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Beschreibung
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ubichinon-10
aus Mikroorganismen, insbesondere aus einem Pilz der Art Aspergillus fumigatus.
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Ubichinon-10, ein Benzochinon der folgenden Formel
kommt in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen vor (vgl.
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R.L. Lester und F.L. Crane, The Journal of Biological Chemistry 234,
2169 (1959)). Als Elektronenüberträger ist es Bestandteil der Atmungskette sowie
bei einigen Organismen Bestandteil des Photosynthesesystems. Ubichinon-10 wird auch
beim Menschen gefunden und hat in neuerer Zeit als pharmazeutischer Wirkstoff, insbesondere
zur Therapie bestimmter Herzerkrankungen, Bedeutung gewonnen.
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Die Herstellung von Ubichinon-10 aus Mikroorganismen ist aus einer
Reihe von Veröffentlichungen an sich bekannt. So beschreiben die DE-OS 27 08 149
die Gewinnung aus Basidiomyceten der Gattung Sporidiobulus oder aus Oosporidium
und die EP-Anmeldung 0 040 536 aus Aureobasidium oder Trichosporon. Die DE-OS 27
47 510 und DE-OS 29 38 377 beschreiben besondere Kultivierungsverfahren für Hefen,
welche zu verbesserten Ubichinon-Ausbeuten führen sollen und in der DE-OS 28 34
952 ist ein Herstellungsverfahren aus Bakterien der Art Xanthomonas offenbart.
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Kommerziell erfolgt die Herstellung von Ubichinon-10 zur Zeit entweder
auf halbsynthetischem Wege oder durch die Gewinnung von biologisch gebildetem Ubichinon-10
aus Rinderherzen oder aus der Fermentation von Hefen der Gattung Rhodotorula. Die
zur Zeit angewendeten Verfahren sind zeitaufwendig und teuer und führen zu verhältnismäßig
geringen Ausbeuten. Auch bei der Fermentation von Hefen wird nur eine unzureichende
Produktivität, d.h. Ausbeute/Zeiteinheit erreicht.
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Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Ubichinon
zu schaffen, welches eine hohe Produktivität aufweist und gleichzeitig die Möglichkeit
liefert, preiswerte Ausgangsprodukte wie beispielsweise Melasse einzusetzen.
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Zur Lösung der Aufgabe wird ein Verfahren vorgeschlagen, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man einen Pilz der Art Aspergillus fumigatus in wäßrigem
Kulturmedium bei einem pH-Wert von 2 bis 7 unter aeroben Bedingungen kultiviert
und anschließend das Ubichinon aus dem Mycel gewinnt.
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Das Auftreten von Ubichinon-10 in Aspergillus fumigatus ist von N.M.
Packter und J. Glover, Biochem. Biophys.
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Acta. 58, 531-537 (1962) und von W.V. Lavate und Ronald Bentley, Archives
of Biochemistry and Biophysics 108, 287-291 (1964) beschrieben worden. Der Gehalt
des Pilzmycels an Ubichinon-10 ist jedoch verhältnismäßig niedrig und es ist bisher
nicht in Betracht gezogen worden, diesen mycelbildenden Pilz zur fermentativen Gewinnung
von Ubichinon-10 heranzuziehen.
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Überraschenderweise ist es erfindungsgemäß gelungen, das Mycelwachstum
des Pilzes so anzuregen, daß trotz eines verhältnismäßig niedrigen Ubichinon-10-Gehaltes
bezogen auf das Trockengewicht eine hohe Produktivität erreicht werden kann.
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Der Pilz kann in dem wäßrigen Kulturmedium angezogen werden, dessen
pH-Wert 2 bis 7, vorzugsweise 4 bis 5 beträgt und das über eine ausreichende Quelle
für organischen Kohlenstoff, anorganischen Stickstoff in Form von Ammoniumsalzen
und/oder Nitraten sowie Phosphat als Kaliumdihydrogenphosphat verfügt.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als Quelle
für organischen Kohlenstoff in dem Medium Melasse verwendet.
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Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von
20 bis 400C durchgeführt und das Kulturmedium sollte während der Inkubationszeit
in Bewegung gehalten werden, vorzugsweise durch Rühren mit einer Geschwindigkeit
von 200 bis 800 und in besonders bevorzugter Weise mit 600 UpM. Es ist ferner vorteilhaft,
eine zusätzliche Belüftung mit 0,4 bis 2, vorzugsweise mit 1 VVM (Volumenteile Luft/Fermentervolumen/Mi-
nute)
durchzuführen, wobei die Belüftungsrate im Verlauf der Fermentation beginnend mit
niedrigeren Werten auf die angegebenen Werte gesteigert wird.
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Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber
vorbekannten Verfahren zur Gewinnung von Ubichinon aus Bakterien oder Hefezellen
besteht darin, daß die zeitaufwendige und schwierige Abtrennung der Zellen von dem
Kulturmedium durch Zentrifugieren wegfällt. Das Pilzmycel kann durch einfache Filtration
des Fermentationsansatzes gewonnen werden.
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Auch die weitere Aufarbeitung des Mycels zur Gewinnung des reinen
Ubichinon-10 ist erheblich schneller und einfacher möglich, als dies bei den vorbekannten
Verfahren der Fall ist. Im Gegensatz zu den bisher verwendeten Mikroorganismen enthält
das Mycel von Aspergillus fumigatus keine weiteren lipophilen Farbstoffe, die zusammen
mit dem Ubichinon extrahiert werden und die bei bekannten Verfahren bei der anschließenden
chromatographischen Reinigung der Substanz stören.
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Vorzugsweise wird das Mycel nach dem Filtrieren getrocknet, gemahlen
und verseift. Der erhaltene Aufschluß wird mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel,
beispielsweise n-Hexan, extrahiert und der Extrakt eingeengt. Der Rückstand kann
mit Aceton extrahiert werden und nach Fällung der Phospholipide durch Kühlen auf
etwa 0 bis iOOC kann der Extrakt erneut eingeengt werden. Die abschließende Reinigung
der gewonnenen Substanz erfolgt chromatographisch.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich durch eine hohe Produktivität
aus, die durch die extrem hohe Wachstumsrate des Pilzmycels unter den gewählten
Fermen-
tationsbedingungen bewirkt wird. Es schafft ferner die Möglichkeit,
preiswerte landwirtschaftliche Abfallstoffe wie beispielsweise Melasse in einen
hochwertigen pharmazeutischen Wirkstoff umzuwandeln.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.
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Beispiel 1 Zusammensetzung des Kulturmediums: Bestandteile Gew.%
Malzextrakt 1 Hefeextrakt 0,4 Glucose 2 (NH4)2HP04 0,1 H20 bidest. ad 100 pH-Wert:
6,0 18 1 des oben angegebenen Kulturmediums wurden in einem 20 1 Labor-Rührfermenter
bei 121 0C sterilisiert. Nach Abkühlen auf etwa 350C wurde das Kulturmedium mit
250 ml einer Sporensuspension von Aspergillus fumigatus DSM 819 (10 Sporen/ml Arbeitsvolumen)
inokuliert. Die Fermentation wurde unter Rühren 48 Stunden lang bei 350C durchgeführt.
Die Rührgeschwindigkeit betrug 600 UpM und der Ansatz wurde mit 18 1 steriler Luft/Minute
(1 VVM) belüftet. Der pH-Wert des Kulturmediums wurde mit Ammoniumhydroxidlösung
in dem Bereich von 4 bis 5 gehalten.
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Nach Ablauf der Kultivierungsdauer wurde das gebildete Mycel durch
Filtrieren von dem Kulturmedium abgetrennt
und bei 400C im Umluftschrank
getrocknet. Die Ausbeute betrug 10 g Trockensubstanz/l Kulturmedium, die Produktivität
5 g/l/Tag.
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100 g des trockenen Mycels mit einem Ubichinon-10-Gehalt von 15 mg
wurden gemahlen und mit jeweils 2,0 1 10 %iger alkoholischer Pyrogallol-Lösung sowie
1,5 1 20 %iger Natronlauge vermischt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang am Rückfluß
gekocht und anschließend durch Zufügen von 6,500 1 destilliertem Wasser abgekühlt.
Sie wurde anschließend dreimal mit jeweils 1 1 n-Hexan extrahiert. Die vereinigten
Hexanphasen wurden bis zur Neutralität mit Wasser gewaschen, über Na2SO4 0 getrocknet
und bei 40 C und vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit 10 ml kaltem
Aceton extrahiert und der Extrakt zur Fällung der Phospholipide auf etwa 5 0C abgekühlt.
Nach etwa 120 Minuten wurde der Extrakt zentrifugiert und der Überstand bei 400C
eingeengt. Es wurde ein gelber Rückstand erhalten (620 mg), der in 5 ml n-Hexan
gelöst wurde. Die Lösung wurde zur weiteren Reinigung auf Dünnschichtchromatographie-Kieselgelplatten
aufgetragen, wobei als Laufmittel Hexan/ Ethylacetat (95:5) verwendet wurde. Die
Ubichinon-Fraktion wurde mit Ethylacetat eluiert und bei 400C eingeengt. Es wurden
auf diese Weise 11 mg eines gelben Öls erhalten, aus dem durch Kristallisation aus
Ethanol 5 mg reine Ubichinon-10-Kristalle gewonnen wurden.
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Die Identifizierung der Substanz erfolgte durch HPLC sowie Massenspektroskopie.
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Beispiel 2 Die Fermentation wurde in gleicher Weise durchgeführt
wie in Beispiel 1 beschrieben, mit dem Unterschied, daß folgendes Kulturmedium verwendet
wurde: Bestandteile Gew.
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Saccharose 3 NH4N03 0,5 MgSO4.7H20 0,06 KH2PO4 0,4 Hefeextrakt 0,1
H20 bidest. ad 100 pH-Wert: 6,0 Es wurde nach 27 Stunden eine Trockenmycelausbeute
von 16,3 g/l Kulturmedium erhalten, die Produktivität betrug 14,5 g/l/Tag. 100 g
Trockenmycel mit einem Ubichinon-l0-Gehalt von 32 mg wurden wie in Beispiel 1 angegeben
aufgearbeitet.