DE3143761A1

DE3143761A1 - "moranolinderivat"

Info

Publication number: DE3143761A1
Application number: DE19813143761
Authority: DE
Inventors: Yoshiaki Aoyagi; Hiroshi Nagaokakyo Enomoto; Yoji Otsu Ezure; Kiyotaka Kyoto Konno; Shigeaki Maruo; Shingo Kyoto Matsumura; Nobutoshi Ojima; Yoshiaki Uji Yoshikuni
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1980-12-01
Filing date: 1981-11-04
Publication date: 1982-06-24
Also published as: FR2495160B1; KR850000318B1; CH648328A5; GB2088365A; IT1172071B; IT8149705A0; DE3143761C2; JPS6055078B2; JPS5793997A; FR2495160A1; GB2088365B; KR830006281A; US4363802A

Description

Die Erfindung betrifft ein Bis-glukosylmoranolinderivat der Formel

HO OH

OH

CH₂OH CH₂OH

das ein Heilmittel gegen Diabetes mellitus ist.

Im Rahmen der Erfindung waren intensive Studien auf die Entwicklung eines sicheren und wirksamen Heilsmittels gegen Diabetes mellitus gerichtet, wobei festgestellt wurde, daß Bis-glukosylmoranolinderivat der Formel (i) eine beachtliche Unterdrtickungswixkung gegenüber dem Blutzuckeranstieg bei Zuckerbelastung aufweist und somit ein nützliches Arzneimittel darstellt.

Moranolin der Formel

CH₂OH

-II

(II)

3U3761

ist schon aus Mori Cortex isoliert worden, das ein Roharzneimittel natürlicher Herkunft ist (vgl. Yagi et al., Nippon Nogei Kagaku Kaishi, Vol. 50, Seite 571, 1976, und japanische Patentanmeldung Sho-52-83951)· Später wurde dann die Gewinnung der Substanz (il) durch Fermentierung unter Anwendung von Mikroorganismen der Art Streptomyces erforscht (vgl. japanische Patentanmeldung

Obwohl Moranolin selbst schon eine inhibitorische Wirkung gegen den Blutzuckerspiegelanstieg bei Zuckerbelastung aufweist und ein nützliches Heilmittel für Diabetes mellitus ist, war die Forschung darauf gerichtet, noch wirksamere Moranolinderivate zu ermitteln und zu erzeugen, und man fand k-(&-O-Glukosyl)-moranolin und ^-(ö£-D-Glukosyl)-N-niederalkylmoranolin der folgenden Formel

CII₂OH ^R H J N

(in).

in der R ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe ist (vgl. DE-OS 30 ^6

Sodann wurden die Forschungen erfindungsgemäß auf einen neuen Typ von 4-(p^-D-Glukosyl)moranolinderivaten gerichtet, und als Ergebnis gelangte man erfindungsgemäß zu dem Derivat der Formel (i), das noch weit wirksamer ist als 4-(o(-D-Glukosyl)-moranolin und k- (o(-D-Glukosyl)-N-niederalkylmoranolin.

Unterdrückungswirkung gegenüber dem Blutzuckerspiegelanstieg:

Die zu prüfendenVerbindungen wurden zusammen mit 2 g/kg Saccharose peroral an eine Gruppe von männlichen Ratten vom SD-Stamm (5 Wochen alt, Körpergewicht 100 bis 120 g) gegeben, wobei jede Gruppe aus vier Tieren bestand. In konstanten

Zeitintervallen wurde von Beginn der Verabreichung an 18O Minuten lang Blut von der Schwanzvene entnommen, und der Blutzuckerspiegelanstieg wurde bestimmt. Dann wurde die Fläche (AaUC) unter der Zeit-Blutzuckerspiegelanstieg-Kurve gemessen. ¥enn die bei alleiniger Gabe von Wasser erhaltene Fläche als "Grundgruppe" und die bei alleiniger Gabe von Saccharose erhaltene Fläche als "Vergleichsgruppe" angesetzt wird, wird das Unterdrückungsverhältnis gegenüber dem Blutzuckerspiegelanstieg bei der Gruppe, die die Testverbindung erhalten hat, nach der folgenden Gleichung berechnet:

Unt erdrückungs- _ verhältnis ~

Vergleichsgruppe )

(4AUC Testgruppe)

(AAUC Vergleichsgruppe)

(AA.UC Grundgruppe)

χ 100

Die jeweils errechneten Unterdrückungsverhältnisse sind in der folgenden. Tabelle zusammengestellt:

Name der Verbindung

Dosis

Verhältnis

Moranolin

¹I- (öC-D-Glukosyl) -moranolin

4- (o(-D-Glukosyl) -N-methylmoranolin

Verbindung (l)

10 mg/kg 10 mg/kg 5 mg/kg 1 mg/kg

19 f°

kk <fa

56 °/o

65 io

Die Verbindung (i) ist neu und in der Literatur bisher nicht erwähnt. Sie kann auf verschiedene ¥eise synthetisiert werden, Am besten geht man so vor, daß man ein aktiviertes ßis-allylalkoholderivat des Benzols, wie beispielsweise Bis(3-halogen-1-propenyl)benzol der Formel

3U3761

in der X ein Halogenatora ist, mit k- (ö(-D-Glukosyl)-moranolin der folgenden Formel (v) in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid, in Gegenwart eines Säurefängers, wie Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat, umsetzt.

CH₂OH

(ν)

H OH

4-(c\.-D-Glukosyl )-moranolin kann durch Kupplung von Moranolin mit oi-Cyclodextrin in Gegenwart von Cyclodextringlukosyl·» transferase und anschließende umsetzung des erhaltenen Oligoglukosylmoranolins mit Glukoamylase nach Adsorbieren an ein

stark saures Ionenaustauscherharz erhalten werden (vgl. DE-OS 30 h6 184).

Reaktionsscliema:

H OH

0(-Cyclodextrin ν Cyclodextringiukosyltransferase

J η

aOH.H

Oligoglukosyl-

moranolin (n = 0 oder ganze Zahl)

5OW χ 2(H⁺) Glukoamylase

CH₂OH

CH₂OH/ H N η

H OH

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung wird anhand eines Beispiels nachstehend im einzelnen erläutert.

Beispiel

I. Synthese von Benzol-1,4-bis-allylchlorid

Aus 60 g Vinylbromid und 14 g metallischem Magnesium hergestelltes Vinylmagnesiumbromid wurde in Tetrahydrofuran (nachstehend abgekürzt THF) gelöst, wobei 200 ml Lösung erhalten wurden. Unter Rühren wurde eine Lösung von 25 g Terephthalaldehyd in 200 ml THF während eines Zeitraums von 30 Minuten

zugetropft. Danach wurde die Reaktionslösung unter weiterem Rühren 30 Minuten lang am Rückfluß gehalten. Nach Abkühlen wurde unter Eiskühlung eine kleine Menge Wasser zugegeben, um das Produkt zu zersetzen. Das Reaktionsprodukt wurde mit Äthylacetat versetzt, die unlöslichen Bestandteile wurden entfernt , die Äthylacetatschicht wurde mit Wasser gewaschen und eingeengt, wobei 21 g eines blaßgelben und Öligen Reaktionsproduktes erhalten wurden. Dieses wurde in 250 ml Äthylacetat gelöst, 30 g Thionylchlorid wurden unter Rühren zugetropft, und danach wurde zwei Stunden lang am Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt, und der erhaltene kristalline Rückstand wurde aus einer kleinen Menge Äthylacetat umkristallisiert, wobei 15,8 g Benzol-1,U-bis-allylchlorid vom Fp. 12U-129° C erhalten wurden.

II. Herstellung von Λ-(ol-D-Glukosyl )-moranolin

a) Kultur von Bacillus macerans

In einen 500-ml-Erlenmeyerkolben wurden I50 ml einer Kulturbrühe (pH 7) gegeben, die 1 °/o Korneinweichlauge (corn steep liquor), 1 $ lösliche Stärke, 0,5 °/o Ammoniumsulfat und 0,5 $ Calciumcarbonat enthielt, und durch I5 Minuten langes Erhitzen bei 120° C sterilisiert. Es wurde mit drei Platinösen von Bacillus macerans (iFO 3^90-Stamm), der auf einer 1 ⁰Jo Pepton, 0,5 Io Hefe, 0,3 % Glukose, 1,5 % Glycerin, 0,3 $> Natriumchlorid, 0,1 °/o Leberpulver (OXOID, Warenzeichen für neutralisiertes Leber-digest) und 1,5 % Agar enthaltenden Schrägkultur gewachsen war, geimpft und 3 Tage lang bei 37° C kultiviert. Die Kulturlösung {300 ml) wurde in einen 15-1-Schüttelfermentierer inokuliert, der mit 9 1 desselben Kulturgemisch.es beschicht war, und 3 Tage lang unter ausreichendem Belüften und Rühren bei 37° C kultiviert, wobei etwa 130 bis 150 Einheiten Enzymlösung (Definition für Einheiten folgt nachstehend) als überstehende Flüssigkeit nach Zentrifugieren erhalten wurden.

b) Einheit der Cyclodextringlukosyltransferase-Aktivität

Lösliche Stärke (0,7 °/°_f Erzeugnis von Nakarai Kagaku Co. für biochemische Untersuchungen) wurde in 0,05 ni Acetatpuffer (pH 5,5) gelöst und als Substratlösung verwendet. Zu 950 /Ul des Substrats wurden 50/Ul Enzymlösung zugesetzt, das Ganze wurde 10 Minuten lang bei kO C umgesetzt, und die Reaktion wurde durch Zusatz von 0,5 "1 Of5 n Essigsäure abgebrochen. 100/Ul der Reaktionslösung wurden entnommen, und 3 ml ¥asser und 0,8 ml einer Jodlösung, für deren Bereitung Jod bis zu einer Konzentration von 0,01 m in 0,25 m KJ-Lösung gelöst worden war, wurden zugegeben, und das ganze Gemisch wurde gerührt und die Absorbanz (Α-) bei 660 run gemessen. In gleicher Weise wurden 100/ul einer Lösung, bei der 50/ul Wasser und 0,5 ml 0,5 η Essigsäure zu 950/ul der entnommenen Substratlösung zugesetzt worden waren, mit Jodlösung versetzt und die Absorbanz (A_r) bei 66θ nm gemessen. Eine Einheit wird nun durch tljti (U

A - A

1 Einheit = —- — _x 100 χ 2

^AR

repräsentiert. Dies entspricht der Aktivität, wo 1 ml der Enzymlösung einen 1 ^igen Abfall der Absorbanz innerhalb von 1 Minute bei 40 C verursacht.

c) Bereitung der Rohenzymlösung

Die kultivierte Losung von Bacillus macerans IFO 3^90 wurde zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde abgenommen. Diese wurde lyophilieiert, dann in einer kleinen Menge Wasser gelost, und eine eingeengte Enzymlösung wurde erhalten. Diese wurde bei 5 C gegen destilliertes Wasser gründlich dialysiert, und die innere Lösung, aus der die niedermolekularen Substanzen entfernt wurden, wurde als Rohenzymlösung verwendet.

d) Umsetzung und Behandlung

Dann wurden 6,5 g Moranolin in einer kleinen Menge Wasser gelöst, und die Lösung wurde mit 3 η Salzsäure auf einen pH-Wert von 5*7 eingestellt. Danach betrug das Volumen 32,5 nil. ^-Cyclodextrin (26 g) wurde in 1300· ml roher Cyclodextringlukosyltransferase-Enzymlösung (U6o Binheitem/ml) gelöst, eine wäßrige Moranolinlösung wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 5,67 eingestellt. Dieses wurde drei Tage lang bei 39° C geschüttelt, wobei die Reaktion ablief. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wurde durch eine Säule geschickt (Harzvolumen 50 ml, Dowex 5OW χ 2 (H⁺)), so daß die basischen Substanzen daran adsorbiert wurden. Nachdem gründlich mit Wasser gewaschen worden war, wurde das Harz in 1200 ml Wasser suspendiert, 120 mg ot-1,4-Glukanglukohydrase (etwa 22 Einheiten/mg), erhalten von Rhizopus niveus, wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde bei ko . C inkubiert, und das Fortschreiten der Reaktion wurde anhand von intermittierend entnommenen Proben verfolgt, wonach die während der Reaktion gebildete Glukose quantitativ bestimmt wurde. Es wurde festgestellt, daß die Glukosemenge nach der Umsetzung rapid zunahm« Nach 5-stündiger Reaktionsdauer wurde die Reaktion abgestoppt. Nach der Umsetzung wurde das Harz abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen, mit 0,5 η Ammoniakwasser eluiert, das Eluat wurde im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und durch eine Sephadex-G-15-Säule (12 cm 0 χ 30 cm) geschickt. Die gewünschten Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei 5»8 g k-(ctf-D-Glukosyl)-moranolin vom Fp. 138-48° C erhalten wurden. = 121,6 (Wasser).

III. Synthese der Verbindung (i)

1 g 4-(o(-D-Glukosyl )-raoranolin und 1 g Natriumbicarbonat wurden in 15 ml Dirnethylsulfoxid (nachstehend abgekürzt DMSO) bei 22 bis 2k C gelöst, und eine unter Rühren bereitete Lösung von 380 mg Benzol-bis-allylchlorid in 15 ml DMSO wurde während 6o Minuten zugetropft. Das Gemisch wurde weitere k Stunden bei 22 bis 25 C gerührt. Dann wurden unlösliche Bestandteile

- 10 -

abfiltriert, das Filtrat wurde mit 300 ml Wasser verdünnt, mit Chloroform gewaschen und durch eine Säule (Dowex 50¥ χ 2 (H⁺), 20 ml) geschickt. Nachdem die Säule gründlich mit Wasser gewaschen worden war, wurde mit 0,2 $ Ammoniakwasser eluiert, und dann wurde das gewünschte Produkt mit 5 °h Ammoniakwasser enthaltendem wäßrigem Methanol eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum bis zur Trockne eingedampft, und die erhaltenen Kristalle wurden aus 80 ^igem Methanol umkristallisiert, wobei 300 mg derVerbindung (i) vom Fp. 109-173° C erhalten wurden. _b .28,0° (Wasser).

Elementaranalyse für C^Hεβ°^ο^_ζ'² ^Η2^0ϊ

Berechnet: C = 51,52 ?ί H= 7,15% N = 3,2*»-

Gefunden: C = 51,^2 # H= 7,20 °/o N = 3t33

Claims

PATENTANWÄLTE ■:. 3H3761 \>„/nüuerzs9örrier, ^/vey D-e München; 22 · widenmayerstrasse 48 D-I BERLIN-DAHLEM 33 · PODBIELSKIALLEE 6B Nippon Shinyaku Co., Ltd., Kyoto (Japan) BERLIN: DIPI INQ. R. MÜLLER-BÖRNER MÜNCHEN: DIPL.-INQ. HANS-HEINRICH WEY DIPL.-ΙΝβ. EKKEHARD KÖRNER München, den 4. November 1981 Patentanspruch :

1.1 Bis-glukosylmoranolinderivat der Formel

OH

HO OH

OH
CHOR CH₂OH

(I)

2. Verwendung des Derivats nach Anspruch 1 als Arzneimittel zur Unterdrückung des Blutzuckerspiegelanstiegs neben den üblichen Füll- und Trägerstoffen.

MÜNCHEN: TELEFON (Ο8Θ) 335585 KABEL: PROPINDUS · TELEX O5 34244 BERLIN: TELEFON (O3O) 8312Ο88 KABEL: PROPINDUS -TELEX OI 8*057