DE2121397A1 - Production of alkaline protease from bacillus licheni - formis - Google Patents
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Abstract
Description
Verfahren zur Herstellung von Protease durch Kultivierung von Bakterien Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Protease durch Kultivierung von Bacillus licheniformis auf einem geeigneten Kulturmedium, und anschließende Abtrennung der alkalischen Protease aus der Kulturlösung. Process for the production of protease by culturing bacteria The invention relates to a method for producing an alkaline protease by cultivating Bacillus licheniformis on a suitable culture medium, and then separating the alkaline protease from the culture solution.
ßs izt bereits allgemein bekannt, Bakterien der Art Bacillus subtilis für die IIerstellung einer alkalischen Protease zu verwenden, die ihre optimale Aktivität bei einem hohen pH-Wert aufweist. Es wird hierzu auf die folgenden Literaturstellen verwiesen: das Buch "Nature", 1O, 802 (1952) von N. Ottessen et al; "Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan", 33, 9 (1959) von Fukumoto et al; "Agr. Biol. Chem.", )0, 1261 (1966) von Fukumoto et al; oder "J. Biochem.", 45, 251 (1958) von Hagihara et-al. Eine derartige-alkalische Protease findet ausgedehnte Verwendung in der Nahrungsmittel industrie und in anderen Industrien. Es wird jedoch hier darauf hingewiesen, dar die alkalische Protease unter Verwendung der Stämme von Bacillus subtilis hergesteift wird.ßs izt already well known, bacteria of the species Bacillus subtilis to use for the production of an alkaline protease that is its optimal Has activity at a high pH. For this, reference is made to the following literature referenced: the book "Nature", 10, 802 (1952) by N. Ottessen et al; "Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan ", 33, 9 (1959) by Fukumoto et al;" Agr. Biol. Chem. ", ) 0, 1261 (1966) to Fukumoto et al; or "J. Biochem.", 45, 251 (1958) by Hagihara et al. Such an alkaline protease has found extensive use in food industry and in other industries. However, it is pointed out here the alkaline protease was synthesized using the strains of Bacillus subtilis will.
Es wurde nunmehr die Aktivität der Enzyme von verschiedenen Bakterienarten untersucht, die aus dem Boden gewonnen wurden.It was now the activity of the enzymes from different types of bacteria investigated that were extracted from the soil.
Hierbei wurde festgestellt, daß gewisse Bakterien ein starkes Vermögen zur Erzeugung von Protease besitzen. Die Bakterien wurden auf ihre morphologischen, physiologischen und bakteriologischen Eigenschaften untersucht. Hierbei wurden die Verfahren verwendet, die in dem Buch "Bergeyrs Manual of Determinative Bacteriology", 7. Auflage, angegeben sind. Es wurde gefunden, daß es sich um Bakterien handelte, die zur Art Bacillus licheniformis gehörten.It was found that certain bacteria have a strong capacity to generate protease. The bacteria were based on their morphological, investigated physiological and bacteriological properties. Here were the Methods used in the book "Bergeyrs Manual of Determinative Bacteriology", 7th edition, are indicated. It was found that they were bacteria which belonged to the species Bacillus licheniformis.
I)urch R.W, Bernlohr wird bereits in dem Buch tJ. Biol.Chem." 239, 538 (1964) von einer Protease berichtet, die durch Bacillus lichenisformis gebildet wurde. Es wird dabei festgestellt, daß die Protease nicht durch Athylendiamintetraacetat (EDTA) beeintrachtigt wurde, daß sie bezüglich ihrer thermischen Stabilität der durch Bacillus subtilis erzeugten Protease ähnlich war, und dad sie ihre Aktivität in dem weiten pH-TJertbereich von 6,o bis 10,0 entfaltet. Der optimale pH- ert wurde jedoch nicht angegeben0 Von M. Damodaran et al wurde in "Biochem. Biophys. Acta", 17, 99 (1955) von einem Enzym berichtet, das vom Bacillus licheniformis abgetrennt worden war.I) urch R.W, Bernlohr is already mentioned in the book tJ. Biol. Chem. "239, 538 (1964) reported a protease produced by Bacillus lichenisformis became. It is found that the protease is not caused by ethylenediaminetetraacetate (EDTA) was impaired in terms of their thermal stability of the was similar to protease produced by Bacillus subtilis, and their activity unfolds in the wide pH range of 6.0 to 10.0. The optimum pH was but not stated0 M. Damodaran et al in "Biochem. Biophys. Acta", 17, 99 (1955) reported on an enzyme that was separated from Bacillus licheniformis had been.
In diesem Buch wurde festgestellt, daß das Enzym aus Protease mit einem optimalen pH-Wert von 7,4 und aus Peptidase bestand.In this book it was found that the enzyme made protease with an optimal pH of 7.4 and consisted of peptidase.
Durch F. F. Hall et al wurde schließlich in dem Buch "ArchO Eiochem. Biophys.", 114, 145 (1966) von einem Enzym berichtet, das vom Bacillus licheniformls abgetrennt worden war. Die autoren stellten fest, da das Enzym aus zwei Arten Protease und einer Art Peptidase bestand, und daß die Protease in einem Caseinlculturmedium eine optimale Aktivität bei pH-retten von 7 bis 8 aufwies.Finally, by F. F. Hall et al. In the book "ArchO Eiochem. Biophys. ", 114, 145 (1966) reported on an enzyme derived from Bacillus licheniformls had been severed. The authors found that the enzyme is made up of two types of protease and a kind of peptidase, and that the protease was in a casein culture medium exhibited optimal activity at pH saves from 7 to 8.
Die Protease, die durch die Erfinder vom Bacillus licheniformis abgetrennt und identifiziert wurde, unterscheidet sich von der Protease, von der in den obigen Literaturstellen berichtet wurde, bezüglich ihrer Eigenschaften und insbesondere ihres optimalen pH-Werts, der ein wichtiger Faktor für die ausnutzung der Wirkung der Protease ist, wenn sie in der Praxis zur Verwendung gelangt. Die Protease, die vom Bacillus licheniformis erhalten wurde, und die durch die Erfinder gefunden wurde, zeigt ihre optimale aktivität bei einem pH-Wert im Bereich von 10 bis 10,5, und zwar sogar dann, wenn Casein, Hämoglobin oder Albumin als Substrat verwendet wird, und aus diesem Grunde ist es klar, daß diese Protease eine alkalische Protease ist. So wird also gemäß der Erfindung eine neue alkalische Protease vorgeschlagen, die durch Kultivierung von Stämmen, die zur Art Bacillus licheniformis gehören, erhalten wird. Die neue alkalische Protease hat viele Verwendungen, wie z.B. bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, bei der Verbesserung von Meerprodukten, Häuten und Nahrungsmitteln, in der Textilindustrie und bei der Herstellung von tlaschprodukten und auch in anderen industriellen Bereichen.The protease separated by the inventors from Bacillus licheniformis and identified is different from the protease used in the above References have been reported regarding their properties and in particular their optimal pH value, which is an important factor for the utilization of the effect is the protease when it comes to practical use. The protease that obtained from Bacillus licheniformis, and which was found by the inventors, shows their optimal activity at a pH in the range from 10 to 10.5, and even if casein, hemoglobin or albumin are used as a substrate, and therefore it is clear that this protease is an alkaline protease. Thus, according to the invention, a new alkaline protease is proposed which by cultivating strains belonging to the species Bacillus licheniformis will. The new alkaline protease has many uses, such as in manufacture of food, in the improvement of sea products, hides and foodstuffs, in the textile industry and in the manufacture of tlash products and also in others industrial areas.
Gemäß der Erfindung kann die alkalische Protease dadurch hergestellt werden, daß man Bakterien des Stammes Bacillus licheniformis (FERM-P Nr. 387, ATCC Nr. 21471) auf herkömmlichen Kulturmedien kultiviert, wobei sich die genannte alkalische Protease im erhaltenen Kulturmedium ansammelt, und daß man hierauf die alkalische Protease aus dem Kulturmedium in an sich bekannter Weise gewinnt.According to the invention, the alkaline protease can be produced thereby that bacteria of the strain Bacillus licheniformis (FERM-P No. 387, ATCC No. 21471) cultivated on conventional culture media, said alkaline Protease accumulates in the culture medium obtained, and that the alkaline Protease wins from the culture medium in a manner known per se.
Der verwendete Stamm wurde sowohl beim Fermentation Reseach Institute, Agency of Industrial Science & Technology in Tokio (Hinterlegungs-Nr. FERM - P Nr. )87) als auch bei der American Type Culture Collection in Rockville-(ATCC Nr. 21471) hinterlegt.The strain used was obtained from the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology in Tokyo (deposit number FERM - P No.) 87) as well as at the American Type Culture Collection in Rockville- (ATCC No. 21471).
Die folgenden Komponenten werden im Kulturmedium verwendet: Glukose und Stärke als KohleSstoffquelle; Pepton und Casein als Stickstoffquelle; nattirliche Nährstoffe, wie z.B. Hefeextrakte und Fleischextrakte; -sowie anorganische Salze. Es können aber auch ein Extrakt eines entfetteten Sojabohnenkuchens, Reiskleie und Maiskleie als natürliches Kulturmedium verwendet werden.The following components are used in the culture medium: glucose and starch as a carbon source; Peptone and casein as nitrogen sources; natural Nutrients such as yeast extracts and meat extracts; -as well as inorganic salts. But it can also be an extract of a defatted soybean cake, rice bran and Corn bran can be used as a natural culture medium.
Es wird bevorzugt, eine Kulturtemperatur von 30 bis 35°C bei einem pH von ungefähr 7 unter Belüftung 40 bis 72 Stunden lang aufrechtzuerhalten, um die maximal aktive Protease zu erzielen. Die maximale Aktivität kann bei 55 0C während eines Zeitraums bis zu 40 Stunden erhalten werden.It is preferred to have a culture temperature of 30 to 35 ° C at a Maintain pH of about 7 with aeration for 40 to 72 hours to to achieve the maximally active protease. The maximum activity can occur at 55 0C during a period of up to 40 hours.
Die alkalische-Protease, die sich in der Kulturlösung ansammelt, wird dadurch gereinigt, daß aufeinanderfolgend die in der Folge angegebenen Schritte ausgeführt werden: Entbakterisierung, Konzentrierung, Aussalzung, Dialyse, Entfärburig,-Kolonnenchromatographie unter Verwendung einer Ionenaustauschcellulose und eines Ionenaustausch-Sephadex, und Gelfiltrierung.The alkaline protease that accumulates in the culture solution will purified by sequentially following the steps given below carried out: debacterization, concentration, salting out, dialysis, decolorizing, column chromatography using an ion exchange cellulose and an ion exchange Sephadex, and gel filtration.
Nun werden die Zeichnungen erläutert.The drawings will now be explained.
Fig. 1 zeigt das Chromatogramm, welches dadurch erhalten wird, daß die Kulturlösung einer Entbakterisierung, Aussalzung, Dialyse und Entfärbung unterworren wird, um eine gereinigte alkalische Protease einer Kolonnenchromatographie durch Carboxymethylcellulose unterworfen wird. In Fig. 1 zeigt die Kurve 1 die Proteinkonzentration, die Kurve 2 zeigt die Aktivität der Protease, und die gerade Linie 3 zeigt die Natriumchloridkonzentration. Wie in Fig. 1 gezeigt ist, ist die Aktivität der Protease in der Spitzenfraktion C konzentriert. Die Aktivität einer kleinen Proteasemenge kann in der Fraktion D beobachtet werden. Die Protease, die in der Fraktion C konzentriert ist, ist die alkalische Protease von Bacillus licheniformis, die durch die Erfinder gefunden wurde. Es wurde im übrigen keine Fraktion gefunden, die die Proteaseaktivität wie in Fig. 1 zeigt. Diese Tatsache läßt erkennen, daß die Reinigung der rohen Protease leicht durchgeführt werden kann und daß durch die Erfindung in vorteilhafter Weise alkalische Protease hergestellt werden kann.Fig. 1 shows the chromatogram obtained by subject the culture solution to debacterization, salting out, dialysis and decolorization is carried out to a purified alkaline protease by column chromatography Carboxymethyl cellulose is subjected. In Fig. 1, curve 1 shows the protein concentration, curve 2 shows the activity of the protease and straight line 3 shows the sodium chloride concentration. As shown in Fig. 1, the activity of the protease is in the peak fraction C concentrated. The activity of a small amount of protease can be found in fraction D to be observed. The protease concentrated in fraction C is the alkaline protease from Bacillus licheniformis found by the inventors became. Incidentally, no fraction was found which had the protease activity as in Fig. 1 shows. This fact suggests that the purification of the crude protease can be easily carried out and that by the invention in an advantageous manner alkaline protease can be produced.
Die Charakteristiken der alkalischen Protease, die gemäß der Erfindung hergestellt worden ist, sind in den Figuren 2 bis 5 gezeigt. Fig. 2 zeigt im Zusammenhang zwischen der Aktivität der alkalischen Protease und dem pH-Wert. Wie in Fig. 2 zu sehen ist, liegt der optimale pH-Wert im Bereich von 10 bis 10,5, wenn Casein als Substrat verwendet wird, und dieser optimale pH-Wert ändert sich auch nicht, wenn Hämoglobin oder Albumin als Substrat verwendet wird. Fig. 3 zeigt den Zusammenhang zwischen der Aktivität der alkalischen Protease und der Temperatur. In Fig. 3 zeigt die Kurve 1 die Aktivität der alkalischen Protease, wenn das Substrat Calciumacetat in einer Menge von 5 x 10113 Mol enthält. Die Kurve 2 zeigt die Aktivität der alkalischen Protease, wenn das Kulturmedium kein Calciumacetat enthält. Die Fig. 5 zeigt, daß die optimale Kulturtemperatur bei 600 C zu finden ist und daß die Protease bei 0 80 C deaktiviert wird. Die Aktivität der Protease wird bemerkenswert erhöht, wenn Calciumacetat im Reaktionsgemisch enthalten ist, wie dies durch die Kurve 1 dargestellt ist, aber die optimale Kulturtemperatur wird nicht wesentlich verändert, Die Aktivität der alkalischen Protease wurde durch ein Verfahren getestet, das im-Buch "Method for the Investigation of Enzyme", Band 2, Seite 240 von Hagihara (gedruckt durch Asakura Bookshope) angegeben ist. Die Protease wurde mit einer Lösung, die Cäsein enthielt; bei einem pH-Wert von 10,0 und bei einer~Temperatur von 59 C gemischt. Das Casein wurde in Tyrosin hydrolisiert und das nicht-hydrolisierte Casein wurde unter Verwendung des Fällungsmittels B ausgefällt, bei welchem es sich um ein Gemisch aus 0,11 Mol CC13COOH, 0,22 Mol CH5COONa und 0,3) Mol CH3COOH handelt. Da's Filtrat wurde auf die Lichtabsorption bei 257 v geprüft. Die Aktivität der Protease wird durch die "Einheit" angegeben, bei der es sich um die Menge Tyrosin ( ) handelt, die in einer Minute gebildet wird.The characteristics of the alkaline protease produced according to the invention is shown in Figures 2-5. Fig. 2 shows in connection between alkaline protease activity and pH. As in Fig. 2 too can be seen, the optimal pH is in the range of 10 to 10.5 when using casein Substrate is used, and this optimal pH does not change either, though Hemoglobin or albumin is used as the substrate. Fig. 3 shows the relationship between alkaline protease activity and temperature. In Fig. 3 shows curve 1 shows the activity of alkaline protease when the substrate is calcium acetate in an amount of 5 x 10 113 moles. Curve 2 shows the activity of the alkaline Protease if the culture medium does not contain calcium acetate contains. the Fig. 5 shows that the optimal culture temperature can be found at 600 C and that the protease is deactivated at 080C. The activity of the protease becomes remarkable increased when calcium acetate is included in the reaction mixture, as indicated by the Curve 1 is shown, but the optimum culture temperature does not become essential altered, The activity of the alkaline protease was tested by a method that in the book "Method for the Investigation of Enzyme", Volume 2, page 240 by Hagihara (printed by Asakura Bookshope) is specified. The protease was treated with a solution which contained cesein; at a pH of 10.0 and at a ~ temperature of 59 C mixed. The casein was hydrolyzed into tyrosine and the non-hydrolyzed Casein was precipitated using precipitant B, which is is a mixture of 0.11 mol of CC13COOH, 0.22 mol of CH5COONa and 0.3) mol of CH3COOH. Da's filtrate was checked for light absorption at 257 volts. The activity of the Protease is indicated by the "unit", which is the amount of tyrosine () that is formed in one minute.
Fig. 4 zeigt die thermische Stabilität der alkalischen Protease.Fig. 4 shows the thermal stability of the alkaline protease.
In Fig. 4 zeigt die Kurve 1, daß die Protease bei einer Temperatur bis zu 550c 15 Minuten lang stabil ist, wenn das Reaktiongemisch Calciumacetat in ether Menge von 5 x 10 1 Mol enthält und ein pH von 10,0 verwendet wird. Die Kurve 2 zeigt, daß die Protease bei einer Temperatur bis zu 500C stabil ist und daß die Aktivität der Protease bei einer Temperatur oberhalb 5500 rasch verringert wird, wenn das Kulturmedium kein Calciumacetat enthält, aber im übrigen unter den gleichen Bedingungen wie bei Kurve 1 gehalten wird.In Fig. 4, curve 1 shows that the protease at a temperature is stable for up to 550c for 15 minutes when the reaction mixture contains calcium acetate in ether amount of 5 x 10 1 mol and a pH of 10.0 is used. The curve 2 shows that the protease is stable at a temperature up to 500C and that the Activity of the protease is rapidly reduced at a temperature above 5500, if the culture medium does not contain calcium acetate, but otherwise among the same Conditions as in curve 1 is maintained.
Fig. 5 zeigt den Zusammenhang zwischen der Aktivität der alkalischen Protease und dem pH-Wert, wenn das Reaktionsgemisch 22 Stunden auf 30°C gehalten wird. Die Kurve 1 zeigt die Aktivität der Protease, wenn das Reaktionsgemisch Calciumacetat in einer Menge von 5 x 10 3 Mol enthält, und die Kurve 2 zeigt die Aktivität der Protease, wenn das Reaktionsgemisch kein Calciumacetat enthält. Aus den Kurven 1 und 2 geht hervor, daß die Protease bei einem pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 11,0 stabil ist.Fig. 5 shows the relationship between the activity of the alkaline Protease and the pH when the reaction mixture is kept at 30 ° C for 22 hours will. Curve 1 shows the activity of the protease when the reaction mixture is calcium acetate in an amount of 5 x 10 3 mol, and curve 2 shows the activity of Protease if the reaction mixture does not contain calcium acetate. From curves 1 and Figure 2 shows that the protease is effective at a pH in the range of 5.0 to 11.0 is stable.
Die Aktivität der alkalischen Protease der vorliegenden Erfindung wird durch Schwermetallionen, wie z, B. Hg- und Cu-Ionen und insbesondere durch Oxydationsmittel, wie z.B.The activity of the alkaline protease of the present invention is by heavy metal ions, such as, for example, Hg and Cu ions and in particular by Oxidizing agents, e.g.
Jod oder Diisopropylfluorophosphat (DEP) und Kartoffelinhibitor (potato-inhibitor) beeinträchtigt. Die Aktivität der alkalischen Protease wird jedoch nicht durch Reddktionsmittel, wie Cystein, Chelierungsmittel wie EDTA, Monojodessigsäure und einem SH-Reagenz beeinträchtigt.Iodine or diisopropyl fluorophosphate (DEP) and potato inhibitor impaired. However, the activity of the alkaline protease is not affected by reducing agents, such as cysteine, chelating agents such as EDTA, monoiodoacetic acid and an SH reagent impaired.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.The invention is illustrated by the following examples.
Beispiel 1 Bacillus licheniformis (FERM-P 387, ATCC Nr. 21471) wurde in 1 1 eines wäßrigen Kulturmediums (pH = 7,2) inkubiert, welches 1 ß Gluccose, 1 ffi Pepton, o,i ç Hefeextrakt, 0,2 % Natriumchlorid, 0,2 % Calciumchlorid, 0,05 % Kaliumphosphat, 0,01 % Magnesiumsulfat und 0,001 % von jeweils Eisen(II)-sulfat und Mangansulfat enthielt. Der Bacillus licheniformis wurde unter Schütteln bei 50°C 72 Stunden lang kultiviert. Das erhaltene Kulturmedium enthielt die alkalische Protease, die eine Aktivität von 1.930 Einheiten je ml aufwies. Das Kulturmedium wurde durch Verwendung einer Zentrifuge oder eines Filters entbakterisiert, und dann wurde das Filtrat mit einer zu 80 ffi gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat gemischt, und das Gemisc; wurde ausgesalzt und dialysierte Die dialysierte Lösung wurde durch eine Kolonne hindurchgeführt, die mit Duolite A-2-Harz (oder einem Anionenaustauschharz) bepackt war, um Färbestoffe abzutrennen. Die entfärbte Lösung wurde einer Kolonnenchromatographie unterworfen, wobei Carboxymethylcellulose und DEAE-Sephadex verwendet wurde. Hierauf wurde die rohe Protease durch. das Gelfilblerungsvelfahren unter Verwendung von Sephadex-75 abgetrennt, und die rohe Protease wurde durch ein Ausfällungsverfahren behandelt, wobei Aceton verwendet wurde, um die gereinigte Protease herzustellen. Die gereinigte Protease wurde getrocknet und gewogen. Es wurden 47 mg getrocknete Protease mit einer Aktivität von 4.110 Einheiten je mg erhalten.Example 1 Bacillus licheniformis (FERM-P 387, ATCC No. 21471) incubated in 1 1 of an aqueous culture medium (pH = 7.2), which contains 1 ß gluccose, 1 ffi peptone, o, i ç yeast extract, 0.2% sodium chloride, 0.2% calcium chloride, 0.05 % Potassium phosphate, 0.01% magnesium sulphate and 0.001% of each ferrous sulphate and manganese sulfate. The Bacillus licheniformis was found with shaking Cultivated at 50 ° C for 72 hours. The culture medium obtained contained the alkaline one Protease, the one Had activity of 1,930 units per ml. The culture medium was debacterized by using a centrifuge or a filter, and then the filtrate was treated with an 80 ff solution of ammonium sulfate mixed, and the mix; was salted out and dialyzed. The dialyzed solution was passed through a column lined with Duolite A-2 resin (or an anion exchange resin) was packed to separate dye. The decolorized solution was subjected to column chromatography using carboxymethyl cellulose and DEAE-Sephadex. On that was the crude protease by. the gel filtering level method using Sephadex-75 separated and the crude protease was precipitated by a precipitation process treated using acetone to produce the purified protease. The purified protease was dried and weighed. 47 mg were dried Protease obtained with an activity of 4,110 units per mg.
Beispiel 2 Bacillus licheniformis des in Beispiel 1 angegebenen Stammes wurde in 1 1 eines Kulturmediums (pH = 7,2) inkubiert, welches einen Extrakt enthielt, der dureh Extrahieren von etfettetem Sojabohnenkuchen mit einer Lösung, die 4 ß Alkali und 1 % lösliche Stärke enthielt, erhalten worden war. Der Bacillus licheniformis wurde 40 Stunden lang bei 350 C unter Belüftung und Rühren kultiviert. Das erhaltene Kulturmedium enthielt die alkalische Protease, die eine Aktivität von 4.400 Einheiten je ml aufwies. Das Kulturmedium wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelte wobei 1,07 g der gereinigten Protease erhalten wurde die eine Aktivität von 4.110 Einheiten/ mE aufwiesExample 2 Bacillus licheniformis of the strain indicated in Example 1 was incubated in 1 l of a culture medium (pH = 7.2) which contained an extract, by extracting fat soybean cake with a solution that is 4 ß Alkali and 1% soluble starch. The Bacillus licheniformis was cultured for 40 hours at 350 ° C. with aeration and stirring. The received Culture medium contained the alkaline protease, which had an activity of 4,400 units per ml. The culture medium was treated in the same manner as in Example 1 whereby 1.07 g of the purified protease was obtained which had an activity of 4,110 Units / mU
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