KR102374956B1

KR102374956B1 - 에키나세아 추출물 유래의 생리활성 물질을 포함하는 파골세포 분화 억제용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102374956B1
Application number: KR1020200052489A
Authority: KR
Inventors: 김성연; 이미경; 장보윤; 박소영
Original assignee: 원광대학교산학협력단; 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2022-03-18
Also published as: KR20210134134A

Abstract

파골세포 분화 억제에 탁월한 효능을 보이는 에키나세아 유래의 특정 생리활성 물질을 밝히고, 이러한 생리활성 물질을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제용 약학 조성물로서, 의약품 또는 건강기능식품 용도로 활용 가능한 조성물이 개시된다. 본 발명은 에키나세아 추출물로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 에키날카마이드(Echinalkamide) 화합물을 유효 성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 1]

Description

에키나세아 추출물 유래의 생리활성 물질을 포함하는 파골세포 분화 억제용 약학 조성물{A pharmaceutical composition for preventing osteoclast differentiation comprising a physiologically active substance derived from an Echinacea extract}

본 발명은 파골세포 분화 억제용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에키나세아 추출물을 이용한 파골세포 분화 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.

골(bone)은 근육과 연합되어 있는 석회화된 결체조직으로서, 표면은 두껍고 단단한 석회화 조직으로 중요한 장기의 보호, 조혈화에 필요한 미세 환경제공과 같은 기본적이며 다양한 기능을 제공하여 준다. 또한 체내의 칼슘이나 인, 마그네슘과 같은 필수 무기질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다.

골 대사는 골 형성(bone formation)을 담당하는 조골세포와 골 흡수(bone resorption)를 담당하는 파골세포의 작용으로 이루어져 있으며, 이들 세포의 기능이 균형을 이루어 항상성을 유지한다. 따라서 골 대사에서는 이들 사이의 균형이 중요하다. 골 조직은 지속적으로 재형성되는 활발한 대사조직으로 노화된 뼈를 파골세포에 의해 용해하는데, 뼈의 표면에 부착하여 산화 분해효소를 분비함으로써 뼈를 구성하는 뼈 기질(matrix)을 제거한다. 반면에 새로운 뼈의 형성은 조골세포(osteoblast)가 칼슘과 인을 분비하여 골격을 형성한다. 생체 내에서 이들 세포의 항상성 유지에 의한 골 흡수와 골 형성은 근골격계의 정상적인 구조를 유지하는 데 중요하다.

파골세포 활성이 증가하거나 성숙 파골세포가 조기에 활성화되어 조골세포의 활성에 비해 증가함으로써 일어나는 골대사 질환의 대표적인 예인 골다공증(osteoporosis)은 총 골질량(total bone mass)이 감소하는 증상을 말한다. 이외에도 유방암과, 전립선암 등의 종양이 뼈로 전이된 뼈 전이암, 원발성(primary)으로 뼈에 생성된 종양(예, 다발성 골수종), 류마티스성 또는 퇴행성 관절염, 치주질환을 야기하는 세균에 의해 발생하여 치조골의 파괴가 일어난 치주질환, 각종 유전적인 소인에 의해 발생하는 파케트 질병(Paget's disease) 등이 있다. 이러한 골대사 질환은 생체 내에서 호르몬과 물리적인 스트레스 등의 요인들에 의해 파골세포와 조골세포 간의 상호작용에 불균형이 초래되어 발생한다. 특히, 노화와 관련된 골질환이나, 여성들의 폐경에 의해 발생하는 골다공증은 골형성 보다는 파골세포의 골 흡수 활성 증가가 주된 원인이다.

파골세포는 조혈모세포의 단핵구로부터 유래되는 세포로서, 마우스의 RAW2647 단핵구 세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor кB (RANK) ligand)에 결합하면 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 성숙화(maturation)되어 골 흡수(bone resorption)가 일어난다.

조골세포 또는 활성화된 면역세포에서 생성된 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB ligand)은 파골세포 및 전구세포에 위치한 수용체(RANK)와 결합하여 파골세포의 형성과 활성을 촉진시킨다. 또한 조골세포는 RANKL과 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다.

Osteoprotegerin(OPG)는 RANKL에 대한 생체 내 길항제이다. 즉, RANKL과 OPG의 균형에 의하여 파골세포의 형성과 활성이 조절되는 것이다. 그러나, 에스트로겐 결핍, 부갑상선 호르몬 항진증 등의 골 흡수를 자극이 발생하게 되면 OPG와 RANKL의 균형이 깨져 파골세포가 활성화되어 골 흡수가 촉진되는 것이다. 따라서, RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증 뿐만 아니라 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다.

한편, 에키나세아(Echinacea)는 국화과의 다년생 허브식물로 북미가 원산이며 크기가 80 내지 120 cm 내외로 자란다. 잎은 어긋나고 털이 없으며 끝은 피침형의 긴 타원형이다. 꽃은 7 내지 10월에 두상화와 설상화로 핀다. 두상화는 자줏빛이며 설상화는 수평으로 피지만 10 cm 이상으로 자라면 아래로 처진다.

또한, 에키나세아의 학명은 Echinacea pupurea이며, 에키나세아는 꽃이 크고 화려하며 약용, 조경용으로 인기가 높은 허브 식물 중의 하나로서, 아메리카 대륙의 원주민인 인디언들이 이용하였다고 해서 인디언 허브라고도 불린다.

이러한, 에키나세아의 용도와 관련하여 공개특허 제2002-7011626호는 에카나세아 추출물의 노화 방지 효능 등에 관해 개시하고 있고, 파골세포 분화 억제 효능에 대하여는 명확히 알려져 있지 않고, 또한, 에키나세아의 다양한 생리활성 물질 중 어떠한 물질이 특히 파골세포 분화 억제에 영향을 미치는 것인지 명확히 알려지지 않고 있다.

따라서 본 발명은 상기 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 파골세포 분화 억제에 탁월한 효능을 보이는 에키나세아 유래의 특정 생리활성 물질을 밝히고, 이러한 생리활성 물질을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제용 약학 조성물로서, 의약품 또는 건강기능식품 용도로 활용 가능한 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 에키나세아 추출물로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 에키날카마이드(Echinalkamide) 화합물을 유효 성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에 따르면, 파골세포 분화 억제에 탁월한 효능을 나타내는 에키나세아 유래 생리활성 물질이 에키날카마이드(Echinalkamide) 화합물임을 명확히 제시함으로써 에키나세아 추출물을 활용한 파골세포 분화 억제용 약학 조성물 제조 시 상기 물질 함량 조절 등을 통해 효율적인 제조기준을 제공하는 효과가 있다.

또한 본 발명에 따른 조성물은 천연물로부터 추출한 추출물에서 유래하여 부작용이 거의 없고, 파골세포 분화 억제효과가 있어 이를 건강기능식품으로 사용할 경우 골다공증 및 골질환 예방 및 개선 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 에키날카마이드의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 2는 에키날카마이드의 파골세포 분화 억제능을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 3은 에키날카마이드의 파골세포 분화 억제능을 확인하기 위하여 역상현미경(Leica microsystems, Germany)으로 촬영한 사진,
도 4a는 에키날카마이드에 의한 NFATc1 및 c-Fos의 단백질 발현을 측정한 결과를 FluorChem E system image analyzer(Cell Biosciences, Santa Clara, CA)로 촬영한 사진,
도 4b는 에키날카마이드에 의한 NFATc1 및 c-Fos의 단백질 발현을 Image J로정량화한 결과를 나타낸 그래프,
도 4c는 에키날카마이드에 의한 NFATc1 및 c-Fos의 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 5a는 에키날카마이드에 의한 MMP-9 및 cathepsin K의 단백질 발현을 측정한 결과를 FluorChem E system image analyzer(Cell Biosciences, Santa Clara, CA)로 촬영한 사진,
도 5b는 에키날카마이드에 의한 MMP-9 및 cathepsin K의 단백질 발현을 Image J로 정량화한 결과를 나타낸 그래프,
도 5c는 에키날카마이드에 의한 MMP-9 및 cathepsin K의 mRNA 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 6a는 에키날카마이드에 의한 p-ERK, p-P38 및 p-JNK의 단백질 발현을 측정한 결과를 FluorChem E system image analyzer(Cell Biosciences, Santa Clara, CA)로 촬영한 사진,
도 6b는 에키날카마이드에 의한 p-ERK의 단백질 발현을 Image J로 정량화한 결과를 나타낸 그래프,
도 6c는 에키날카마이드에 의한 p-P38의 단백질 발현을 Image J로 정량화한 결과를 나타낸 그래프,
도 6d는 에키날카마이드에 의한 p-JNK의 단백질 발현을 Image J로 정량화한 결과를 나타낸 그래프,
도 7a는 에키날카마이드의 뼈 재 흡수능을 확인하기 위하여 역상 현미경(Leica microsystems, Germany)으로 촬영한 사진,
도 7b는 에키날카마이드의 뼈 재 흡수능을 측정한 결과를 나타낸 그래프.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

본 발명자들은 에키나세아 배양근 유래의 신규 화합물을 발견하고 발명의 명칭을 "에키나세아 배양근 유래 신규 화합물 및 이의 항염증 용도"로 하여 2018년 06월 29일자로 특허출원 한 바 있으며, 이 특허에서는 11개 화합물을 분리 후 일부 화합물(화합물 1 내지 3)에 대하여 NO 및 TNF-α 생성 억제를 통한 항염증 활성이 있음을 보였으나, 실제 파골세포 형성 및 뼈 재흡수 억제 가능성에 대해서는 확인할 수 없었으며, 또한 분리된 11개 화합물 중 어떠한 화합물에서 그러한 효과가 있을 것인지 예측하기 어려웠다. 그러나 본 발명에서는 에키나세아 추출물이 파골세포 분화를 억제함으로써 파골세포 형성 및 뼈 재흡수를 억제하는 것에 대하여 탁월한 효과를 보이는 것을 확인하였고, 이러한 에키나세아 추출물에 포함된 생리활성 물질 중 파골세포 분화 억제 및 골 질환 개선에 특이적 활성을 보이는 물질을 탐색하고자 예의 연구를 거듭한 결과, 골다공증, 골질환 개선 및 파골세포 분화 억제에 기능성을 나타내는 유효물질은 에키날카마이드(Echinalkamide) 화합물임을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.

따라서 본 발명은 에키나세아 추출물로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 에키날카마이드(Echinalkamide) 화합물을 유효 성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제용 약학 조성물을 개시한다.

[화학식 1]

상기 에키나세아 추출물은 에키나세아로부터 당 업계에 알려진 방법을 적절히 채택하여 제조될 수 있고, 따라서 추출시간, 용매, 온도 등의 조건은 통상의 기술자가 적절히 조절할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 또는 에틸아세테이트를 사용하여 추출할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 파골세포 형성 및 뼈 재흡수를 억제할 수 있다. 또한, 이러한 본 발명의 약학 조성물은 골 질환을 치료 또는 예방하는 데 적용될 수 있다. 골질환으로는 관절염, 골다공증, 류마티스관절염, 파제트병, 척추측만증, 섬유이형성증, 골용해성 전이, 피크노디소토시스 및 치주질환을 예로 들 수 있으나, 이러한 질환에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 종래의 골다공증 치료제와 병용으로 사용될 수 있다. 이 경우 기존의 한계를 가진 골다공증 치료제인 비스포스포네이트 계열, SERM(selective estrogen receptor modulator) 계열, 칼시토닌, 에스트로겐, 비타민 D 복합체, 데노수맘, 부갑상선 호르몬(PTH)와의 병용 사용으로 인하여 효능 증진뿐만 아니라 부작용을 최소화할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 안정성 평가를 통하여 새로운 치료제의 개발 가능성을 제시할 수 있다.

본 발명에 따른 에키날카마이드(Echinalkamide) 화합물을 포함하는 파골세포 분화 억제용 약학 조성물은 그 목적에 따라 의약품 또는 건강기능식품 형태로 활용될 수 있다.

상기 의약품으로 활용 시 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품으로 활용 시 상기 유효성분 이외에 건강기능식품에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함될 수 있으며, 예컨대 건강기능성 음료로 제조 시 구연산, 올리고당, 타우린, 과실농축액 등이 포함될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

제조예 : 마우스 BMM의 제조

10% FBS(태아 소 혈청), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 mg/mL)으로 보충된 α-MEM(alpha-minimum essential medium)으로 대퇴골과 경골을 씻어내서 5주령 수컷 C57BL6 마우스(오리엔트 바이오, 광주)로부터 마우스 BMC(Bone Barrow Cells)를 얻었다. BMM(bone marrow-drived macrophages)을 얻기 위해서 BMC를 10% FBS와 M-CSF(macrophage colony-stimulating factor, 10ng/mL)로 보충된 α-MEM 중에서 배양 접시 위에 파종하고 1일 동안 배양했다. 비-부착 세포를 10cm 페트리 접시로 옮겨서 M-CSF(30 ng/mL)의 존재 하에 3일 동안 더 배양했다. 비-부착 세포의 제거 후, 부착 세포를 파골세포 전구체인 BMM으로 사용하였다.

실시예 1 : 에키나세아 추출물 제조

선행문헌(Murphy HN, Kim YS, Park SY, Paek KY. Biotechnological production of caffeic acid derivatives from cell and organ cultures of Echinacea species. Appl Microbiol Biotechnol. 2014; 98: 7707-7717)을 참고하여 에키나세아 부정근(시중에서 구입)을 1 mg의 L-1 인돌부틸릭산(indole butyric acid, 전체 부피 대비 3%(w/v))이 첨가된 Murashige & Skoog 배지(MS 2.2 g/L, agar 8 g/L, pH 6.0)를 이용하여 암조건에서 대규모 생물반응기에 의한 배양을 통하여 확보하였다. 배양된 에키나세아 시료 50g에 95%(v/v) 에틸아세테이트를 10배수 가하여 20℃로 24시간 추출하여 에키나세아 에틸아세테이트 추출물을 제조하였다.

실시예 2 : 생리활성 물질 분리

실시예 1에서 제조한 에키나세아 에틸아세테이트 추출물(4.7g)을 CH₂Cl₂-MeOH로 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피시켜 15개의 분획물(E1-E15)을 수득하였다. E6 분획물을 MeOH(100%)에 녹인 후 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20)를 통하여 4개의 분획물(E6A-E6D)을 수득하였다. 상기 수득된 E6B를 CH₃CN-H₂O(25:75)에 녹인 후 컬럼 크로마토그래피(semi-preparative HPLC)를 통하여 28.3분에 용출되는 피크를 확보하여 에키날카마이드(Echinalkamide)를 분리 정제하였다. 에키날카마이드는 종래 알려지지 않은 신규화합물로서 이하에서와 같이 동정되었다.

에키날카마이드는 갈색 시럽으로 분리되었다. 그 분자식은 HREIMS(m/z 444.1992 ([M + Na]+, calcd for 444.1998))와 ¹³C NMR 데이터로부터 C₂₂H₃₁NO₇로 확인하였다. IR 스펙트럼은 각각 3364 및 1646 cm^-1에서 히드록실 및 카르보닐기의 전형적인 흡수 밴드를 나타냈다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼에서는 특징적인 anomeric proton δH 4.41 (1H, d, J, 80 Hz, H-1") 및 6 개의 글루코실 탄소(δC 100.9, 76.7, 76.6, 73.7, 70.2, 61.3)가 관찰되어 글루코스 잔기가 존재함을 추정할 수 있었다. 글루코오스 잔기의 배열은 J = 8.0 Hz의 커플링 상수에 기초하여 β로 결정되었다. H-3 '/ 4'와 C-1', C-2' 사이의 HMBC 상관관계와 함께 ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼의 [δ_H3.03 (2H, d, J= 7.0 Hz, H-1′), 1.78 (1H, m, H-2′) and 0.91 (6H, d, J = 7.0 Hz, H-3′, 4′); δ_C46.4(C-1′), 28.3 (C-2′), 19.2 (C-3′, 4′)]에서의 신호를 통해 이소부틸 잔기의 존재를 제시하였다. 또한, ₁H NMR 데이터에서는 J = 11.5 Hz 및 15.5 Hz의 커플링 상수에 의해 결정된 Z 및 E 배열 안에 각각 [δ_H5.67 (1H, d, J= 11.5 Hz, H-2), 6.41 (1H, dd, J= 11.5, 11.5 Hz, H-3)] 및 [δ_H7.45 (1H, ddd, J= 15.5,.11.5, 1.0 Hz, H-4), 5.98 (1H, dt, J = 15.5, 6.5 Hz, H-5)]에서 2 쌍의 olefinic protons의 신호가 관찰되었다. 또한, ¹H NMR 스펙트럼에서 두 개의 메틸렌 신호 δH2.39 (2H, m, H-6), 2.43 (2H, m, H-6)와 하나의 옥시메틴 신호 δH4.47 (2H, m, H-12)를 관찰할 수 있었다. ¹³C NMR 스펙트럼에서는 ¹H NMR 데이터와 일치하는 두 쌍의 올레핀 탄소, 두 개의 메틸렌 및 하나의 옥시 메틸렌에 대한 신호를 나타내었다. 또한, ¹³C NMR 및 HSQC 스펙트럼에서 [δC79.6, 64.5, 70.7, 71.7]에서의 4 개의 4차 탄소는 2 쌍의 삼중 결합으로서 할당되었다. ¹H 및 ¹³C NMR 데이터 해석 결과 에키날카마이드는 메틸기 대신 옥시 메틸렌 및 글루코오스 잔기의 존재를 제외하고는 undeca-2Z-4E-diene-8,10-diynoic acid isobutylamide의 것과 매우 유사하였으며, 이러한 결과는 에키날카마이드가 undeca-2Z-4E-diene-8,10-diynoic acid isobutylamide의 글루코사이드인 것을 제안한다. 이는 HMBC 상관 관계에 의해 뒷받침된다. 이소부틸 및 글루코스 부분의 위치는 H-1 '과 C-1 사이 및 H-1' '과 C-12 사이의 HMBC 상관에 의해 각각 C-1 및 C-12로 결정되었다. 이에 따라 에키날카마이드는 하기 화학식 1과 같은 구조로 결정되었으며, 이는 천연에서 처음으로 분리되어 보고되는 화합물로서 본 발명에서는 “echinalkamide”로 명명하였다.

Echinalkamide. Brown syrup; 21.2 (c 0.03, MeOH); UV (MeOH)λmax249.0 nm; IRmax3364,1646cm-1;1H NMR (500 MHz, CD3OD)δ5.67(1H,d,J = 11.5 Hz, H-2), 6.41 (1H, t, J = 11.5 Hz, H-3), 7.45 (1H, ddd, J = 15.5, 11.5, 10 Hz, H-4), 5.98 (1H, dt, J = 15.5, 6.5 Hz, H-5), 2.39 (2H, m, H-6), 2.43 (2H, m, H-7), 4.47 (2H, s, H-12), 3.03 (2H, d, J = 7.0 Hz, H-1′), 1.78 (1H, m, H-2′), 0.91 (6H, d, J = 7.0 Hz, H-3′, 4′), 4.41 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1″), 3.1-3.3 (4H, m, H-2″, 3″, 4″, 5″), 3.84 (2H, m, H-6″) ppm; 13CNMR (125MHz, CD3OD),δ167.6(C-1), 119.4(C-2), 140.2(C-3), 128.2(C-4), 139.3(C-5), 31.2(C-6), 18.2(C-7), 79.6(C-8), 64.5(C-9), 70.7(C-10), 71.1(C-11), 55.7(C-12), 46.4(C-1′), 28.3(C-2′), 19.2(C-3′,4′), 100.9(C-1″), 76.7(C-2″), 76.6(C-3″), 73.5(C-4″), 70.2(C-5″), 61.3(C-6″)ppm; ESIMS (positive mode) m/z : 444 [M+Na]+; HRESI-TOF-MS(positivemode) m/z : 444.1492 (calcd for C22H31NNaO 744.41998)

[화학식 1]

실험예

(1) 세포독성 측정

에키날카마이드(Echinalkamide)와 RANKL(Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B Ligand)의 세포 내 처리가 세포 독성을 유발하는지 확인하기 위하여 상기 제조예에서 제조된 BMM을 96-웰 플레이트에 첨가하고(1x10⁴ 세포/웰), 하룻밤 배양한 후 M-CSF(30ng/mL) 및 상기 실시예 2에서 제조된 시험물질을 각각 1 μM부터 50 μM의 농도로 처리하였다. 3일간 배양 후, 50 ㎕ XTT(나트륨 3'-[1-(페닐-아미노카르보닐)-3,4-테트라졸륨]-비스(4-메톡시-6-니트로)벤젠술폰산 수화물 및 N-메틸 디벤조피라진 메틸 술페이트) 시약을 각 웰에 첨가하고, 이어서 세포를 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 마이크로 플레이트 리더(Molecular Devices, 미국 캘리포니아 서니베일)를 사용하여 450 nm에서 각 웰의 광학 밀도를 측정하였다.

(2) 파골세포 형성 분석

파골세포를 생성하기 위해서, 상기 제조예에서 제조된 BMM을 M-CSF(30 ng/mL)와 RANKL(100 ng/mL)을 함유하는 완전 배지 중에서 96-웰 플레이트(1x10⁴ 세포/웰)에 파종하고, 상기 실시예 2에서 제조된 시험물질을 각각 0 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM 및 30 μM의 농도로 처리하여 4일 동안 배양하였다. 일차 골아세포와 BMC의 공배양물로부터 파골세포를 생성하기 위해서, 배양 기간이 종료되면 세포를 10분 동안 3.7% 포르말린에 고정하고, 15분간 0.1% Triton X-100으로 투과화하고, 이어서 TRAP(Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 핵이 3개를 초과하는 TRAP-양성 다핵화 세포를 파골세포로서 계수하였다.

(3) 실시간 역전사 효소 PCR

24, 48, 72 및 96시간 동안 각각 RANKL 및 RANKL과 에키날카마이드(Echinalkamide)로 처리된 BMM세포는 eszy-Blue^TM Total RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Korea)로 mRNA를 추출 후, TaqMan RNA-to-Ct^TM 1-Step Kit를 사용하여 추출물과 프라이머를 혼합하고 StepOne 기계에서 48℃에서 15분, 95℃에서 10분 1회, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분으로 40 내재 60회 반복하여 Ct(threshold cycle) 값을 측정하였다.

(4) 웨스턴 블롯 분석

상기 제조예에서 제조된 BMM 세포에 각각 RANKL 및 RANKL과 에키날카마이드(Echinalkamide)로 처리한 후, PBS(PHOSPHATE BUFFERED SALINE)로 pellet의 배양액을 완전히 제거한 후 프로테이나제 저해제(proteinase inhibitors)를 포함한 용균 버퍼(lysis buffer)로 얼음에서 30분간 용해시켰다. 용해물(lysate)을 13,000 rpm에서 25분간 원심분리한 후 상층액을 취해 얻은 단백질을 정량하여 사용하였다. 단백질과 5Хsample buffer를 혼합하여 95℃에서 5분간 가열하여 불활성화시킨 후 SDS polyacrylamide gel에서 전기영동을 실행하였다. 전기영동 된 겔의 단백질을 니트로섬유소막(nitrocellulose membrane)으로 이동시키고, 탈지유(skim milk) 또는 BSA로 1시간 동안 blocking 시킨 후 세척하였다. 상기 막에 primary antibody(c-FOS, NFATc1, MMP-9, Cathepsin K, phospho-ERK, phospho-JNK, phospho-P38)를 희석하여 4℃에서 24시간 동안 반응시키고 PBST로 세척한 후 primary-specific HRP conjugate secondary antibody를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 세척한 후 ECL 용액으로 발광시켜 FluorChem E system image analyzer(Cell Biosciences, Santa Clara, CA)를 이용하여 band의 사진을 촬영하였다. 단백의 증감은 Image J(Media Cybernetics, 미국 메릴랜드 실버스프링) 프로그램을 활용하여 정량화하였다.

(5) 뼈 재흡수 분석

파골세포의 분화와 활성의 결과 나타나는 뼈의 흡수능을 평가하기 위하여, plate에 칼슘 콜라겐(calcium-collagen)으로 코팅하여 제조된 인공 뼈(Corning Life Sciences, Corning Inc, Corning, NY, USA)를 사용하여 측정하였다. 인산칼슘(Calcium phosphate)과 콜라겐(collagen)을 코팅한 plate를 phenol-red-free MEM 배지를 사용하여 세척하였다. 세척 후 미분화된 파골세포 전구세포를 1Х10³ cells/well로 분주하고 24시간 배양 후, RANKL을 100 ng/ml로 처리하였다. RANKL이 처리된 배지에 상기 실시예 2에서 제조된 에키날카마이드(Echinalkamide)를 1 μM, 10 μM 및 30 μM의 농도별로 처리한 다음 7일간 배양하였고, 배지는 2일에 한번씩 교체하였다. 배양 후 5% 하이포아염소산나트륨(sodium hypochlorite)을 처리하여 세포를 제거하고 DDW(deuteriumdepleted water)로 세척한 후 Х400 역상 현미경(Leica microsystems, Germany)으로 뼈의 흡수를 관찰하고 사진을 촬영하였다. 촬영 후 재흡수(resorption) 부위를 Image J software(Media Cybernetics, 미국 메릴랜드 실버스프링)로 수치화하였다.

(6) 통계 분석

실험은 적어도 3회 수행되었으며, 데이터는 평균±표준편차(SD)로 표시된다. 모든 통계 분석은 Social Sciences Software의 Statistical Package(SPSS; 한국 버전 14.0)를 사용하여 수행되었다. 2그룹 간 변수 비교에는 스튜던트 t-테스트가 사용되었고 P < 0.05가 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

파골세포는 뼈 조직에서 유일하게 뼈의 파괴를 담당하는 단핵구 대식세포 계통의 세포로 RANKL과 같은 특정 사이토카인(cytokine)에 의해 여러 조직에 존재하는 단핵구 대식 전구세포로부터 분화되어 생성이 가능하다.

도 1을 참조하면, 에키날카마이드(Echinalkamide)는 30μM의 농도까지는 독성이 없는 것으로 판단하였다.

도 2 및 도 3을 참조하면, TRAP 염색을 하게 되면 RANKL 처리를 하지 않은 대조군은 BMC 세포가 구 모양을 유지한 채 증식하며, TRAP 염색에서도 음성 반응을 보여 연한 갈색이나 황토색을 띤다. 이에 반해 RANKL을 처리한 세포에서는 진한 암갈색 내지 적갈색으로 염색된 TRAP(+) 다핵세포가 관찰된다. 양성대조군으로 사용된 RANKL 처리 세포군에서는 3개 이상의 핵을 가지는 TRAP(+) 다핵세포로 분화가 유도되었고, RANKL과 에키날카마이드를 처리한 세포군에서는 농도가 증가할수록 파골세포로의 분화가 억제되었다.

도 4a 내지 도 4c를 참조하면, 파골세포 형성 시 에키날카마이드 효과의 분자 기전을 결정하기 위하여 c-Fos 및 NFATc1와 같은 핵심 전사 인자들의 발현에 대한 에키날카마이드의 효과를 알 수 있다. c-Fos와 NFATc1의 발현은 RANKL 자극에 의해 BMM에서 상향 조절되었다. 에키날카마이드에 의한 전처리는 24시간 또는 48시간째에 각각 c-Fos 또는 NFATc1의 RANKL-유도 mRNA 발현을 효과적으로 저해하였고, RANKL-유도 c-Fos 및 NFATc1 단백질 발현도 억제되었다.

도 5a 내지 도 5c를 참조하면, 파골세포 형성의 다른 두 마커인 MMP-9, cathepsin K의 RANKL-유도 발현도 에키날카마이드의 존재 하에 상당히 감소되었다.

도 6a 내지 도 6d를 참조하면, RANKL-유도 파골세포 형성에 대한 에키날카마이드(Echinalkamide)의 저해 효과를 뒷받침하는 분자 기전을 더 조사하기 위해 ERK, p38 및 JNK를 포함하는 RANKL-유도 조기 신호화 경로에 대한 에키날카마이드의 효과를 알 수 있다. 이들 신호화 분자들의 포스포릴화는 BMM에서 RANKL 처리 후 15분째에 관찰되었다. RANKL에 의한 ERK, p38 및 JNK의 활성화는 모두 에키날카마이드에 의해 상당히 저해되었다.

도 7a 및 도 7b를 참조하면, RANKL을 처리하여 파골세포 형성 후 나타나는 골 흡수로 인해 형성되는 pit 면적이 크게 나타났으며, 에키날카마이드 처리 시 1 μM 농도에서는 골 흡수가 저해되어 작은 pit가 관찰되었다. 에키날카마이드를 30 μM 농도로 처리한 경우에는 pit 형성이 거의 나타나지 않았다.

이와 같이, 본 발명에 따른 에키날카마이드(Echinalkamide) 화합물을 포함하는 파골세포 분화 억제용 약학 조성물은, 에키날카마이드가 BMM의 RANKL-유도 파골세포 형성 및 성숙한 파골세포성 뼈 재흡수를 방지하고, 또한 에키날카마이드가 ERK, p38 및 JNK는 물론 c-Fos와 NFATc1의 하향 조절과 관련되며, MMP9 및 cathepsin K의 발현을 저하시키고 있으므로, 골다공증을 포함하는 파골세포와 관련된 골 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 시사한다.

이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 도면을 참고하여 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

에키나세아 추출물로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 에키날카마이드(Echinalkamide) 화합물을 유효 성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제를 통한 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]