DE2425582B2 - Verfahren zur herstellung von hydroxycyclopentenonderivaten - Google Patents

Verfahren zur herstellung von hydroxycyclopentenonderivaten

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DE2425582B2 DE19742425582 DE2425582A DE2425582B2 DE 2425582 B2 DE2425582 B2 DE 2425582B2 DE 19742425582 DE19742425582 DE 19742425582 DE 2425582 A DE2425582 A DE 2425582A DE 2425582 B2 DE2425582 B2 DE 2425582B2
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Description

CH2I—COOR
HO
"5
(D
worin R ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe und m eine ganze Zahl von 1 bis 6 bedeutet, verwendet und das erhaltene Hydroxycyclopentenon der allgemeinen Formel 11
CU2)—COOP
(Π)
HO
worin R die vorstehende Bedeutung hat und η gleich m ist oder auch {in — 2) bedeutet, wenn m = 2 bis 6 ist. in üblicher Weise abtrennt.
Das beim erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Hydroxycyclopentenonderivat ist eine Verbindung, die z. B. als Zwischenprodukt zur Herstellung von Prostaglandin oder seinen Homologen wertvoll ist. Prostaglandin hat in den letzten Jahren auf medizinischem und pharmakologischem Gebiet große Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da es wertvolle physiologische Aktivitäten aufweist, wie hypotensive Aktivität, Schrumpfaktivität auf die glatte Muskulatur oder antiinflammatorische Aktivität.
Es ist auch bekannt, daß Verbindungen der allgemeinen Formel 11, z. B. eine Verbindung der allgemeinen Formel II, worin η - 6 ist, physiologische Aktivitäten aufweist, wie die Inhibierung einer Agglutination von Blutplättchen oder eine hypolensive Aktivität.
Diese Verbindung kann z. B. mit einer Organometi>llverbindung der allgemeinen Formel 111
worin R die vorstehende Bedeutung hat und η gleich m ist oder auch (m — 2) bedeutet, wenn m = 2 bis 6 ist, in üblicher Weise abtrennt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Aspergillus tamarii oder Aspergillus fiavus verwendet.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial Verbindungen der allgemeinen Formel 1 verwendet, in der R eine Methylgruppe oder Äthylgruppe und m = 6 ist.
35 In-Bu)3P -Cu-Li
(IH)
40
45
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hydroxycyclopentenonderivaten aus den enttprechenden Cyclopentenonderivaten durch Behandeln mit einer Kulturlösung, in der nach üblichen Verfahren ein Stamm der Gattung Aspergillus, wie Aspergillus niger, gezüchtet wird, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man als Cyclopentenonderivat eine Verbindung der allgemeinen Formel I
2^ COOR
(D
worin R ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe und m eine ganze Zahl von I bis 6 bedeutet.
worin n-Bu eine n-Butylgruppe bedeutet und R'" eine Schutzgruppe, wie eine Tetrahydropyranylgruppe, bedeutet, umgesetzt werden, um einen Vorläufer von Prostaglandin E1 zu bilden.
Hydroxycyclopentenonderivate wurden bislang z. B. nach einem Verfahren durch Behandlung eines Cyclopentenonderivats der allgemeinen Formel 1 mit N-Bromsuccinimid in einem mehrstufigen Verfahren hergestellt (vgl. »Rec. Trav. Chim. Pays-Bas«. Bd. 87, 1421 [1968]). Bekannt ist ferner ein mehrstufiges Verfahren, bei dem ein bestimmtes Cyclopentantrion das Ausgangsmaterial darstellt (vgl. »Tetrahedron Letters«, 2627 [1972]). Schließlich ist noch ein Verfahren bekannt bei dem ein bestimmtes Cyclopentadienderivat Oxydrest wird (vgl. »Chem. Commun.«, 240 [1972]). Bei diesem Verfahren entstehen jedoch neben der gewünschten Verbindung Nebenprodukte. Diese bekannten Verfahren müssen daher nicht nur mehrstufig durchgeführt werden, um das gewünschte Produkt zu erhalten, sondern sie weisen auch den Nachteil auf, daß die Ausbeute des Produkts schlecht ist und das Produkt eine Mischung aus d- und 1-lsonieren darstellt.
Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß die Hydroxycyclopentenonderivate der allgemeinen Formel II leicht unter Verwendung von Mikroorganismen, die der Gattung Aspergillus in guten Ausbeuten angehören, hergestellt werden können.
Erfindungsgemiiß kann jeder Mikroorganismus, der der Gattung Aspergillus angehört, verwendet werden, jedoch wurden Aspergillus niger, Aspergillus
55
tamarii und Aspergillus flavus als besonders geeignet befunden. Unter diesen kann Aspergillus niger mit besonderem Vorteil verwendet werden.
Wenn ein Stamm von Aspergillus niger erfindunus- »emäß in einem das Cyclopentenonderivat der allgenieinen Formel I enthaltenden Medium gezüchtet wird, erhält man das Cyclopentenonderivat der allgemeinen Formel 11 nicht nur in einer sehr hohen Ausbeute, sondern dieses kann auch leicht aus dem Kulturmedium abgetrennt und nach an sich bekannten Methoden gereinigt werden.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Hydroxycyclopentenons unter Verwendung eines Stamms der Gattung Aspergillus, wie Aspergillus niger. ist bereits bekannt. So wird das Cinerolon der Formel V aus Cineron der Formel IV unter Verwendung von Aspergillus niger hergestellt (vgl. »Applied Microbiology« Mai 1969, S. 714 bis 717). '
eis
j \
HO
CH3
eis
CH2CH=CHCH,
(IV)
(V)
Das 2-Cyclopenten-l-on-Derivat der allgemeinen Formel I, das erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial verwendet wird, weist eine funktionelle Gruppe auf, die im Cineron der Formel IV nicht anwesend ist, da das Ende der Seitenkette in 2-Stellung eine Carboxyl-oder Carbalkoxy-Gruppe ist. In der vorstehenden Literaturstelle wird berichtet, daß die Umwandlung zum Cinerolon der Formel V etwa 60%, jedoch die Ausbeute an isoliertem Cinerolon etwa 13% beträgt. Im Gegensatz hierzu kann erfindungsgemäß unter Verwendung eines Stamms, dem Aspergillus niger angehört, das Hydroxycyclopentenonderivat der Formel II, in dem die 4-Stellung des 2-Cyclopenten-l-on-Derivats selektiv durch eine Hydroxylgruppe substituiert wird, in einer Ausbeute von tatsächlich mindestens 60% und unter bevorzugten Bedingungen von etwa 70 bis 95% hergestellt werden.
Einige typische Beispiele der erfindungsgemäß verwendeten Stämme sind:
Aspergillus niger Al CC 9142 (ATCC = American Type Culture Collection),
Aspergillus niger IFO 6428 (IFO = Institute for Fermentation, Osaka, Japan).
Aspergillus tamarii ATCC 1005 und
Aspergillus flavus ATCC 12 073.
60
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann jedes Medium, das zur Züchtung von Schimmelpilzen verwendet wird, verwendet werden. Bevorzugte Medien sind diejenigen, die d-Glucose als Kohlenstoffquelle für das Wachstum der Zellen enthalten. Um eine Abnahme des pH-Werts der Kulturbrühe zu vermeiden, kann eine basische Substanz, wie Natriumhydroxyd oder Calciumcarbonat. verwendet werden.
Mit besonderem Vorteil wird Calciumcarbonat verwendet.
Die geeigneterweise zugesetzte Menge an Calciumcarbonat beträgt 0,01 bis 1,0 Gewichtsprozent, bezogen auf die Kulturbrühe. Wenn die Menge weniger als 0,1 Gewichtsprozent beträgt, tritt kaum ein nennenswerter Effekt hinsichtlich des absinkenden pH-Werts ein, jedoch wird eine Förderung bzw. Beschleunigung des Zellenwachstums beobachtet.
Die Züchtung kann bei Raumtemperatur, vorzugsweise bei 10 bis 40QC, insbesondere bei etwa 25 bis 30cC, durchgefiihrt werden.
Die Zusammensetzung des Kulturmediums und die Kultivierungsbedingungen für einen Stamm der Gattung Aspergillus sind z. B. detailliert in »Physiology of Fungi«, V. W. Cochrane, Academic Press und »The Fungi«, Bd. 1—JVa, Ain worth. Academic Press, beschrieben.
Erfindungsgemäß können alle Medien und alle Züchtun^sbedingungen, die in diesen Literaturstellen genannt sind, verwendet werden. Kurz gesagt, erfindungsgemäß kann jedes Kulturmedium und jede Kultivierungsbedingung verwendet werden, solange Mikroorganismen, die der Gattung Aspergillus angehören, in solch einem Medium, das eine Verbindung der vorstehenden allgemeinen Formel I enthält, wachsen können.
Als Ausgangsmaterial werden bevorzugt Cyclopentenonderivate der allgemeinen Formel 1 verwendet, worin R ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Äthylgruppe und m eine ganze Zahl von I bis 6 ist.
Die Verbindungen, in denen R ein Wasserstoffatom bedeutet, lassen sich im allgemeinen mit besonderem Vorteil verwenden.
Beispielsweise stehen folgende Methoden zur Hydroxylierung der Ausgangsverbindung zur Verfugung:
A. Eine Methode, bei der ein das Ausgangsmaterial enthaltendes Medium mit einem Stamm angeimpft und kultiviert wird.
B. Eine Methode, bei der ein Stamm kultiviert bzw. gezüchtet wird, während das Substrat mit dem Wachstum der Zellen des Stamms nach und nach zugegeben wird.
C. Eine Methode, bei der die Zellen eines Stamms in einem gewissen Ausmaß gezüchtet werden und danach das Substrat zugegeben wird, um die Züchtung des Stamms fortzuführen.
Unter diesen ist die Methode A bevorzugt, da hierbei eine hohe Umwandlung des Ausgangsmaterials erzielt wird.
Die Konzentration des Ausgangsmaterials ist derart, daß durch die Animpfung mit einem Stamm das Wachstum seiner Zellen beobachtet werden kann. So beträgt z. B. die Konzentration des Ausgangsmaterials 0,05 bis 4 Gewichtsprozent, insbesondere etwa 0,08 bis 2 Gewichtsprozent, bezogen auf die Kulturbrühe, wenn das Ausgangsmaterial ein Cyclopentenonderivat der allgemeinen Formel I mit R = Wasserstoff ist und die Methode A angewandt wird. Wird jedoch ein Cyclopentenonderivat der allgemeinen Formel 1 verwendet, worin R einen niederen Alkylesler bedeutet, so beträgt die bevorzugte Konzentration etwa 0.01 bis 0.5 Gewichtsprozent, insbesondere 0.02 bis 0.1 Gewichtsprozent, bezogen auf die Kulturbrühe.
Bei der Züchtung des Hydroxycyclopentenonderi-
24
vats der allgemeinen Formel II werden vorteilhaft Aspergillus niger, Aspergillus tamarii oder Aspergillus fiavus, insbesondere aber Aspei iillus niger verwendet.
Während der Umsetzung bildet sich ein Hydroxycyclopentenonderivat der allgemeinen Formel II, das dieselbe Anzahl νοη Kohlenstoffatomen als Seitenkette aufweist oder eine Seitenkette besitzt, die zwei Methylengruppen (—CH,—(weniger enthält, als das Ausgangsma^erjal.-
Wird ein Ester der allgemeinen Formel I, worin R eine niedere Alkylgruppe, vorzugsweise eine Methyloder Äthylgruppe, bedeutet, als Ausgangsmaterial verwendet, so kann das Hydroxycyclopentenonderivat der allgemeinen Formel 11 in Form des Esters oder der freien Säure erhalten werden. '5
Die Natur des Endprodukts hängt hauptsächlich von der Reaktionszeit ab. Wenn z. B. Aspergillus niger verwendet wird und die Züchtungszeit bis zu etwa 40 Stunden beträgt, wird ein Hydroxycyclopentenonderivat als Hauptprodukt erhalten, worin die Zahl der Methylengruppen, die die Seitenkette ausmachen, unverändert ist Wird dieser Zeitraum überschritten, so wird ein Hydroxycyclopentenonderivat als Hauptprodukt erhalten, das zwei Methylengruppen weniger in der Seitenkette aufweist.
Wird jedoch eine Verbindung der allgemeinen Formel 1, worin m = I ist, als Ausgangsmaterial verwendet, so bleibt die Zahl der Methylengruppen im Hydroxycyclopentenonderivat die gleiche, selbst wenn die Züchtungszeit langer ist.
Wird ein Stamm von Aspergillus niger bis zu 40 Stunden unter Verwendung eines Esters eines Cyclopentenonderivats der allgemeinen Formel I als Ausgangsmaterial kultiviert, so kann ein Hydroxypentenonderivat erhallen werden, in dem die Estergruppe nicht hydrolysiert ist. 1st die Kultivierungszeit jedoch langer, so kann ein Hydroxycyclopentenon erhalten werden, das als Folge der Hydrolyse der Estergruppe eine freie Carboxylgruppe enthält.
Die Isolierung des Reaktionsprodukts kann leicht in üblicher Weise erfolgen. Zum Beispiel kann das Rohprodukt leicht aus der Kulturbrühe durch Filtration, Waschen der Zellen mit einem allgemein üblichen organischen Lösungsmittel, das in Wasser schwer löslich ist (z. B. Äther, Chloroform, Äthylacetat. Benzol, Hexan oder Cyclohexanon), Extrahieren des Produkts aus der wäßrigen Phase des Filtrats mit demselben organischen Lösungsmittel und anschließend durch Aufarbeiten des extrahierten Produkts in üblicher Weise er.halt?n werden.
Um ein Produkt mit guter Wirksamkeit zu gewinnen, ist es erwünscht, sich des Aussalzens und einer kontinuierlichen Extraktion zu bedienen.
Das Rohprodukt ist fast rein, kann jedoch gewünschtenfalls weitergereinigt werden, z. B. durch Säulen-Chromatographie, präparative Dünnschichtchromatographie oder Umkristallisation. Die freien Carbonsäuren werden am besten durch Umkristallisieren gereinigt.
Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren kann das Hydroxycyclopentenonderivat der allgemeinen Formel II, in der R. vorzugsweise H. CH, oder C2H5 bedeutet, in einer einzigen Stufe in einer Ausbeute von mindestens 60%. insbesondere mindestens 70% erhalten werden, wenn ein Stamm von Aspergillus niger zur Anwendung gelangt.
Das erhaltene Produkt ist optisch aktiv und weist daher überlegene Eigenschaften auf.
582
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1
150 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-l-on und 310 me Calciumcarbonat wurden in einen 500-ml-Dreihalskolben, der 100 ml einer Kulturbrühe der nachstehenden Zusammensetzung enthielt, eingebracht. Nach dem Sterilisieren innerhalb von 10 Minuten bei 120° C wurde mit einer Platinöse voll von Aspergillus niger ATCC 9142 angeimpft und 39 Stunden bei 30cC auf einer Rotationsschüttelvorrichtung kultiviert.
Zusammensetzung von 1 1 Kulturbrühe
Glucose 20 g
Primäres Kaliumphosphat 1,5 g
Magnesiumsulfatheptahydrat 1,5 g
Ammoniumnitrat 1,0 g
Lactalbumin 1 -0 g
Maisquellflüssigkeit-Feststoff 2,0 g
Lösl. Komponente v. autolysiert. Hefe 0,5 g
1-Glutaminsäure 0,5 g
Zinksuiratheptahydrat 10 mg
Destilliertes Wasser auf 1 1
pH-Wert mit NaOH auf 7,0eingestellt.
Die Kulturbrühe wies am Ende der Kultivierung einen pH-Wert von 4,55 auf. Die Zellen wurden aus der Kulturbrühe durch Filtration abgetrennt und mit Äther gewaschen. Das Filtrat wurde mit Äther extrahiert und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschließend das Lösungsmittel bei vermindertem Druck abgedampft. Man erhielt 98 mg eines Rohprodukts. Die Analyse des Produkts durch Dünnschichtchromatographie (im folgenden als TLC abgekürzt; Adsorbens Siliciumdioxydgel; Entwicklungslösungsmittel bzw. Laufmittel Äthyläther/Isopropyläther/Essigsäure = 70/35/3 Volumenverhältnis) ergab einen großen Flecken beim Rf-Wert von 0,10 und zwei kleine Flecken beim RrWert von 0,18 und 0,27.
Das Rohprodukt wurde aus einer Mischung aus Petroläther und Äthyläther bei -40°C umkristallisiert, wobei 62 mg von Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 15 bis 2O'C erhalten wurden.
Das erhaltene Produkt besaß folgende Eigenschaften:
TLC: Rf 0,10.
NMR-Spektrum [60 MHz, CDCl3, A(ppm)]
in der Nähe von 1,40 (8 H, Methylengruppe),
in der Nähe von 2,5 (6H, Carbonylgruppe oder Methylengruppe in Nachbarschaft zu der Doppelbindung),
in der Nähe von 4,0 (IH, Methinproton an dei Hydroxylgruppe gebunden),
in der Nähe von 6,20 (2 H, Proton in der Carboxylgruppe und der Hydroxylgruppe),
7,35 (1 H. olefinisches Proton).
IR-Spektrum (Flüssigkeitsfilm):
3300 cm"1 (Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe).
1700 cirT1 (Carboxylgruppe),
!680. 1620cm"1 (konjugiertes Enon).
UV-Spektrum ().,mx in Methanol): 229 nm:
[„]<; = +8 (in Methanol).
Aus den vorstehenden spek.troskopisehen Daten wurde das erhaltene Produkt als 2-(6'-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on !identifiziert. Ausbeute 40%.
Zur Charakterisierung wurden 300 mg (1.4mMol) dieses 2 - (6' - Carboxyhexyll - 4 - hydroxy - 2 - cyclopenten-l-ons in 50 ml Äthyläther gelöst, und ein geringer Überschuß einer ätherischen Lösung von Diazomethan (l.SmMol) wurde nach und nach bei OC zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt und nach einer üblichen Methode nachbehandelt, wobei 305 mg eines Rohprodukts erhalten wurden, welches auf Grund seiner spektroskopischen Daten als das 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-1 -on identifiziert wurde. Der Methylester dieses Produkts wies die folgenden Eigenschaften auf:
TLC: Rr-Wert 0,30.
NMR-Spektrum (60 MHz. CDCI.,. >) (ppm): xo
in der Nähe von 1.40 (8 H. Methylengruppe), in der Nähe von 2,5 (6H. Carbonylgruppe oder Methylengruppe benachbart zur Doppelbindung). 3.65 (1 H. Hydroxylgruppe).
3.70 (3H. Methylgruppe der Carbornethoxygruppe).
4.00 (1 H, Methinproton, an das eine Hydroxylgruppe gebunden ist).
7.30 (1 H. olefinische» Proton).
30
IR-Spektrum (Flüssigkeitsfilm):
3350 cm"1 (Hydroxylgruppe), 1720 cm"1 (veresterte Carboxylgruppe).
1680. 1620 cm"1 (konjugiertes Enon).
UV-Spektrum (/.,„„ in Methanol): 229 nm: -15
00 = +6 (in Methanol).
Beispiel 2
40
263 mg 2-(6-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-1 -on wurden in drei gleiche Teile geteilt, und diese Teile wurden jeweils in drei 500-ml-Dreihalskolben. die je 100ml der im Beispiel! angegebenen Kulturbrühe enthielten, eingebracht. Einem der Kolben (im folgenden als erster Kolben bezeichnet) wurden !00 mg Calciumcarbonat zugegeben. Nach dem Sterilisieren innerhalb von 10 Minuten bei 120 C wurde jeder Kolben mit einer Platinöse voll Aspergillus niger ATCC 9142 angeimpft, und es wurde 35 Stunden bei 30 C auf einer Rotationsschü ttelvorrichtung kultiviert. Nach der Kultivierung betrug der pH-Wert der Kulturbrühe für den ersten, zweiten und dritten Kolben entsprechend 4,60, 4,25 und 4,10. Das Wachstum der Zellen war am besten im ersten Kolben, dem Calciumcarbonat zugegeben worden war.
Die Kulturbrühen wurden vereinigt, und die Zellen wurden in derselben Weise, wie im Beispiel 1, durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wurde mit Äther extrahiert und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft, wobei 177 mg des Rohprodukts in einer Ausbeute von 62% erhalten wurden. Die Analyse des Rohprodukts durch Dünnschichtchromatographie ergab einen großen Flecken beim Rf-Wert von 0.10 und zwei sehr kleine Flecken bei den RrWerten von 0.18 und 0.28. Der Fleck beim R,-Wert von 0.10 des Rohprodukts wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie (Adsorbens Siliciumdioxydgel) isoliert. Aus den NMR- und IR-Spektren wurde der Fleck beim RrWert von 0.10 als das 2-(6' - Carboxy hexyl)-4- hydroxy - 2 -cyclopenten-I-on identifiziert.
Beispiel 3
377 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopcnten-1 -on wurden zu 500 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 1, welche jedoch kein Calciumcarbonat enthielt, zugegeben. In dieser Kulturbrühe wurde Aspergillus niger ATCC 9142 36 Stunden bei 30 C in derselben Weise wie im Beispiel 1 kultiviert. Anschließend wurde die Kulturbrühe mit Natriumchlorid gesättigt und mit Äther kontinuierlich 8 Stunden extrahiert, wonach in üblicher Weise getrocknet und konzentriert wurde, wobei 383 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Nach der Kultivierung besaß die Kulturbrühe einen pH-Wert von 3,10. Die Analyse des Rohprodukts durch Dünnschichtchromatographie ergab einen großen Flecken (das gewünschte Produkt) bei einem Rf-Wert von 0,10 und zwei kleine Flecken bei den Rf-Werten von 0,18 und 0,27. Der Fleck beim Rf-Wert von 0.10 wurde in derselben Weise wie im Beispiel 2 isoliert und auf Grund der Dünnschichtchromatographie und der NNiR- und IR-Spektren als 2-(6-Carbuxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l -on identifiziert.
Beispiel 4
20 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten -1 -on wurden zu 200 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 1 zugegeben, und Aspergillus niger ATCC 9142 wurde ohne Zugabe von Calciumcarbonat 30 Stunden bei 30 C in derselben Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet. Nach dem Wachstum der Zellen wurden weitere 205 ms 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten -1 -on keimfrei zugegeben, und anschließend wurde die Züchtung weitere 15 Stunden fortgesetzt. Der pH-Wert dei Kulturbrühe betrug zu diesem Zeitpunkt 3.55. Es wurde dann in derselben Weise wie im Beispiel ! behandelt, wobei 244 mg eines Rohprodukts erhalter wurden. Die Analyse dieses Rohprodukts durch Dünn Schichtchromatographie ergab einen kleinen Flecker beim R,-Wert von 0,10 und einen großen Flecken de: Ausgangsmaterials beim Rf-Wert von 0.46. Jed< Komponente wurde unter Befolgung der im Beispiel '. angegebenen Verfahrensweise isoliert, und es wurdet etwa 10 mg der dem RrWert 0,10 entsprechendei Komponente erhalten. Auf Grund der Dünnschicht Chromatographie und der NMR- und IR-Spektrei wurde diese Komponente als das 2-(6'-Carboxyhexyl) 4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on identifiziert.
Beispiel 5
39 mg 2-i6'-Carboxyhexyi)-2-cyclopenten-1 -01 wurden zu 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zu sammensetzung wie im Beispiel 1 gegeben, und e wurde ohne Zugabe von Calciumcarbonat Aspergillu niger ATCC 9142 in der Kulturbrühe innerhalb vo 55 Stunden bei 30 C in derselben Weise wie ir Beispiel 1 gezüchtet. Nach der Kultivierung wurd die Kulturbrühe in derselben Weise wie im Beispiel behandelt, wobei 20 mg eines Rohprodukts erhalte wurden. Nach der Kultivierung betrug der pH-Wei
der Kulturbrühe 2,7. Die Analyse des Produkts durch Dünnschichtchromatographie ergab einen sehr kleinen Flecken beim Rf-Wert von 0,10 und einen großen Flecken beim Rr-Wert von 0,27.
Das erhaltene Rohprodukt wurde aus einer Äther/ Petroläther-Mischung umkristallisiert, wobei 5 mg von Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 95 bis 97C erhalten wurden. Dieses Produkt besaß die folgenden Eigenschaften:
TLC: Rf-Wert 0,27.
NMR-Spektrum [60 MHz. CDCl1. <)(ppm)]:
1,40 (4 H, Methylengruppe),
2.0 bis 2,8 (6 H, Carbonylgruppe oder Methylengruppe benachbart zur Doppelbindung),
4,20 (IH, Methinproton, an das eine Hydroxylgruppegebunden ist),
7.1 (2 H, Proton der Carboxylgruppe und der Hydroxylgruppe),
7,40 (1 H, olefinisches Proton).
IR-Spektrum (KBr-Preßling):
in der Nähe von 3300 cm"1 (Hydroxylgruppe).
1720 cm"1 (Carboxylgruppe).
1680, 1620 cm"' (konjugiertes Enon).
UV-Spektrum (/.,„„* in Methanol): 227 nm.
Aus den vorstehenden spektroskopischen Daten wurde das erhaltene Produkt als das 2-(4'-Carboxybutyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-1-on identifiziert. Dies ist die Folge der /-/-Oxydation von 2-(6'-Carboxytiexyl)-4-hydroxy-2-cycIopenten-l-on. welches in eine Verbindung übergeführt wurde, die zwei Kohlenstoffatome weniger aufweist.
Beispiel 6
Nach der Sterilisierung wurden 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 1 mit einer Platinöse voll Aspergillus niger ATCC 9142 angeimpft, und es wurde 24 Stunden bei 30cC vorkultiviert. um die Zellen wachsen zu lassen. Anschließend wurden 50 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-l-on keimfrei zugegeben, und die Züchtung wurde weitere 24 Stunden fortgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt betrug der pH-Wert der Kulturbrühe 3.20. Die Kulturbrühe wurde in derselben Weise wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 42 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse des Rohprodukts durch iDünnschichtchromatographie zeigte zwei fast gleichgroße Flecken beim Rf-Wert von 0,10 (das Produkt) lind 0,46 (das Ausgangsmaterial) und einen kleinen Flecken beim Rf-Wert von 0.27. Der Fleck beim itr-Wert von 0,10 wurde durch die im Beispiel 2 beschriebene Methode isoliert, und auf Grund seines iDünnschichtchromatogramms sowie seiner NMR-end IR-Spektren wurde er als das 2-(6'-CarboxyhexyI)- ^-hydroxy-Z-cyclopenten-l-on identifiziert.
B e i s ρ i e I 7
50mg 2-(6'-Carboxyhexyli-2-cyclopenten-1 -on Wurden in 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zujammensetzung wie im Beispiel I gegeben, und nach -der Sterilisierung innerhalb von 10Minuten bei 120 C wurde mit einer Platinöse voll Aspergillus liiger ATCC 9142 angeimpft und 27 Stunden bei 28CC tuf einer Rotationsschüttelvorrichtung gezüchtet.
Nach der Kultivierung betrug der pH-Wert dei Kulturbrühe 3,42. Es wurde in derselben Weise wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 46 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse des Roh· produkts durch Dünnschichtchromatographie ergab einen großen Flecken (das gewünschte Produkt) bein· Rr-Wert von 0,10 und zwei sehr kleine Flecken bc dem Rf-Wert von 0,27 und 0,47. Der Fleck bein Rf-Wert von 0,10 wurde in derselben Weise wie irr
ίο Beispiel 2 isoliert und auf Grund des Dünnschichtchromatogramms und der NMR- und IR-Spektren
als das 2-(6'-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclo-
penten-1-on identifiziert.
Als dieses Rohprodukt unter Verwendung
eines Dünnschichtchromatographen (Thinchograph TFG-10, TLC-Autodetector der Iatron Company quantitativ bestimmt wurde, wurde die Umwandlung des Produkts zu 80% ermittelt. Die Ausbeute betrug
70%.
Beispiel 8
Nach der Sterilisierung wurden lOOml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 1 mit einer Platinöse voll Aspergillus niger IFO 642Ü
angeimpft, und es wurde 24 Stunden bei 30 C vorgezüchtet, um die Zellen wachsen zu lassen. Anschließend wurden 50 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-l-on keimfrei zugegeben, und die Kultivierung wurde weitere 24 Stunden fortgesetzt. Zu diesem
Zeitpunkt betrug der pH-Wert der Kulturbrühe 4,15. hs wurde in derselben Weise wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 39 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse dieses Rohprodukts durch Uunnscnichtchromatographie ergab einen eroßen
Hecken (Produkt) beim Rr-Wert von 0,10 und zwei kleine Flecken bei den R,-Werten von 0.27 und 0.46. Der Fleck beimRf-Wert von 0.10 wurde nach derselben verlahrensweise wie im Beispiel 2 isoliert und auf Grund der TLC und der NMR- und IR-Spektren
als das 2-(6'-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-1-on identifiziert. Als das Rohprodukt unter verwendung eines Dünnschichtchromatoeraphen Uhinchograph, dasselbe Gerät wie im Beispiel 7) bestimmt wurde, wurde eine Produktumwandlunc
von 60% ermittelt. Die Ausbeute betrug 45%.
Beispiel 9
5°mg.2-(6'-CarboxyhexyI)-2-cyclopenten-1 -on wurden in 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung, wie sie im Beispiel 1 verwendet wurde, gegeben, und nach der Sterilisation wurde mit einer natmose voll Aspergillus tamarii ATCC 1005 ange-
impft und 27 Stunden bei 28 C auf einer Rotationsscnuttelvornchtung kultiviert. Nach der Kultivierung betrug der pH-Wert der Kulturbrühe 5,90. Es wurde in derselben Weise wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 4U mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Ana-
lyse dieses Produkts durch Dünnschichtchromatorffn T? er|ab zwei Weine Flecken beim Rf-Wert von 0,10 (das Produkt) und 0,46 (das Ausgangsmaterial) und einen recht großen Flecken beim Rr-Wert von
. η ,?" ™ eck beim Rrwert von 0,10 wurde in
derselben Weise wie im Beispiel 2 isoliert und auf
Ä ej Dünnschichtchromatogramms und der
NMR- und IR-Spektren als das 2-(6'-Carboxvhexyl)-
4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on identifiziert '
Beispiel 10
50 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-1 -on wurden in 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 1 gegeben, und nach der Sterilisation wurde mit einer Platinöse voll Aspergillus flavus ATCC 12 073 angeimpft und 27 Stunden bei 28 C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung kultiviert. Nach der Kultivierung wies die Kulturbrühe einen pH-Wert von 6,45 auf. Es wurde in derselben Weise wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 43 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse des Rohprodukts durch Dünnschichtchromatographie zeigte einen kleinen Flecken beim Rf-Wert von 0,10 (das Produkt) und beim Rf-Wert von 0,46 (das Ausgangsmaterial), einen recht großen Flecken beim RrWert von 0,27 und noch einige andere kleine Flecken an anderen Stellen. Der Fleck beim Rr-Wert von 0,10 wurde in derselben Weise wie im Beispiel 2 isoliert und auf ürund von TLC, NMR und IR als das 2-(6'-Carboxyhcxyl)-4-hydroxy-2-cyclopcnten-l -on identifiziert.
Beispiel Il
53 mg 2-(6'-Carbomelhoxyhexyl)-2-cyelopenten-1-on wurden in 120 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 1 eingebracht, und nach der Sterilisation wurde mit einer Platinöse voll Aspergillus niger ATCC 9142 angeimpft und 24 Stunden bei 30 C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung kultiviert. Es wurde in derselben Weise wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 20 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse des Rohprodukts durch TLC ergab einen mittelgroßen Flecken beim Rr-Wert von 0.10 und 0,29. einen kleinen Flecken beim Rf-Wert von 0.50 und einen großen Flecken beim RrWert von 0.63 (Ausgangsmatenal). Diese wurden in derselben Weise wie im Beispiel 2 isoliert. Der Fleck beim Rr-Wert von 0,10 auf dem Dünnschichtchromaiogramm wurde auf Grund des NMR- und 1R-Spektrums als das 2-(6'-Carboxyhexyl)-4-hydroxv-2-cyclopenten-l-on und der Fleck beim Rf-Wert von 0,29 auf dem Dünnschichlchromatogramm auf Grund des NMR- und 1R-Spektrums als das 2 - (6' - Carbomethoxyhexyl) - 4 - hydroxy - 2 - cyclopenten-1-on identifiziert.
Beispiel 12
50 mg 2 - (6' - Carboäthoxyhexyl) - 2 - cyclopenten-1-on wurden in 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 1 gegeben, und nach der Sterilisation wurde mit einer Platinöse voll Aspergillus niger ATCC9142 angeimpft und 27 Stunden bei 28 C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung kultiviert. Es wurde in derselben Weise wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 28 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Das Rohprodukt wurde vorsichtig bei Raumtemperatur unter Verwendung einer wäßrigen 0,5 n-Natriumhydroxydlösung hydrolysiert und in üblicher Weise extrahiert und isoliert. Die Analyse des Produkts durch Dünnschichtchromaiographie ergab einen Flecken beim Rf-Wert von 0.10. Es wurde in derselben Weise wie im Beispiel 2 isoliert und auf Grund von TLC, NMR und IR als das 2-(o'-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-1 -on identifiziert.
Beispiel 13
325 mg 2-(3'-Carboxypropyl)-2-cyclopenten-l -on wurden in fünf gleiche Teile aufgeteilt, und diese Teile wurden in fünf 500-ml-Dreihalskolben, jeweils enthaltend 100 ml der Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 1, gegeben, und nach der Sterilisation wurde eine Platinöse voll Aspergillus niger ATCC 9142 bei 28 C innerhalb von 7 Tagen
ίο auf einer Ro tationsschüttelvorrichtung kultiviert. Nach der Kultivierung betrug der pH-Wert der Kulturbrühe 3,32. Diese Kulturbrühen wurden vereinigt und in derselben Weise wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 297 mg eines Rohprodukts erhalten wurden.
• 5 Die Analyse des Rohprodukts durch Dünnschichtchromatographie ergab einen kleinen Flecken beim Rf-Werl von 0,07, einen mittelgroßen Flecken beim Rf-Wert von 0,38 (das Ausgangsmaterial) und einige Flecken an deren Stellen.
Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie getrennt (Träger: Siliciumdioxydgel, Entwicklungslösungsmittel : Benzol/Äthylacetat/Methanol), und es wurden 21 mg einer Komponente, die auf dem Dünnschichtchromatogramm einen Flecken beim Rf-Wert von 0,07 aufwies, erhalten Diese Verbindung wies die folgenden Eigenschaften auf:
TLC: Rf 0,07.
NMR-Spektrum [60 MHz, CDCl3, Λ (ppm)]:
in der Mähe von 1,40 (2 H, Methylengruppe),
in der Nähe von 2,5 (6 H, Carbonylgruppe oder Methylengruppe benachbart zur Doppelbindung), in der Nähe von 4,0 (1H, Methinproton, an das eine Hydroxylgruppe gebunden ist),
6,20 (2 H, Proton der Carboxylgruppe und Hydroxylgruppe),
7,35 (1H, olefinisches Proton).
1R-Spektrum (Flüssigkeitsfilm):
3300 cm"1 (Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe),
1700 cm"1 (Carboxylgruppe),
1680, 1620 crrT! (konjugiertes Enon).
UV-Spektrum (/.m„ in Methanol): 229 nm.
Aus den vorstehenden spektroskopischen Daten wurde das Produkt als das 2-(3'-Carboxypropyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on identifiziert.
Beispiel 14
437 mg 2 - Carboxymethyl - 2 - cyclopenten - 1 - on wurden in sieben gleiche Teile geteilt, und diese Teile wurden in sieben Dreihalskolben, jeweils mit einer Kapazität von 500 ml und jeweils 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie im Beispiel 1 enthaltend, eingebracht. Nach der Sterilisation bei 120° C innerhalb von 10 Minuten wurde eine Platinöse voll Aspergillus niger ATCC 9142 7 Tage bei 28° C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung kultiviert. Nach der Kultivierung besaß die Kulturbrühe einen pH-Wert von 3,14 ± 0,2. Diese Kulturbrühen wurden vereinigt und in derselben Weise wie im Beispiel 1 behandelt, wobei 308 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse dieses Rohprodukts durch TLC ergab einen kleinen Flecken in der Nachbarschaft vom RrWert von 0,05, einen mittelgroßen Flecken beim Rr-Wert von 0,30 (das Ausgangsmaterial) und einige andere kleine Flecken an anderen Stellen.
In derselben Weise wie im Beispiel 2 wurden 31 mg des dem Rf-Wert von 0,05 entsprechenden Fleckens
ioliert. Das isolierte Produkt besaß die folgenden eigenschaften:
TLC: Rf = 0,05.
NMR-Spektrum [60 MHz, CDCl3, Λ (ppm)]: in der Nähe von 2,5 (2 H, Methylengruppe benachbart zu Carbonyl),
3,10 (2 H, Methylengruppe gebunden an der Carboxylgruppe),
in der Nähe von 4,0 (1 H, Methylproton, an das die Hydroxylgruppe gebunden ist),
6,20 (2 H, Proton der Carboxylgruppe und der Hydroxylgruppe),
7,30 (1 H, olefinisch.es Proton).
1R-Spektrum (Flüssigkeitsfilm): 3300 cm~l (Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe), 1700 cm"1 (Carboxylgruppe), 1690, 1635 cm"1 (konjugiertes Enon).
Auf Grund der vorstehenden spektroskopischen ίο Daten wurde dieses Produkt als das 2-Carboxymethyl-4-hydroxy-2-cyclopentcn-l-on identifiziert.
Die in den Beispielen erhaltenen Ausbeuten sind in der nachfolgenden Tabelle aufgerührt:
Beispiel Ausgangsmaterial Verwendete Produkt HO OR Rohausbeute Reinausbeute
Nr. Menge Art
O
A
<^ V-(CHjfc-COOR		 (mg) O [mg<%>] [mg(%)]
150 vV,CH^CO. 98 (61) 62 (40)
Art 263 Ji = 6, R = H 177 (63) 112(40)
377 desgl. 383 (95) 206 (50)
255 desgl. · 244(100) 100(44)
J)I = 6, R = H 39 desgl. 20 (59) 5(15)
1 desgl. 50 Ji = 4. R=H 42 (78) 24(44)
2 desgl. 50 Ji = 6. R=H 46 (86) 38 (70)
3 desgl. 50 desgl. 39 (73) 24 (45)
4 desgl. 50 desgl. 40 (74) 9(17)
5 desgl. 50 desgl. 43 (80) 7(13)
6 desgl. 53 desgl. 20 (37) 4 (7)
7 desgl. /ji = 6. R = H 3 (5)
8 desgl. 50 \jj = 6. R = CH3 28 (59) 13(24)
9 desgl. 325 ji = 6. R = H 297 (83) 87 (24)
10 m = 6. R = CH3 437 Ji = 3. R = H 308 (63) —
Π ji = 1,R = H
m = 6, R = C2H5
12 /?i = 3, R = H
13 jji = KR = H
14

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Hydroxycyclopentenonderivaten aus den entsprechenden Cyclopentenonderivaten durch Behandeln mit einer Kulturlösung, in der nach üblichen Verfahren ein Stamm der Gattung Aspergillus. wie Aspergillus niger, gezüchtet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cyclopentenonderivat eine Verbindung der allgemeinen Formel I
verwendet und das erhaltene Hydroxycyclopentenon der allgemeinen Formel 11
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