DE1940488A1 - Process for the production of protease by culturing bacteria - Google Patents
Process for the production of protease by culturing bacteriaInfo
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Description
GOSO SHUSKE KABUSHIEI KAISHA, Tokiog JapanGOSO SHUSKE KABUSHIEI KAISHA, Tokiog Japan
Verfahren zur Herstellung von Protease durch Kultivierung von BakterienProcess for the production of protease by culturing bacteria
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Protease durch Kultivierung von Bacillus lichenifoxmis auf einem geeigneten Kulturmedium ;und ansohliessende Abtrennung der alkalischen Protease aus der KulturlösungoThe invention relates to a method of manufacture an alkaline protease by cultivating Bacillus lichenifoxmis on a suitable culture medium; Separation of the alkaline protease from the culture solution o
Es ist bereits allgemein bekannt, Bakterien der Art Bacillus subtilis für die Herstellung einer alkalischen Protease zu verwenden, die ihre optimale Aktivität bei einem hohen pH-Wert amiweisto Es wird hierzu auf die falgenden Literaturstellen verwiesen: das Buch "Nature··, J1IO, 802 (1952) von N0 Ottesssn et al? MJournal of the Agricultural Chemical Society of Japan", 22.» S-(1959) von Fukumoto et al| "Agr» Biol» Gbemo w, 2P.» 1261 (1966) von Pukumoto et al* oder "J. Biochem.f, ££, 251 (1958) von Hagihara et al» Eine derartige alkalische Protease findet ausf gedehnte Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie und in anderen Industrien,, Es wird jedoch hier darauf hingewiesen« daß die alkalische Protease unter Verwendung der Stämme von Bacillus subtilie _ hergestellt wird·It is already generally known to use bacteria of the species Bacillus subtilis for the production of an alkaline protease amiweisto their optimal activity at a high pH, it is this, please refer to the falgenden references: the book "Nature ··, J 1 IO , 802 (1952) by N 0 Ottesssn et al? M Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan ", 22." S- (1959) by Fukumoto et al | "Agr» Biol »Gbem o w , 2P.» 1261 (1966) by Pukumoto et al * or "J. Biochem. F, ££, 251 (1958) by Hagihara et al "One such alkaline protease has extensive use in the food and other industries" However, it is pointed out here "that the alkaline protease using the strains of Bacillus subtle _ is produced
Ee wurde nunmehr die Aktivität der Enzyme von verschiedenen Bak-The activity of the enzymes of various bacteria has now been
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terienarten untersucht, die aus dem Soden gewonnen wurden« Hierbei wurde festgestellt, daß gewisse Bakterien ein starkes Yerni©*gen aur Erzeugung von Protease besitzen. Die Bakterien wurden auf ihre morphologischen, physiologischen und bakteriologischen Eigenschaften untersucht,, Hierbei wurden die Verfahren verwendet, die in dem Buch "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7» Auflage j, angegeben sind«. Es wurde gefunden, daß es sich um Bakterien handelte, die zur Art Bacillus liehenifonnis gehörten,,investigated species obtained from the sod. It was found that certain bacteria have a strong yernosis aur to generate protease. The bacteria were on their morphological, physiological and bacteriological properties were examined, the methods used were the in the book "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7 "Edition j, are given". It was found to be Bacteria that belonged to the species Bacillus boronifonnis,
Durch Rö Wo Bernlohr nird bereits in de© Buch *J* Biol· Chem»", Ü22, 538 (1964) von einer Protease berichtet, die durch Bacillus liehenisformis gebildet wurde. Es wird dabei festgestellt, daß die Protease nicht durch Äthylendiamintetraaeetat (BDTA) beeinträchtigt wurde, daß sie bezüglich ihrer thermischen Stabilität der durch Bacillus subtilis erzeugten Protease ähnlich war, und daß sie ihre Aktivität in dem weiten pH-¥ertbereich von 6,0 bis 10,0 entfaltet« Der optimale pH-Wert wurde Jedoch nicht angegebene ¥on M0 Damodaraa et al wurde in "Blechern» Biophys«, Acta", λ£, 99 (1955) von einem Enzym berichtet, das vom Bacillus licheniformis abgetrennt worden war« In diesem Buch wurde festgestellt, daß . das Enzym aus Protease mit einem optimalen pH-Wert von 7,4 und aus Peptidase bestand«. Durch ?. ?· Hall et al wurde schließlich in dem Buch "Arch» Biochem0 Blophys<,B, II4« 145 (1966) von einem Ensym berichtet, das vom Bacillus licheniformis abgetrennt worden war ο Die Autoren stellten fest, daß das Enzym aus swei Arten Protease und einer Art Peptidaae bestand, und daß die Protease . in einem Caseinkulturmedium eine optimale Aktivität bei pH-Werten von 7 bis 8 aufwieseRö Wo Bernlohr has already reported in de © Buch * J * Biol · Chem »", Ü22, 538 (1964) of a protease that was formed by Bacillus liehenisformis. It was found that the protease was not caused by ethylenediaminetetraate (BDTA ) that it was similar in terms of its thermal stability to the protease produced by Bacillus subtilis, and that it develops its activity in the wide pH range from 6.0 to 10.0. However, the optimum pH was not specified ¥ on M 0 Damodaraa et al, "Acta Tinny" Biophys "" λ £, 99 (1955) reported by an enzyme, which had been separated from Bacillus licheniformis "in this book, it was found that. the enzyme from protease with an optimal pH of 7.4 and consisted of peptidase «. By?.? · Hall et al was finally reported in the book" Arch "Biochem 0 Blophys <, B , II4 " 145 (1966) by an Ensym, which had been separated from the Bacillus licheniformis ο The authors presented found that the enzyme consisted of two types of protease and one type of Peptidaae, and that the protease. exhibited optimal activity at pH values of 7 to 8 in a casein culture medium
Die Protease, die durch die Erfinder vom Bacillus lioheniformis abgetrennt und identifiziert wurde, unterscheidet eich von der Protease, von der ia den obigen LiterattarstaLlen berichtet wurde, bezüglich ihrer Eigenschaften und insbesondere ihres optimalenThe protease produced by the inventor from Bacillus lioheniformis has been separated and identified, differentiates eich from the Protease, which has been reported in the above literature, with regard to their properties and especially their optimal
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pH-Werts, der ein wichtiger Faktor für die Ausnutzung der Wirkung der Protease ist, wenn sie in der Praxis sur Verwendung.gelangte Die Protease, die vom Bacillus lieheniformis erhalten wurde, und die durch die Erfinder gefunden wurde, aeigt ihre optimale Akti* vi tat la ei einem pH-Wert im Bereich von 10-bis 1O9 5, und zwar sogar dann, wenn Casein, Hämoglobin, oder Albumin als Substrat verwendet wird, und aus diesem Grunde ist es klar, daß diese Protease eine alkalische Protease ist. So wird also gemäß der Erfindung eine neue alkalische Protease vorgeschlagen, die durch Kultivierung von Stämmen, die sur Art Baoillus lichenifonais gehören t erhalten wirdo Die neue alkalische Protease hat viele Vet^wendtanjieru wie s„E, bei er Herstellung von Hahruagsmitteln, bei der Verbesserung von Meerprodukten, Häuten und Nahrungsmitteln, in der lextilindustrie und bei der Herstellung von Waschprodukten und auch in anderen industriellen Bereichen.,pH value, which is an important factor in exploiting the action of the protease when it is used in practice. The protease obtained from Bacillus lieheniformis and found by the inventors shows its optimal activity It has a pH in the range of 10-1O 9 5 even when casein, hemoglobin, or albumin is used as the substrate, and for this reason it is clear that this protease is an alkaline protease. Thus the invention is proposed according to a novel alkaline protease wirdo t obtained by cultivation of strains sur Art Baoillus lichenifonais include the new alkaline protease has many Vet ^ wendtanjieru as s "E in he manufacturing Hahruagsmitteln, in improving of sea products, hides and foodstuffs, in the textile industry and in the manufacture of laundry products and also in other industrial areas.,
Gemäß der Erfindung kann die alkalische Protease dadurch herge=> stellt werden, daß raan die Stämme von Bacillus lieheniformis., die durch die Erfinder gefunden und identifiziert wurden, auf einem herkömmlichen flüssigen Kulturmedium unter Belüftung kultiviert und dann die erhaltene rohe Protease in der gleichen Weise wie bei den herkömmlichen Verfahren reinigteAccording to the invention, the alkaline protease can thereby herge => that the strains of Bacillus lieheniformis., found and identified by the inventors are cultured on a conventional liquid culture medium with aeration, and then the obtained crude protease in the same Cleaned way like the traditional method
Die folgenden Komponenten werden im Kulturmedium verwendet: Glukose und Stärke als Kohlenstoff quelle; Pepton und Casein als Stickstoffquelle; natürliche Hährstoffe, wie \zoBo Hefeextrakte und Fleischextrakt«; sowie anorganische Salsa„ Ss können aber auch ein Extrakt eines entfetteten Sojabohnenkuehens, Reiskleie und Maiskleie als natürliches Kulturmedium verwendet werdön& The following components are used in the culture medium: glucose and starch as a carbon source; Peptone and casein as nitrogen sources; natural Hährstoffe as \ z o B o yeast extracts and meat extract "; as well as inorganic salsa, an extract of defatted soybean cows, rice bran and corn bran can also be used as a natural culture medium &
Es wird bevorzugt t eine Kulturtemperatur von 30 bis 35°C bei einem pH von ungefähr 7 unter Belüftung 40 bis 72 Stunden lang aufrechtzuerhalten, um die maximal aktive Protease au ersieleno DieIt is preferred t a culture temperature of 30 to 35 ° C at a pH of about 7 with aeration 40 to 72 hours to maintain long, except for the maximum active protease ersielen o
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maximale Aktivität kann bei 35°C während eines· Zeitraums "bis au 40 Stunden erhalten werden«maximum activity can be at 35 ° C for a "period" up to au 40 hours will be received «
Die alkalische Proteaes* die sich in der EuI tür lösung ansammelt, wird dadurch gereinigt „ daß aufeinanderfolgend die in der Folge angegebenen Schritte ausgeführt wer&ens Biifbakteri-sierung, Konzentrierung» Aussalsungj, Dialyse, Entfärbung^· Kolonnenchromslibgraphie unter Verwendung einer ionenaustausehcelltilose und eiiies Tonenaustausch-SephadeZj, und Gelfiltrierung .The alkaline Proteaes * accumulated in the EuI door solution is purified by "that sequentially executed the steps in the sequence Who & ens Biifbakteri-tion, concentration" Aussalsungj, dialysis, discoloration ^ · Kolonnenchromslibgraphie using a ionenaustausehcelltilose and eiiies ion exchange-SephadeZj , and gel filtration.
3Jun werden die Zeichnungen erläuterte3Jun the drawings are explained
Figo 1 zeigt das Ghroiaatograrasa9 welohes dadurch erhalten daß die EuLturlösung einer EntbakterißierungP Aussalanng, Dialyse und Entfärbimg imterworfen wird» um eine gereinigte alkalische Protease, herzustellen, und daß fiaim hierauf die gereinigte alkalische Protease einer Eolonnenehrosatographie duroh CärboxyraetJiylcellulose unterworfen wirdc In Figo 1 seigt die K\wv& i/di,©..-■.-. ; Proteinkonaöntration0 -die Kurve 2 zeigt die Aktüritt&t der Protease, νηά. dis gerade Linie 3 seigi; die, Natriumchlbridkonzen'" tration» Wie in Figo 1 gezeigt i8tp ist die Aktivität der Pro teas© in der Spitaenfraktion C koBsentrierto Die Aktivität einer kleinen Proteasemenge kann in der Fraktion D beobachtet werdeno Die Protease, die in der Fraktion G konzentriert ist, ist die alkalisehe Protease von-Bacillus licheniformis? die durch die Erfinder gefunden wurde*, Eb wurde im übrigen keine Fraktion gefunden, die die Proteasaktivität wie in Fig0 t zeigte Diese Tatsache läßt erkennen, daß die Reinigung der rohen Protease leicht durchgeführt werden kann und daß durch die Erfindung in vorteilhafter Weise alkalische Protease hergestellt werden kanne,Figo 1 shows the Ghroiaatograrasa 9 welohes thereby obtained that the EuLturlösung a Entbakterißierung P is imterworfen Aussalanng, dialysis and Entfärbimg "a purified alkaline protease to produce and that fiaim thereto seigt the purified alkaline protease a Eolonnenehrosatographie duroh CärboxyraetJiylcellulose subjected wirdc In Figo 1, the K \ wv & i / di, © ..- ■ .-. ; Protein concentration 0 - curve 2 shows the action of the protease, νηά. dis straight line 3 seigi; which Natriumchlbridkonzen '"concentration" As shown in Figo 1 i8t shown p the activity of the pro teas © in the Spitaenfraktion C koBsentrierto The activity of a small amount of protease can be observed in the fraction D werdeno The protease is concentrated in the fraction G is the alkali see protease from Bacillus licheniformis? which was found by the inventors * Eb was found in the rest of any fraction containing the Proteasaktivität as in Figure 0 t showed This fact shows that the purification of the crude protease can be easily carried out and that alkaline protease can advantageously be produced by the invention,
e eharakteristiken der alkalischen Protease, die gemäß der. Er-e echaracteristics of the alkaline protease, which according to the. He-
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findung hergestellt worden ist, sind iii den Figuren 2 bis 5 ge*· zeigt· Mg» 2 zeigt im Zusammenhang zwischen der Aktivität der alkalieehen Protease und dempH-Werto Wie in Figo 2 zu sehen ist j liegt der optimale pH~Wert im Bereich von IQ bis 10,5, 5renn Öaaein als Substrat verwendet wird* und dieser optimale pH*¥ert ändert sich auch nicht, wenn Hämoglobin oder Albumin als Substrat ver*· wendet wird. -Figo 3 zeigt den Zusammenhang zwischen der Aktivität der alkalischen Protease und der Temperatur. In figo 3 zeigt die Kurve 1 die Aktivität der alkalischen Protease, -wenn das Substrat Galeiumaeetat in einer Menge von 5x tÖ Mol enthalt ö Die Kurve 2 zeigt die Aktivität der alkalisßhen Protense, trenn das Kulturmedium kein Caleiumacetat enthält« Die Figo 3 zeigt, daß die optimale Kulturtemperatur bei 6O0G au finden i«t und dai die Protease bei 8Q0C deaktiviert wird. Die· Aktivität der Protease wird bemerkenswert erhöht* wenn Galeiumacetat. im RBaktionsgemisch enthalten ist, wie dies dureh die Kurve 1 dargestellt ist, aber die optimale Ktilturtemperatur wird nicht iresentlieh2 to 5 are shown in FIGS. 2 to 5 shows Mg 2 shows in connection between the activity of the alkaline protease and the pH value IQ up to 10.5.5 if Öaaein is used as substrate * and this optimal pH * ¥ ert also does not change if hemoglobin or albumin is used as substrate. -Figo 3 shows the relationship between alkaline protease activity and temperature. In fig o 3 1 shows the curve, the activity of alkaline protease, -if the substrate Galeiumaeetat in an amount of from 5x tÖ Mol contains ö Curve 2 shows the activity of the alkalisßhen Protense, separating the culture medium no Caleiumacetat contains "The Figo 3, that the optimum culture temperature at 6O 0 G au find i "t and dai the protease at 8Q 0 C is disabled. The · activity of the protease is remarkably increased * when gallium acetate. is contained in the action mixture, as shown by curve 1, but the optimal cooling temperature is not irrelevant
Die Aktivität der alkalischen Protease wu^de durch ein Verfahren getestet* das im Buch "Method for the Inv jstigation of Enzyme11, Band 2, Seite, 240 von Hagihara (gedruckt «lurch Asakura Bookshope) angegeben isto Die Protease wurde iait einär Lösung, die Casein enthielt, bei einem pH^Wert von 10^0 und aei einer Temperatur von 3O0C gemischto Das Gasein wurde in 2y.?oain hydrolisiert und das niöht*hydroiiBierte Gäsöin wurde unte:.· Verwendung des Fäl~. lungsmiiitels B ausgefällt, bei welchem es eich um ein Gemisch aus 0,11 Mol ÖCl^CÖOHi 0*22 Mol CH3CQOHa \ind 0,33 Mol CH3COOH handelt» Daö %Ütrat wurde auf die Licht»^sorption bei 257 mu geprüft0 Die Aktivität der Protease wird turch die "Einheit" angegeben, bei dör es sieh um die Menge Tjrosin (f·) handelt, die in einer Minute gebildet wird o The activity of the alkaline protease was tested by a method * which is given in the book "Method for the Inv jstigation of Enzyme 11 , Volume 2, Page, 240 by Hagihara (printed by Asakura Bookshope). The protease was iait a solution, lungsmiiitels B · application of FAEL ~ precipitated: the casein contained, at a pH value of ^ 10 ^ 0 and aei a temperature of 3O 0 C gemischto the gas inlet was hydrolyzed in 2y.?oain and niöht * hydroiiBierte Gäsöin was unte.. , which is a mixture of 0.11 moles of OCl ^ COOHi 0 * 22 moles of CH 3 CQOHa \ and 0.33 moles of CH 3 COOH the protease is Turch indicated the "unit" in dör it is to check the amount Tjrosin (f ·), which is formed in a minute o
4 zeigt die thermische Stabilität der alkaliiöhen Protease,,4 shows the thermal stability of the alkaline protease ,,
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In Figo 4 zeigt die Kurve 1 $ daß die Protease bei einer Temperatur bis sü 550Q 15 Minuten lang stabil ists wenn'das Reaktionsgemiseh Galöiumacetat in einer-Menge von b t. 1O~ Mol enthält und ein pH voa 10,0 verwendet wird „ Dia Kurve 2 zeigt, daß axe Protease bei einer temperatur bis zu 5O0C stabil ist und daß die Aktivität der Protease bei einer !temperatur oberhalb 55°G rasch verringert wird, wenn das Kulturmedium kein Calciumacetat enthält aber im Übrigen unter den gleichen Bedingimgen wie bei Kurve 1 gehaltenIn Figo 4, curve 1 $ that the protease at a temperature up sweet 55 0 Q 15 minutes s is stable wenn'das Reaktionsgemiseh Galöiumacetat in an amount of b t shows. 1O ~ mol, and having a pH is used VOA 10.0 "Dia curve 2 shows that ax protease is stable at a temperature up to 5O 0 C and that the activity of the protease at a! Temperature is rapidly reduced above 55 ° G, if the culture medium does not contain calcium acetate but otherwise kept under the same conditions as in curve 1
fig* 5 zeigt den Zusammenhang zwischen der A&tiVität der .alkali-S6hen Protease und dea pH-Wert, wenn das Reaktionsgemisch 22 Stun den auf 300G gehalten wird» Bie Kurve ί zeigt'die Aktivität der Protease, wenn das Reaktionsgemisoh Galciumacetat in einer Menge ' von 5 x 1O-^ Mol enthält, und die ICurve 2 isai^t die Aktivität aer Protease, wenn das Reaktionsgemisch kein Calciumacetat enthält 0 Aus den Eorven 1 und 2 geht hervor, daß die Protease bei einem pH-Wert im Bereich von 5,0 bis 11,0 stabil ist« Fig * 5 shows the relationship between the activity of the .alkali-S6hen protease and the pH value, if the reaction mixture is kept at 30 0 G for 22 hours includes ^ mol, and the ICurve 2 isai ^ t the activity aer protease, when the reaction mixture no calcium acetate containing 0 Off is the Eorven 1 and 2 show that the protease at a pH in the range of - amount 'of 5 x 1O 5.0 to 11.0 is stable «
Die Aktivität der alkalischen Protease der vorliegenden Erfindung wird dureh Sehwexinetallionen* wie ζa Bo ag- und Cu-Ionen und ins* besondere dufeh Oxydationsmittel, wie s»Bo Jod öder Diieopropylfluörophosphat (BEP) und Ejartoff elinhibitor (potat(0*inMbi1:ör) beeinträchtigto Diö Aktivität der alkalischen Protease «ird nicht durch Reduktionsmittel, wie Cystein, Ghelierungsmittel ΒΒΪΑ, Mono 3 öd essigsäure und einem SH -Reagenz beeinträchtigt ö The activity of the alkaline protease of the present invention will dureh Sehwexinetallionen * as ζ a Bo Ag and Cu ions and dufeh the * particular oxidizing agent, such as s "B o iodine barren Diieopropylfluörophosphat (BEP) and Ejartoff elinhibitor (potat (0 * inMbi1: OER) beeinträchtigto Diö activity of the alkaline protease "ird not by reducing agents such as cysteine, Ghelierungsmittel ΒΒΪΑ, mono 3 öd acetic acid and an SH reagent impaired ö
Die ErfiMüng wird durch die -.folgenden Beispiele, erläutert«,The result is illustrated by the following examples, "
Bacillus iicheniformis wurde in 1 1 eines wäßrigen Kulttirmediums (pH = 7,2) infcubiert, welches \ °& ÖluecoB©» 1 % Peptön, 0,1 % Hefeextrakt, '.0»~£;~$ Natriumchlorid, Ö,2 $> Calciumchlorid, 0|0S fo Bacillus licheniformis was infcubiert in 1 1 of an aqueous Kulttirmediums (pH = 7.2) containing \ & ÖluecoB ° © »1% Peptön, 0.1% yeast extract, '.0' ~ £; ~ $ sodium chloride, east, 2 $ > Calcium chloride, 0 | 0S fo
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E^iumphosphat, 0,01 fa Magnesiumsulfat und 0,001 %> von jeweils* Eisen( II)-sulfat und Mangansulfat enthielto Der Baeillus licheni« f ormis wurde unter Schütteln "bei 300G 72 Stunden lang kultiviert«, Das erhaltene Kulturmedium enthielt die alkalisehe Protease, die eine Aktivität von 1.930 Einheiten je ml aufwies. Das Kulturmedium wurde durch Verwendung einer Zentrifuge oder eines Filters entbakterisiert, und dann wurde das Piltrat mit einer zu 80 # gesättigten Lösung von Ammoniuinsulfat gemischt, und das Gemisch wurde ausgesalzt und dialysierto Die Dialysierte lösung wurde durch eine Kolonne hindurehgefuhrt, die mit Duolite A-2-Hara (oder einem Anionenaußtauschharz) bepackt war^. um Färbestoffe abzutrennen,. Die entfärbte Lösung wurde einer Kolonnenchroiaatographie unterworfen«, wobei ÖarboxymethyleelluloBe und DEAE-Sephadex verwendet wurde» Hierauf wurde die rohe Protease durch das uelfiltrierungsverfahren unter Verwendung von Sephadex-75 abgetrennt, und die rohe Protease wurde durch ein Ausfällungsverfahren behandelt, wobei Aceton verwendet wurde, um die gereinigte Protease herzustell en«. Die gereinigte Protease wurde getrocknet und gewögenr. Es wurden 47 mg getrocknete Protease mit einer Aktivität von 4o110 Einheiten je mg erhalten. E ^ iumphosphat, 0.01 fa magnesium sulfate and 0.001%> of each * Iron (II) sulfate and manganese sulfate containing o The Baeillus licheni "f ormis was 72 hours cultured with shaking" at 30 0 G ", containing the culture medium obtained the alkaline protease, which had an activity of 1,930 units per ml. The culture medium was debacterized by using a centrifuge or a filter, and then the piltrate was mixed with an 80 # saturated solution of ammonium sulfate, and the mixture was salted out and dialyzed to die Dialyzed solution was passed through a column packed with Duolite A-2-Hara (or an anion exchange resin) to separate dyes. The decolorized solution was subjected to column chromatography "using arboxymethyleelluloBe and DEAE-Sephadex the crude protease was separated by the oil filtration method using Sephadex-75, and the crude protease was du I treated a precipitation process in which acetone was used to produce the purified protease ”. The purified protease was dried and weighed. 47 mg of dried protease with an activity of 40110 units per mg were obtained.
Baeillus lieheniformis wurde in 1 1 eines Kulturmediums (pH = 7,2) inkubiert«, welches einen Extrakt enthielt f der durch Extrahieren von entfettetem Sojabohnenkuehen mit einer Lösung, die 4 % Alkali und 1 % lösliehe Stärke enthielt, erhalten worden waro Der Baeillus lieheniformis wurde 40 Stunden lang bei 35°C unter Belüftung und Rühren kultiviert. Das erhaltene Kulturmedium enthielt die alkalische Protease, die eine Aktivität von 4o400.Einheiten 3e ml aufwieso Das Kulturmedium wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei 1,07 g der gereinigten Protease erhalten wurde, die eine Aktivität von 4p110 Einheiten/mg aufwiesοBaeillus lieheniformis was dissolved in 1 1 of a culture medium (pH = 7.2), 'which f an extract containing the starch contained lösliehe by extracting defatted Sojabohnenkuehen with a solution containing 4% of alkali and 1%, was obtained o The Baeillus lieheniformis was cultivated for 40 hours at 35 ° C. with aeration and stirring. The obtained culture medium contained the alkaline protease having an activity of 40400 units of 3e ml. The culture medium was treated in the same manner as in Example 1 to obtain 1.07 g of the purified protease having an activity of 4p110 units / mg exhibited o
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