DE2425582A1 - Verfahren zur herstellung von hydroxycyclopentenonderivaten unter verwendung von mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zur herstellung von hydroxycyclopentenonderivaten unter verwendung von mikroorganismen

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DE2425582A1 DE19742425582 DE2425582A DE2425582A1 DE 2425582 A1 DE2425582 A1 DE 2425582A1 DE 19742425582 DE19742425582 DE 19742425582 DE 2425582 A DE2425582 A DE 2425582A DE 2425582 A1 DE2425582 A1 DE 2425582A1
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Description

F2O67-K362(Teijin)/h0
TEIJIN LIMITED, Osaka/Japan
Verfahren zur Herstellung von Hydroxycyclopentenonderivaten unter Verwendung von Mikroorganismen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hydroxycyclopentenonderivaten aus Cyclopentenonderi.vaten unter Verwendung von Mikroorganismen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Hydroxycyclopentenonderivaten, welches die Züchtung bzw. Kultivierung eines
Mikroorganismus, das der Gattung bzw. Klasse Aspergillus angehört, in einem Medium, das ein Cyclopentenonderivat der
Formel (D^
OOR
(1)
worin R ein Viasserstoff atom oder eine Niedrigalkylgruppe und m eine ganze Zahl von 1 bis 6
bedeuten, enthält, um in dem Medium ein Hydroxycyclopentenonderivat der Formel (2)
0 9 3 5 1/110
HO
worin R die vorstehende Bedeutung hat und η m oder (m-2) gleich ist,
zu bilden, und das Sammeln dieses Derivats umfaßt.
Das beim erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Hydroxycyclo— pentenonderivat ist eine Verbindung, die z.B. als Zwischenprodukt zur Herstellung von Prostaglandin oder seinen Homologen wertvoll ist. Prostaglandin hat in den letzten Jahren auf den medizinischen und pharmakologischen Gebieten große Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da es vielfache physiologische Aktivitäten aufweist, wie hypotensive Aktivität, Schrumpfaktivität auf die glatte Muskulatur oder anti-inflammatorische Aktivität.
Es ist auch bekannt, daß die durch die Formel (2) ausgedrückte Verbindung, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wird, z.B. eine Verbindung der Formel (2) , worin η 6 ist, physiologische Aktivitäten aufweist, wie die Inhibierung der Agglutination von Blutplättchen oder eine hypotensive Aktivität.
Diese Verbindung kann z.B. mit einer Organometallverbxndung der folgenden Formel (3)
(n-Bu J3P-Cu-Li L^^X\y\^ >2 (3)
OR l ' '
worin n-Bu eine n-Butylgruppe bedeutet und R' ' ' eine Schutzgruppe, wie eine Tetrahydropyranylgruppe,
bedeutet, umgesetzt v/erden, um einen Vorläufer von Prostaglandin E1 zu bilden.
4 0 9 8 5 1/110 6
Hydroxycyclopentenonderivate wurden bislang z.B. nach einem Verfahren hergestellt, welches die Behandlung eines Cyclopentenonderivats der vorstehenden Formel (1) mit N-Bromsuccinimid und Unterwerfung einiger synthetischer chemischer Stufen, um das gewünschte Produkt zu erhalten ["Rec.Trav.Chim.", 87, 14 21 (1968)] umfaßt, einem Verfahren, das die Behandlung eines bestimmten Cyclopentantrions in einigen synthetischen chemischen Stufen, um das gewünschte Produkt herzustellen ["Tetrahedron Letters", 2627 (1972)] umfaßt, oder einem Verfahren, das die Oxydation eines bestimmten Cyclopentadienderivats, um das Produkt und Nebenprodukte herzustellen, beinhaltet ["Chem.Commun.", 240 (1972)].
Jedoch erfordern diese bekannten Verfahren einige synthetische chemische Stufen, um am Ende das gewünschte Produkt zu erhalten, und sie weisen auch den Nachteil auf, daß die Ausbeute des Produkts schlecht ist und das Produkt eine Mischung eines d-Isomeren und eines 1-Isomeren darstellt.
Es wurden nunmehr Untersuchungen durchgeführt zur Herstellung des Hydroxycyclopentenonderivats der -Formel (2) unter Verwendung der metabolischen Aktivität eines Mikroorganismus, anstatt auf die komplizierten synthetischen Stufen, die vorstehend erwähnt wurden, zurückzugreifen, und es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Hydroxycyclopentenonderivate leicht unter Verwendung von Mikroorganismen,' die der Gattung Aspergillus angehören, hergestellt werden können.
Erfindungsgemäß kann jeder Mikroorganismus, der der Gattung Aspergillus angehört, verwendet werden, jedoch wurden Aspergillus niger, Aspergillus tamarii und Aspergillus flavus als besonders geeignet befunden. Unter diesen kann Aspergillus niger mit besonderem Vorteil verwendet werden.
Wenn ein Stamm von Aspergillus niger erfindungsgemäß in einem das Cyclopentenonderivat der Formel (1) enthaltenden Medium kultiviert bzw. gezüchtet wird, wird das Cyclopentenonderivat
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der Formel (1) in das Hydroxycyclopentenonderivat der Formel (2) auf Grund der metabolischen Wirkung des vorstehenden Stamms mit einer sehr hohen Ausbeute umgewandelt. Dieses Produkt kann leicht aus dem Kulturmedium abgetrennt und nach bekannten Methoden gereinigt werden.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Hydroxylderivats unter Verwendung eines Stamms, der Aspergillus niger angehört, ist bereits bekannt, in dem Cinerolon der Formel (5) aus Cineron der Formel (4) hergestellt wird (vergl. "Applied Microbiology", Mai 1969, Seite 714 bis 717).
CH-
eis
CH-CH=CHCH.
(4)
HO
CH.
CIS -CH2CH=CHCH,
(5)
Das 2-Cyclopenten-l—on-Derivat der Formel (1), das erfindungsgemäß als Substrat verwendet wird, weist eine funktioneile Gruppe auf, die im Cineron der Formel (4) nicht anwesend ist, da das Ende der Seitenkette in 2-Stellung eine Carboxyl- oder Carbalkoxy-Gruppe ist. In der vorstehenden Literaturstelle wird berichtet, daß die Umwandlung zum Cinerolon der Formel (5) etwa 60%, jedoch die Ausbeute an isoliertem Cinerolcn etwa 13 % beträgt. Im Gegensatz hierzu kann erfindungsgemäß unter Verwendung eines Stamms, der Aspergillus niger angehört, das Hydroxycyclopentenonderivat der Formel (2), in dem die 4-Stellung des 2-Cyclopenten-l-on-Derivats selektiv durch eine Hydroxylgruppe substituiert wird, in einer großen Ausbeute von mindestens 60 % und unter bevorzugten Bedingungen von etwa bis 95 % hergestellt werden.
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Einige typische Beispiele der erfindungsgemäß verwendeten Stämme sind:
Aspergillus niger ATCC 9142 (ATCC = American Type Culture
Collection),
Aspergillus niger IFO 6428 (IFO = Institute for Fermentation, Osaka, Japan),
Aspergillus tamarii ATCC 1005 und Aspergillus flavus ATCC 12073.
Jedoch ist die Erfindung nicht auf diese besonderen Stämme beschränkt.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann jedes Medium, das im allgemeinen zur Kultivierung bzw. Züchtung von Schimmelpilzen (molds) verwendet wird, verwendet werden. Bevorzugte Medien sind diejenigen, die d-Glucose als Kohlenstoffquelle für das Wachstum der Zellen enthalten. Um eine Abnahme des pH-Werts der Kulturbrühe zu vermeiden, kann eine basische Substanz, wie Natriumhydroxyd oder Calciumcarbonat, verwendet werden. Im Hinblick auf die Vorteilhaftigkeit der Verfahrensweise wird vorzugsweise Calciumcarbonat verwendet.
Die geeigneterweise zugesetzte Menge an Calciumcarbonat beträgt 0,01 bis 1,0 Gewichts-%, bezogen auf die Kulturbrühe. Wenn die Menge weniger als 0,1 Gewichts-% beträgt, tritt kaum ein nennenswerter Effekt hinsichtlich der Verhinderung der pH-Abnahme ein, jedoch werden ausreichende Effekte hinsichtlich der Förderung bzw. Beschleunigung des Zellenwachstums beobachtet.
Die Zugabe einer basischen Substanz, insbesondere von Calciumcarbonat, erlaubt es, die Verringerung des ρ Werts des Kulturmediums, verglichen mit dem Fall, wo eine Zugabe unterlassen wird, zu verhindern, und ermöglicht daher, das Wachstum der Zellen"zu verbessern.
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Di-e Kultivierung bsw. Züchtung kann bei Raumtemperatur, vorzugsweise bei 10 bis
durchgeführt werden.
zugsweise bei 10 bis 40 C, insbesondere bei etwa 25 bis 30°C,
Die Zusammensetzung des Kulturmediums und die Kultivierungsbedingungen, die zur Kultivierung bzw. Züchtung eines Stamms des Genus Aspergillus verwendet werden können, sind z.B. detailliert in "physiology of Fungi", V.W. Cochrane, Academi Press und "The Fungi", Band I-IVA, Ainworth, Akademi Press beschrieben.
Erfindungsgemäß können alle Medien und alle Kultivierungsbzw. Züchtungsbedingungen, die in diesen Literaturstellen genannt sind, verwendet werden. Kurz gesagt, erfindungsgemäß können jedes Kulturmedium jeglicher Zusammensetzung und jegliche Kultivierungsbedingungen verwendet werden, solange Mikroorganismen, die der Gattung Aspergillus angehören, voll in einem Medium, das eine Verbindung (Substrat) der vorstehenden Formel (1) enthält, wachsen können.
Erfindungsgemäß kann jedes Cyclopentenonderivat der Formel (1) als Substrat verwendet werden. Das bevorzugte Substrat ist eine Verbindung, ausgedrückt durch die Formel (1-a)
(-CK2->ir-C00R '
worin R1 ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Äthylgruppe und
m eine ganze Zahl von 1 bis 6
darstellt.
Unter den Verbindungen der Formel (1-a) sind diejenigen, in denen R' ein Wasserstoffatom oder eine Methyl- oder Äthyl-Gruppe bedeutet und m 6 darstellt, geeignet. Weiterhin sind im allgemeinen diejenigen, worin R1 ein Wasserstoffatom be-
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deutet, im allgemeinen als Substrat vorteilhaft.
Beispielsweise stehen die folgenden Methoden zur Verfügung, um das Substrat umzuwandeln:
(A) Eine Methode, bei der ein das Substrat enthaltendes Medium mit einem Stamm angeimpft und kultiviert wird.
(B) Eine Methode, bei der ein Stamm kultiviert bzw. gezüchtet wird, während das Substrat mit dem Wachstum der Zellen des Stamms nach und nach zugegeben wird.
(C) Eine Methode, bei der die Zellen eines Stamms in einem gewissen Ausmaß wachsen gelassen bzw, gezüchtet werden und danach das Substrat zugegeben wird, um die Züchtung bzw. Kultivierung des Stamms fortzuführen.
Unter diesen ist die Methode (A) bevorzugt, da eine hohe Umwandlung des Substrats erzielt wird.
Die Konzentration des Substrats ist derart, daß durch die Animpfung mit einem Stamm das Wachstum-seiner Zellen beobachtet werden kann. Z.B. beträgt die geeignete Konzentration des Substrats 0,05 bis 4 Gewichts-%, insbesondere etwa 0,08 bis 2 Gewichts-%, bezogen auf die Kulturbrühe, wenn das Substrat ein Cyclopentenonderivat der Formel (1) ist, worin R ein Wasserstoff atom bedeutet, und die Methode (A) verwendet wird. Wenn ein- Cyclopentenonderivat der Formel (1) verwendet wird, worin R einen Niedrigalkylester bedeutet, beträgt die bevorzugte Konzentration des Substrats etwa 0,01 bis 0,5 Gewichts—%, insbesondere 0,02 bis 0,1 Gewichts-%, bezogen auf die Kulturbrühe.
Erfindungsgemäß kann das Hydroxycyclopentenonderivat der Formel (2) in dem die Verbindung der Formel (1) als Substrat enthaltenden Kulturmedium durch Kultivierung bzw. Züchtung eines Stamms, der der Gattung Aspergillus angehört, insbesondere eines Stamms, der Aspergillus niger, Aspergillus tamarii oder Aspergillus flavus abgehört, insbesondere Aspergillus niger, in dem Kulturmedium erhalten werden.
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Wenn die Verbindung der Formel (1—a), die ein bevorzugtes Substrat ist, verwendet wird, kann ein Hydroxycyclopentenon derivat, das durch die Formel (2-a) ausgedrückt wird, erhal ten werden:
(2-a)
worin R1 die bezüglich der Formel (1-a) angegebene Bedeutung hat und
η gleich m oder (m-2) ist.
Wie aus der Definition von η in der vorstehenden Formel (2) oder (2-a) hervorgeht, kann, wenn die Verbindung der Formel (1) oder (1-a) als Substrat verwendet wird, ein Hydroxycyclopentenonderivat der Formel (2) oder (2-a) erhalten werden, das dieselben Kohlenstoffatome als Seitenkette, ausgedrückt durch -4CH2-^-COOR oder —fC^-fj^—COOR', aufweist oder eine Seitenkette aufweist, die zwei Methylengruppen (-CH2-) weniger enthält als die vorstehende Seitenkette.
Wenn ein Ester der Formel (1) oder (1-a), worin R oder R1 eine Niedrigalkylgruppe, vorzugsweise eine Methyl- oder Äthyl-Gruppe, bedeuten, als Substrat verwendet wird, kann ein Hydroxycyclopentenonderivat der Formel (2) oder (2—a) in Form des Esters oder in einer Form, in der der Ester zu einer freien Carboxylgruppe-zersetzt ist, erhalten werden.
Das unterschiedliche Produkt hängt hauptsächlich von der KuI-tivierungs- bzw. Züchtungs-Zeitspanne ab. Wenn z.B. ein Stamm, der Aspergillus niger angehört, verwendet wird und die KuItivierungs- bzw. Züchtungszeit bis zu etwa 40 Stunden beträgt,wird ein Hydroxycyclopentenonderivat als Hauptprodukt erhalten, worin die Anzahl der Methylengruppen, die die Seitenkette ausmachen, unverändert ist [n = m in der Formel (2) oder (2-a)]. Wenn die KuItivierungs- bzw. Züchtungszeit langer ist, wird ein Hydroxy-
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cyclopentenonderivat als Hauptprodukt erhalten," das zwei Methylengruppen weniger in der Seitenkette aufweist [n = (m-2) in der Formel (2) oder (2-a)].
Wenn jedoch eine Verbindung der Formel (1)oder (l-a),worin m=l, als Substrat verwendet wird, kann ein Hydroxycyclopentenonderivat mit derselben Anzahl von Methylengruppen erhalten werden, selbst wenn die Kultivierungs- bzw. Züchtungszeit langer ist.
Wenn ein Stamm, der Aspergillus niger angehört, bis zu 40 Stunden unter Verwendung eines Esters eines Cyclopentenonderivats als Substrat kultiviert wird, kann ein Hydroxypentenonderivat erhalten werden, indem die Estergruppe nicht hydrolysiert ist. Wenn jedoch die Kultivierungszeit langer ist, kann ein Hydroxycyclopentenon erhalten werden, das als Folge der Hydrolyse der Estergruppe eine Carboxylgruppe enthält.
Die Isolierung des Produkts kann leicht in üblicher Weise erfolgen. Z.B. kann das Rohprodukt leicht durch Entfernung der Zellen aus der Kulturbrühe durch Filtration, Waschen der Zellen mit einem allgemeinen bzw. üblichen organischen Lösungsmittel, das in Wasser schwer löslich ist (z.B. Äther, Chloroform, Äthylacetat, Benzol, Hexan oder Cyclohexanon), Extrahieren des Produkts aus der wäßrigen Phase des Filtrats mit demselben organischen Lösungsmittel und anschließend durch Aufarbeiten des extrahierten Produkts in üblicher Weise erhalten werden.
Um das Produkt mit guter Wirksamkeit zu gewinnen, ist es erwünscht, sich des Aussalzens und einer kontinuierlichen Ex— traktions—Verfahrensweise zu bedienen.
Das Rohprodukt ist fast rein, kann jedoch gewünschtenfalls, falls es weiter gereinigt werden soll, z.B. der Säulenchromatographie, präparativen Dünnschichtchromatographie oder Umkristallisation unterworfen werden, um ein reines Hydroxycyclopentenonderivat herzustellen. Wenn das Produkt ein Hydroxycyclopentenonderivat, das eine Carboxylgruppe enthält, ist,
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vereinfacht die Anwendung der Umkristallisatiansmethode das Verfahren.
Nach dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren kann das Hydroxycyclopentenonderivat der allgemeinen Formel (2), vorzugsweise (2-a), in einer einzigen Stufe in einer Großausbeute von mindestens 60 %, insbesondere mindestens 70 % (wenn ein Stamm, der Aspergillus niger angehört, verwendet wird) aus dem Cyclopentenonderivat der allgemeinen Formel (1), vorzugsweise Cl-a) erhalten werden.
Das erhaltene Produkt ist, da es nach einer Umwandlungsmethode, die auf Mikroorganismen basiert, hergestellt wurde, optisch aktiv und weist diesbezüglich ebenfalls überlegene Merkmale auf.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne sie jedoch einzuschränken.
Beispiel 1
150 rag (2—(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten—1-on und 310 mg Calciumcarbonat wurden in einen 500 ml-Dreihalskolben, der 100 ml einer Kulturbrühe der nachstehenden Zusammensetzung enthielt, eingebracht, und nach dem Sterilisieren während IO Minuten bei 120°C wurde mit einer Platinöse voll Aspergillus niger ATCC 9142 angeimpft und 39 Stunden bei 30°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung kultiviert.
Zusammensetzung von 1 1 Kulturbrühe
Glucose 20 g
primäres Kaliumphosphat 1,5 g
Magnesiumsulfatheptahydrat 1,5 g Ammoniumnitrat 1,0 g
Lactalbumin · 1,0 g
Maisquellflüssigkeit-Feststoff 2,Og lös !.Komponente v.autolysiert.Hef e 0,5 g 1-Glutaminsäure 0,5 g
Zinksulfatheptahydrat IO mg
destilliertes Wasser auf 1 1
·' pH rait NaOH auf 7,0 eingestellt
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- li - ·
Die Kulturbrühe wies am Ende der Kultivierung bzw. Züchtung einen ρ -Wert von 4,55 auf. Die Zellen wurden aus der Kultur-r brühe durch Filtration abgetrennt und mit Äther gewaschen.
Das Filtrat wurde mit Äther extrahiert und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrockhnet, wonach das Lösungsmittel bei vermindertem Druck verdampft wurde, um 98 mg eines Rohprodukts zu erhalten. Die Analyse des Produkts durch Dünnschichtchromatographie (im folgenden als.TLC abgekürzt; Adsorbens Sili— ciumdioxydgel; Entwicklungslösungsmittel bzw. Laufmittel
Äthyläther/lsopropyläther/Essigsäure = 70/35/3 Volumenverhältnis) ergab einen großen Flecken beim Rf-Wert von 0,10
und zwei kleine Flecken beim Rf-Wert von 0,18 und 0,27.
Das Rohprodukt wurde aus einer Mischung aus Petroläther und Äthyläther bei -40°C umkristallisiert, wobei 62 mg von Kristallen mit einem Schmelzpunkt von 15 bis 20°C erhalten wurden,
Das erhaltene Produkt besaß folgende Eigenschaften:
TLC; Rf 0,10
NMR-Spektrum [60 MHz, CDCl3, S (ppm)] ·
in der Nähe von 1,40 (8H, Methylengruppe)
in der Nähe von 2,5 (6H, Carbonylgruppe oder Methylengruppe
in Nachbarschaft zu der Doppelbindung)
in der Nähe von 4,0 (IH, Methinproton an der Hydroxylgruppe
gebunden)
in der Nähe von 6,20 (2H, Proton in der Carboxylgruppe und der
Hydroxylgruppe)
7,35 (IH, olefinisches Proton)
A0S85 1/1106
IR-Spektrum (Plüssigkeitsfilm)
3300 cm (Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe) 1700 cm (Carboxylgruppe)
— 1
1680, 1620 cm (konjugiertes Enon)
UV-Spektrum (\max in Methanol): 229 nm
= + 8° (in Methanol)
Aus. den vorstehenden spektroskopischen Daten wurde das erhaltene Produkt als 2-(6'-Carboxyhexyl)—4-hydroxy-2-cyclopenten-1-on identifiziert. Ausbeute 40 %.
Vergleichsbei spiel
300 mg (1,4 mMol) 2-(6'-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-1-on wurden in 50 ml Äthyläther gelöst, und ein geringer Überschuß einer ätherischen Lösung von Diazomethan (1,5 mMol) wurde nach und nach bei 0 C zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt und nach einer üblichen Methode nachbehandelt, wobei 305 mg eines Rohprodukts erhalten wurden, welches auf Grund seiner spektrospkopischen Daten als das 2-(6'-Carbomethoxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on identifiziert wurde. Der Methylester dieses Produkts wies die folgenden Eigenschaften auf:
TLC: R^-Wert 0,30
■ i
NMR-Spektrum (60 MHz, CDCl3, O (ppm):
in der Nähe von 1,40 (8H, Methylengruppe)
in der Nähe von 2,5 (6H, Carbonylgruppe oder Methylengruppe
benachbart zur Doppelbindung)
3,65 (IH, Hydroxylgruppe)
3,70 (3H, Methylgruppe der Carbomethoxygruppe)
4,00 (IH, Methinproton, an das eine Hydroxylgruppe gebunden ist)
7,30 (IH, olefinisches Proton).
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IR-Spektrum (Flüssiqkeitsfilm ) : 2425582
3350 cm (Hydroxylgruppe)
1720 cm" (Estercarboxylgruppe)
—1
1680, 1620 cm (konjugiertes Enon)
UV-Spektrum (λΠ)3χ in Methanol): 229 niti
= + 6° (in Methanol)
Beispiel 2
263 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-l-on wurden in drei gleiche Teile geteilt, und diese Teile wurden jeweils in drei 500 ml-Dreihalskolben, jeweils enthaltend 100 ml der in Beispiel 1 angegebenen Kulturbrühe, eingebracht. Einem der Kolben (im folgenden als erster Kolben bezeichnet) wurden 100 mg CaI-ciumcarbonat zugegeben. Nach dem Sterilisieren während 10 Minuten bei 120°C wurde jeder Kolben mit einer Platinöse voll Aspergillus niger ATCC 9142 angeimpft, und es wurde 35 Stunden bei 30 C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung kultiviert. Nach der Kultivierung betrug der p„-Wert der Kulturbrühe für den ersten, zweiten und dritten Kolben entsprechend 4,60, 4,25 und 4,10. Das Wachstum der Zellen war am besten im ersten Kolben, dem Calciumcarbonat zugegeben worden war.
Die Kulturbrühen wurden vereinigt, und die Zellen wurden in derselben Weise, wie in Beispiel 1, durch Filtration getrennt. Das Filtrat wurde mit Äther extrahiert und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft, wobei 177 mg des Rohprodukts in einer Ausbeute von 62 % erhalten wurden. Die Analyse des Rohprodukts durch Dünnschichtchromatographie ergab einen großen Flecken beim Rf-Wert von 0,10 und zwei sehr kleine Flecken bei den Rf-Werten von O,18 und 0,28. Der Fleck beim Rf-Wert von O1IO des Rohprodukts wurde durch präparat!ve Dünnschichtchromatographie (Adsorbens Siliciumdioxydgel) isoliert. Aus den NMR- und IR-Spektren wurde der Fleck beim FU~Wert von 0,10 als das 2-C6 »-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on identifiziert. -
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Beispiel 3
377 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-l-on wurden zu 500 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1, welche jedoch kein Calciumcarbonat enthielt, zugegeben. In dieser Kulturbrühe wurde Aspergillus niger ATCC 9142 36 Stunden bei 30 C in derselben Weise wie in Beispiel 1 kultiviert.. Anschließend wurde die Kulturbrühe mit Natriumchlorid gesättigt und mit Äther kontinuierlich 8 Stunden extrahiert, wonach in üblicher Weise getrocknet und konzentriert wurde, wobei 3-83 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Nach der Kultivierung besaß die Kulturbrühe einen pH-Wert von 3,10. Die Analyse des Rohprodukts durch Dünnschichtchromatographie ergab einen großen Flecken (das gewünschte Produkt) bei einem Rf—Wert von 0,10 und zwei kleine Flecken bei den R^-Werten von O,18 und 0,27. Der Fleck beim Rf-Wert von 0,10 wurde in derselben Weise wie in Beispiel 2 isoliert und auf Grund der Dünnschichtchromatographie und der NMR- und IR-Spektren als 2-(6·-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on identifiziert.
Beispiel 4
20 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-l-on wurden zu 200 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1 zugegeben, und Aspergillus niger ATCC 9142 wurde ohne Zugabe von Calciumcarbonat 30 Stunden bei 30 C in derselben Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet. Nach dem Wachstum der Zellen wurden weitere 205 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-l-on keimfrei zugegeben, und anschließend wurde die Züchtung weitere 15 Stunden fortgesetzt. Der p„-Wert der Kulturbrühe betrug zu diesem Zeitpunkt 3,55. Es wurde dann in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 244 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse dieses Rohprodukts durch Dünnschichtchromatographie ergab einen kleinen Flecken beim Rf-Wert von 0,10 und einen großen Flecken des Ausgangsmaterials beim R^-Wert von 0,46, Jede Komponente wurde unter Befolgung dec in Beispiel 2 angegebenen Verfahrensweise isoliert, und es Wurden etwa 10 mg der dem R^-Wert 0,10 entsprechenden ponente erhalten« Auf Grund der Dünnschichtchromatographie
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und der NMR- und IR-Spektren wurde diese Komponente als das 2—(6'-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l~on identifiziert.
Beispiel 5
39 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-l-on wurden zu 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1 zugegeben, und es wurde ohne Zugabe von Calciumcarbonat Aspergillus niger ATCC 914 2 in der Kulturbrühe während 55 Stunden bei 30 C in derselben V/eise wie in Beispiel 1 gezüchtet. Nach der Kultivierung wurde die Kulturbrühe in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 20 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Nach der Kultivierung betrug der ρ -Wert der Kulturbrühe 2,7. Die Analyse des Produkts durch Dünnschichtchro-' matographie ergab einen sehr kleinen Flecken beim R^-Wert von 0,10 und einen großen Flecken beim Rf-Wert von 0,27.
Das erhaltene Rohprodukt wurde aus einer Äther/PetrolätherMischung umkristallisiert, wobei 5 mg von Kristallen mit einem Schmelzpunkt von .95 bis 97°C erhalten wurden. Dieses Produkt besaß die folgenden Eigenschaften:
TLC: Rf-Wert 0,2 7
NMR-Spektrum [60 MHz, CDCl3, c5(pprn)]:
1,40 (4H, Methylengruppe)
2,0-2,8 (6H, Carbonylgruppe oder Methylengruppe benachbart zur Doppelbindung)
4,20 (IH, Methinproton, an das eine Hydroxylgruppe gebunden ist)
7,1 (2H, Proton der Carboxylgruppe und der Hydroxylgruppe) 7,40 (IH, olefinisches Prqton)
A 0 9 8 5 1 / 1 1 0 6
IR-Spektrum (KBr-Preßling):
in der Nähe von 3300 crn (Hydroxylgruppe)
1720 crn (Carboxylgruppe)
— Λ
16 80, 1620 cm (konjugiertes Enon)
UV-Spektrum (λ in Methanol): 227 nm
c max
Aus den vorstehenden spektroskopischen Daten wurde das erhaltene Produkt als das 2-(4'-Carboxybutyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-1-on identifiziert. Dies ist die Folge der ß-Oxydation von 2-(6'-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on, welches in eine Verbindung überführt wurde, die zv;ei Kohlenstoffatorne weniger aufweist.
Beispiel 6
Nach der Sterilisierung v/urden 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1 mit einer Platinöse voll Aspergillus niger ATCC 9142 angeimpft, und es wurde 24 Stunden bei 30 C vor-kultiviert, um die Zellen wachsen zu lassen. Anschließend wurden 50 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-1-on keimfrei zugegeben, und die Züchtung wurde weitere 24 Stunden fortgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt betrugt der ρ -Wert der Kulturbrühe 3,20. Die Kulturbrühe wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 42 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse des Rohprodukts durch Dünnschichtchromatpgraphie zeigte zwei fast gleichgroße Flekken beim Rf-V/ert von 0,10 (das Produkt) und 0,46 ( das Ausgangsmaterial) und einen kleinen Flecken beim Rf-Wert von 0,27. Der Fleck beim R^-VJert von 0,10 wurde durch die in Beispiel beschriebene Methode isoliert, und auf Grund seines Dünnschichtchromatogramms sowie seiner NMR- und IR-Spektren wurde er als das 2-(6·-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on identifiziert.
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Beispiel 7
50 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten—1-on wurden in 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1 gegeben, und nach der Sterilisierung während 10 Minuten bei 120° C wurde mit einer Platinöse voll Aspergillus niger ATCC 9142 angeirnpft und 27 Stunden bei 28°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung gezüchtet. Nach der Kultivierung betrug der ρ -Wert der Kulturbrühe 3,42. Es wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 46 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse des Rohprodukts durch Dünnschichtchromatographie ergab einen großen Flecken (das gewünschte Produkt)'beim Rf-Wert von 0,10 und zwei sehr kleine Flecken bei den Rf-Wert von 0,27 und 0,47. Der Fleck beim Rf-Wert von 0,10 wurde in derselben Weise wie in Beispiel 2 isoliert und auf Grund· des Dünnschichtchromatogramms und der NMR- und IR-Spektren als das 2-(6'-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-1-on identifiziert.
Als dieses "Rohprodukt unter Verwendung eines Dünnschichtchromatographen (Thinchograph TFG-IO, TLC-Autodetector der Iatron Company) quantitativ bestimmt wurde, wurde die Umwandlung des Produkts zu 80 % ermittelt. Die Ausbeute betrug 70 %.
Beispiel 8
Nach der Sterilisierung wurden 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1 mit einer Platinöse voll Aspergillus niger IFO 6428 angeimpft, und es wurde 24 Stunden bei 30 C vor-gezüchtet, um die Zellen wachsen zu lassen. Anschließend wurden 50 mg 2-(6·-Carboxyhexy1)-2-cyclopenten-lon keimfrei zugegeben, und die Kultivierung wurde weitere 24 Stunden fortgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt betrug der ρ -Wert der Kulturbrühe 4,15. Es wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 39 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse dieses Rohprodukts durch Dünnschichtchromatographie ergab einen großen Flecken (Produkt) beim Rf-Wert von 0,10 und zwei kleine Flecken bei den Rf-Werten von 0,27 und 0,46. Der Fleck beim- Rf-Wert von 0,10 wurde nach derselben
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Verfahrensweise wie in Beispiel 2 isoliert und auf Grund der TLC und der NMR- und IR-Spektren als das 2-(6'-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on identifiziert. Als das Rohprodukt unter Verwendung eines Dünnschichtchromatographen (thinchograph) (dasselbe Gerät wie in Beispiel 7) bestimmt wurde, wurde eine Produktuniwand lung von 60 % ermittelt. Die Ausbeute betrug 45 %.
Beispiel 9
50 mg 2-(6'-Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-l-on wurden in 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung,wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, gegeben, und nach der Sterilisation wurde mit einer Platinöse voll Aspergillus tamariii ATCC 1005 angeimpft und 27 Stunden be 28 C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung kultiviert. Nach der Kultivierung betrug der p„-Wert der Kulturbrühe 5,90. Es wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 40 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse dieses Produkts durch Dünnschichtchromatographie ergab zwei kleine Flecken beim Rf-Wert von 0,10 (das Produkt) und 0,46 (das Ausgangsmaterial) und einen recht großen Flecken beim Rf-Wert von 0,27. Der Fleck beim Rf-Wert von 0,10 wurde in derselben Weise wie in Beispiel 2 isoliert und auf Grund des Dünnschichtchromatogramms und der NMR- und IR-Spektren als das 2-(6'-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on identifiziert.
Beispiel 10
50 mg 2-(6'—Carboxyhexyl)-2-cyclopenten-l—on wurden in 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1 gegeben, und nach der Sterilisation wurde mit einer Platinöse voll Aspergillus flavus ATCC 12073 angeimpft und 27 Stunden bei 28°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung kultiviert. Nach der Kultivierung wies die Kulturbrühe einen p„—Wert von 6,45 auf. Es wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 43 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse des Rohprodukts durch Dünnschichtchromatographie zeigte einen kleinen Flecken beim Rf-Wert von 0,10 (das Produkt) und beim
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Rf-Wert von 0,46 (das Ausgangsmaterial), einen recht großen Flecken beim R,--Wert von 0,27 und noch einige andere kleine Flecken an anderen Stellen. Der Fleck beim R^-Wert von 0,10 wurde in derselben Weise wie in Beispiel 2 isoliert und auf Grund von TLC, NMR und IR als das 2-(6'-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on identifiziert.
Beispiel 11
53 mg 2-(6'-Carbomethöxyhexyl) - 2- cyclopenten-1-on wurden in 120 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1 eingebracht, und nach der Sterilisation wurde mit einer Platinöse voll Aspergillus niger ATCC 9142 angeimpft und 24 Stunden bei 30 C auf einer Rotationr.schüttelvorrichtung kultiviert. Es wurde in derselben Weise wie in Bei spiel 1 behandelt, v.'obei 20 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse des Rohprodukts durch TLC ergab einen mittelgroßen Flecken, beim Rf-Viert von 0,10 und 0,29, einen kleinen Flecken beim Rf-V.'ert von 0,50 und einen großen Flecken beim R.-Wert von 0,63 (Ausgangsmaterial)» Diese wurden in derselben Weise wie in Beispiel 2 isoliert. Der Fleck bein R,.-Wert von 0,10 auf dem Dünnschichtchromatogramrn wurde auf Grund des NMR- und IR-Spektrums als das 2-(6'-Carboxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-1-on und der Fleck beim R ,.-Wert von 0,29 auf dem Dünnschichtchromatograrnm auf Grund des NMR- und IR-Spektrums als das 2-(6'-Carbomethöxyhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on identifiziert.
Beispiel 12
50 mg 2-(6'-Carboäthoxyhexyl)-2-cyclopenten-l-on wurden in 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1 gegeben, und nach der Sterilisation wurde mit einer Platinöse voll Aspergillus niger ATCC 9142 angeimpft und 27 Stunden bei 28 C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung kultiviert. Es wurde in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 28 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Das Rohprodukt wurde vorsichtig bei Raumtemperatur unter Verwendung einer wäßrigen 0,5n-Natriumhydroxydlösung hydrolysiert und in
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üblicher Weise extrahiert und isoliert. Die Analyse des Pro-dukts durch Dünnschichtchromatographie ergab einen Flecken beim Rf-Wert von 0,10. Es wurde in derselben Weise wie in Beispiel 2 isoliert und auf Grund von TLC, NMR und IR als das 2-(6'-CarboxYhexyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten-l-on identifiziert.
Beispiel 13
325 mg 2-(3'—Carboxypropyl)-2-cyclopenten-l-on wurden in fünf gleiche Teile aufgeteilt, und diese Teile wurden in fünf 500 ml-Dreihalskolben, jeweils enthaltend 100 ml der Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie'in Beispiel 1, gegeben, und nach der Sterilisation wurde eine Platinölse voll Aspergillus niger ATCC 9142 bei 28°C während 7 Tagen auf einer Rotationsschüttelvorrichtung kultiviert. Nach der Kultivierung betrug der ρ -Wert der Kulturbrühe 3,32. Diese Kulturbrühen wurden vereinigt und in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 297 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse des Rohprodukts durch Dünnschichtchromatographie ergab einen kleinen Flecken beim Rf-Wert von 0,07, einen mittelgroßen Flecken beim Rf-Wert von 0,38 (das Ausgangsmaterial) und einige Flecken an deren Stellen.
Das Rohprodukt wurde durch Säulen Chromatographie gettrenntCTräger: Siliciumdioxydgel, Entwicklungslösungsmittel: Benzol/Äthylacetat/Methanol), und es wurden 21 mg einer Komponente, die auf dem Dünnschichtchromatografie einen Flecken beim Rf-Wert von 0,07 aufwies, erhalten. Diese Verbindung wies die folgenden Eigenschaften auf:
TLC: Rf 0,07
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NMR-Spektrum [60 MHz, CDCl3, 6 (ppm)]:
in der Nähe von 1,40 (2H, Methylengruppe)
in der Nähe von 2,5 (6H, Carbonylgruppe oder Methylengruppe
benachbart zur Doppelbindung)
in der Nähe von 4,0 (IH, Methinproton, an das eine Hydroxylgruppe gebunden ist)
6,20 (2H, Proton der Carboxylgruppe und Hydroxylgruppe) 7,35 (IH, olefinisches Proton)
IR-Spektrum (Flüssigkeitsfilm):
3300 cm (Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe) 1700 cm (Carboxylgruppe)
— 1
1680, 1620 cm (konjugiertes Enon)
UV-Spektrum (λ χ in Methanol): 229 nm
Aus den vorstehenden spektroskopischen Daten wurde das Produkt als das 2-(3'-Carboxypropyl)-4-hydroxy-2-cyclopenten~lon identifiziert.
Beispiel 14
43 7 mg 2-Carboxymethyl-2-cyclopenten-l-on wurden in sieben gleie Teile geteilt, und diese Teile wurden in sieben Dreihalskolben, jeweils mit einer Kapazität von 500 ml und jeweils enthaltend 100 ml einer Kulturbrühe derselben Zusammensetzung wie in Beispiel 1, eingebracht. Nach der Sterilisation bei 120 C während 10 Minuten wurde eine Platinöse voll Aspergillus niger ATCC 9142 7 Tage bei 28°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung kultiviert. Nach der Kultivierung besaß die Kulturbrühe einen ρ -Wert von 3,14 i 0,2. Diese Kulturbrühen wurden vereinigt und in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 308 mg eines Rohprodukts erhalten wurden. Die Analyse dieses Rohprodukts durch TLC ergab einen kleinen Flecken in der Nachbarschaft vom Rf-Wert von 0,05,
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einen mittelgroßen Flecken beim Rf-Wert von 0,30 (das Ausgangsmaterial) und einige andere kleine Flecken an anderen Stellen.
In derselben Weise wie in Beispiel 2 wurden 31 mg des dem Rf-Wert von 0,05 entsprechenden Fleckens isoliert. Das isolierte Produkt besaß die folgenden Eigenschaften:
TLC: Rp = 0,05
1 " Jl
NMR-Spektrum [60 MHz, CDCl3, <$ (ppm")]:
in der Nähe von 2,5 (2H, Methylengruppe benachbart zu Carbonyl) 3,10 (2H, Methylengruppe gebunden.an der Carboxylgruppe)
in der Nähe von 4,0 (IH, Methylproton, an das die Hydroxylgruppe gebunden ist)
6,20 (2H, Proton der Carboxylgruppe und der Hydroxylgruppe) 7,30 (IH, olefinisches Proton) "
IR-Spektrum (Flüssigkeitsfilm):
3300 cm (Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe) 1700 cm (Carboxylgruppe) 1690, 1635 cm (konjugiertes Enon)
Auf Grund der vorstehenden Spektroskop!schen Daten wurde dieses Produkt als das 2-Carboxymethyl-4~hydroxy-2-cyclopenten—1-on identifiziert.
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Claims (5)

Patentansprüche ? Λ ? R R 8 2
1.) Verfahren zur Herstellung von Hydroxycyclopentenonderivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der der Gattung .Aspergillus angehört, in einem Medium, enthaltend ein Cyclopentenonderivat der Formel (1)
worin R ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe und πι eine ganze Zahl von 1 bis 6
bedeuten, kultiviert, um in diesem Medium ein Hydroxycyclopentenonderivat der Formel (2)
(2) \-JJ - "
HO
worin R die vorstehende Bedeutung, hat und η gleich rn oder (m-2) ist,
zu bilden, und dieses dann sammelt.
2.) Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der .Mikroorganismus mindestens ein Stamm, ausgewählt unter Aspergillus niger, Aspergillus tamarii und Aspergillus flavus, ist.
3.) Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R in den Formeln (1) und (2) ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer Methylgruppe und einer Äthylgruppe.
4.) Verfahren zur Herstellung von Hydroxycyclopentenonderivaten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens einen Stamm, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Asper-
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gillus niger, Aspergillus tamarii und Aspergillus flavus, in einem Kulturmedium, enthaltend ein Cyclopentenonderxvat der Formel (1-a)
worin R' ausgewählt wird aus.der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer Methylgruppe und einer Äthylgruppe und
m eine ganze Zahl von 1 bis 6 darstellt,
kultiviert, um ein Hydroxycyclopentenonderivat der Formel (2-a)
0
\ If-(· CHp-^pj—COOR ' (2-a)
HO
worin R1 die bezüglich der Formel (1-a) vorstehend angegebene Bedeutung hat und
η gleich m oder (m-2) ist,
zu bilden, und dieses dann sammelt.
5.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß m in der Formel (1) oder (1-a) 6 ist und η in der Formel (2) oder (2-a) 6 oder 4 ist.
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