DE2026092A1 - Alkalische Protease und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents
Alkalische Protease und Verfahren zu deren HerstellungInfo
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Description
TElEPON: 55 54 7ί
W. 14882/70 7/de
Rikagaku Kenkyusho
Kita-Adachi-gun, Saitama {Japan)
Kita-Adachi-gun, Saitama {Japan)
Alkalische Protease und Verfahren
zu deren Herstellung
Die Erfindung bezieht sich auf eine hochwirksame neue Protease und ein vorteilhaftes Verfahren zu ihrer Herstellung
durch ZUchtung eines neuen Mikroorganismus, wel- |
eher alkalische Protease in einem alkalischen Kulturmedium, das ein Carbonat enthält, oder einem Kulturmedium, das
keine Zucker enthält, erzeugt*
Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Protease, einem Protein zerlegenden oder spaltenden Enzym,
mit einem optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich bekannt.
009850/1858
Es ist jedoch bisher ein Verfahren zur Herstellung einer großen Menge von alkalischer Protease unter Anwendung eines
Mikroorganismus und eines speziellen Mediums und unter ZUchtungsbedingungen, wie sie gemäß der Erfindung vorgesehen sind, noch nicht beschrieben worden.
Wesentlich für die Erfindung ist der verwendete Mikroorganismus und seine Züchtungsbedingungen zur Erzeuk gung einer großen Menge von neuer alkalischer Protease.
Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen
zeigen gutes Wachstum unter nachstehend näher beschriebenen ZUchtungsbedingungen und erzeugen die alkalische
Protease gemäß der Erfindung. Die Mikroorganismen sind
neue Stämme, die zu der Bacillusgattung Bacillus ep. Ho. 221, Bacillus sp. Ho. 0-4 und Bacillus sp. Ho. Y-76
gehören. Die genannten Bacillus ep. Ho. 221, Bacillus sp.
Ho. 0-4 und Bacillus sp. Ho. Y-76 sind von den Erfindern entdeckt worden.
genannten
Jeder der^Stämme Bacillus 0p. Ho. 221, Bacillus
w ep. Ho. 0-4 und Bacillus sp. Ho. T-76, die bei dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, wird aus dem
Boden Isoliert, der in dem Yamato-machi Distrikt von Kitaadachi-gun; Saltama Präfektur, Japan gesammelt worden
ist.
Jede Isolierung der genannten Mikroorganismen Bacillus sp. Ho, 221, Bacillus sp. Ho. 0-4 und Bacillus sp.
Ho. Y-76 wurde in der nachstehend beschriebenen Arbeitsweise ausgeführt.
009850/1858
Der genannte Boden wurde In sterilisiertem Wasser
suspendiert und auf dem folgenden Medium für eine Plattenlcultur rerteilt.
(MedlumeusammensetEung)
a) lösliche Stärke I2HPO4
Hefeextrakt Peptone MgSO4*7H2O
Agar
Wasser
b) Na2CO3
Wasser
(Nach Sterilisieren bei 113° 0 während 15 min wurden
«) und b) gemischt.)
| 20 | g |
| 1 | β |
| 5 | g |
| 5 | g |
| 0, | 2g |
| 20 | g |
| 900 | ml |
| 10 | β |
| 100 | Bl |
brütet.
Auf diese Weise wurde eine Kolonie eines Mikro organismus, der eine große Menge der genannten alkalischen
Protease erzeugt, τοη Kolonien auf der Platte isoliert.
Dieser Mikroorganismus wurde Bacillus sp. No. 221
genannt. Die genannten Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus
ep. No. Y-76 wurden auch nach dem gleichen Verfahren isoliert.
Die als Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 identifizierten Stämme sind bei
der American Type Culture Collection (ATCC) mit den
009S50/18 58
ATCC-Nummern 21522, 21536 und 21537 hinterlegt worden und
befinden sich bei ATCC in unbeschränkter Hinterlegung, welche der Öffentlichkeit vollen Zugang zu der Kultur
gestattet. Die genannten Stämme sind zur Verteilung an
die Öffentlichkeit am 22. April 1970, 5. Mai 1970 bzw. 5. Mai 1970 freigegeben worden. Es ist gefunden worden,
daß die genannten Mikroorganismen Bacillus sp. No. 221,
Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 eine hohe
Einheit von neuer alkalischer Protease unter den nach- ι
stehend beschriebenen ZUchtungsbedlngungen erzeugen und anhäufen und daß es gelingt, mit diesen das Verfahren zur
Herstellung der alkalischen Protease gemäß der Erfindung
mit gutem Erfolg durchzuführen. Diese alkalische Protease j
ist sehr brauchbar als Zusatz zu Reinigungsmitteln (detergents).
Die genannten Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp.
No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 haben die folgenden Eigenschaften:
Die mikrobiologischen Eigenschaften wurden nach j den Methoden geprüft, die in "Aerobic Spore-forming Bacteria"
von Nathan R. Smith, R. E. Gordon und F.E. Clark (United States Department of Agriculture, November 1952)
und "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology"
(1957) beschrieben sind.
0098 50/1858
Bacillus sp. No. 221
(a) Wachstum im Medium pH-Wert in dem Medium
Medium pH-Wert 7 pH-Wert 10,2+
Wachstum gutes Wachstum
Wachstum reichlich
Wachstum reich-Wachstum gering lieh
—- gutes Wachstum
Wachstum Wachstum nicht
gut
Wachstum gutes Wachstum
| (D | Bouillon | Wachstum |
| (2) | Bouillon-Agar | Il |
| (3) | Glucose-Bouillon | schlechtes |
| Wachstum |
(4) Glueose-Bouillon-Agar
(5) Gelatinemedium
(6) Pept on e-Wasser
(7) Kartoffelmedium
+ 1 $> Na2CO, wurde zugesetzt.
Die Größe des Mikroorganismus ist
0,6 - 0,8 /u χ 2,0 - 3,0 zu; das Sporangium ist etwas
gequollen, und die Spore ist oval, 0,8 - 1,0 /u χ 1,3 /u.
Der Mikroorganismus hat pertrichinöse Plagella (pertrichous flagella), wie dies in der Elektronenmikrographie
zu sehen ist (Pig. 1). Der genannte Bacillus wächst sehr gut auf dem Medium (Glucose, Hefeextrakt, Peptone,
K2HPO4, MgS04*7H20 und Na2CO3, pH-Wert 10,2), wie
dies nachstehend beschrieben ist, in Form einer weißen Kolonie. Das Charakteristische dieses Bacillus ist, daß
er gut auf alkalischem Medium anstelle von neutralem Medium, in dem kein Zucker enthalten ist, wächst.
D098 5 0/18B8
(b) Physiologische Eigenschaften
(1) optimale Wachstunisbedingungen:
pH-Wert 8-10 Temperatur: 37 - 40° C aerob
(2) Bedingungen, unter welchen die Bakterien wachsen können:
pH-Wert 7-11 Temperatur: bis zu 55°C aerob
Die folgenden Versuche wurden unter Verwendung des 1 % Na2CO, enthaltenden Mediums ausgeführt.
(3) Gram-Färbbarkeit: positiv (änderbar)
(4) Voges-Proskauer-Reaktion: negativ
(5) Nitrat wird reduziert.
(6) Catalase: positiv
(7) Hydrolyse von Gäatine und Casein: positiv
(8) Hydrolyse von Stärke: schwach
(9) Verwertung von Oitrat: verwertet (10)Verwertung von Ammoniumsalzen: verwertet
(11)Wachstum, bestimmt in 5 $>
Natriumchloridlösung.
(12)Wachstum, bestimmt auf Glucose-Nitratmedium. (13)Kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen.
(14)Keine Erzeugung von Gas in Nitratmedium unter anaeroben Bedingungen.
(15) Wachstum, bestimmt auf Glucose-Asparagin-Medium*
(c) Verwertung der Kohlenstoffquelle
Verwertet: Glucose, Mannose, Salicin, Cellobiose, Lactose, Sucrose, Arabinose, Mannit und Xylose in einem
Medium, das 1 % Carbonat enthält. Die Erzeugung von Säure ist jedoch infolge der Gegenwart einer großen Menge von
Carbonat nicht ersichtlich.
QQ9850/1858
| Bacillus BD. No. 0-4 | Wachstum im Medium | pH-Wert | in dem Medium |
| (a) | Medium | pH-Wert 7 | pH-Wert 1O,2+ |
| Bouillon |
schlechtes
Wachstum |
Wachstum | |
| (1.) | Bouillon-Agar | M | gutes Wachstum |
| (2) | Glucose-Bullion | N | N N |
| (3) |
Glucose-Bouillon-
Agar |
Wachstum | η η . - * |
| (4) | Gelatinemedium | -— | If M • |
| (5) | Peptone-Wasser |
Wachstum nicht
gut |
|
| (6) | Kartoffelmedium | Wachstum | gutes Wachstum |
| (7) |
*1£ Na2CO, wurde zugesetzt.
0,5 - 0,7 Ai x 2,0 - 3.0 Aij das Sporangium ist etwas gequollen, und die Spore ist oval, 0,7 - 1,0 ai i1,2- 1,3/U,
Der Mikroorganismus hat pertrichinöse Plagella (pertrichous flagella), wie dies in der Elektronenmikrographie zu sehen ist (Fig. 2). Der genannte Bacillus
wächst sehr gut auf dem Medium (lösliche Stärke, Hefeextrakt, Peptone, K2HPO4, MgSO4'7HgO und Na2CO,, eingestellt auf pH-Wert von 10,2), wie dies nachstehend beschrieben wird, in Form einer weißen Kolonie. Das Charakteristische dieses Bacillus besteht darin, daß er gut auf
alkalischem Medium anstatt auf neutralem Medium wächst.
009850/1858
2&609-2 - β -
(b) Physiologische Eigenschaften
(1) optimale Wachsturasbedingungen:
pH-Wert 8-10 Temperatur: 37 - 400C aerob
(2) Bedingungen, unter welchen die Bakterien wachsen
können:
pH-Wert 6,0 - 11 Temperatur: bis zu 560O aerob
Die folgenden Versuche wurden unter Verwendung des
1 Jt Na2OO, enthaltenden Mediums ausgeführt.
(3) Gram-Färbbarkeit: positiv (änderbar)
(4) Voges-Proskauer-Reaktion: +
(5) Nitrat wird reduziert.
(6) Catalase: positiv
(7) Hydrolyse von Gelatine und Casein: positiv
(8) Hydrolyse von Stärke: schwach
(9) Verwertung von Citrat: verwertet
(10) Verwertung von Ammoniumsalzen: verwertet
(11) Schwaches Wachstum, bestimmt in 7 $>
Natriumchloridlösung.
(12) Wachstum, gering auf Glucose-Nitratmedium.
(13) Kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen.
(14) Keine Erzeugung von Gas in Nitratmedium unter anaeroben Bedingungen.
* (15) Wachstum, bestimmt auf Glucose-Asparaginmedium.
(c) Verwertung der Kohlenstoffquelle
Verwertet: Glucose, Mannose, Salicin, Cellobiose, Lactose,
Sucrose, Arabinose, Mannit und Xylose in einem Medium, das 1 Jt Carbonat enthält. Die Erzeugung von Säure Ist jedoch
infolge der Gegenwart einer großen Menge von" Carbonat nicht
ersichtlich. * *
009850/1858
Bacillus sp. No. Y-76
(a) Wachstum im Medium Medium
(1) Bouillon
(2) Bouillon-Agar
(3) Glucose-Bouillon
(4) Glucose-Bouillon-Agar
(5) Geiatinemedium
(6) Peptone-Wasser
(7) Kartoffelmedium
pH-Wert in dem Medium pH-Wert 7 pH-Wert 10,2+
| Wachstum | Wachstum |
| It | It |
| It | gleichförmige Trü bung, gutes Wachs tum |
| Il | gutes Wachstum |
| — | gutes Wachstum verflüssigt |
| Wachstum nicht gut | |
| Wachstum | gutes Wachstum |
wurde zugesetzt.
Die Größe des Mikroorganismus ist
0,5 - 0,7 /u x 2,0 - 3,0 yu; das Sporangium ist etwas
gequollen, und die Spore ist oval, 0,7- 1,0 yui 1,2 - 1,3/u.
Der Mikroorganismus hat pertrichinöse Flagella (pertrichous flagella), wie dies in der Elektronenmikrographie
zu sehen ist (Fig. 3). Der genannte Bacillus wächst sehr gut auf dem Medium (lösliche Stärke, Hefeextrakt, Peptone,
K2HPO., MgSO.'7H2O und Na2CO5, eingestellt auf pH-Wert
von 10,2), wie dies nachstehend beschrieben wird, in Form einer weißen Kolonie. Das Charakteristische dieses
Bacillus besteht darin, daß er gut auf alkalischem Medium anstatt auf neutralem Medium wächst.
009850/18 58
(b) Physiologische Eigenschaften
(1) optimale Wachstumsbedingungen:
pH-Wert 8-10 Temperatur: 37 - 40° C aerob
(2) Bedingungen, unter welchen die Bakterien wachsen können:
pH-Wert 6,0 - 11 Temperatur: bis zu 560C aerob
Sie folgenden Versuche wurden unter Verwendung des 1 £ Na2CO, enthaltenden Mediums ausgeführt.
(3) Gram-Färbbarkeit: positiv (änderbar)
(4) Voges-Proskauer-Reaktion: +
(5) Nitrat wird reduziert.
(6) Catalase: positiv
(7) Hydrolyse von Gelatine und Casein: positiv
(8) Hydrolyse von Stärke: positiv
(9) Verwertung von Citrat: verwertet
(10) Verwertung von Ammoniumsalzen: verwertet
(11) Wachstum, bestimmt in 7 $> Natriumohloridlösung.
(12) Wachstum, bestimmt auf Sllucose-Nitratmedium.
(13) Kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen.
(14) Keine Erzeugung von Gas in Nitratmedium unter anaeroben Bedingungen.
(15) Wachstum, bestimmt auf Glucose-Asparagin-Medium.
(c) Verwertung der Kohlenstoffquelle
Verwertet*: Glucose, Mannose, Salicin, Cellobiose,
Lactose, Sucrose, Arabinoae, Mannit und Xylose in einem Medium, das 1 i» Carbonat enthält. Die Erzeugung von Säure
ist jedoch infolge der Gegenwart einer großen Menge von Carbonat nicht ersichtlich.
009850/1858
Die genannten Mikroorganismen. Bacillus ep. No. 221,
Bacillus ep. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 sind voneinander verschieden und ihre charakteristischen unterschiedlichen Punkte sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
| Mlkroorganis- | Bacillus | Bacillus | Bacillus | Wachstum |
| nen | sp.No.221 | ep.No.0-4 | sp.No.Y-76 |
gutes
Wachstum |
| Eigenschaften | • | Wachstum | ||
|
Wachstum auf
neutralen Medium |
sehr schwa
ches Wachs tun |
schwaches
Wachstum |
+ mm. |
|
|
Wachstum in
NaCl 7 % |
langsames
Wachstum |
schwaches
Wachstum |
schwaches
Wachstum Bildung. |
|
|
Wachstum in
Glucoee-Aspa- raginmedium |
sehr lang
sames Wachs tum |
Wachstum | ||
|
Toges-Pros-
kauerreaktion |
negativ | + | ||
|
Wachstum bei
56Ö C Membran bildung |
Wachstum
keine Bil dung |
sehr schwa
ches Wachs tum keine Bil dung |
Aus der obengenannten Tabelle ist ersichtlich, daß
die genannten Mikroorganismen nicht identisch miteinander in ihren Eigenschaften sind.
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Vergleichsuntersuchungen der genannten Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76
gemäß dem Klassifikationsverfahren, das in "Aerobic Sporeforming Bacteria" und in "Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology" (1957) Seiten 613 ff beschrieben ist, zeigten, daß die genannten Mikroorganismen hinsichtlich einiger Funkte
ähnlich den bekannten Mikroorganismen waren, welche zu der Gruppe Bacillus sp. gehören, daß sie jedoch in charakteristischen Eigenschaften vollständig verschieden waren und
daß keine Species unter der bekannten Gattung waren, die P mit den genannten Eigenschaften Übereinstimmten. Es wurde
daraus geschlossen, daß sie neue Stämme des Bacillus sp. darstellen. Da die genannten Mikroorganismen jeweils aerobe,
sporenbildende Bakterien sind, ist ersichtlich, daß sie zu
der Bacillüsgattung gehören. Der besonders charakteristische
Punkt der genannten Mikroorganismen besteht darin, daß das Wachstum in alkalischem Medium besonders gut ist, wobei der
optimale pH-Wert 8-10 beträgt.
Es wurden einige Prüfungen an bekannten bakteriellen Species mit Bezug auf Bacillus ep. No. 221 und Bacillus
subtilis gemacht, und Bacillus subtilis kann als Vergleichs-
^ Organismus genannt werden. Bacillus subtilis ist positiv
* gegenüber der Vogel-Proskauerreaktion und hat einen optimalen
pH-Wert von 5 - 8 in einem Glucose enthaltenden Medium. Demgegenüber ist Bacillus sp. No. 221 negativ gegenüber der
Vogel-Proskauerreaktion und zeigt ein schlechtes Wachstum in einem Medium, das Glucose bei einem pH-Wert von 7 enthält,
während der optimale Wert bei etwa pH 10 liegt. In dieser
Hinsicht ist Bacillus sp. No. 221 deutlich vom Bacillus
Bubtilis unterschieden.
009850/1858
Bacillus brevis kann auch als Vergleichsorganismus für Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus
sp. No. Y-76 genannt werden. Bacillus brevis hat jedoch keine Fähigkeit zum Hydrolysieren von Stärke, erzeugt
Gas in einem Nitratmedium unter aeroben Bedingungen und seine Gram-Färbbarkeit ist verschieden, gewöhnlich ist sie
negativ. Demgegenüber haben Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 jeweils etwas Fähigkeit
zum Hydrolysieren von Stärke; sie erzeugen kein Gas in einem Nitratmedium unter aeroben Bedingungen und sind
unveränderlich positiv hinsichtlich der Grara-Färbung. Der
,charakteristische Unterschied in ihren Eigenschaften besteht in folgendem: Während Bacillus brevis als Wachstumsbedingung einen pH-Wert von 8,0 - 8,6 erfordert, wähst er
überhaupt nicht bei einem pH-Wert von 10; Bacillus sp.
No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 wachsen demgegenüber bei pH-Werten von 7 - 11. Das Wachstum
von jedem der Mikroorganismen Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 ist sehr
langsam bei einem pH-Wert von 7 in Gegenwart von Glucose, und der pH-Wert von etwa 10 ist optimal. In dieser Hinsicht
unterscheiden sich jeweils Bacillus sp. No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 deutlich vom Bacillus
brevis.
Da das Wachstum von Bacillus sp. No. 221 durch Glucose
gehemmt wurde, kann er mit Bacillus firmus verglichen werden. Das Wachstum dieser beiden MikoOrganismen auf Oitratmedium
und die optimale Temperatur ihres Wachstums sind jedoch verschieden.
Außerdem zeigt zeigt Bacillus 221 Glucosehemmung bei einem pH-Wert von 7. Es wird jedoch bei einem pH-Wert
▼on 10 keine Wachstumshemmung durch Glucose festgestellt;
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-H-
während Bacillus firmus kein Wachstum bei einem pH-Wert
von 10, unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit
von Glucose, hat. In dieser Hinsicht sind die beiden Mikroorganismen
deutlich unterschieden.
Sementsprechend ist es zweckmäßig, eine neue Species für
jeden der Microorganlsraea Bacillus ep. No. 221, Bacillus
sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76 zu errichten.
Gemäß dem Verfahren nach der Erfindung kann die alkalische
Protease gemäß der Erfindung dadurch erzeugt werden,
daß man nicht nur Bacillus sp. No. 221, Bacillus'sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76, wie sie oben beschrieben sind,
anwendet , sondern auch ihre natürlichen und künstlichen Mutanten,welche die alkalische Protease erzeugen.
Bei der praktischen Ausführung der Erfindung kann die
Gärung (Fermentation) gemäß den folgenden Verfahren ausgeführt werden.
Es gibt zwei Methoden, für die Herstellung des bei der
Erfindung verwendeten Züchtungsmediums.
Sie erste Methode ist durch den Zusatz von Carbonat zu der Zusammensetzung des Züchtungsmediums gekennzeichnet.
In diesem Medium werden Glucose, Stärke, Sextrin, Maltose, Fructose od.dgl. als Kohlenstoffquelle benutzt. Hefeextrakt,
Pepton, Maiseinweichflüssigkeit und dgl. werden als Stickstoff
quelle, angewendet. .Verschiedene Carbonate, wie Kaliura-
!Natriumcarbonat
carbonat/ und Natriumbicarbonat, werden als anorganische Salze
benutzt und zu der Lösung zugegeben, um das Züchtungsmedium herzustellen, das auf einen pH-Wert von etwa 10,5 eingestellt
wird.
009850/1858
Die zweite Methode let durch die Ausschaltung von Glucose und Stärke von der Zusammensetzung des ZUchtungsmediums
gekennzeichnet. In diesem Fall kann ein Carbonat zu dem
ZUchtungsmedtum als anorganisches Salz zugegeben werden.
Hefeextrakt, Fepton, MaiseinweichflUsslgkeit od.dgl. werden
als Stickstoffquelle angewendet, und es finden verschiedene Carbonate, wie Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat und Natrlumhicarbonat, als anorganische Salze Anwendung und können zu
der Lösung der erstgenannten zugegeben werden, um das Züchtungsmedlum herzustellen, das auf einen pH-Wert von etwa 7
eingestellt wird.
Das so hergestellte Medium wird mit dem Stamm eines Mikroorganismus geimpft, der aus der Gruppe Bacillus sp.
No. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und Bacillus sp. No. Y-76
ausgewählt wurde, und unter Schütteln bei einer Temperatur von etwa 24 - 45° C gezüchtet. Im allgemeinen erreicht
die Aktivität des erzeugten Enzyms ein Maximum nach etwa 24-75 Stdn. Züchtung, z. B. 30 - 50 Stdn.
Sa die Zeitdauer, welche zu der Erreichung der maximalen Enzymaktivität erforderlich ist, gemäß den Belüftunge-
und Ruhrbedingungen variieren kann, selbst wenn die gleiche
Temperatur und ein Kulturmedium aus denselben Komponenten verwendet werden, ist es zweckmäßig, über die Züchtungsdauer durch Messung der Enzymaktivität in jedem Fall zu
entscheiden.
Sie zweite wichtige Bedingung ist der pH-Wert des Mediums. Es ist notwendig, den Anfangs-pH-Wert innerhalb des
Bereichs von 6-11 mit Carbonat-oder Bicarbonatsalzen einzustellen. Der optimale pH-Wert beträgt, wenn ein Zucker
009850/1858
enthaltendes Kulturmedium angewendet wird, 8-11, während
der pH-Wert von 6 - 10 der optimale ist, wenn Glucose von dem Kulturmedium ausgeschaltet worden ist.
Die üblicherweise verwendeten physikalisch-chemischen
Methoden können zur Isolierung des Enzyms aus der Züchtungsbrtthe
Anwendung finden. Beispielsweise wird nach Abkühlung der ZUchtungsbrühe Essigsäure zugegeben oder nicht zu der
Züchtungsbrühe zugegeben, um sie zu neutralisieren, und es wird dann Äthanol zugegeben, um das Enzym, alkalische Protease,
quantitiv zu fällen. Der Durchschlag wird dann gesammelt, gründlich mit Äthanol gewaschen und getrocknet.
Das Enzym, alkalische Protease, das so aus der Züchtung der
genannten Mikroorganismen erhalten ist, stellt eine alkalische Protease dar, welche den optimalen pH-Wert von etwa
11,5 hat, und die Aktitivät, wenn sie.auf 50° C erhitzt
wird, eine Stunde behält.
Als Kulturbedingung ist es notwendig, ein alkalisches
Medium mit einer hohen Konzentration an Carbonat zu haben.
Verschiedene Carbonate werden zu dem Medium zugegeben, das
eine Zusammensetzung hinsichtlich der Kohlenstoffquelle und
der Stickstoffquelle aufweist, welche notwendig für das
Wachstum des Mikroorganismus ist. Es ist beispielsweise notwendig,
ein Medium, das Glucose, K2HPO-, Hefeextrakt, Pepton
und MgSO.'7HpO enthält, unter Zusatz von Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat
oder Natriumbicarb'onat herzustellen. Es ist erwünscht, eine Konzentration des zugesetzten Carbonate von
0,5 - 5 1> vorzusehen.
Für die vorteilhafte Herstellung der in Betracht kommenden alkalischen Protease ist ein Zusatz eines Carbonate zu
dem obengenannten Medium eine äußerst wichtige Bedingung, und die folgende Tatsache wird durch experimentelle Ergebnisse
bewiesen.
009850/1858
Das Wachstum des angewendeten Mikro ox ganisraus Bacillus
sp. No. 221 und die Herstellung von Protease wurden unter
Verwendung des vorstehenden Tiediums, dem 1 % Natriumcarbonat
oder jeweils 1 # von verschiedenen Carbonaten zugesetzt war,
und durch die Verwendung des gleichen Mediums, von dem das
Carbonat fortgelassen und an seiner Stelle 1 # Natriumchlorid oder Kaliumchlorid zugesetzt war, wobei der pH-Wert
auf 10,0 mit Natriumhydroxyd eingestellt war, untersucht.
Das Wachstum des Mikroorganismus (Bacillus sp. No. 221) wurde dadurch geprüft, daß man die Züchtungsbrühe nach
18 Stdn. in eine Cuvette von 1 cm Mchtweg einbrachte und
ihre Absorption bei 66O m/u maß; die Proteaseaktivität
wurde unter später beschriebenen Bedingungen gemessen. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle I wiedergegeben, welche
zeigt, daß die Gegenwart eines Oarbonats in dem Medium eine wichtige Bedingung für die Erzeugung der alkalischen Protease
gemäß der Erfindung ist.
009 85 0/ 1858
| keiner | I | 1 1» | Anfangs- PH |
End- PH |
Wachs tum |
Protease- aktivität (U/ml) |
|
| (nur Glucose,K2I | 1 f> | 7,2 | 6,5 | 0,1 | < 100 | ||
| Tabelle I | |||||||
| Glucose- Salzzusatz Konzen tration |
IPO., | ||||||
| 1 | Hefeextrakt,Pepton | * | |||||
| und MgSO+*7H2O] | 10,5 (eingest. mit NaOH) |
0,5 | < 100 | ||||
| KCl | 10,5 | 0,45 | < 100 | ||||
| NaCl | * | (eingest. mit NaOH) |
|||||
| 1 | 10,5 | - | 0,8 | 750 | |||
| 1 | Na2HPO4-NaOH 0,05g |
10,0 | 8,5 | 1,2 | 1400 | ||
| NaHCO3 1,0 | 10,2 | 8,8 | 1,2 | 1800 | |||
| 1 | Na2CO3 0,5 | 10,5 | 9,5 | 1,2 | 2800 | ||
| 1 | Na2CO3 1,0 | 10,5 | 9,2 | 1,15 | 1500 | ||
| 1 | K2CO3 -1,0 | ||||||
| 1 | |||||||
| 1 |
009850/1858
Es wurden ferner das Wachstum des Mikroorganismus Bacillus ep. No. 0-4 und die Erzeugung von Protease durch Anwendung des vorstehenden Mediums, dem 1 £ Natriumcarbonat
oder jeweils 1 % von verschiedenen Carbonaten zugesetzt
worden war, und unter Anwendung des gleichen Mediums, von dem das Carbonat fortgelassen und an seiner Stelle 1 f>
Natriumchlorid oder Kaliumchlorid zugesetzt war, wobei ein pH-Wert von 10 mit Natriumhydroxyd eingestellt war, untersucht. Bas Wachstum des Mikroorganismus wurde dadurch geprüft, daß man die ZUchtungebrUhe nach 18 Tagen in eine
Cuvette von 1 cm Lichtweg einbrachte und ihre Absorption bet 660 m/u maß; die Proteaseaktivität wurde unter den
nachstehend beschriebenen Bedingungen gemessen. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle II aufgeführt, die zeigt, daß
die Gegenwart eines Carbonate in dem Medium eine wichtige Bedingung für die Erzeugung der alkalischen Protease gemäß
der Erfindung ist.
Wenn der Bacillus sp. No. Y-76 als TestOrganismus
verwendet wurde, wurden ähnliche Ergebnisse, wie diejenigen der Tabelle II, erzielt.
—— Proteaseaktivität Salzzusatz pH Wachstum (U/ml)
keiner . 10,0 0,8 750
(nur lösliche Stärke,
KHPO,Hefeextrakt,
24
Pepton und MgSO^'
Pepton und MgSO^'
| KCl | η | 0,9 | η |
| NaCl | n | H | N |
| Na2CO3 | 10,5 | 1·2 | 71,00 |
| NaHCO3 | 9,0 | .W | 51,00 |
| K2CO3 | 10,5 | 1,1 | 52,00 |
009850/1858
Das andere gemäß der Erfindung verwendete Medium ist ein Medium, das keinen Zucker enthält. Es ist ein Medium, das
Komponenten enthält, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind, wie eine Kohlenstoffquelle und eine Sticketoffquelle,
z.B. KpHP(K, Hefeextrakt, Pepton und
MgSO4'7H2O. Es ist erwünscht, daß der pH-Wert auf 6-10
eingestellt wird.
Für die vorteilhafte Erzeugung der in Betracht koramen-P
den alkalischen Protease ist die Abwesenheit von Zuckern in dem vorgenannten Medium eine wichtige Bedingung, und diese
Tatsache wird durch die folgenden Versuche belegt.
Das Wachstum des verwendeten Organismus Bacillus sp. No. 221 und die Erzeugung der alkalischen Protease wurden
durch die Anwendung dieses Mediums untersucht, und das Medium wurde mit Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat
versetzt. Das gleiche Medium, das mit Glucose versetzt war, wurde mit oder ohne Natriumcarbonat oder Natriumbicarbonat
geprüft. Das Wachstum des Organismus (Bacillus sp. No. 221) wurde dadurch untersucht, daß man die Züchtungsbrühe nach
^ 18 Stdn. in eine Cuvette von 1 cm Lichtweg einbrachte und * ihre Absorption bei 660 m/a maß; die Proteaseaktivität wurde
unter später angegebenen Bedingungen gemessen. Diese Ergebniese Bind in der Tabelle III wiedergegeben, welche
zeigt, daß die Abwesenheit oder niedrige Konzentration von Glucose in dem Medium eine wichtige Bedingung bei einem
neutralen pH-Wert für die Erzeugung der alkalischen Protease gemäß der Erfindung ist.
009850/185®
(Ohne Zusatz von Glucose)
Glucose- Salz (Carbonat)
Konzen- Konzentration (
trat lon ^ ^
Konzen- Konzentration (
trat lon ^ ^
An- End- WachsfangspH tum
pH
pH
Proteaseaktivität (U/ml)
keines
(nur K2HPO,,Hefeextrakt,
(nur K2HPO,,Hefeextrakt,
Pepton,MgSO4·7H2O)
6,8 9,3 1,1
(Mit Zusatz von Glucose)
0,1 keines
(nur Glueöse,K
0,1 keines
(nur Glueöse,K
Hefeextrakt, Pepton,
MgSO4-TH2O)
MgSO4-TH2O)
NaHCO,
Na2CO3
0,2
0,5
1,0
0,2
0,5
1,0
0,2
0,4
1,0
1,0
7,2 9,0 1,1
8,7
9,6
10,0
9,3 10,0
10,5 9,3
9,4
9,5
9,3
9,5
9,5
9,4
9,5
9,3
9,5
9,5
1,0
1,0
0,98
0,98
1,1
.1,05
2500
| NaHCO3 | 0,1 | 8,2 | 9,4 | 1,0 ; | 2700 |
| η | 0,2 | 8,7 | 9,5 | 0,9 | * 2000 |
| Il | 0,3 | 9,1 | 9,6 | 1,0 | 1800 |
| Na2CO, | 0,2 | 9,5 | 9,6 | 0,9 | 1600 |
| Il | 1,0 | 10,6 | 9,8 | 0,8 | 1150 |
600
2600 2100 2100 1800 1600 600
0,5 0
NaHCO,
NaHCO,
Na2CO3
Il
Il
Il
0,2
0,5
1,0
0,2
0,4
1,0
1,0
0,2
0,4
1,0
7,2 8,6
9,6 10,0
9,2 10,0 10,5 6,0
6,4
9,3
9,3
9,1
9,3
9,6
9,3
9,1
9,3
9,6
0,14
0,40
0,40
1,2
1,15
1,1
1,1
1,15
1,15
100 600
1600 2000 1600 1100 900
009850/1858
- 22 Portsetzung Tabelle III
(Mit Zusatz von Glucose)
Glucose-Konzentration )
Salz (Carbonat) An- End- Wachstum Protease-Konzentration
(#) fangs- pH aktivität
pH (U/ml)
1,O Na2CO3
η η η η
1,0 7 (einge- 0,4 stellt mit HCl oder NaOH)
8 » 0,9
9 " 1,2
10 " 1,2
11 " 0,7
200
900 1500 2100
700
Der nächste wichtige Punkt bei den Züchtungsbedingungen
ist der pH-Wert während der Züchtung. Gemäß den Ergebnissen der folgenden Versuche ist es notwendig, den pH-Wert für
die Erzeugung der alkalischen Protease auf den gewählten
Wert in dem Bereich von 6-11 einzustellen. Eine Untersuc hung der Wirkung des pH-Werts auf die Erzeugung von
alkalischer Protease durch Abänderung des pH-Werts des oben genannten Züchtungsmediums mit 1 $>
Natriumcarbonat mit HCl oder NaOH, wie dies aus Tabelle IV ersichtlich ist, zeigte,
dass das beste Ergebnis bei einem pH-Wert von 7-11 bzw. bei einem pH-Wert von 8 - 11 in. Gegenwart von Glucose erhalten
wurde. In diesem Fall war der verwendete Mikroorganismus der genannte Bacillus sp. No. 221.
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- 23 -Tabelle IV
Proteaseaktivität (ü/ml) pH 7 8 9 10
Medium
880 1,520 1,640 700
100 100 100
| mit 1 | % Na2CO3 | 220 | 880 |
| ohne | |||
| 1 % Na | 2CQ3 | 100 | 100 |
Wenn der genannte Bacillus sp. No. 0-4 benutzt wurde, i
wurden die aus der Tabelle 5 ersichtlichen Ergebnisse er- !
halten.
pH Proteaseaktivität (ü/ml)
6,8 8 9 10
Medium
1 3CNa2CO3 800 3,000 5,550 6,3OC 2,530
Aus der Tabelle V ist ersichtlich, daß die besten
Ergebnisse bei einem pH-Wert von 6 - 11, besonders bei einem pH-Wert von 8 - 11, in der Gegenwart von Carbonat
erhalten werden.
009850/1858
Die Wirkung des pH-Werts auf die Erzeugung von alkalischer
Protease wurde dann durch Variierung des pH-Werts des Züchtungsmediums mit NaHCO, oder Na2CG, und
ohne einen Gehalt von Zuckern untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI wiedergegeben. Wenn Glucose nicht zugegeben war, wurden die besten Ergebnisse in einem pH-Wert-Bereich von 6 - 11, insbesondere bei pH-Werten von
6 - 10, erhalten. Der verwendete Mikroorganismus war der Bacillus sp. No. 221.
ohne einen Gehalt von Zuckern untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI wiedergegeben. Wenn Glucose nicht zugegeben war, wurden die besten Ergebnisse in einem pH-Wert-Bereich von 6 - 11, insbesondere bei pH-Werten von
6 - 10, erhalten. Der verwendete Mikroorganismus war der Bacillus sp. No. 221.
| 4, Hefe- | 0,5 | Tabelle VI | End- pH |
Wachstum | • | |
| Salzzusatz | Pepton, | 0,1 | Anfangs- pH |
Protease- aktivität (U/ml) |
||
| keiner | 0) | 0,2 | 9,3 | 1,2 | ||
| (nur K2HPO | 0,3 | 7,0 | 2 100 | |||
| extrakt, | 0,2 | |||||
| MgSO4-TH2 | 1,0 | 9,2 | 1,1 | |||
| Na2CO3 | """eingestellt mit | io 6,S+ | 9,4 | 1,0 | 2 000 | |
| NaHCO3 | % 8,2 | 9,5 | 0,9 | 1 800 | ||
| η | * 8,7 | 9*6 | 1,0 | 1 580 | ||
| M | % 9,1 | 9,6 | 0,9 | 1 300 | ||
| Na2CO3 | * 9,5 | 9,8 | 0,8 | 1 020 | ||
| N | # 10,3 | 420 | ||||
| HCl | ||||||
So wird unter den vorstehenden Züchtungsbedingungen mit jedem der genannten Mikroorganismen Bacillus sp. No. 221,
Bacillus sp. Ho. 0™4 und Bacillus sp« No. Y-769 Torbebrütet
009 8 50/1
in dem gleichen Medium, das Medium geimpft und einer Züchtung
unter Schütteln unter geeigneten Bedingungen, z.B. bei
24 - 75 Stdn. bei 37° C unterworfen. Nach Vollendung der Züchtung werden die Zellen entfernt, die Brühe wird mit
Essigsäure oder ähnlicher Säure neutralisiert oder auch nicht neutralisiert, und es wird dann ein organisches Lösungsmittel, wie Äthanol oder Aceton, zugegeben, um die
erzeugte alkalische Protease zu fällen. Der Niederschlag
wird dann dehydratisiert und getrocknet, um die in Betracht kommende Substanz zu erhalten. Die Aktivität der
so erhaltenen alkalischen Protease beträgt etwa 3000 U/ml,
die alkalische Protease hat einen optimalen pH-Wert auf der alkalischen Seite von ungefähr 11,5. Diese alkalische
Protease verliert ihre Aktivität nicht, selbst wenn sie auf 50° C während einer Stunde erhitzt wird, was durch die
Versuchsergebnisse belegt ist.
Physikalisch-chemische Eigenschaften des Enzyms gemäß der Erfindung, der alkalischen Protease, sind folgende:
(1) Analytische Werte:
Gefunden: C, 48,04; H, 6,62; ST, 16,07; S+, 0,31 %
+Wert berechnet aus der Aminosäurenanalyse, die zeigte,
daß nur Methionin als schwefelhaltige Aminosäure anwesend
ist und weder Cystein noch Cystin festzustellen sind. ·
(2) Molekulargewicht:
Die folgenden Versuche zeigen, daß das Molekulargewicht dieser Protease etwa 20 000 - 30 000 beträgt.
(a)Die Sedimentationskonstante für mtrazentrifugieren beträgt etwa 3,3S.
(a)Die Sedimentationskonstante für mtrazentrifugieren beträgt etwa 3,3S.
(b)Das Molekulargewicht, bestimmt unter Verwendung von "Sephadex" ("Sephadex" ist ein Warenzeichen", hatte
einen Wert zwischen 20 000 und 40 000.
009850/1868
(c) Der von der Aminosäurenanalyse gelieferte Wert ist
ein ganzzahliges Mehrfaches von etwa 16 OOO.
(d) Das nach der Archibald-Method© kalkulierte Molekulargewicht beträgt etwa 33 OOO.
(3) Optimaler pH-Wert- und stabiler pH-Wert-Bereich:
Aus Pig. 4 ist ersichtlich, daß der optimale pH-Wert
zwischen 11 und 12 liegt.
Das kristalline Enzym gemäß der Erfindung, versetzt mit Pufferlösung bei verschiedenen pH-Werten, wurde auf
60° C 10 min erhitzt und die Restaktivität wurde bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Pig. 5 gezeigt.
pH
Verwendete Pufferlösung
| Acetatpuffer | 4 | - 6 |
| Phosphatpuffer | 6 | - 8 |
| sämtlich in 0,05M | ||
| HaHGO3 - Ha2CO3-Puffer | 9 | -.10,7 |
| Ha2HPO4 - HaOH-Puffer | 11 | - 12 |
(4) Prüfung der Enzymaktivität;
1 ml der in geeigneter Weise ¥©rätlnnten Enzymlösung
mit 10 M. CaCl2 wurde mit 5 ml von 0,6 $-ig@r Gaseinlösung
(pH-Wert 11,5,,2 x 10"2^ Ha2HPO4 - MaOH-Puffer) bei 30° C
gemischt. Nach 10 min Bebrütung wurden 5 ml Trichloressigsäurelösung
(0,11$$ Tr i chlor essigsäure» 0,22M. latriumacetat
und 0,33 M Essigsäure) zu der R@aktionsQischung zugegeben,
und die Mischung wurde weiter bei 30° 0 30 min bebrütet.
Die Mischung wurde filtriert, irad die Absorption des PiI-trats
wurde bei 275 raM gemessen. Die Ablesungen wurden
durch Subtraktion des Werts der Ixratrollprobe korrigiert,
009850/1868
2026G92
in welcher die Enzymlösung mit Trichloressigsäurelösung
gemischt war, bevor die Caseinlösung zugegeben wurde.
Definition der Enzymaktivität:
Eine Einheit von Proteaseaktivität wird als die Menge
von Enzym definiert, welche die Verdauung erzeugt, die nicht durch Trichloressigsäure gefällt wird und die einen Absoiptiona'
gibt.
gibt.
tionawert äquivalent 1γ von Tyrosin je Minute bei 30° C
(5) Arbeitstemperaturbereich:
Die Enzymaktivität wurde durch die übliche Methode
unter Variierung der Temperatur gemessen. Die Messung wurde unter Verwendung von Lösungen mit und ohne Zusatz von
5mM CaCIp als Stabilisierungsmittel ausgeführt. Wie in
Fig. 6 gezeigt, in der die Aktivität bei 30° C als 10OfS
angenommen wurde, betrug die Aktivität bei 60-70 C in Gegenwart von CaCl2 700 % und diejenige bei 60° C
ohne Zusatz von CaCIp 500 £. Sämtliche Versuche wurden
bei einem pH-Wert von 11,5 ausgeführt.
(6) Bedingungen zur Inaktivierung durch Temperatur:
Das kristalline Enzym gemäß der Erfindung wurde in M/20 Tris-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 gelöst,
die Lösung wurde während 15 min bei verschiedenen Temperaturen erhitzt, und die Restaktivität wurde gemessen.
Die Messungen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 5m§ CaCl2 ausgeführt. Wie aus Fig. 7 ersichtlich ist, betrug
die Restaktivität etwa 100 $, wenn eine Erhitzung bei etwa
30 - 62° C in Gegenwart von CaCl2 vorgenommen wurde und
50 jCa wenn auf etwa 650C erhitzt wurde. Wenn kein
009850/ 1858
zugesetzt wurde, betrug die Restaktivität 100 #, wenn auf
etwa 30 - 52° O erhitzt wurde und 80 %, wenn auf etwa 57° C
erhitzt wurde.
(7) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung:
Inhibierung und Aktivierung des kristallinen Enzyms gemäß der Erfindung wurden untersucht,und die Ergebnisse
sind in der Tabelle VII wiedergegeben.
Zusatz
Konzentration (M)
EDTA (Äthylendiamin- «
tetraessigsäure) . 10"
PCMB (p-Chlormercuri- -.
benzoat) 10~°
Harnstoff
Restaktivitat
100
100 0
Hinsichtlich der Stabilisierung gegen Wärme bewirkte ein Zusatz von 5mlJ CaCl2 eine Stabilisierung von etwa 100C,
(Vgl. Bedingung zur Inaktivierung durch Temperatur im Abschnitt (6) und in Pig. 7).
(8) Reinigungsverfahren:
Zu 1 1 (3000 U/ml) des Züchtungsfiltrats, das durch die Züchtung der Mikroorganismen gemäß der Erfindung jeweils von Bacillus sp. Ho. 221, Bacillus sp. No. 0-4 und
Bacillus sp. No. Y-76 erhalten war, wurden 5 1 Aceton
009850/18
zugegeben, der gebildete Niederschlag wurde gesammelt und mehrmals mit Aceton gewaschen. Es wurden etwa 32 g acetongetrocknetes
Pulver erhalten. Dieses wurde gründlich mit 100 % gesättigter (NH.)2SO,-Lösung gewaschen, in 0,01g
Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7»5 gelöst und über
Nacht gegen den gleichen Puffer dialysiert.
Dieses Dialysat wurde durch eine Säule von Diäthylaminoäthylcellulose
(DEAE-Cellulose),mit 0,01 ^ Phosphatpuffer,
(pH-Wert 7>5) ins Gleichgewicht gebracht, geführt. Das Enzym gemäß der Erfindung, die alkalische Protease, wurde
nicht adsorbiert und ging durch die Säule. Das ausfließende Material wurde dann durch eine Säule von Carboxymethylcellulose
(CM-Cellulose) mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht
gebracht, geführt, wodurch das Enzym vollständig (100 fo ) adsorbiert wurde. Die adsorbierte alkalische Protease
wurde mit 0,01^ Phosphatpuffer (pH-Wert 7,5) mit einem Gehalt
von 0,3M NaCl eluiert.
Das so gereinigte Enzym bildet säulenförmige Kristalle
in 30, fo-iger mit Amraoniurasulfat gesättigter lösung. Die Ausbeute des Enzyms gemäß der Erfindung aus der oben genannten
Reinigungsarbeitsweise beträgt etwa 50 fot und die spezifische
Aktivität des Enzyms beträgt etwa 13 000 ü/ml.
(9) Kristallstruktur
Eine feine Struktur des Enzyms gemäß der Erfindung ist nicht ersichtlich, aber die unter Anwendung von Ammoniumsulfat
gebildeten Kristalle erscheinen in einer Anordnung von säulenförmigen Kristallen, wie dies in der Mikrophotographie
gemäß Fig. 8 gezeigt ist.
009850/1858
(10) Elektrophorese:
Der isoelektrische Punkt des Enzyms gemäß der Erfindung wurde mit dem Tiseliusapparat gemessen und liegt,
wie gefunden wurde, bei etwa pH 10.
' Zusammenfassend ist festzustellen, daß ein Vergleich der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Enzyms gemäß
der Erfindung, der alkalischen Protease, mit demjenigen der * bekannten alkalischen Proteasen deutlich zeigt, daß es sich
um eine neue alkalische Protease handelt, die von irgendwelchen der bekannten alkalischen Proteasen verschieden ist.
FigurenbeSchreibung
Fig. 1 ist eine Elektronenmikrophotographie des gemäß
der Erfindung verwendeten Mikroorganismus Bacillus sp. No. 221;
Fig. 2 ist eine Elektronenmikrophotographie des gemäß
der Erfindung verwendeten Mikroorganismus Bacillus sp. No. 0-4;
^ Fig. 3 ist eine Elektronenmikrophotographie des gemäß
der Erfindung verwendeten Mikroorganismus Bacillus sp. No.
Y-76;
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, welche den optimalen pH-Wert der alkalischen Protease gemäß der Erfindung
zeigt;
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, welche die Restaktivität der alkalischen Protease gemäß der Erfindung
unter Wirkung des pH-Wertes zeigt;
009850/18 58
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, welche den Bereich der Arbeitstemperatur der alkalischen Protease
gemäß der Erfindung zeigt;
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, welche die Bedingungen für eine Inaktivierung der alkalischen Protease gemäß der Erfindung durch Temperatureinwirkung zeigt;
und
Fig. 8 ist eine Mikrophotographie der Kristalle der alkalischen Protease gemäß der Erfindung.
Das Enzym gemäß der Erfindung, die alkalische Protease, ist ein Protein abbauendes Enzym, das einen optimalen pH-Wert
auf der alkalischen Seite (pH-Wert etwa 11,5) hat, ausgezeichnete Enzymaktivität zeigt, wenn es mit Reinigungsmitteln verwendet wird, und die Waschkraft der Reinigungsmittel
festigt oder verstärkt.
Die enzymatische Aktivität dieser alkalischen Protease ,
in Reinigungsmitteln wird nachstehend als die Wirksamkeit des Enzyms gemäß der Erfindung, aufgrund experimenteller Ergebnisse,
erläutert. ~ μ
1) Gebrauch:
Wenn das Enzym gemäß der Erfindung als Zusatzstoff ftir
Reinigungsmittel verwendet werden soll, wird das kristalline Enzym gemäß der Erfindung unmittelbar zu den Reinigungsmitteln,
wie Natriumdodecylbenzolsulfonat (DBS) und Hatriumlaurylsulfat,
oder gemischt mit anderen Zusatzstoffen, wie Polyäthylenglykoi, zugesetzt. Es gibt keine Begrenzung
bei dieser Zubereitung, wie z.B. der pH-Wert des Reinigungsmittels
oder das Mischungsverhältnis von Reinigungsmittel-
009850/1858
komponenten und Zusatzstoffen. Beispielsweise gibt die Anwendung von 0,01 - 1,0 Gew.-# der Enzymzubereitung gemäß
Beispiel 1 nach der Erfindung gute Wirksamkeit, d.h., es tritt eine gute proteolytische Kraft ein. ·
2) Wirksamkeit (enzymatische Aktivität in Reinigungsmitteln):
' Das Enzym gemäß der Erfindung wurde während einer bestimmten Zeitdauer bei verschiedenen Temperaturen in Gegenwart
eines Reinigungsmittels bebrütet, und die restliche Aktivität des Enzyms wurde gemessen.
Experimentelles Verfahren:
Die Konzentration des Reinigungsmittels zu der Zeit der Berührung mit dem Enzym gemäß der Erfindung betrug 0,1 fo.
Natriumdodecylbenzolsulfonat (DBS) und Natriumlauryl sulfat
wurden als Reinigungsmittel verwendet. Der pH-Wert wurde auf 10,5 zu der Zeit der Reaktion durch die Verwendung eines
Boratpuffers eingestellt.
Reaktionslösung:
Reinigungsmittel, 0,5 5^ 2 ml Boratpuffer (0,05M) 3 ml
kristallines Enzym gemäß
der Erfindung 1 ml
(1 000 U/ml)
Zusatz für Wasser 4 ml
Ergebnis:
Restliche Aktivität des Enzyms gemäß der Erfindung (1) (Reaktionstemperatur: 50° C)
009850/1858
Reinigungsmittel Zusatz restliche Aktivität
O min 30 min 60 min
| Natriumdodecyl- | keiner 100 | ___ | 10 |
| benzolsulfonat | |||
| CaCl2 5 mM 100 | 95 | 94 | |
| 0,02 % Polyäthy1- | |||
| englykol | |||
| (Polymerisationsgrad 2000) | |||
| ÜTatriumlauryl- | keiner 100 | 5-15 | |
| sul fat | |||
| CaCl2 5 mM 100 | 100 | 100 | |
| 0,02 % Polyäthy- | |||
| lenglykol | |||
| (Polymerisationsgrad 2000) |
00 9850/1858
Restliche Aktivität des Enzyms gemäß der Erfindung (2)
(Stabilität gegen Temperatur)
(Berührungszeit: 15 min)
(Berührungszeit: 15 min)
Reinigungsmittel Zusatz restliche Aktivität {%)
5O0C 550C 6O0C 650C
Natriumdodecyl- CaCl2 5 m| 100 100 49 10
ψ benzolsulfonat
0,02$ Polyäthylenglykol
(Polymerisationsgrad 2000)
Wie aus den ohenjstehenden Werten ersichtlich, ist die
Restaktivität des Enzyms gemäß der Erfindung ausgezeichnet,
und es wurde gefunden, daß die Stabilität des Enzyms ausgesprochen durch die vereinigte Anwendung von Zusatzstoffen,
wie CaCIp und Polyäthylenglykol, erhöht wird.
009850/1858
Eine alkalische Protease gemäß der Erfindung ist eine
neue Protease, welche durch die Züchtung eines neuen Stammes
eines Mikroorganismus aus der Gruppe, bestehend aus Bacillus sp. Wo. 221 (ATCC 2/522), Bacillus sp. No. 0-4
(ATCC 2/536) und Bacillus sp. Iio. Y-76 (ATCC 2/537) in
einem Züchtungsmedium, das ein Carbonat, anorganische
Materialien, eine Stickstoffquelle und eine Kohlenstoffquelle
oder nicht ,irgendwelche Zucker enthält und durch Isolierung der in dem Züchtungsmedium erzeugten alkalischen
Protease erzeugt wird. Bezogen auf die physikalischchemischen Eigenschaften der genannten alkalischen Protease
ist diese alkalische Protease als neues Enzym in Vergleich mit den bekannten alkalischen Proteasen bestimmt worden.
Versuche für die praktische Anwendung der genannten alkalischen Protease zeigen, daß diese Protease äußerst
brauchbar als Zusatzstoff für Reinigungsmittel ist.
Praktische Beispiele bei der Anwendung der Erfindung
werden nachstehend gegeben.
Mediumzusammensetzung:
Glucose 10 g K2HPO4 1g
Hefeextrakt 5g
Pepton 5g
MgSO4.7H2O o,25 g
009850/1858
Die oben genannte Zusammensetzung wird in 900 ml Wasser gelöst und bei 1150C 15 min sterilisiert. Eine
Lösung von 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat,gelöst in 100 ml Wasser, wird bei 1150C 15 min sterilisiert. Diese
beiden Lösungen werden dann gemischt, um ein Züchtungsmedium mit einem pH-Wert von etwa 10,5 herzustellen.
50 ml dieses Züchtungsmediums werden in mit Schultern versehene Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) von 500 ml Fassungsvermögen
eingebracht. Der genannte Bacillus sp. No. 221 (ATCC 2/522), über Nacht vorbebrütet, wird in diese Kolben
geimpft und die Kolben werden unter Schütteln bei 370C
48 Stdn. der Züchtung unterworfen. Die Zellen werden aus dem Züchtungsmedium entfernt; 1 ml dieses Züchtunrrsfiltrate
enthält 2 700 Einheiten von alkalischer Protease.
Diese Züchtun;;sbrühe wurde gründlich gekühlt, und es wurden 3 Volumina Äthanol zugegeben, durch welche
das Enzym quantitativ gefällt wurde. Dieser Niederschlag wurde gründlich mit Äthanol gewaschen und in Luft getrocknet.
Etwa 11 g des Pulvers wurden aus einem Liter der Züchtun~sbrühe erhalten.
Die dadurch erhaltene Probe hatte einen optimalen pH-Wert von etwa 11,5 und es wurde gefunden, daß sie aus
einer alkalischen Protease bestand,welche ihre Aktivität selbst dann nicht verlor, wenn sie bei 5O2C eine Stunde
erhitzt wurde. (Spezifische Aktivität 240 000 U/g.)
003SS0/18B8
| Beispiel 2 | 5 | g | g |
| Mediumzusaramensetzung: | O | ,1 | g |
| Weizenkleie | O | ||
| Hefeextrakt | |||
| Maismehl | |||
Die oben genannte Zusammensetzung wird in einen Erlenmeyer-Kolben gebracht, der 250 ml Wasser enthält,und
bei 1150C 20 min sterilisiert. Zu dieser Lösung werden 7 ml
von 1?£iger Natriumcarbonatlösung, sterilisiert bei 1150C
während 15 min, zugegeben und gut vermischt. Eine Platinscheibe des genannten Bacillus sp. No.. 221· (ATCC 2/522)
wird in dieses Medium geimpft; und die Kolben werden statisch bei 3T* 48 Stdn. unter gelegentlichem Bewegen
gezüchtet. Die Protease wurde mit 30 ml Wasser extrahiert;
ihre Aktivität betrug 2 900 U/ml. Die so erhaltene Probe
ist, wie sich erweist, eine alkalische Protease mit einem
optimalen pH-Wert von etwa 11,5, v/elche nicht ihre Aktivität verlor, selbst wenn sie auf 5O2C eine Stunde erhitzt
wurde.
Mediumzusammensetzung:
Hefeextrakt 5g
Pepton 5g
K2HPO4 1 g
MgS047H20 0,25 g
Die oben genannte Zusammensetzung wird in 1000 ml Wasser gelöst, bei 115CC 15 min sterilisiert, um ain Züchtungsmedium
mit einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 7,2 her-
0 09850/18 S 8
zustellen, und 5o ml dieses Züchtungsmediums werden in
mit Schultern versehne Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) von 500 ml Fassungsvermögen eingebracht. Der genannte
Bacillus sp. Ho. 221 (ATCC 2/522), über Ilacht in dem
gleichen Medium vorbebrütet, wird in diese Kolben geimpft und unter Schütteln bei 37^C 4-8 Stdn. der Züchtung unterworfen.
Die Zellen wurden entfernt und die Aktivität der alkalischen Proteaseln diesem Züchtungsfiltrat
betrug 1 950 U/ml.
Dieses Züchtungsfiltrat wurde gründlich gekühlt
und 3 Volumina Äthanol wurden zugegeben, durch welche das Enzym quantitativ gefällt wurde. Dieser niederschlag
wurde gesammelt, gründlich mit Äthanol gewaschen und in Luft getrocknet.
Die so erhaltene Probe erwies sich als eine alkalische
Protease mit einem optimalen pH-Wert von etwa 11,5 und verlor ihre Aktivität nicht, selbst wenn sie bei 500C
eine Stunde erhitzt wurde.
| Beispiel 4 | 1 | g |
| Mediumzusammensetzung: | 5 | g |
| K2HPO4 | 5 | g |
| Hefeextrakt | 0 | ,25 g |
| Pepton | ||
| MgSO4.7H2O | ||
Die oben genannte Zusammensetzung wird in 900 ml Wasser gelöstund die die Lösung bei 1153C 15 min sterilisiert.
Eine 1$oige Lösung von NaHCO-* wird bei 115^ 15min
sterilisiert und 100 ml dieser Lösung werden mit der
0 0 9 8 5 0/1858
oben genannten Lösung gemischt, um ein ZUchtungsmedium
herzustellen. 50 ml des Züchtungsmediums werden in mit
Schultern versehene Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) mit einem 500-ml-Fassungsvermögen gegossen. Der genannte
Bacillus sp. Ι,'ο. 221 (ATCC 2/522), über !lacht in dem
gleichen Medium vorbebrütet, wird in diese Kolben
geimpft, und es erfolgte eine Züchtung unter Schütteln bei 370C während 48 Stdn. Die Zellen wurden entfernt und
die alkalische Protease in diesem Züchtungsfiltrat betrug 2 500 U/ml.
Dieses Züchtungsfiltrat wurde gründlich gekühlt, 5 Volumina Aceton wurden zugegeben und das erzeugte
Enzym wurde gefällt. Dieser Niederschlag wurde gesammelt,
mit Aceton cevaschen und in Luft getrocknet. Es wurden
etwa 1,2 g eines bräunlichen Pulvers aus einem Liter der ZüchtungsbrUhe erhalten.
Die dadurch erhaltene Probe erwies sich als eine alkalische Protease mit einem optimalen pH-V/ert von
etwa 11,5, die ihre Aktivität nicht verlor, selbst wenn sie bei 5tfC eine Stunde erhitzt wurde.(Aktivität: 1 900 QOO
| Beispiel 5 | 20 g |
| MediumzucammenSetzung: | 1 g |
| Lösliche Stärke | 5 g |
| K2HPO4 | 5 g |
| Hefeextrakt | 0,2 g |
| Pepton . | |
| MgSO4.7H2O | |
009850/1858
Die oben genannte Zusammensetzung wird in 900 ml
Wasser gelöst und bei 1150C 15 min sterilisiert. Eine
Lösung von 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat, gelöst in 100 ml Wasser, wird bei 1150C 15 min sterilisiert.
Diese beiden Lösungen werden gemischt, um ein Züchtungsmedium mit einem pH-Wert von etwa 10,5 herzustellen,
von welchem 50 ml in mit Schultern versehene Kolben (Sakaguchi-Kolben) mit einem Fassungsvermögen von
500 ml eingebracht werden. Der genannte Bacillus sp. No." .Y-76 (ATCC 2/537), über Nacht in dem gleichen Medium
vorbebrütet, wird in diese Kolben geimpft, und die Kolben werden unter Schütteln bei 370C 72 Stdn. der Züchtung
unterworfen. Die Zellen werden aus dem Züchtungsmedium entfernt, und 1 ml dieses Züchtungsfiltrates enthielt
4 500 Einheiten alkalischer Protease.
Diese Züchtungsbrühe wurde gründlich gekühlt und 3 Volumina Äthanol wurden zugegeben, durch welche das
Enzym quantitativ gefällt wurde. Dieser Niederschlag wurde gründlich mit Äthanol gewaschen und in Luft
getrocknet. Aus einem Liter der Züchtungsbrühe wurden etwa 11 g des Pulvers erhalten.
Die dadurch erhaltene Probe hat einen optimalen pH-Wert von etwa 11,5 und sie war, wie gefunden wurde,
eine alkalische Protease, die ihre Aktivität, selbst wenn sie bei 50cC eine Stunde erhitzt wurde, nicht verlor.
(Spezifische Aktivität: 400000 U/g).
0 9 2 5 0/1858
| Beispiel 6 | 20 g |
| Mediumzusammensetzung: | 1 g |
| Lösliche Stärke | 5g |
| K2HPO4 | 5 g |
| Hefeextrakt | 0,2 g |
| Pepton | |
| MgS04.7H20 . | |
Eine Lösung von 1o g Kaliumbicarbonat, gelöst in 100ml
Wasser, wird bei 1150C 15 min sterilisiert. Diese beiden
Lösungen werden gemischt, um ein Züchtungsmedium mit
einem pH-Wert von etwa 10,5 herzustellen, wovon 50 ml in mit Schultern versehene Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben)
mit einem Fassungsvermögen von 500 ml eingebracht werden. Der genannte Bacillus sp. No. Y-76 (ATCC 2/537),
über Nacht in dem gleichen Medium vorbebrütet, wird in diese Kolben geimpft.und die Kolben werden unter Schütteln
bei 370C 72 Stunden einer Züchtung unterworfen.
Die Zellen werden aus dem Züchtungsmedium entfernt; 1 ml dieses Züchtungsfiltrats enthielte 10Ö Einheiten
alkalischer Protease.
Diese Züchtungsbrühe wurde gründlich gekühlt und 3 Volumina Äthanol wurden zugegeben, durch welche das
Enzym quantitativ gefällt wurde. Dieser Niederschlag wurde gründlich mit Äthanol gewaschen und in Luft getrocknet.
Ein Liter der Züchtungsbrühe enthielt etwa 11 g des Pulvers*
Die dadurch erhaltene Probe hat einen optimalen pH-Wert von etwa 12,0·(Spezifische Aktivität! 300 000 U/g)/
008850./ 1868
| 'Bei ST)i.el 7 | 20 g |
| Mediumzusammensetzung: | 1 g |
| Lösliche Stärke | 5 g |
| K2HPO4 | 5 g |
| Hefeextrakt | 0,2 g |
| Pepton | |
| MgSO..7H2O | |
Die oben genannte ZusamnBisetzung wird in 900 ml
Wasser gelöst( und die Lösung bei 1150C 15 min sterilisiert.
Eine 1#ige Lösung von NaHCO5 wird bei 1150C 15 min sterilisiert
und 100 ml dieser Lösung werden mit der oben genannten Lösung gemischt, um ein Züchtungsmedium herzustellen.
50 ml des Züchtungsmediums werden in mit Schultern versehene Schüttelkolben (Sakaguchi-Kolben) mit einem Passungsvermögen
von 500 ml gegossen. Der genannte Bacillus sp. No. 0-4 (ATCC 2/536), über Nacht in dem gleichen Medium vorbebrütet,
wird in diese Kolben g©impft9 und diese Kolben werden unter
Schütteln bei 37:C 72 Stunden einer Züchtung unterworfen.
Die Zellen wurden entferntj und die alkalische Protease
in diesem Züchtungsfiltrat betrug 7 500 U/ml.
Dieses Züchtungsfiltrat wurde gründlich gekühlt, f?
Volumina Aceton wurden zugegeben,und das erzeugte Enzym wurde quantitativ gefällt. Dieser Niederschlag wurde
gesammelt, mit Aceton gewaschen und in Luft getrocknet* Aus einem Liter der Züchtungsbrühe wurden etwa 12 g
eines bräunlichen Pulvers erhalten·
009350/1858
Die dadurch erhaltene Probe war, wie sich ergibt,
eine alkalische Protease mit einem optimalen pH-Wert von etwa 12,0, die ihre Aktivität, selbst wenn sie bei
5CK! eine Stunde erhitzt wurde, nicht verlor, Aktivität: 620 000 U/g).
00985071858
Claims (9)
1) Alkalische Protease, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem säulenförmigen kristallinen Pulver
besteht, ein Molekulargewicht von etwa 33 000 nach der Archibald-Methode hat, folgende analytische Werte aufweist:
48,04% Kohlenstoff, 6,62 Jo Wasserstoff, 16,07 %
Stickstoff, 0,31 % Schwefel und Restsauerstoff und einen optimalen pH-Wert von 11 bis 12 hat.
2) Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Protease mit den physikalisch-chemischen Eigenschaften
gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm eines Mikroorganismus aus der Gruppe von Bacillus
sp. No. 221 (ATCC 2/522), Bacillus sp. No. 0-4 (ATCC 2/536) xma Bacillus sp. Ho. Y-76 (ATCC 2/537) in ein Züchtungsmedium impft, das aus einem Carbonat, einer Kohlenstoffquelle,
einer Stickstoffquelle und einem anorganischen
Material zusammengesetzt Et, das Züchtungsmedium bei
einem pH-Wert von 7 bis 11 während einer ausreichenden Zeitdauer züchtet, um eine wesentliche Enzymaktivität
in dem Züchtungsmedium herbeizuführen und die alkalische Protease in dem Züchtungsmedium zu erzeugen und die alkalische
Protease von dem Züchtungsmedium sammelt.
3) Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Protease mit den physikalisch-chemischen Eigenschaften gemäß
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Bacillus sp. Ho. 221 (ATCC 2/522) in ein Züchtungsmedium
impft, in dem keine Zucker enthalten sind,und das aus einem Carbonat, einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle
und einem anorganischen Material zusammengesetzt ist, das Züchtungsmedium bei einem pH-Wert von
6 bis 11 während einer ausreichenden Zeitdauer züchtet,
009850/18 5 8
um eine wesentliche Enzymaktivität in dem Züchtungsmedium
herbeizuführen und die alkalische Protease in dem Medium zu erzeugen, und die alkalische Protease von dem Züchtungsmedium sammelt.
4) Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung unter aeroben Bedingungen, untergetaucht,
unter Rühren ausgeführt wird.
5) Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 24 bis 450C ausgeführt wird. * ■ ■
6) Verfahren nach Anspruch 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung während et\^a 24 bis 75 Stdn.
ausgeführt wird.
7) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Züchtungsmediums 8 bis 11 beträgt.
8) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der pH-Wert des Züchtungsmediums 6 bis 10 beträgt.
9) Verwendung einer Protease gemäß Anspruch 1 oder hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche %j
bis 8 als Zusatz in einer Menge von opi bis 1,0 Gew.-Jo
zu einer Reinigungsmittelzusainmensetzung, die Natriumdodecylbenzolsulfat
und Matriumlaurylsulfat umfaßt und einen
pH-Wert zwischen 9 und 12 in einer wäßrigen Waschlösung
liefert,und gegebenenfalls Polyäthylenglykol und/oder Calciumchlorid enthält.
0098 50/1858
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