.，86(5)：1257-65(2010)以及Yin，AlcoholAlcoholSuppl.，2：113-9(1994)中公开的醇脱氢酶。
本方法可以用在任何合适的试验例如免疫测定、蛋白测序、核酸扩增、杂交或测序中。典型的免疫测定包括夹心型或竞争型试验，酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀反应、免疫染色、测流免疫测定、u-捕获试验、抑制测定和活性测定。典型的核酸测序技术包括使用水解酶，例如碱性磷酸酶，产生信号读出的DNA测序技术。参见，例如，Pateland Nash，Biotechniaues，18(2)：328-33(1995)。
本方法可以用于任何合适的试验形式或组合中。在一些实施例中，本方法可以用于混杂试验形式中。在其它的实施例中，本方法可以用于同类试验形式中。典型的同类试验形式包括克隆酶供体免疫测定(CEDIA)、放大免疫分析技术(EMIT)、脱辅基酶激活免疫测定(ARIA)、辅因子标记免疫分析以及抑制剂标记免疫分析。参见，例如，美国专利号4,708,929、5,120,653、5,244,785和5,362,625、WO96/41172A1，以及Jenkins，J.Immunol.Meth.，150：91-97(1992)。
目前的组合和/或方法可以用来检测任何合适的样品液体中的分析物。在一些实施例中，液体样品可以是体液样品，例如全血、血清、血浆、尿液样品或口液。这类体液样品可以直接使用或可以被加工，例如，在使用前被富集、纯化或稀释。在其它的实施例中，液体样品可以是取自固体或半固体生物材料例如噬菌体、病毒、细菌细胞、真核细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞、培养细胞、细胞或亚细胞结构、细胞聚集体、组织或器官的液体提取物、悬浮液或溶液。在具体的实施例中，样品液体从哺乳动物或人类来源中获得或提取。还在其它实施例中，液体样品是取自生物的、法医的、食物、生物战或环境来源的样品。在其它的实施例中，样品液体是临床样品，例如，人或动物的临床样品。还在其它实施例中，样品液体是人造样品，例如，用于质量控制或标准化目的的标准样品。
目前的组合和/或方法可以用来检测任何合适的样品液体中的分析物的缺乏和/或数量。在一些实施例中，本测试装置用于检测任何合适的样品液体中的分析物的存在或缺乏，即，提供是或否的答案。在其它的实施例中，本测试装置用于对液体样品中的分析物的数量进行定量或半定量。
所述组合和/或方法可用于检测任何合适的样品液体中单一分析物的存在、缺乏和/或数量。备选地，本测试装置可用于检测液体样品中多种分析物的存在、缺乏和/或数量。还在其它的实施例中，本测试装置可用于对液体样品中多种分析物的数量进行定量或半定量。
所述组合和/或方法可用于检测样品液体中任何合适的分析物的存在、缺乏和/或数量。典型的分析物包括无机分子、有机分子或其复合体。典型的有机分子可以是氨基酸、肽、蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸，例如DNA或RNA分子或其混合物、维生素、单糖、寡糖、碳水化合物、脂质及其复合体。在一些实施例中，所述分析物是细胞、病毒或分子。在其它的实施例中，所述分析物是疾病或紊乱标记、传染性生物的抗原、抗传染性生物的抗体，等等。
所述组合和/或方法可用于任何合适的目的。例如目前的组合和/或方法可用于临床诊断、预测、风险评估和预测、分层和治疗监测以及调整。在另一个例子中，目前的组合和/或方法可用于多种研究目的，例如基础研究、候选药物筛选、动物研究以及临床试验。还在另一个例子中，目前的组合和/或方法可用于标准制订、质量控制、违禁药物筛选、食品安全、环境安全、工业安全，以及污染的测试中，等等。目前的组合和/或方法可用于任何合适的环境中，例如在实验室、诊所、医院、医生的办公室、家里、自然环境和战争场地的测试中。
F.典型实施例
水解酶广泛用于研究性生物测定及临床诊断中。两种最常用于生物测定中的水解酶是β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。β-半乳糖苷酶常用作广泛用于多种试验例如为了检测包括激素、维生素、治疗药物在内的临床诊断以及滥用药物测试的CEDIA(克隆酶供体免疫测定)平台(参见，例如，美国专利号4,708,929、5,120,653、5,244,785和5,362,625，以及WO96/41172A1)的酶。
在CEDIA试验中，使用了通常由重组DNA技术制备的β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)的两个片段。较大的片段被称为酶受体或EA，而较小的片段被称为酶供体或ED。当它们分开时两个片段都无催化活性。当这些片段在溶液中混合时，它们自发地组装成类似天然β-半乳糖苷酶的完全活性的酶。在包括临床诊断的许多试验中，同类试验是理想的，因为它们节约时间、节约试剂，并且容易自动化。同类试验允许简单的“混合和读取”过程，而不要求漫长的、耗费时间的为了去除未结合成分的冲洗步骤。
CEDIA试验是满足了一些需要的临床测试要求的同类试验。CEDIA同类试验平台通过控制EA和ED经靶标-结合剂如抗原-抗体反应的自发组装而运行。在一些实施例中，分析物或生物标记可以在某种程度上共价结合在ED上，因此当ED偶联物与EA混合时就没有产生活性β-半乳糖苷酶的干扰。向系统中的分析物或生物标记加入结合剂或抗体将抑制酶的自发组装。使用这个系统竞争样品例如病人的血清中的分析物，将会产生与样品中自由的未知分析物或生物标记的数量成正比例的有活性的酶。产生的酶的数量通过合适的酶底物如o-硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷或氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷的水解进行监测。然而，这些底物在它们的消光系数上具有局限性，不适合于使CEDIA试验成为类似于以化学发光试剂为基础的异源免疫测定的高灵敏性试验系统。
在一些实施例中，为了改善CEDIA系统，我们已经设计出一系列新的β-半乳糖苷酶底物。新底物的一个区别性特征是芳基醇分子通过其羟基基团与β-D-半乳吡喃糖苷的连接。这些底物被β-半乳糖苷酶水解产生自由的芳基醇分子，所述芳基醇分子被芳基醇氧化酶氧化成芳基醛并伴随过氧化氢(H2O2)的产生。然后芳基醛被酶芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶还原成芳基醇。所述氧化和还原反应形成了酶循环，伴随着每个反应循环中指数增长的反应副产物H2O2的积累。
可以使用任何合适的芳基醇氧化酶和芳基醇脱氢酶。例如，可以使用来自真菌例如Pleurotus eryngii的芳基醇氧化酶和芳基醇脱氢酶(Guillen and Evans，Applied andEnviromental Microbiology，60(8)：2811-2817(1994))。在目前所述的试验中新β-半乳糖苷酶底物的使用允许了显著放大用于检测的反应信号并且因此改善CEDIA同质平台的灵敏性的偶联酶循环试验。
作为另一个例子，碱性磷酸酶是在包括免疫测定如ELISA和DNA测序在内的多种试验中广泛用作报告酶的酶。这里所述的新底物包括羟基上连接着磷酸基团(H2PO4)的芳基醇类似物。这些底物被碱性磷酸酶水解将产生自由的芳基醇分子，所述芳基醇分子将作为芳基醇氧化酶的底物并且可以结合在基于芳基醇氧化酶/脱氢酶的用于信号放大的酶循环系统中。这将为免疫测定和DNA测序提供更灵敏的检测。
下列列举的实施例表示本发明的某些方面：
1.一种水解酶底物，它是表达式(I)所示的化合物：
其中：
A是芳香基或芳香杂环基，1-烯烃或1-炔烃，它们中的每一个都可以被任意替代；
每个R都是独立的氢原子或任意替代的C1-C4烷基或芳基；
n是一个从1到4的整数；
且X是包括底物部分的基团。
其中所述底物部分包含底物对于水解酶的识别元件，并且其中所述水解酶的活性能够水解所述表达式(I)的化合物并生成化合物(II)和(III)：
2.实施例1中的水解酶底物，其中的A是可任意取代的芳基或芳香杂环基。
3.实施例2中的水解酶底物，其中A是可任意取代的苯基或萘基。
4.权利要求1中的水解酶底物，其中A是表达式(IV)中的1-烯烃，
其中，波浪线表示A与表达式(I)中-[CH(R)]n-O-X的连接点，每个G，、G’和G”代表独立的氢原子或来自C1-C8烷基，C2-C8烯属烃，C2-C8炔基，C3-C8环烷基，C3-C8杂环烷基，芳基和杂芳基的组成的组的可任意取代基团。
5.实施例1中的水解酶底物，其中A是表达式(V)中的1-炔烃：
其中的波浪线是A与表达式(I)中的-[CH(R)]n-O-X连接点，G是氢原子或来自C1-C8烷基，C2-C8烯属烃，C2-C8炔基，C3-C8环烷基，C3-C8杂环烷基，芳基和杂芳基组成的组的可任意取代基团。
6.实施例1中的水解酶底物，其中R是氢原子，甲基或苯基。
7.实施例1中的水解酶底物，其中X包含糖类。
8.实施例7中的水解酶底物，其中所述化合物如化合物表达式(VIa)或(VIb)所示：
其中，R2是氢原子或-CH2OQ，每个Q都是独立的氢原子或单糖，二糖或寡糖，A、R和n的定义见权利要求1.
9.实施例1中的水解酶底物，其中的化合物是如表达式(VII)所示的脂类：
其中R3是氢原子或可任意取代的芳基，杂环芳基，C1-C8烷基，C3-C8环烷基或C3-C8杂环烷基的基团，
并且A、R和n的如权利要求1中所定义.
10.实施例9中的水解酶底物，其中R3选自甲基、乙基和苯基组成的组，或其中HO2C-R3是α-氨基酸。
11.实施例1中的水解酶底物，其中的化合物如表达式(VIII)所示：
其中Z是N，S，S＝O，P或P-OH，并且R4是氧原子、羟基、C1-C4烷氧基C1-C4烷基或芳基。
12.实施例1中的水解酶底物，其中X包包括磷酸基团。
13.实施例12中的水解酶底物，其中的化合物是表达式(IX)所示的化合物：
或者是它的盐。
14.实施例1-3或6-13所述任一水解酶底物，其中A是可取代苯基基团。
15.实施例14中的水解酶底物，其中的苯基基团为不可替代的，或可被来自halo，羟基，CN，NO2，COOR’，CONR’2，NR’2，OR’组成的组中的1～3个基团取代，被C1-4烷基，SR’，SO2R’或SO2NR’2任意取代，
其中每个R’是独立的氢原子或可任意取代的C1-4烷基，在相同或相邻原子上的两个R’可被同时取代从而形成可任意取代的C3-C8杂环。
16.前述实施例中的任何水解酶底物，其中对烷基和杂环基团的可选的选自halo、oxo、CN、NO2、COOR”、CONR”2、NR”2、OR”的取代物、任意取代C1-4烷基、SR’、SO2R”或SO2NR”2，其中每个R是独立的氢原子或C1-4烷基。
17.实施例1中水解酶底物，此处的A是如表达式(X)所示的基团：
其中的波浪线代表A和表达式(I)中的-[CH(R)]n-O-X的连接点，并且每个G都是独立的氢原子或选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C8环烷基、C3-C8杂环烷基、芳基和杂芳基构成的组的任意取代基团。
18.前述实施例中的任何水解酶底物，其中R是氢原子。
19.前述实施例中的任何水解酶底物，其中的n是1.
20.实施例1中的水解酶底物，其中X包括糖苷酶的底物部分。
21.实施例20中的水解酶底物，其中所述糖苷酶是β-糖苷酶。
22.实施例1中的水解酶底物，其中X包括酯酶的底物部分。
23.实施例22中的水解酶底物，其中所述酯酶选自羧酸酯酶、乙酰酯酶和α-氨基酸酯酶
24.实施例1中的水解酶底物，X包含一种磷酸酶的底物部分。
25.实施例24中的水解酶底物，其中所述磷脂酶是碱性磷脂酶。
26.一种组合，包括：
a)实施例1-25所述任一水解酶底物；以及
b)可裂解所述水解酶底物生成芳基乙醇分子或不饱和脂肪族醇分子的水解酶，不饱和脂肪族醇分子作为由所述水解酶催化的裂解反应产物，其中所述的芳基乙醇分子或不饱和脂肪族醇分子具有所述表达式(II)的结构：
其中A、R和n的如权利要求1所定义。.
27.实施例26中的组合物，其中的水解酶是酯酶、磷酸酶或糖苷酶。
28.实施例27中的组合，其中所述水解酶选自乙酰酯酶、氨基酸酯酶、羧酸酯酶、核酸酶、磷酸二酯酶、脂肪酶和磷酸酶的构成的组。
29.实施例27中的组合，其中所述水解酶是碱性磷酸酶。
30.实施例28中的组合，其中所述水解酶是α-氨基酸酯酶。
31.实施例27中的组合物，其中所述水解酶是β-半乳糖苷酶。
32.实施例27中的组合物，其中所述水解酶是β-半乳糖苷酶。
33.实施例26中的组合物，还包括可以氧化由水解酶催化的裂变反应生成的芳基乙醇分子或不饱和脂肪族醇分子的氧化剂。
34.实施例33中的组合，其中所述氧化剂是在有氧环境下可氧化芳香族醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成芳香族醛分子或不饱和脂肪醛分子和H2O2的芳香族醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶。
35.实施例34中的组合物，还包括用于测量H2O2的试剂。
36.实施例35中的组合物，其中所述用于测量H2O2的试剂包括过氧化物酶，4-AA和/或苯胺类似物。
37.实施例33中的组合物，其中所述氧化剂是在NAD+或NADP+存在下氧化芳香族醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成NADH或NADPH的芳香族醇脱氢酶或醇脱氢酶。
38.实施例37中的组合物，还包NAD+或NADP+。
39.实施例38中的组合物，进一步包括用于测量NADH或NADPH的试剂。
40.实施例34中的组合物，进一步包括NADH或NADPH和在NAD+或NADP+存在下还原芳香族醇分子或不饱和脂肪族醇分子的芳香族醇脱氢酶或醇脱氢酶。
41.实施例40中的组合物，进一步包括用于测量H2O2的试剂。
42.实施例41中的组合物，其中所述用于测量H2O2的反应物包括过氧化物酶，安替比林，苯酚和/或苯胺类似物中的至少一种。
43.实施例26中的组合物，其中所述水解酶底物至少包括β-糖苷酶底物分子的一部分，并且所述水解酶是β-糖苷酶或β-半乳糖甘酶。
44.实施例43中的组合物，进一步包括：
a)在有氧条件下能氧化芳醇分子或不饱和脂肪醇分子并生成芳醛或不饱和脂肪醛分子以及H2O2的芳基醇氧化酶或脂肪醇氧化酶；
b)NADH或NADPH；
c)在NADH或NADPH存在下能还原芳醛分子或不饱和脂肪醛分子的芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶。
45.实施例44中的组合物，进一步包括用于测量H2O2的试剂。
46.实施例26中的组合物，其中所述水解酶底物至少包括碱性磷酸酶底物分子的一部分，并且所述水解酶是碱性磷酸酶。
47.实施例46中的组合物，进一步包括：
a)可以在有氧条件下氧化芳醇分子或不饱和脂肪醇分子并生成氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子以及H2O2的芳基醇氧化酶或脂肪醇氧化酶；
b)NADH或NADPH
c)在NADH或NADPH存在下还原氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子的芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶。
48.实施例47中的组合物，还包括至少一种用于测量H2O2的试剂。
49.实施例26-48中任一组合物，其中组合物的成分包含于试剂盒中。
50.实施例26-48中任一组合物，其包含于针对某种靶标的分析系统、分离系统和/或制备系统中。
51.实施例50中的组合，其中所述靶标是无机分子、有机分子和/化合物或它们的复合物。
52.实施例51中的组合物，其中所述靶标物是来自组氨基酸、肽、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、维生素、单糖、寡糖、碳水化合物、脂类和它们的复合物组成的组中有机分子。
53.实施例52中的组合物，其中所述系统是用于免疫分析、蛋白测序、核酸扩增、杂交和/或测序的系统。
54.用于评估样品中水解酶活性和/或数量的方法，该方法包括：
a)将实施例1-25中任一水解酶底物与包含或疑似包含水解酶的样品相接触，水解酶底物具有有表达式(I)中的结构：
在下述情形下，如果存在于所述样品中，即所述水解酶，裂解所述底物并生成具有表达式(II)中的结构的芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子以及具有表达式(III)中结构的化合物：
其中，A、R、n和X的定义见权利要求1；以及
b)评价所述芳基醇分子或不饱和脂肪族分子的存在和/或量以评估所述样品中所述水解酶的活性和/或总量。
55.实施例54中的方法，其中所述水解酶是酯酶，β-半乳糖苷酶或糖苷酶。
56.实施例55中的方法，其中所述水解酶是选乙酰酯酶、氨基酸酯酶、羧酸酯酶、核酸酶、羧酸二酯酶、脂肪酶和磷酸酶组成的组的酯酶。
57.实施例56中的方法，其中所述水解酶是碱性磷酸酶。
58.实施例56中的方法，其中所述水解酶是α-氨基酸酯酶。
59.实施例55中的方法，其中水解酶是β-半乳糖苷酶。
60.实施例55中的方法，其中水解酶是β-糖苷酶。
61.实施例54中的方法，其中评估芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子的存在和/或量的步骤包括与采用氧化剂氧化芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子。
62.实施例61中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子的存在和/或量通过利用芳基醇氧化酶或脂肪醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子并生成H2O2并评估H2O2的存在和/或量来评估。
63.实施例62中的方法，其中所述H2O2的存在和/或总量通过让H2O2与过氧化物酶、苯酚、安替比林和/或苯胺类似物接触来评估。
64.实施例54中的方法，其中所述芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过利用芳基醇氧化酶或脂肪醇氧化酶在NAD+或NADP+存在条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子生成NADH或NADPH并评估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或总量。
65.实施例54中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子的存在和/或总量通过如下方式进行评估：
a)利用芳基醇氧化酶或脂肪醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成芳基醛分子或不饱和脂肪族醛分子以及H2O2；
b)利用芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶在NADH或NADPH存在条件下还原芳基醛分子或不饱和脂肪醛分子并形成循环反应，其中还原的芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子在有氧条件下被芳基醇氧化酶或脂肪醇氧化酶氧化生成另外的芳基醛分子或不饱和脂肪族醛分子和H2O2；同时
c)评估H2O2的存在和/或总量，或NADH、NADPH、NAD+或NADP+的总量。
66.实施例65中的方法，其中H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、安替比林、苯酚和/或苯胺类似物接触来评估。
67.实施例54中的方法，其中水解酶底物至少包括β-糖苷酶底物分子的一部分，并且所述水解酶是β-糖苷酶或β-半乳糖甘酶。
68.实施例67中的方法，其中评估芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子存在和/或总量的步骤包括利用氧化剂氧化芳基乙醇分子或不饱和脂肪族醇分子。
69.实施例67中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子存在和/或总量通过利用芳基醇氧化酶或脂肪醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪醇分子生成氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2并评估H2O2的存在和/或总量来评估。
70.实施例69中的方法，其中H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、4-AA和/或苯胺类似物接触来评估。
71.实施例67中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子存在和/或总量通过利用芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶在NAD+或NADP+存在条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成NADH或NADPH并评估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或总量来评估。
72.实施例67中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量可通过如下方式进行评估：
a)利用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成氧化的芳基乙醇分子或不饱和脂肪族醇分子以及H2O2；
b)利用芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶在NADH或NADPH存在条件下还原氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并形成循环反应，其中还原的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子在有氧条件下被芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶氧化生成另外的氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2；同时
c)评估H2O2的存在和/或总量。
73.实施例72中的方法，其中H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、安替比林或苯胺类似物接触来评估。
74.实施例54中的方法，其中水解酶底物至少包括碱性磷酸酶底物分子的一部分，并且所述水解酶是碱性水解酶。
75.实施例74中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量的评估步骤包括利用氧化剂氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子。
76.实施例74中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过利用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2并评估H2O2的存在和/或总量来评估。
77.实施例76中的方法，其中H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、安替比林或苯胺类似物接触来评估。
78.实施例74中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子存在和/或总量通过利用芳基醇脱氢酶或醇脱氢酶在NAD+或NADP+存在条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成NADH或NADPH并评估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或总量来评估。
79.实施例74中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量可通过如下方式进行评估：
a)利用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子以及H2O2；
b)利用一种芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NADH或NADPH存在条件下还原氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并形成一个循环反应，即还原的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子在有氧条件下被芳基醇氧化酶或一种脂肪族醇氧化酶氧化生成另外的氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2；同时
c)评估H2O2的存在和/或总量。
80.实施例79中的方法，其中H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与一种过氧化物酶、苯酚、安替比林或苯胺类似物接触来评估。
81.实施例54-80中任一方法，是作为针对某个靶标物的分析、分离和/或制备的一部分来进行的。
82.实施例81中的方法，其中的靶标物是无机分子、有机分子和/化合物或它们的复合物。
83.实施例82中的方法，其中所述有机分子是选自氨基酸、肽、蛋白、核苷、寡核苷酸、核苷酸、维生素、单糖、寡糖、碳水化合物、脂肪和它们的复合物构成的组。
84.实施例82中的方法，是作为免疫分析、蛋白测序、核苷酸扩增、杂交或测序的一部分来进行的。
85.实施例84中的方法，其中所述方法被用于监控RNA或DNA测序。
86.实施例85中的方法，其中所述水解酶是碱性水解酶。
现有发明通过如下示例性实施例来进一步说明。
实施例
实例1
底物合成
适合用于本发明的构思和方法的水解酶底物可通过采用已知起始材料的传统方法来制备。此类水解酶底物的实例包括p-MOBG(对甲氧苄基半乳糖)和HDEGP，其可以由已知的采用在二氯甲烷中的氧化银(I)保护(四乙酸)的半乳糖基溴化物，经过甲醇中的甲醇盐的水解除去醋酸保护基团而制成HDEGP。
对甲氧苄基-β-D-半乳糖(P-MOBG)合成(分子量：300.3)
1)对甲氧苄基-2，3，4，6-四-O-醋酸-β-D-吡喃半乳糖苷(p-MBAGP)(MW：468.38)
在20ml含有2.64g(6.42mmol)乙酰溴-α-D-半乳糖和1.38mL(11.06mmo1)对甲氧苄基乙醇的二氯甲烷的溶液中加入1.5g分子筛(4A°)。在室温下搅拌20min，加入1.5g(6.48mmol)氧化银(I)。反应混合物在室温下搅拌过夜后过滤浓缩。硅胶上的残留物经色谱分析得到1.0g(80.64％)产物作为无色糖浆。1H NMR(500MHz，CDC13)：δ＝7.22，6.88(2d，4H，苯基)，C22H28O11：估算468.5，实测491.6(M+23Na)
2).对甲氧苄基-β-D-半乳糖(P-MOBG)(MW：300.3)
1.0g(2.14mmol)对甲氧苄基-2，3，4，6-四-O-醋酸-β-D-吡喃半乳糖苷(p-MBAGP)与无水乙醇(3X10mL)共蒸发之后，加入10mL无水乙醇和1mL0.5M甲醇钠。反应混合物在室温下搅拌1小时后通过加入2N HCl中和调节pH值到7.0。在20℃到30℃之间将溶剂蒸发去除后，残留物用硅胶色谱分析进行纯化，用乙酸乙酯洗脱后再用乙酸乙酯/乙醇(5/1)洗脱。产物：0.4g白色固体，产量62.2％，1H NMR(500MHz，CDCl3/CD3OD＝90/10)：δ＝7.2，6.76(2d，4H，苯基)，4.74，4.46(2d，2H，CH2-苯酚)，4.18(D，1H，J1，2＝7.6Hz，1-H)，3.70(s，3H，CH3O-)，3.30-3.78(m，6H).C14H20O7：估算300.3，实测299.2(M-1)和323.2(M+23Na)。
HDEG底物通过类似过程合成。
实例2
β-半乳糖甘酶水解
本发明的水解酶底物能被合适的与所述底物相匹配的酶水解；因此以上所显示的PMOBG或HDEGP能被下图所示的β-半乳糖甘酶水解。
将10mM p-MOBG与10unit/mlβ-半乳糖甘酶以及20unit/ml芳基醇氧化物在37℃下孵育30min从而产生H2O2。H2O2可通过过氧化物酶在4-AA和TOOS存在下于560nm波长下检测。如p-MOBG与芳基醇氧化酶单独孵育则检测不出H2O2，这说明p-MOBG不是芳基醇氧化酶的一种底物，但经β-半乳糖甘酶水解后可作为芳基醇乙氧化酶底物。用于本实例中的芳基醇脱氢酶根据Guillen and Evans，Appl.Environmetal Microbiol.，60(8)：2811-17(1994)andReiser et al.，J.Biol.Chem.，269(45)：28152-28159(1994).的描述重组制备。
一些与酶循环反应配合的水解反应具体实例。
实例3
试剂1
试剂2：
磷酸盐缓冲液，pH6.3： 100mM
4-AA： 5mM
Toos： 5mM
辣根过氧化物酶：10unit/ml
在本研究中，180μl试剂与20μl样品混合后待测，所述混合物在37℃下孵育5分钟后，加入六十(60)μl试剂2且在37℃下再孵育5分钟。试剂2加入后的2-分钟测定560nm波长下的吸光值的变化。
实例4
试剂1：
试剂2：
本研究中，180μl试剂1与20μl样品混合后待测，混合物在37℃下孵育5分钟。加入六十(60)μl试剂2混合后在37℃下再次孵育5分钟。试剂2加入后的2-5分钟测定560nm波长下的吸光度值的变化。
实例5
试剂1
试剂2：
本研究中，180μl试剂1与20μl样品混合后待测，混合物在37℃下孵育5分钟。加入六十(60)μl试剂2混合后在37℃下再次孵育4分钟。试剂2加入后的1-4分钟测定560nm波长下的吸光度值的变化。
AP的结构如图4所示。在某些实例中，R1、R2、R4和R5是氢原子，R3是-OCH3。本研究中，180μl试剂1与20μl样品混合后待测，混合物在37℃下孵育5分钟。加入六十(60)μl试剂2混合后在37℃下再次孵育5分钟。加入试剂2后2-5分钟测定560nm波长下的吸光度值的变化。
实例6
试剂1：
试剂2：
AE的结构如图5所示。在某些实例中，R1、R2、R4和R5是氢原子，R3是-OCH3。本研究中，180μl试剂1与20μl样品混合后待测，混合物在37℃下孵育5分钟。加入六十(60)μl试剂2混合后在37℃下再次孵育4分钟。加入试剂2后1-4分钟测定560nm波长下的吸光度值的变化。
实例7
典型的采用芳基醇氧化酶(AAO)和芳基醇脱氢酶(AAD)的AAO/AAD循环系统用于检测芳基醇(见下图)。
AAO是采用Guillén，F.etal.，“Substrate specificity and properties ofaryl-alcohol oxidase from the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii，”Eur.J.Biochem.，209：603-611(1992).中的描述，从杏鲍菇中纯化而来。纯化步骤包括浓缩、阴离子交换色谱分析以及疏水相互作用色谱分析。用于制备重组恶臭假单胞菌AAD的DNA构建体是基于Shaw，J.P.etal.，Kinetic studies on benzyl alcohol dehydrogenaseencoded by TOL plasmid pWW0，”J.Biol.Chem.，268：10842-10850(1993)中公开的DNA序列构建而得，所述重组恶臭假单胞菌AAD通过在大肠杆菌中过表达获得。所述循环系统结合化学发光(鲁米诺-过氧化氢-辣根过氧化物酶)反应形成成灵敏的分析方法。
关于AAO，Kp-anisyl-OH＝37±8μM；和kcat＝117/s。关于AAD，KNADH＝9.1±2μM；Kp-Anisyl aldehyde＝6.6±0.8μM；和kcat＝30/s。
反应条件：Tris-HCL，pH7，100mM；NADH100μM；EDTA100mM；HRP，1.5U；G6PH，1mM；G6PDH，2U；鲁米诺/增强剂，5μl；AAO，20μl(6mg/ml)；AAD，20μl(25mg/ml)，总体积200μl。最后加入AAD开始循环反应。使用来自Monobind Inc的impulse2，CLIA reader监测反应10分钟。
如图10所示，浓度低至0.2nM的芳基醇可通过所述AAO/AAD循环系统检出。与只使用AAO催化的反应相比，使用所述AAO/AAD循环系统对芳基醇的检测限至少要高1000倍。
实例8
如实例7中所描述，典型的使用芳基醇氧化酶(AAO)和芳基醇脱氢酶(AAD)AAO/AAD循环系统被用来检测碱性磷酸酶(ALP)。
反应条件：50μl ALP反应系统；Tris-HCl，pH10.0(100mM)；甲氧基磷酸(40μM)，5μlALP反应液。ALP反应时间为5分钟。
200μl循环系统：50μl ALP反应系统；AAO10μl(2.5mg/ml)；AAD10μl(20mg/ml)；NADH，20μM；G6PH，2mM；G6PDH，2U；HRP，1.5U；Hyperblue，10μl；和Tris-HCl，pH7.0(200mM)。最后加入AAD开始循环反应。使用来自Monobind Inc的impulse2，CLIAattomole reader监测反应30分钟。
如图11所示，当分析中以40μM的甲氧基磷酸作为底物检测溶液中的碱性磷酸酶时，可检出2.6attomoleALP。检测敏感度达到了亚attomole级别，并且可进一步通过ALP底物浓度的优化，酶浓度和反应时间的增加来进一步提升检测敏感度。
上述实例仅用作说明书的目的并不用于限制本发明的范围。上述内容可能有多种变形。因为对上述实例的修改和变形对于本领域技术人员是显而易见的，它的目的在于本发明仅受所附的权利要求的限制。

Claims (31)

1.用于评估样品中水解酶活性和/或总量的方法，包括：
a)用水解酶底物与包含或疑似包含所述水解酶的样品接触，所述水解酶底物具有表达式(I)中的结构：
在所述水解酶条件下，如果存在于所述样品中，则裂解所述底物生成芳基醇分子或具有表达式(II)中结构的不饱和脂肪族醇分子和具有表达式(III)中结构的化合物：
其中
A是芳香基团或杂芳族基团，1-烯烃或1-炔烃，每个都可被选择取代；
R是独立的氢原子或可选择性取代的C1-C4烷基或芳基；
n是1-4的整数；并且
X是包含水解酶底物部分的基团；同时
b)评估所述芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量以评估所述样品中水解酶的活性和/或总量，并且
所述水解酶是酯酶，β-半乳糖苷酶或糖苷酶，并且所述评估芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量的步骤包括用氧化剂氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子。
2.权利要求1中的方法，其中所述水解酶是选自乙酰胆碱酯酶、氨基酸酯酶、羧基酯酶、核酸酶、磷酸二酯酶、脂肪酶和磷酸酶组成的组中的酯酶。
3.权利要求2中的方法，其中所述水解酶是碱性磷酸酶。
4.权利要求2中的方法，其中所述水解酶是α-氨基酸酯酶。
5.权利要求1中的方法，其中所述水解酶是β-半乳糖苷酶。
6.权利要求1中的方法，其中所述水解酶是β-糖苷酶。
7.权利要求1中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成H2O2以及并评估所述H2O2的存在和/或总量来评估。
8.权利要求7中的方法，其中所述所述H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、苯酚、安替比林和/或苯胺类似物接触来评估。
9.权利要求1中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过使用芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NAD+或NADP+存在下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成NADH或NADPH，并评估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或总量来评估。
10.权利要求1中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过下述方法评估：
a)使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成芳基乙醛分子或不饱和脂肪族醛分子和H2O2；
b)使用芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NADH或NADPH存在下还原芳基乙醛分子或不饱和脂肪族醛分子形成反应循环，其中被还原的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子被芳基醇氧化酶脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化生成额外的芳基乙醛分子或不饱和脂肪族醛分子和H2O2；同时
c)评估H2O2的存在和/或总量或NADH、NADPH、NAD+或NADP+的总量。
11.权利要求10中的方法，其中所述H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、安替比林、苯酚和/或苯胺类似物进行接触来评估。
12.权利要求1中的方法，其中所述水解酶底物至少包括β-糖苷酶底物分子的一部分，并且所述水解酶是β-糖苷酶或β-半乳糖苷酶。
13.权利要求12中的方法，其中评估芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量的步骤包括使用氧化剂氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子。
14.权利要求12中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成被氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2并评估H2O2的存在和/或总量来评估。
15.权利要求14中的方法，其中所述H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、4-AA和/或苯胺类似物进行接触来评估。
16.权利要求12中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过使用芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NAD+或NADP+存在下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成NADH或NADPH并评估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或总量来评估。
17.权利要求12中的方法，其中所述芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子存在和/或总量通过下述方法评估：
a)使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成被氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2；
b)使用芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NADH或NADPH存在下还原被氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子形成反应循环，其中被还原的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子被芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化生成额外的被氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2；同时
c)评估H2O2的存在和/或总量。
18.权利要求17中的方法，其中所述H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、苯酚、安替比林和/或苯胺类似物进行接触来评估。
19.权利要求1中的方法，其中所述水解酶底物至少包括碱性磷酸酶底物分子的一部分，且水解酶是碱性磷酸酶。
20.权利要求19中的方法，其中评估芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量的步骤包括使用氧化剂氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子。
21.权利要求19中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子生成被氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2并评估H2O2的存在和/或总量来评估。
22.权利要求21中的方法，其中H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、苯酚、安替比林、和/或苯胺类似物接触来评估。
23.权利要求19中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过使用芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NAD+或NADP+存在下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成NADH或NADPH并评估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或总量来评估。
24.权利要求19中的方法，其中芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子的存在和/或总量通过如下方法评估：
a)用所述芳基醇氧化酶或不饱和脂肪族醇氧化膜在有氧条件下氧化芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子并生成氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2；
b)用所述芳基醇脱氢酶或乙醇脱氢酶在NADH或NADPH存在下还原氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子以形成反应循环，其中还原的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子被芳基醇氧化酶或不饱和脂肪族醇氧化膜在有氧条件下氧化并生成额外的氧化的芳基醇分子或不饱和脂肪族醇分子和H2O2；并且
c)评估H2O2的存在和总量。
25.权利要求24中的方法，其中H2O2的存在和/或总量通过将H2O2与过氧化物酶、苯酚、安替比林和/或苯胺类似物进行接触来评估。
26.权利要求1-25所述任一方法，作为针对靶标物的分析、分离和/或制备的一部分来进行。
27.权利要求26中的方法，其中所述靶标物是无机分子、有机分子和/化合物或它们的复合物。
28.权利要求27中的方法，其中的有机分子选自氨基酸、肽、蛋白、核苷、核苷酸、寡聚核苷酸、核酸、维生素、单糖、寡糖、碳水化合物、化合物脂类和它们的复合物组成的组。
29.权利要求27中的方法，作为免疫分析、蛋白测序、核酸扩增、杂交或测序的一部分来进行。
30.权利要求29中的方法，用于监控RNA或DNA测序。
31.权利要求30中的方法，其中所述水解酶是碱性磷酸酶。
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