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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein wärmestabiles, Kollagen-abbauendes
Enzym, das von einem neuen Mikroorganismus hergestellt wird, und
den neuen Mikroorganismus und ein Verfahren zur Herstellung des
Enzyms durch den Mikroorganismus. Die vorliegende Erfindung betrifft
speziell ein neues, wärmestabiles, Kollagen-abbauendes,
von einem neuen Mikroorganismus der Gattung Bacillus hergestelltes
Enzym, das die höchste
Reaktivität
(Substratspezifität)
für Kollagen
aufweist, den neuen Mikroorganismus und ein Verfahren zur Herstellung
des Enzyms durch den Mikroorganismus.
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Beschreibung
des Stands der Technik
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Kollagen-abbauende
und Gelatine-abbauende Enzyme werden in der Industrie weit verwendet.
Beispielsweise sind Kollagenpeptide, bei denen es sich um Kollagen-Hydrolyseprodukte
dieser Enzyme handelt, wegen ihrer interessanten physiologischen
Wirkungen, wie z. B. feuchtigkeitsbeibehaltende Wirkungen oder immunitätsaktivierende
Wirkung, als Material für
Kosmetika verwendbar. Daher werden Kollagenpeptide für medizinische
und kosmetische Zwecke weit verwendet. Ferner wird Gelatine, bei
dem es sich um eine denaturierte Form von Kollagen handelt, als
Beschichtungsmaterial für
photographische Filme verwendet, und Gelatine-abbauende Enzyme werden
zum Rückführen der
photographischen Filme und Röntgenfilme
verwendet. Viele Proteinasearten sind dafür bekannt, Gelatine abzubauen;
der Abbau von Kollagen durch diese Proteinasen ist jedoch noch schwierig.
Für die
Hydrolyse von Kollagen sollten spezifische Metallproteinasen, die „Kollagenase" genannt werden,
verwendet werden.
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In
letzter Zeit wurden viele Versuche zur effektiven Verwendung von
organischen Abfällen
unternommen. Beispielsweise handelt es sich bei der Kompostierung
von Haushaltsabfällen
um ein spezielles Beispiel der biologischen Rückführung von organischen Abfällen. Über 30 %
des tierischen Proteins ist aus Kollagen zusammengesetzt, und daher
sollten Haushaltsabfälle,
die bei den täglichen
Küchenarbeiten
in Haushalten und Speisegaststätten
anfallen, und die Abfälle
von fleischverarbeitenden Fabriken große Mengen an Kollagen enthalten.
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Wegen
seiner speziellen, hochgeordneten Struktur ist Kollagen allgemein
unlöslich
in Wasser und schwierig abzubauen, und daher verläuft der
Abbau von Kollagen während
des Kompostierens sehr langsam. Der größte Teil der in Tierindustrien
anfallenden nichtverwendbaren Teile ist aus Kollagen zusammengesetzt und
wird daher durch Verbrennung behandelt, was Probleme wie z. B. Erwärmung der
Erde oder die Erzeugung von Kohlendioxid oder Dioxin, die Luftverschmutzung
verursachen, verursacht.
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Diese
Probleme müssen
unter dem Gesichtspunkt, die Materialien effektiv zu verwenden,
gelöst
werden.
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Es
ist bekannt, dass die Temperatur der organischen Abfälle während des
Kompostierungsvorgangs auf 50–65 °C oder mehr
ansteigt. Daher sollte die Kompostierung von organischen Abfällen, wenn
wärmestabile
Enzyme oder thermophile Mikroorganismen, die sogar unter derartigen
Hochtemperatur-Kompostierungsbedingungen
aktiv sind, verwendet werden, effektiver verlaufen.
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Heutzutage
handelt es sich bei industriellen Kollagenasen um solche aus Mikroorganismen
(Bakterien), und als ein spezielles Beispiel kann eine aktinomycetische
Kollagenase aus der Gattung Streptomyces genannt werden. Es sind
auch andere mikrobielle Kollagenasen bekannt; beispielsweise handelt
es sich bei Kollagenasen aus Clostridium hystolyticum (Biochemistry
1984, 23, 3077–3085)
und Cytophaga sp. (Biosci., Biotech., Biochem., 1993, 57, 1894–1898) um
spezielle Beispiele.
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Das
Beispiel von industriell verwendetem Enzym betreffend, muss das
Enzym unter dem Gesichtspunkt der Behandlungsgeschwindigkeit und
des zu behandelnden Gegenstands wärmestabil sein.
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Alle
bekannten Kollagenasen sind jedoch von mesophilem Ursprung und ermangeln
Wärmestabilität, und diese
Umstände
erschweren ihre effizienten industriellen Anwendungen. Bisher wurde
ein Kollagen-abbauendes Enzym mit ausreichender Wärmestabilität (mit hoher
Optimaltemperatur) für
die industriellen Anwendungen noch nicht entwickelt.
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Üblicherweise
ist es schwierig, Kollagen in industriellem Maßstab zu verwenden, da es kein
wärmestabiles
Enzym, das in industriellem Maßstab
effektiv wirkt, gibt. Es ist daher offensichtlich, dass das vorstehend
genannte Problem vollkommen gelöst
werden kann, wenn ein Enzym mit einer hohen Aktivität für Kollagen
entwickelt wird.
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Wie
vorstehend erwähnt,
ist es die Aufgabe dieser Erfindung, ein wärmestabiles, Kollagen-abbauendes
Enzym zu finden.
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Die
Erfinder dieser Erfindung haben eine eingehende Untersuchung durchgeführt, um
einen Mikroorganismus, der ein wärmestabiles,
Kollagen-abbauendes Enzym in der Natur herstellt, zu finden, und
haben ein vielversprechendes, thermophiles, zu der Gattung Bacillus
gehörendes
Bakterium, das das Enzym im Erdreich von Sendai, Japan, herstellt,
gefunden, und die vorliegende Erfindung fertiggestellt.
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Der
Mikroorganismus, der zur Herstellung eines wärmestabilen, Kollagenabbauenden
Enzyms dieser Erfindung verwendet wird, gehört zu der Gattung Bacillus
und wird Stamm NTAP-1 genannt. Dieser Stamm wurde gemäß dem Hinterlegungserfordernis
des Budapester Vertrags bei dem „Biotic Technology Industries Institute
of the Agency of Industrial Science of Technology", das zum „Ministry
of International Trade and Industry Japan" gehört,
hinterlegt, und unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6926 am 1.
November 1999 angenommen. (Dieser Stamm wurde ursprünglich am
27. August 1999 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-17535 hinterlegt.)
(In der Beschreibung wird dieser Stamm nur als NTAP-1-Stamm abgekürzt.)
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Die
Erfinder haben gefunden, dass das industriell verwendbare Enzym
durch die Verwendung dieses Stamms erhalten werden kann, und dass
das erhaltene Enzym als Katalysator bei der Biokonversion verwendet
werden kann.
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Genaue Beschreibung
der Erfindung
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Bei
dem ersten wichtigen Punkt dieser Erfindung handelt es sich um ein
wärmestabiles,
Kollagen-abbauendes Enzym, das aus einem Bakterium, das zu einer
Bacillus-Gattung gehört,
erhältlich
ist, wobei: (1) das Bakterium Gram-negativ oder Gram-undefiniert
ist; (2) das Bakterium Sporenbildungsfähigkeit aufweist; (3) das Bakterium
bewegungsfähig
ist; (4) das Bakterium bei 70 °C
wächst
und bei 30 °C
oder 80 °C
nicht wächst; (5)
bei pH 5 wächst
und bei pH 7 nicht wächst;
(6) das Bakterium stäbchenförmig ist;
(7) das Bakterium für Katalase
negativ ist; (8) das Bakterium für
Oxidase negativ ist; (9) das Bakterium bei einem O/F-Test negativ ist;
(10) das Bakterium eine Acetoin-produzierende Aktivität aufweist;
und (11) das Bakterium eine Gelatine-abbauende Aktivität aufweist,
und das Enzym ferner durch folgende Merkmale gekennzeichnet ist:
(a): das Enzym weist höhere
Hydrolyse-Aktivität gegenüber Kollagen
und Gelatine als gegenüber
Kasein und Albumin auf; (b) der optimale pH-Wert der Umsetzung liegt
zwischen pH 3,5 und 4,5; (c) die optimale Temperatur der Umsetzung
liegt zwischen 65 °C
und 70 °C;
(d) das Enzym behält
nach einer vierstündigen
Wärmebehandlung bei
60 °C und
einem pH-Wert von 6,0 mehr als 60 % seiner ursprünglichen Aktivität; (e) das
Enzym ist zwischen pH 3 und 6 stabil; und (f) das über SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
abgeschätzte
Molekulargewicht des Enzyms beträgt
etwa 46 000.
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Demgemäss kann
eine ausgezeichnete Wirkung und Wirkungsweise, die zum Abbau von
Kollagen bei 70 °C
oder niedrigeren Temperaturen verwendet werden kann, erwartet werden.
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Vorzugsweise
wird das wärmestabile,
Kollagen-abbauende Enzym dieser Erfindung von dem Mikroorganismus,
der zu der Gattung Bacillus oder dem Bacillus sp.-Stamm-NTAP-1 gehört, hergestellt.
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Bei
dem zweiten wichtigen Punkt dieser Erfindung handelt es sich um
ein Verfahren zur Herstellung des wärmestabilen, Kollagen-abbauenden
Enzyms der Erfindung, umfassend die Verwendung eines Mikroorganismus,
der die folgenden Eigenschaften aufweist, d. h. mit den folgenden
Eigenschaften: (1) das Bakterium ist Gram-negativ oder Gram-undefiniert,
(2) das Bakterium weist Sporenbildungsfähigkeit auf, (3) das Bakterium
ist bewegungsfähig,
(4) das Bakterium wächst
bei 70 °C,
wächst
nicht bei 30 °C
oder 80 °C
und (5) wächst bei
pH 5, wächst
nicht bei pH 7, (6) das Bakterium ist stäbchenförmig, (7) das Bakterium ist
für Katalase
negativ, (8) das Bakterium ist für
Oxidase negativ, (9) das Bakterium ist bei einem O/F-Test negativ,
(10) das Bakterium weist eine Acetoin-produzierende Aktivität auf und
(11) das Bakterium weist eine Gelatine-abbauende Aktivität auf, Reinigen
und Sammeln des wärmestabilen,
Kollagen-abbauenden Enzyms.
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Bei
dem Verfahren zur Herstellung des wärmestabilen, Kollagen-abbauenden
Enzyms handelt es sich bei dem Mikroorganismus, der zu der Gattung
Bacillus gehört,
vorzugsweise um den NTAP-1-Stamm der Bakterien der Bacillus-Gattung.
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Bei
dem dritten wichtigen Punkt dieser Erfindung handelt es sich um
einen neu entwickelten, zu einer Bacillus-Gattung gehörenden Mikroorganismus,
der das wärmestabile,
Kollagen-abbauende Enzym herstellt, vorzugsweise handelt es sich
bei dem Mikroorganismus um den als Bacillus sp. NTAP-1 bezeichneten
Stamm, der gemäß dem Hinterlegungserfordernis
des Budapester Vertrags bei dem „Biotic Technology Industries
Institute of the Agency of Industrial Science of Technology", das zum „Ministry
of International Trade and Industry Japan" gehört,
hinterlegt und unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6926 am 1.
November 1999 angenommen wurde (Dieser Stamm wurde ursprünglich am
27. August 1999 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-17535 hinterlegt.).
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Die
Erfinder dieser Erfindung haben gefunden, dass sich unter den zur
Bacillus-Gattung
gehörenden Mikroorganismen
ein neuer Mikroorganismus befindet, der ein wärmestabiles, Kollagen-abbauendes
Enzym herstellt, und haben die vorliegende Erfindung fertiggestellt.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
ein Schaubild, das die Wärmestabilität des wärmestabilen,
Kollagenabbauenden Enzyms zeigt, 2 ist ein
Schaubild, das die pH-Stabilität
des wärmestabilen,
Kollagen-abbauenden Enzyms zeigt, 3 ist ein
Schaubild, das die Temperaturabhängigkeit
der Umsetzung des wärmestabilen,
Kollagen-abbauenden Enzyms zeigt und 4 ist ein
Schaubild, das die pH-Abhängigkeit
der Umsetzung des wärmestabilen, Kollagen-abbauenden
Enzyms zeigt.
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Die beste
Ausführungsform
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wird nun ausführlicher veranschaulicht.
- A. Die mikrobiologischen Kennzeichen von Bakterien,
die verwendet werden, um ein wärmestabiles,
Kollagen-abbauendes Enzym herzustellen, sind vorstehend genannt.
Dieser Mikroorganismus kann ferner durch ein Gefrierverfahren (etwa –80 °C) konserviert
werden.
- B. Wachstumsbedingung
Name des Kulturmediums: GGY-Medium
Komponenten
des Mediums: Medium, das 1,5 % Glucose, 1,5 % Gelatine und 0,01
% Hefeextrakt enthält.
- pH-Wert des Mediums: 4,8
Sterilisierungsbedingung des Mediums:
20 Minuten bei 120 °C
Temperatur
des Mediums: 60 °C
Aerobe
Bedingung
- C. Komponenten des Schutzmittels: 30 %-ige wässrige Glycerinlösung (es
ist nicht notwendig, den pH-Wert des Schutzmittels einzustellen).
Es
ist nicht notwendig, den pH-Wert des Schutzmittels einzustellen
Sterilisierungsbedingung des Schutzmittels: 20 Minuten bei 120 °C
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Die
Eigenschaften des wärmestabilen,
Kollagen-abbauenden Enzyms dieser Erfindung werden mit Bezug auf
die Zeichnungen genauer veranschaulicht.
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1 ist
ein Schaubild, das die relative verbleibende Aktivität des wärmestabilen,
Kollagen-abbauenden Enzyms nach 1-stündiger Wärmebehandlung bei verschiedenen
Temperaturen zeigt, und in diesem Schaubild wird die Aktivität nach der
Wärmebehandlung
bei 30 °C
als 100 % angenommen.
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2 ist
ein Schaubild, das die relative verbleibende Aktivität des wärmestabilen,
Kollagen-abbauenden Enzyms nach 1-stündiger Behandlung bei verschiedenen
pH-Werten zeigt,
und in diesem Schaubild wird die Aktivität nach der Behandlung bei einem
pH-Wert von 4,1 als 100 % angenommen.
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3 ist
ein Schaubild, das die relative Aktivität des wärmestabilen, Kollagenabbauenden
Enzyms bei verschiedenen Temperaturen zeigt, und in diesem Schaubild
wird die Enzymaktivität
bei 60 °C,
die die maximale Aktivität
darstellt, als 100 % angenommen.
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4 ist
ein Schaubild, das die relative Aktivität des wärmestabilen, Kollagenabbauenden
Enzyms bei verschiedenen pH-Werten zeigt, und in diesem Schaubild
wird die Enzymaktivität
bei einem pH-Wert von 3,8, die den maximalen Aktivitätswert darstellt,
als 100 % angenommen.
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Beispiele
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[Beispiel 1]
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Verschiedene
Arten von Proben, wie z. B. Erdreiche, Komposte, Fluss- und Seewasser
wurden mit 0,85 %-iger NaCl auf das 100-10000-fache verdünnt, und
0,1 ml der verdünnten
Lösung
wurde auf GGY-Agar-Agar-Medium verteilt und dann 2 oder 3 Tage bei
70 °C belassen.
Die auf dem Medium gewachsene Kolonie wurde isoliert und in 5 ml
flüssiges
GGY-Medium eingeimpft, und unter Schütteln 2 oder 3 Tage bei 70 °C kultiviert.
Die Kollagen-abbauende Enzymaktivität von mehreren hundert Arten
von Isolaten wurde unter Verwendung des Kulturüberstands gemäß dem in
Beispiel 2 beschriebenen Verfahren ausgewertet.
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Der
Stamm, der die höchste
Kollagen-abbauende Aktivität
aufweist, wurde ausgewählt
und NTAP-1-Stamm genannt.
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Die
taxonomischen Eigenschaften des NTAP-1-Stamms können folgendermaßen beschrieben
werden.
- (1) Zellmorphologie: stäbchenförmig (0,8 × 2–3 μm), gebogen
und wird durch Alterung kettenförmig.
- (2) Gram-Färbung:
negativ oder undefiniert
- (3) Sporenbildungsfähigkeit:
ja
- (4) Bewegungsfähigkeit:
ja
- (5) Form und Eigenschaften von Kolonien: kreisförmig, wellig
oder leicht konvex, mit glatter Oberfläche und transparent.
- (6) Wachstumstemperatur: wächst
bei 70 °C,
wächst
aber nicht bei 80 °C.
- (7) Katalase: negativ
- (8) Oxidase: negativ
- (9) O/F-Test: negativ
- (10) Biochemischer Test:
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- Baut ab: Glucose, Fructose, Sorbose, D-Arabinose, L-Arabinose,
Ribose, D-Xylitol,
L-Xylitol, D-Turanose, L-Turanose, D-Lyxose, D-Tagatose, 5-Ketogluconsäure.
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- Baut nicht ab: Glycerol, Erythritol, Adonitol, β-Methyl-D-xylose,
Galactose, Mannose, Rhamnose, Dulcitol, α-Methyl-D-mannose, α-Methyl-D-glucose,
N-Acetylglucosamin, Amidaglin, Arbutin, Aesuculin, Salicin, Cellobiose,
Maltose, Milchzucker, Melibiose, Rohrzucker, Trehalose, Inulin,
Melezitose, Raffinose, Glycogen, Xylitol, Gentiobiose, D-Fucose,
L-Fucose, D-Arabitol, L-Arabitol, 2-Ketogluconsäure. Enzymaktivität
| β-Galactosidase | negativ |
| Arginindihydrolase | negativ |
| Lysindecarboxylase | negativ |
| Urease | negativ |
| Tryptophandesaminase | negativ |
| Gelatinase | positiv |
Andere | Verwendung
von Citronensäure | nein |
| Herstellung
von H2S | nein |
| Herstellung
von Indol | negativ |
| Herstellung
von Acetoin | positiv |
| Reduktion
von Nitrat | positiv |
| Anaerobes
Wachstum | geringfügig beobachtet |
| Wachstum
bei pH-Wert 7 | nein |
| Wachstum
bei pH-Wert 5,1 | ja |
| Wachstum
bei 30 °C | nein |
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Im
Hinblick auf die vorstehend genannten taxonomischen Eigenschaften
wird bezügl.
der taxonomischen Einordnung dieses Bakteriums auf Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology, Band 2, Seiten 1104–1139, Autor: S. H. Sneath,
Editor: P. N. Snerth et al. (Herausgeber: Williams & Willkins) Bezug
genommen.
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Bei
diesem Bakterium handelt es sich um ein sporenbildendes, stäbchenförmiges Bakterium.
Obwohl sich die Gram-negative Eigenschaft des Bakteriums von der
Gram-positiven Eigenschaft von bekannten Arten der Gattung Bacillus
unterscheidet, wird erkannt, dass es sich um einen Stamm der Gattung
Bacillus handelt, da es aerobisch wächst.
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Unter
den bekannten Arten der Gattung Bacillus sind B. acidocaldarius,
B. lichenformis oder B. coagulans als thermophil und acidophil bekannt.
Bei diesem Stamm sollte es sich jedoch nicht um B. lichenformis und
B. coagulans handeln, da B. lichenformis oder B. coagulans Katalase-positiv
sind und bei 40 °C,
aber nicht bei 65 °C,
wachsen können.
Er unterscheidet sich auch von der gewöhnlichen Art B. acidocaldarius,
da er Acetoin herstellt. Es ist daher nicht möglich zu bestätigen, ob
es sich bei ihm um eine veränderte
Art von B. acidocaldarius handelt oder ob es zu einer anderen Art
gehört;
die Art dieses Bakteriums kann nicht angegeben werden.
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[Beispiel 2]
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5
ml Medium (pH-Wert 4,8), das 1,5 % Glucose, 1,5 % Gelatine und 0,01
Hefeextrakt enthält,
werden in ein 5 ml-Probenröhrchen
gegeben und 20 Minuten bei 120 °C
sterilisiert. NTAP-1 (der abgekürzte
Name von Bacillus-Gattung NTAP-1, um den Mikroorganismus dieser
Erfindung zu kennzeichnen) wird in das Medium eingeimpft und unter
Schütteln
4 Tage kultiviert. Das Kulturmedium wird 20 Minuten mit 8000 U/min
zentrifugiert und die Aktivität
des wärmestabilen,
Kollagenabbauenden Enzyms im Überstand
wird gemessen. Das heißt,
es werden 0,4 ml der Enzymflüssigkeit
mit 0,1 ml 1 M Natriumacetatpuffer (pH-Wert 4,5) gemischt, und das
Gemisch wird 5 Minuten bei 60 °C
vorinkubiert. Dann werden 3 mg Azocoll (Azofarbstoff-gebundenes
Kollagenpulver: Produkt der Sigma Co., Ltd.) suspendiert und die
Enzymreaktion wird 1 Stunde unter Rühren bei 60 °C durchgeführt. Nach
der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch auf Eis gekühlt, und
unlösliches
Azocoll wird durch Zentrifugieren abgetrennt.
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Während der
Enzymreaktion wird Azocoll durch das Enzym abgebaut und der Überstand
wird rot. Durch Messen der Extinktion des Überstands bei 518 nm wird die
Aktivität
des wärmestabilen,
Kollagen-abbauenden Enzyms abgeschätzt. Die Enzymmenge, die bei
der genannten Bedingung eine Zunahme der Extinktion bei 518 nm um
0,001 pro 1 Minute verursacht, wird als 1 Einheit (U) definiert.
Die Konzentration der Enzymaktivität der erhaltenen Überstandsflüssigkeit
der kultivierten Flüssigkeit
beträgt
3,1 U/ml.
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[Beispiel 3]
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6
Liter des gleichen Mediums wie in Beispiel 2 werden in einen Schüttelfermentery
mit einem 10-Liter-Gefäß gegeben.
Nach 30-minütigem
Sterilisieren bei 120 °C
werden 200 ml der NTAP-1-Kultur in das Medium eingeimpft. Das Kultivieren
wird 4 Tage bei 60 °C
unter Belüftung
mit 6 Liter/min durchgeführt.
Die wärmestabile,
Kollagenabbauende Aktivität
des Kulturüberstands
wird gemessen. Die Enzymaktivität
der Überstandsflüssigkeit
beträgt
5,0 U/ml.
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Der
entstandene Überstand
wurde als Ausgangsmaterial verwendet, die Reinigung und Konzentrierung
des wärmestabilen,
Kollagen-abbauenden Enzyms wurde gemäß folgendem Verfahren durchgeführt.
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Ammoniumsulfat
wird zu der Überstandsflüssigkeit
zugegeben, und das bei 40 %-iger
Ammoniumsulfat-Sättigung
gebildete Präzipitat
wurde gesammelt und in 585 ml 0,01 M Acetatpuffer (pH-Wert 5,0)
gelöst. Phenyl-Sepharose
(Produkt von AmershamPharmacia Biotech.) wurde zu der Lösung zugegeben,
1 Stunde gerührt
und gemischt, dann wurde das Gemisch filtriert und das Harz abgetrennt.
Die an das Harz absorbierte Enzymaktivität wurde durch Waschen des Harzes
mit einem 1:1-Gemisch
von 0,01 M Essigsäurepuffer (pH-Wert
5,0) und Ethylenglycol eluiert, und die aktive Fraktion wurde dann
gegen 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) dialysiert.
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Dann
wurde die Lösung
durch eine DEAE-Sephadex (AmershamPharmacia Biotech)-Säule, die
zuvor mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) äquilibriert worden ist, gegeben.
Ein linearer Natriumchloridgradient (0–1 M) wurde verwendet, um die
Enzymaktivität
von der Säule
zu eluieren. Das Eluat wurde in etwa 90 Fraktionen aufgeteilt, und
die Enzymaktivität
jeder Fraktion wurde gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gemessen.
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Dann
wurde zu den aktiven Fraktionen (233 ml) Ammoniumsulfat bis zu 20
%-iger Sättigung
zugegeben. Die Enzymaktivität
wird an eine Säule
adsorbiert, indem die Enzymlösung
durch eine Phenyl-Sepharose (AmershamPharmacia Biotech)-Säule, die
zuvor mit 0,01 M Essigsäurepuffer
(pH-Wert 5,0) äquilibriert
wurde, geführt
wird.
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Dann
wurde die an die Säule
adsorbierte Enzymaktivität
durch Waschen der Säule
mit einem linearen Konzentrationsgefälle (0–50 %) von Ethylenglycol im Äquilibrierungspuffer
eluiert. Die eluierte Lösung
wird in etwa 90 Fraktionen aufgeteilt und die Enzymaktivität in jeder
Fraktion wird gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Messverfahren gemessen. Aus Fraktionen
eluierter Lösung
werden aktive Fraktionen (insgesamt 48 ml) gesammelt.
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Die
Lösung
wird gegen 0,01 M Phosphatpufter (pH-Wert 7,0) dialysiert, dann
auf eine MONO-Q (AmershamPharmacia Biotech)-Säule, die zuvor mit dem gleichen
Puffer äquilibriert
wurde, aufgebracht. Die Aktivität
wurde durch Waschen der Säule
mit einem linearen Natriumchloridgradienten (0–1 M) eluiert.
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Aktive
Fraktionen (10,6 ml) wurden gesammelt und unter Verwendung eines
Centricon (Zentrifugenkonzentrator: Amicon Co., Ltd.: der Konzentrator
weist eine Ultrafiltrationsmembran aus einem Cellulosederivat am
Boden des Behälters
auf. Wenn eine gemischte Lösung,
die aus Enzym und Protein zusammengesetzt ist, in den Behälter gegeben
und mit 6000 U/min zentrifugiert wird, verbleibt in der Lösung enthaltenes
Protein auf der Membran, während
Wasser und Ionen mit niedrigem Molekulargewicht durch den Film gelangen
und als eine filtrierte Flüssigkeit
wiedergewonnen werden) auf 0,5 ml konzentriert, und mit einem Gelfiltrations- Chromatographieverfahren
getrennt, und 1,2 ml Fraktion mit höherer Aktivität werden
gewonnen. Die Aktivitätsausbeute
der gelösten
Fraktion aus der kultivierten Flüssigkeit
beträgt
1,4 %, und die Konzentration des aktivierten Enzyms beträgt 416 U/ml.
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Die
so erhaltene Enzymlösung
wurde mit SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gemäß dem Laemmli-Verfahren (Laemmli,
U. K., Nature, 1970, 227, 680–685)
analysiert, und das Molekulargewicht des wärmestabilen, Kollagen-abbauenden
Enzyms wird zu etwa 46 000 abgeschätzt.
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[Beispiel 4]
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(Experiment, um die Substratspezifität des wärmestabilen,
Kollagen-abbauenden Enzyms zu untersuchen).
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Nachdem
5 mg Azocoll in 0,4 ml 0,01 M Natriumacetatpuffer (pH 4,5) suspendiert
wurde, wurde 0,1 ml Enzymlösung,
deren Enzymkonzentration durch Verdünnen richtig eingestellt ist,
zugegeben und 1 Stunde bei 60 °C
unter ständigem
Schütteln
zur Umsetzung gebracht. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch
1 Stunde auf Eis gekühlt
und dann zentrifugiert. Die Extinktion des Überstands bei 518 nm wurde
gemessen. Ein Reaktionsgemisch, das mit dem gleichen Verfahren,
außer
dass Wasser anstatt von Enzymlösung
verwendet wurde, hergestellt wurde, wurde als Blindlösung verwendet.
Die Extinktion bei 518 nm des Reaktionsgemischs, dessen zugegebenes
Azocoll vollständig
löslich
gemacht war, wurde gemessen. Die gleichen Experimente wurden mit
verschiedenen Enzymkonzentrationen durchgeführt, und die Enzymmenge, die unter
dieser Bedingung etwa 50 %-igen Abbau (um etwa 2,5 mg Azocoll löslich zu
machen) ergibt, wurde bestimmt.
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Mit
dem gleichen Verfahren wie vorstehend genannt werden jeweils 5 mg
Kollagen, Gelatine, Kasein oder Rinderserum-Albumin (alle sind Produkte
der Nacalai Tesque, Co.) in 0,4 ml 0,01 M Natriumacetatpufterlösung (pH-Wert
4,5) suspendiert (oder gelöst),
dann wird 0,1 ml Enzymlösung
mit zuvor festgelegter Konzentration zugegeben und 1 Stunde bei
60 °C unter
ständigem
Schütteln
umgesetzt. Nach der Umsetzung wird das Reaktionsgemisch 20 Minuten
bei 4 °C
belassen und zentrifugiert. In Fällen,
die Kasein oder Rinderserum-Albumin verwenden, wird zu dem Reaktionsgemisch
0,5 ml 50 %-ige Trichloressigsäure
zugegeben, 20 Minuten bei 4 °C
belassen und dann zentrifugiert. Die Extinktion des Überstands
bei 280 nm wurde gemessen. Wenn jedes der Proteine vollständig löslich gemacht
ist, wird aus dem Extinktionswert bei 280 nm das Abbauverhältnis jedes
Proteins gemessen. Wenn die Abbaurate von Azocoll als 100 % betrachtet
wird, sind die relativen Löslichmachungsraten
der einzelnen Proteine in Tabelle 1 angegeben. Tabelle
1 Relative
Löslichmachungsrate
der einzelnen Proteine, wenn die Abbaurate von Azocoll als 100 %
betrachtet wird
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Dieses Enzym ist bis 60 °C
stabil. Außerdem
wird die Stabilität
von Enzymen untersucht, wobei Enzyme mit verschiedenen pH-Werten
behandelt werden. Die in speziellen Bereichen des pH-Werts zu verwendenden
Puffer sind nachstehend angegeben.
pH-Wert 2,5 bis 3,5: 1 M
Glycin-HCl-Puffer
pH-Wert 3,5 bis 5,5: 1 M Natriumacetatpufter
pH-Wert
6,0 bis 8,0: 1 M Natriumphosphatpufter
pH-Wert 8,0 bis 9,0:
1 M Glycin-NaOH-Puffer
pH-Wert 9,0 bis 10,0: 1 M Natriumphosphatpuffer
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Nachdem
0,0025 ml dieser Puffer und 0,0025 ml 1 %-ige wässrige Tween 80-Lösung zu
0,02 ml Enzymflüssigkeit
zugegeben wurden, wird sie 1 Stunde bei einer Temperatur von 60 °C belassen.
Dann wird 0,05 ml 1 M Essigsäurepuffer
(pH-Wert 4,0) zu dieser behandelten Enzymflüssigkeit zugegeben und die
Aktivität wird
gemessen. Das erhaltene Ergebnis zeigt, dass dieses Enzym im Bereich
des pH-Werts von
3 bis 6 stabil ist (2).
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[Beispiel 7]
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(Experiment, um die optimale
Reaktionstemperatur und den optimalen Reaktions-pH-Wert des wärmestabilen, Kollagen-abbauenden
Enzyms zu untersuchen).
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Die
Aktivität
des wärmestabilen,
Kollagen-abbauenden Enzyms dieser Erfindung wurde bei 30, 40, 50, 60,
70 und 80 °C
gemessen. Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde verwendet,
außer
dass die Reaktionstemperatur geändert
wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass dieses Enzym die höchste Aktivität bei 60 °C aufwies
(siehe 3).
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Zweitens
wird die Aktivität
dieses Enzyms bei verschiedenen (pH-Werte von 2,5 bis 7,2) gemessen. Das
Verfahren zur Aktivitätsmessung
basierte auf dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens, außer dass
die im Reaktionssystem zu verwendende Pufferkomponente folgendermaßen geändert wurde:
0,01 M Glycin-HCl-Puffer (pH-Wert
2,5 bis 7,2), 0,01 M Natriumacetatpufter (pH-Wert 4 bis 6) und 0,01
M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6 bis 8). Die Ergebnisse zeigten,
dass dieses Enzym die höchste
Aktivität
bei einem pH-Wert von 3,7 bis 3,9 aufweist (siehe 4).
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Möglichkeiten
zur industriellen Verwendung
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Es
ist aus den vorstehend genannten Beispielen offensichtlich, dass
es durch die vorliegende Erfindung möglich wird, ein wärmestabiles,
Kollagen-abbauendes Enzym, das bei der optimalen Temperatur, optimalem
pH-Wert und Kollagen-Substratspezifität ausgezeichnet
ist, durch die Verwendung des vorstehend genannten neuen Mikroorganismus
effektiv herzustellen. Daher ermöglicht
es die vorliegende Erfindung, die Materialien, die in Tierindustrien
nicht verwendet werden, zu verwenden und wesentlich zur Herstellung
von Kollagenpeptiden, die mögliche
Anwendungen in den medizinischen, pharmazeutischen und Lebensmittel-Industrien
haben, beizutragen.