JP4175746B2 - 新規な耐熱性コラーゲン分解酵素、前記酵素を産生する新規な微生物および前記酵素の製造方法 - Google Patents
新規な耐熱性コラーゲン分解酵素、前記酵素を産生する新規な微生物および前記酵素の製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な微生物起源の耐熱性コラーゲン分解酵素、前記新規な微生物および前記微生物による前記酵素の製造方法、具体的には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する新規な微生物起源のコラーゲンに対して最も高い反応性（基質特異性）を有する新親な耐熱性コラーゲン分解酵素、前記新規な微生物および前記微生物による前記酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
コラーゲン分解酵素やゼラチン分解酵素は工業的利用価値の高い酵素である。例えばコラーゲンのベプチド性加水分解物には、シワ取りなどの美容整形用の材料としての有用性があり、また保湿性、免疫賦活作用等の興味深い生理活性も見いだされており、実際に、コラーゲンを低分子化したベプチドが医療や化粧品分野において多量に用いられている。また、写真用乳剤などにはゼラチンが用いられており、レントゲンや写真のフィルムのリサイクルにはゼラチン分解酵素が用いられている。コラーゲンの変性産物であるゼラチンを分解できるプロテアーゼは多数知られているが、これらのプロテアーゼによるコラーゲンの分解は困難であり、コラーゲンの加水分解には「コラゲナーゼ」と呼ばれる特異的な金属プロテアーゼ群が用いられている。
【０００３】
また近年、有機廃棄物の有効利用のためのバイオコンバージョン（生物学的変換）が積極的に試みられている。例えば生ゴミの堆肥化（コンポスト化）はその好例である。動物性タンパク質の３０％以上はコラーゲンからなっており、一般家庭や食堂から出される生ゴミ、および食肉加工業において排出される廃棄物にもコラーゲンが多量に含まれている。コラーゲンはその特殊な高次構造のために一般に難溶性・難分解性であり、コンポスト化においても比較的分解の遅いタンパク質である。畜産資源の非利用部分の多くは難分解性で、多くは焼却処分されているのが現状であり、地球の温暖化や大気汚染で問題とされている二酸化炭素やダイオキシンなどの発生をもたらしている。これは物質の有効利用という点から見ても解決すべき問題である。コンポスト化の過程で有機廃棄物の品温は微生物の発酵熱により５０〜６５℃あるいはそれ以上に達することが知られているので、こうしたコンポスト化の条件に耐えうる耐熱性酵素剤または好熱性微生物が利用できれば、コンポスト化がより有効に進行するものと考えられる。
【０００４】
現在、工業的目的のためには主として微生物由来のコラゲナーゼが利用されており、その一例としてStreptomyces属放線菌のコラゲナーゼを挙げることができる。他にも微生物起源のコラゲナーゼは多数知られており、例えば、Clostridium hystolyticum（Biochemistry 1984，23，3077-3085）やCytophaga sp.(Biosci.Biotech.Biochem.,1993,57,1894-1898）などがその例である。他の工業的に利用されている酵素の例からも理解されるように、酵素が工業的に利用されるためには、処理速度および処理対象物の範囲といった面から、一般的に耐熱性を有していなければならない。しかしながら、これらのコラゲナーゼは例外なく中温菌由来のもので熱安定性に欠けているため、その工業的利用は不十分なものであった。これまでのところ工業的に利用可能な程度に耐熱性（至適温度が十分高い）のあるコラーゲン分解酵素は見いだされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記問題は前記コラーゲンの有効利用の道が開ければ一気に解決することは明らかである 。従って、従来工業的に有効に機能する酵素がないために利用できなかったコラーゲンに対して高い活性を持つ酵素の開発が重要である。従って、本発明の課題は、耐熱性のコラーゲン分解酵素を見い出すことである。本発明者等は、耐熱性コラーゲン分解酵素生産微生物を自然界に幅広く探索し、仙台市の土壌からバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物に、前記酵素を生産する有望な好熱性細菌株を見いだし本発明を完成させた。本発明の耐熱性のコラーゲン分解酵素を製造するのに用いられる微生物は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物であり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＮＴＡＰ−１株である。好ましくは通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、バチルス エスピー ＮＴＡＰ−１（ Bacillus sp. NTAP-1 ）と表示され、平成１１年１１月１日に原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求により受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９２６として受託された（平成１１年８月２７日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７５３５として原寄託された。）微生物である。そしてこれを用いれば、工業用酵素と有用な酵素を得ることができ、バイオコンバージョンの触媒として有効に利用できることを見出した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は、以下の特性、すなわち、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属し、（１）グラム染色性は陰性または不定性であり、（２）胞子形成能があり、（３）運動性があり、（４）７０℃で生育するが、３０℃または８０℃では生育せず、（５）ｐＨ５では生育するが、ｐＨ７では生育せず、（６）桿菌であり、（７）カタラーゼ陰性であり、（８）オキシダーゼ陰性であり、（９）Ｏ／Ｆ試験陰性であり、（１０）アセトイン産生能をもち、（１１）（ａ）至適ｐＨがｐＨ３．５〜４．５にあり、（ｂ）反応至適温度が６５〜７０℃であり、（ｃ）６０℃、ｐＨ６．０で４時間の熱処理後も、処理前の６０％以上の活性を保持し、（ｄ）ｐＨ３−６の間で安定であり、（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分子量約４６０００であることにより特徴付けられるゼラチン分解能をもつ耐熱性酵素を産性する新規な微生物から得られる耐熱性コラーゲン分解酵素である。好ましくは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＮＴＡＰ−１株であることを特徴とする前記耐熱性コラーゲン分解酵素である。
【０００７】
本発明の第２は、以下の特性、すなわち、（１）グラム染色性は陰性または不定性であり、（２）胞子形成能があり、（３）運動性があり、（４）７０℃で生育するが、３０℃または８０℃では生育せず、（５）ｐＨ５では生育するがｐＨ７では生育せず、（６）桿菌であり、（７）カタラーゼ陰性であり、（８）オキシダーゼ陰性であり、（９）Ｏ／Ｆ試験陰性であり、（１０）アセトイン産生能をもち、（１１）（ａ）至適ｐＨがｐＨ３．５〜４．５にあり、（ｂ）反応至適温度が６５〜７０℃であり、（ｃ）６０℃、ｐＨ６．０で４時間の熱処理後も、処理前の６０％以上の活性を保持し、（ｄ）ｐＨ３−６の間で安定であり、（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分子量約４６０００であることにより特徴付けられる（ｆ）カゼイン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲンのなかでコラーゲンおよびゼラチンをもっとも効率良く加水分解する耐熱性酵素を産性する新規なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物を用いて、（ａ）反応至適ｐＨがｐＨ３．５〜４．５にあり、（ｂ）反応至適温度が６５〜７０℃であり、（ｃ）６０℃、ｐＨ６．０で４時間の熱処理後も、処理前の６０％以上の活性を保持し、（ｄ）ｐＨ３−６の間で安定であり、（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分子量約４６０００であることによって特徴付けられる（ｆ）カゼイン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲンのなかでコラーゲンおよびゼラチンをもっとも効率良く加水分解する能力を持つ耐熱性コラーゲン分解酵素を培養物中に精製蓄積させ、これを採取することを特徹とする耐熱性コラーゲン分解酵素の製造方法である。好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＮＴＡＰ−１株であることを特徴とする前記耐熱性コラーゲン分解酵素の製造方法である。本発明の第３は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属し、請求項１に記載の（１）グラム染色性は陰性または不定性であり、（２）胞子形成能があり、（３）運動性があり、（４）７０℃で生育するが、３０℃または８０℃では生育せず、（５）ｐＨ５では生育するが、ｐＨ７では生育せず、（６）桿菌であり、（７）カタラーゼ陰性であり、（８）オキシダーゼ陰性であり、（９）Ｏ／Ｆ試験陰性であり、（１０）アセトイン産生能をもち、（１１）（ａ）至適ｐＨがｐＨ３．５〜４．５にあり、（ｂ）反応至適温度が６５〜７０℃であり、（ｃ）６０℃、ｐＨ６．０で４時間の熱処理後も、処理前の６０％以上の活性を保持し、（ｄ）ｐＨ３−６の間で安定であり、（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分子量約４６０００であることにより特徴付けられるカゼイン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲンのなかでコラーゲンおよびゼラチンをもっとも効率良く加水分解する耐熱性酵素を産性する新規な微生物であり、好ましくは、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、バチルス エスピー ＮＴＡＰ−１（ Bacillussp. NTAP-1 ）と表示され、平成１１年１１月１日に原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求により受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９２６として受託された（平成１１年８月２７日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７５３５として原寄託された。）ことを特徴とする前記の微生物である。本発明者は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物中に、耐熱性コラーゲン分解酵素を産生する新規な微生物があることを発見することにより、前記本発明の課題を解決したものである。
【０００８】
【本発明の実施の態様】
本発明を詳細に説明する。
Ａ．本発明で使用する菌学的特徴は前記したとおりである。更に、この微生物は凍結法（−８０℃付近）で保管できる。
Ｂ。生育条件培地名：ＧＧＹ培地培地の組成：グルコース１．５％、ゼラチン１．５％、酵母エキス０．０１％を含む培地培地のｐＨ：４．８培地の殺菌条件 ：１２０℃で２０分間培地温度：６０℃好気性Ｃ．保護剤の組成：３０％グリセロール水溶液（保護剤のｐＨは調製不要）
保護剤のｐＨ調製不要保護剤殺菌条件：１２０℃で２０分間
【０００９】
【実施例】
実施例１
土壌、汚水、堆肥などさまざまな試料を０．８５％の食塩水にて１００〜１００００倍に希釈した後、その０．１ｍｌをＧＧＹ寒天培地上に塗布し、７０℃で２〜３日静置した。培地上に生育したコロニーを白金耳にて取り、５ｍｌのＧＧＹ液体培地に接種して７０℃で２〜３日しんとう培養した。このように分離したおよそ数百株の分離株につき、培養液上清中のコラーゲン分解酵素活性を実施例２にて述べる方法により評価した。コラーゲン分解酵素活性のもっとも強かった一株を選抜し、これをＮＴＡＰ−１株とした。
【００１０】
ＮＴＡＰ−１株の分類学的性質は次のとおりである。
細胞形態 桿菌(０．８×２〜３μｍ)加齢培養により湾曲し鎖状になる。
（2）グラム染色性 陰性または不定性
（3）胞子形成能 あり
（4）運動性 あり
（5）コロニーの形態と性状 円形 波状 低凸状 表層なめらか 半透明
（6）生育温度 ７０℃で生育するが８０℃で生育しない。
（7）カタラーゼ 陰性
（8）オキシダーゼ 陰性
（9）Ｏ／Ｆ試験 陰性
（10）生化学試験分解する
グルコース、フルクトース、ソルボース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシリトール、Ｌ−キシリトール、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、５−ケトグルコン酸
分解しないグリセロール、エリスリトール、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、ズルシトール、α−メチル−Ｄ−マンノース、α−メチル−Ｄ−グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミダグリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、乳糖、メリビオース、ショ糖、トレハロース、イヌリン、メレチトース、ラフィノース、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、２−ケトグルコン酸
酵素活性
β−ガラクトシダーゼ 陰性
アルギニンジヒドロラーゼ 陰性
リジンデカルボキシラーゼ 陰性
ウレアーゼ 陰性トリプトファンデアミナーゼ 陰性
ゼラチナーゼ 陽性
その他
クエン酸の利用 なし
Ｈ２Ｓの産生 なし
インドール産生 陰性
アセトイン産生 陽性
硝酸塩の還元 陽性
嫌気的生育 ややみられる
ｐＨ７での生育 なし
ｐＨ５．１での生育 あり
３０℃での生育 なし
【００１１】
以上の分類学的性質から本菌の分類学的な位置づけをP. H. Sneath著、P. H.Sneathら編、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、第2巻、p1104-1139（Williams & Wilkins社刊）において検索した。本菌は芽胞を形成する桿菌で、グラム染色性陰性を示す点が定型とは異なるものの、好気的に生育することからBacillusと考えられる。
Bacillus属細菌のなかで好熱性、好酸性を示す種は、B. acidocaldarius, B.licheniformis, B. coagulansなどが挙げられるが、B. licheniformisとB.coagulansはカタラーゼ陽性が定型性状であり、またこれらは４０℃で生育を示し６５℃では生育を示さないとの知見があるので、本株はB.acidocaldariusに近い菌であると考えられる。しかしながら、アセトインを産生する点が、B. acidocaldariusの定型とは異なっている。
アセトインを産生する特性は、acidocaldariusの変種と見るのか、別種に属すると見るのかを確認できないために、種名を特定することができない。
【００１２】
実施例２
グルコース１．５％、ゼラチン１．５％、酵母エキス０．０１％を含む培地（ｐＨ４．８）５ｍｌを試験管に入れ、１２０℃で２０分間滅菌した。ＮＴＡＰ−１（本発明の微生物の識別のための表示Bacillus属細菌ＮＴＡＰ−１株の略称）の白金耳を接種し、４日間振とう培養した。培養液を８０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、得られた培養液上清の耐熱性コラーゲン分解酵活性を測定した。すなわち、１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）０．１ｍｌに酵素液０．４ｍｌを混合し、６０℃で５分間温置した。ついでそこにAzocoll（アゾ色素結合コラーゲン粉末；シグマ社製）３ｍｇを懸濁し、６０℃で１時間攪拌することにより酵素反応を行なった。反応後、反応液を氷冷し静置することにより不溶性のAzocoll部分と液体部分（上清）を分離した。酵素反応の進行に伴ってAzocollが可溶化し、上清は赤色に着色するので、５１８ｎｍの吸光度を測定することにより、耐熱性コラーゲン分解酵素の活性を見積もった。この条件下で５１８ｎｍの吸光度を１分間に０．００１増加させる酵素量を１ユニット（Ｕ）と定義した。得られた培養液上清の酵素活性の濃度は３．１Ｕ／ｍｌであった。
【００１３】
実施例３
実施例２と同じ培地６リットルを１０リットル通気攪拌培養装置に仕込み、１２０℃で３０分間滅菌後、ＮＴＡＰ−１の前培養液２００ｍｌを接種した。６０℃、通気量１分間あたり６リットルの通気量で４日間通気撹拌培養を行った。培養液を遠心分離することにより菌体を除去し、上清の耐熱性コラーゲン分解酵素活性を測定した結果、上清中の酵素活性濃度は５．ＯＵ／ｍｌであった。
【００１４】
上で得られた上清を出発材料として、耐熱性コラーゲン分解酵素の精製・濃縮を以下のようにして行なった。この上清液に硫酸アンモニウムを加え硫酸アンモニウム４０％飽和で沈殿した画分を集め、０．０１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）５８５ｍｌに溶解した。この溶液にフェニル−セフアロース樹脂（アマシャムファルマシア社製）を加え、１時間撹拌混合した後、混合液をろ過して樹脂を取り出した。この樹脂の吸着画分を０．０１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）とエチレングリコール、１：１の混合溶液で溶出させ、セロファンチューブを透析膜として０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で透析した。
【００１５】
次いで、予め０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックス（アマシャムファルマシア社製）のカラムに通し、カラムを塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０−１Ｍ）をかけながら平衡化バッファーで洗浄することにより、カラムに吸着していた酵素活性を溶出させた。溶出液をおよそ９０本の画分に分け、各画分中の酵素活性を実施例１に記載した方法で測定した。 溶出液の分画中で活性の高い画分２３３ｍｌを集めた。ついでこの活性画分に硫酸アンモニウムを２０％飽和で加え、予め０．０１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したフェニル-セフアロースカラム（アマシャムファルマシア社製）に負荷することにより、酵素活性をカラムに吸着させた。次いで、エチレングリコールの直線濃度勾配（０−５０％）をかけながらカラムを平衡化バッファーで洗浄することにより、カラムに吸着していた酵素活性を溶出させた。溶出液をおよそ９０本の画分に分け、各画分中の酵素活性を実施例１に記載した方法で測定した。溶出液の分画中で活性の高い画分（合計量４８ｍｌ）を集た。
【００１６】
この溶淡をセロファンチューブを透析膜として０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で透析し、予め同じバッファーで平衡化したＭＯＮＯ−Ｑカラム（アマシャムファルマシア社製）に通し、酵素活性をカラムに吸着させた。次に、カラムを塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０−１Ｍ）をかけながら平衡化バッファーで洗浄することにより、カラムに吸着していた酵素活性を溶出させた。溶出液の分画中で活性の高い画分１０．６ｍｌを集めた。セントリコン（遠心濃縮器：アミコン社製：該濃縮装置は、容器の底にセルロースの誘導体でできた限外濾過膜が張ってあり、容器に酵素・蛋白質の溶液を入れ、1分間に6000回転（6000rpm）くらいの遠心力をかけると、溶液中のタンパクは膜の上に残り、水や低分子のイオンなどは遠心力により膜を通過して濾液として回収されるものである。）で０．５ｍｌに濃縮しゲル炉過クロマトグラフィーにより分画して溶出液中の活性の高い画分１．２ｍｌを集めた。この溶出画分の培養液からの活性収率は１．４％、酵素活性の濃度は４１６Ｕ／ｍｌであった。この酵素液をLaemmliの処方（Laemmli, U. K., Nature, 1970, 227,680-685）によるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ、耐熱性コラーゲン分解酵素の分子量は約４６０００であると見積もられた。
【００１７】
実施例４（耐熱性コラーゲン分解酵素の基質特異性を調べた実験）
５ｍｇのAzocoll を０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）０．４ｍｌに懸濁し、そこに適宜希釈して酵素濃度を調整した酵素液０．１ｍｌを加え、６０℃で１時間、しんとうさせながら反応させた。反応後、反応液を氷上で２０分間放置したのち遠心分離し、上清の５１８ｎｍにおける吸光度を求めた。その場合、酵素液を水で置き換えた場合の反応液を対照とした。Azocollが完全に可溶化したときの５１８ｎｍにおける吸光度を求めるとともに、いくつかの酵素濃度についてこの実験を行い、この条件下でおよそ50％の分解率を与える（約２．５ ｍｇのAzocollを可溶化する）酵素量を決定した。次に上と同様にして、５ｍｇのコラーゲン、ゼラチン、カゼイン、または牛血清アルブミン（いずれもナカライテスク社製）を０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）０．４ｍｌに懸濁（または溶解）し、さきに決定した酵素濃度の酵素液０．１ｍｌを加え、６０℃で1時間、しん盪させながら反応させた。反応後、反応液を４℃で２０分間放置したのち遠心分離した。なお、基質をカゼインまたは牛血清アルブミンとした場合には、５０％トリクロロ酢酸０．０５ｍｌを反応液に加え、４℃で２０分間放置したのち遠心分離した。上清の２８０ｎｍにおける吸光度を求めた。各蛋白質が完全に可溶化したときの２８０ｎｍにおける吸光度から、各蛋白質の分解率を求めた。Azocollの分解速度を１００％としたときの各蛋白質の相対的可溶化速度を表１に示した。
【００１８】
【表１】
Azocollの分解速度を１００％としたときの
各蛋白質の相対的可溶化速度
（＋＋＋：Azocoll に対して８０％以上の相対活性をもつ；±：Azocollに対して２０％以下の相対活性しかもたない；−：反応しない）
【００１９】
実施例５（耐熱性コラーゲン分解酵素の耐熱性を既知の市販コラーゲン分解酵素と比較した実験）
本発明の耐熱性コラーゲン分解酵素を０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に対して十分透析した。また、Streptomyces由来のコラゲナーゼ（新田ゼラチン製）を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して十分透析した。透析後、各酵素液を６０℃でさまざまな時間熱処理し、残存する酵素活性を求めた。本発明の耐熱性コラーゲン分解酵素の活性は実施例１にて述べた方法にしたがって求めた。またStreptomyces由来のコラゲナーゼの活性は、実施例１にて述べた方法における１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）をリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に置き換えて行った。なお、熱処理に用いた各酵素の濃度は、加熱処理しない場合の酵素活性測定において、５１８ｎｍにおける吸光度が１．０となるように設定した。その結果、Streptomyces由来のコラゲナーゼは６０℃１分間の熱処理によりほぼ完全に失活した（残存活性１％以下である）のに対し、本発明の耐熱性コラーゲン分解酵素は６０℃で４時間の熱処理後も、熱処理前の６５％以上の活性を保持していた。
【００２０】
実施例６（耐熱性コラーゲン分解酵素の熱安定性とｐＨ安定性を調べた実験）
１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）０．００２５ｍｌと１％Tween ８０水溶液０．００２５ｍｌを酵素液０．００２ｍｌに加えた後３０℃〜８０℃の温度に３０分間保ち、処理後、直ちに氷水で１０分間冷却し、残存活性を測定した。その結果を第１図に示す。本酵素は６０℃まで安定であった。一方、酵素をさまざまなｐＨで処理したときの酵素の安定性を調べた。ｐＨ２．５〜３．５の範囲は１Ｍグリシンー塩酸バッファー、ｐＨ３．５〜５．５の範囲は１Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ６．０〜８．０の範囲は１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ８．０〜９．０の範囲は１Ｍトリスー塩酸バッファー、ｐＨ９．０〜１０．０の範囲は１Ｍグリシンー水酸化ナトリウムバッファーを使用した。これらのバッファー０．００２５ｍｌと１％ Tween ８０水溶液０．００２５ｍｌを酵素液０．０２ｍｌに加えた後６０℃に１時間放置した。この処理酵素液に１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）を０．０５ｍｌを加えた後活性を測定した。その結果、本酵素はｐＨ３から６の間で安定であった（図２）。
【００２１】
実施例７（耐熱性コラーゲン分解酵素の反応至適温度と反応至適ｐＨを調べた実験）
本発明の耐熱性コラーゲン分解酵素の活性を３０、４０、５０、６０、７０、８０℃の各温度で求めた。活性測定方法は、反応温度を変えた以外は実施例１に記載した方法によった。その結果、本酵素は６０℃でもっとも高い活性を示した（図３）。次に、本酵素の活性を反応系のｐＨをさまざまに変えて（ｐＨ２．５〜７．２）測定した。なおｐＨに応じて、反応系の緩衝液を０．０１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜４）、０．０１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４〜６）、または０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６〜８）で置き換えた以外は、実施例１に記載した方法により酵素活性を測定した。その結果、本酵素はｐＨ３．７〜３．９付近でもっとも高い活性を示した（図４）。
【００２２】
【発明の効果】
以上述べたように、前記新規な微生物を使用することにより、前記実施例から明らかなように、至適温度、および至適ｐＨ、およびコラーゲン基質特異性の優れた耐熱性コラーゲン分解酵素を効率良く得ることができ、従来未利用であった畜産資源をバイオリサイクリングに利用することができ、種々の資材などとして用途の広がりを見せるコラーゲンの生産に貢献するところ大であるという優れた効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 耐熱性コラーゲン分解酵素の熱安定性。各温度で1時間熱処理後の残存酵素活性を、３０℃の処理の時の活性を１００％としたときの相対値で示した。
【図２】 耐熱性コラーゲン分解酵素のｐＨ安定性。各ｐＨで１時間処理後の残存酵素活性を、ｐＨ４．１で処理した時の活性を１００％としたときの相対値で示した。
【図３】 熱性コラーゲン分解酵素の反応の温度依存性。各温度における活性を、最大活性を示した６０℃における酵素活性を１００％としたときの相対活性で示した。
【図４】 耐熱性コラーゲン分解酵素の反応のｐＨ依存性。各ｐＨにおける活性を、最大活性を示したｐＨ３．８ における酵素活性を１００％としたときの相対活性で示した。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な微生物起源の耐熱性コラーゲン分解酵素、前記新規な微生物および前記微生物による前記酵素の製造方法、具体的には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する新規な微生物起源のコラーゲンに対して最も高い反応性（基質特異性）を有する新親な耐熱性コラーゲン分解酵素、前記新規な微生物および前記微生物による前記酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
コラーゲン分解酵素やゼラチン分解酵素は工業的利用価値の高い酵素である。例えばコラーゲンのベプチド性加水分解物には、シワ取りなどの美容整形用の材料としての有用性があり、また保湿性、免疫賦活作用等の興味深い生理活性も見いだされており、実際に、コラーゲンを低分子化したベプチドが医療や化粧品分野において多量に用いられている。また、写真用乳剤などにはゼラチンが用いられており、レントゲンや写真のフィルムのリサイクルにはゼラチン分解酵素が用いられている。コラーゲンの変性産物であるゼラチンを分解できるプロテアーゼは多数知られているが、これらのプロテアーゼによるコラーゲンの分解は困難であり、コラーゲンの加水分解には「コラゲナーゼ」と呼ばれる特異的な金属プロテアーゼ群が用いられている。
【０００３】
また近年、有機廃棄物の有効利用のためのバイオコンバージョン（生物学的変換）が積極的に試みられている。例えば生ゴミの堆肥化（コンポスト化）はその好例である。動物性タンパク質の３０％以上はコラーゲンからなっており、一般家庭や食堂から出される生ゴミ、および食肉加工業において排出される廃棄物にもコラーゲンが多量に含まれている。コラーゲンはその特殊な高次構造のために一般に難溶性・難分解性であり、コンポスト化においても比較的分解の遅いタンパク質である。畜産資源の非利用部分の多くは難分解性で、多くは焼却処分されているのが現状であり、地球の温暖化や大気汚染で問題とされている二酸化炭素やダイオキシンなどの発生をもたらしている。これは物質の有効利用という点から見ても解決すべき問題である。コンポスト化の過程で有機廃棄物の品温は微生物の発酵熱により５０〜６５℃あるいはそれ以上に達することが知られているので、こうしたコンポスト化の条件に耐えうる耐熱性酵素剤または好熱性微生物が利用できれば、コンポスト化がより有効に進行するものと考えられる。
【０００４】
現在、工業的目的のためには主として微生物由来のコラゲナーゼが利用されており、その一例としてStreptomyces属放線菌のコラゲナーゼを挙げることができる。他にも微生物起源のコラゲナーゼは多数知られており、例えば、Clostridium hystolyticum（Biochemistry 1984，23，3077-3085）やCytophaga sp.(Biosci.Biotech.Biochem.,1993,57,1894-1898）などがその例である。他の工業的に利用されている酵素の例からも理解されるように、酵素が工業的に利用されるためには、処理速度および処理対象物の範囲といった面から、一般的に耐熱性を有していなければならない。しかしながら、これらのコラゲナーゼは例外なく中温菌由来のもので熱安定性に欠けているため、その工業的利用は不十分なものであった。これまでのところ工業的に利用可能な程度に耐熱性（至適温度が十分高い）のあるコラーゲン分解酵素は見いだされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記問題は前記コラーゲンの有効利用の道が開ければ一気に解決することは明らかである 。従って、従来工業的に有効に機能する酵素がないために利用できなかったコラーゲンに対して高い活性を持つ酵素の開発が重要である。従って、本発明の課題は、耐熱性のコラーゲン分解酵素を見い出すことである。本発明者等は、耐熱性コラーゲン分解酵素生産微生物を自然界に幅広く探索し、仙台市の土壌からバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物に、前記酵素を生産する有望な好熱性細菌株を見いだし本発明を完成させた。本発明の耐熱性のコラーゲン分解酵素を製造するのに用いられる微生物は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物であり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＮＴＡＰ−１株である。好ましくは通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、バチルス エスピー ＮＴＡＰ−１（ Bacillus sp. NTAP-1 ）と表示され、平成１１年１１月１日に原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求により受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９２６として受託された（平成１１年８月２７日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７５３５として原寄託された。）微生物である。そしてこれを用いれば、工業用酵素と有用な酵素を得ることができ、バイオコンバージョンの触媒として有効に利用できることを見出した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は、以下の特性、すなわち、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属し、（１）グラム染色性は陰性または不定性であり、（２）胞子形成能があり、（３）運動性があり、（４）７０℃で生育するが、３０℃または８０℃では生育せず、（５）ｐＨ５では生育するが、ｐＨ７では生育せず、（６）桿菌であり、（７）カタラーゼ陰性であり、（８）オキシダーゼ陰性であり、（９）Ｏ／Ｆ試験陰性であり、（１０）アセトイン産生能をもち、（１１）（ａ）至適ｐＨがｐＨ３．５〜４．５にあり、（ｂ）反応至適温度が６５〜７０℃であり、（ｃ）６０℃、ｐＨ６．０で４時間の熱処理後も、処理前の６０％以上の活性を保持し、（ｄ）ｐＨ３−６の間で安定であり、（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分子量約４６０００であることにより特徴付けられるゼラチン分解能をもつ耐熱性酵素を産性する新規な微生物から得られる耐熱性コラーゲン分解酵素である。好ましくは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＮＴＡＰ−１株であることを特徴とする前記耐熱性コラーゲン分解酵素である。
【０００７】
本発明の第２は、以下の特性、すなわち、（１）グラム染色性は陰性または不定性であり、（２）胞子形成能があり、（３）運動性があり、（４）７０℃で生育するが、３０℃または８０℃では生育せず、（５）ｐＨ５では生育するがｐＨ７では生育せず、（６）桿菌であり、（７）カタラーゼ陰性であり、（８）オキシダーゼ陰性であり、（９）Ｏ／Ｆ試験陰性であり、（１０）アセトイン産生能をもち、（１１）（ａ）至適ｐＨがｐＨ３．５〜４．５にあり、（ｂ）反応至適温度が６５〜７０℃であり、（ｃ）６０℃、ｐＨ６．０で４時間の熱処理後も、処理前の６０％以上の活性を保持し、（ｄ）ｐＨ３−６の間で安定であり、（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分子量約４６０００であることにより特徴付けられる（ｆ）カゼイン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲンのなかでコラーゲンおよびゼラチンをもっとも効率良く加水分解する耐熱性酵素を産性する新規なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物を用いて、（ａ）反応至適ｐＨがｐＨ３．５〜４．５にあり、（ｂ）反応至適温度が６５〜７０℃であり、（ｃ）６０℃、ｐＨ６．０で４時間の熱処理後も、処理前の６０％以上の活性を保持し、（ｄ）ｐＨ３−６の間で安定であり、（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分子量約４６０００であることによって特徴付けられる（ｆ）カゼイン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲンのなかでコラーゲンおよびゼラチンをもっとも効率良く加水分解する能力を持つ耐熱性コラーゲン分解酵素を培養物中に精製蓄積させ、これを採取することを特徹とする耐熱性コラーゲン分解酵素の製造方法である。好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＮＴＡＰ−１株であることを特徴とする前記耐熱性コラーゲン分解酵素の製造方法である。本発明の第３は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属し、請求項１に記載の（１）グラム染色性は陰性または不定性であり、（２）胞子形成能があり、（３）運動性があり、（４）７０℃で生育するが、３０℃または８０℃では生育せず、（５）ｐＨ５では生育するが、ｐＨ７では生育せず、（６）桿菌であり、（７）カタラーゼ陰性であり、（８）オキシダーゼ陰性であり、（９）Ｏ／Ｆ試験陰性であり、（１０）アセトイン産生能をもち、（１１）（ａ）至適ｐＨがｐＨ３．５〜４．５にあり、（ｂ）反応至適温度が６５〜７０℃であり、（ｃ）６０℃、ｐＨ６．０で４時間の熱処理後も、処理前の６０％以上の活性を保持し、（ｄ）ｐＨ３−６の間で安定であり、（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分子量約４６０００であることにより特徴付けられるカゼイン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲンのなかでコラーゲンおよびゼラチンをもっとも効率良く加水分解する耐熱性酵素を産性する新規な微生物であり、好ましくは、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、バチルス エスピー ＮＴＡＰ−１（ Bacillussp. NTAP-1 ）と表示され、平成１１年１１月１日に原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求により受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９２６として受託された（平成１１年８月２７日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７５３５として原寄託された。）ことを特徴とする前記の微生物である。本発明者は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物中に、耐熱性コラーゲン分解酵素を産生する新規な微生物があることを発見することにより、前記本発明の課題を解決したものである。
【０００８】
【本発明の実施の態様】
本発明を詳細に説明する。
Ａ．本発明で使用する菌学的特徴は前記したとおりである。更に、この微生物は凍結法（−８０℃付近）で保管できる。
Ｂ。生育条件培地名：ＧＧＹ培地培地の組成：グルコース１．５％、ゼラチン１．５％、酵母エキス０．０１％を含む培地培地のｐＨ：４．８培地の殺菌条件 ：１２０℃で２０分間培地温度：６０℃好気性Ｃ．保護剤の組成：３０％グリセロール水溶液（保護剤のｐＨは調製不要）
保護剤のｐＨ調製不要保護剤殺菌条件：１２０℃で２０分間
【０００９】
【実施例】
実施例１
土壌、汚水、堆肥などさまざまな試料を０．８５％の食塩水にて１００〜１００００倍に希釈した後、その０．１ｍｌをＧＧＹ寒天培地上に塗布し、７０℃で２〜３日静置した。培地上に生育したコロニーを白金耳にて取り、５ｍｌのＧＧＹ液体培地に接種して７０℃で２〜３日しんとう培養した。このように分離したおよそ数百株の分離株につき、培養液上清中のコラーゲン分解酵素活性を実施例２にて述べる方法により評価した。コラーゲン分解酵素活性のもっとも強かった一株を選抜し、これをＮＴＡＰ−１株とした。
【００１０】
ＮＴＡＰ−１株の分類学的性質は次のとおりである。
細胞形態 桿菌(０．８×２〜３μｍ)加齢培養により湾曲し鎖状になる。
（2）グラム染色性 陰性または不定性
（3）胞子形成能 あり
（4）運動性 あり
（5）コロニーの形態と性状 円形 波状 低凸状 表層なめらか 半透明
（6）生育温度 ７０℃で生育するが８０℃で生育しない。
（7）カタラーゼ 陰性
（8）オキシダーゼ 陰性
（9）Ｏ／Ｆ試験 陰性
（10）生化学試験分解する
グルコース、フルクトース、ソルボース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシリトール、Ｌ−キシリトール、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、５−ケトグルコン酸
分解しないグリセロール、エリスリトール、アドニトール、β−メチル−Ｄ−キシロース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、ズルシトール、α−メチル−Ｄ−マンノース、α−メチル−Ｄ−グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミダグリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、乳糖、メリビオース、ショ糖、トレハロース、イヌリン、メレチトース、ラフィノース、グリコーゲン、キシリトール、ゲンチオビオース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、２−ケトグルコン酸
酵素活性
β−ガラクトシダーゼ 陰性
アルギニンジヒドロラーゼ 陰性
リジンデカルボキシラーゼ 陰性
ウレアーゼ 陰性トリプトファンデアミナーゼ 陰性
ゼラチナーゼ 陽性
その他
クエン酸の利用 なし
Ｈ２Ｓの産生 なし
インドール産生 陰性
アセトイン産生 陽性
硝酸塩の還元 陽性
嫌気的生育 ややみられる
ｐＨ７での生育 なし
ｐＨ５．１での生育 あり
３０℃での生育 なし
【００１１】
以上の分類学的性質から本菌の分類学的な位置づけをP. H. Sneath著、P. H.Sneathら編、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、第2巻、p1104-1139（Williams & Wilkins社刊）において検索した。本菌は芽胞を形成する桿菌で、グラム染色性陰性を示す点が定型とは異なるものの、好気的に生育することからBacillusと考えられる。
Bacillus属細菌のなかで好熱性、好酸性を示す種は、B. acidocaldarius, B.licheniformis, B. coagulansなどが挙げられるが、B. licheniformisとB.coagulansはカタラーゼ陽性が定型性状であり、またこれらは４０℃で生育を示し６５℃では生育を示さないとの知見があるので、本株はB.acidocaldariusに近い菌であると考えられる。しかしながら、アセトインを産生する点が、B. acidocaldariusの定型とは異なっている。
アセトインを産生する特性は、acidocaldariusの変種と見るのか、別種に属すると見るのかを確認できないために、種名を特定することができない。
【００１２】
実施例２
グルコース１．５％、ゼラチン１．５％、酵母エキス０．０１％を含む培地（ｐＨ４．８）５ｍｌを試験管に入れ、１２０℃で２０分間滅菌した。ＮＴＡＰ−１（本発明の微生物の識別のための表示Bacillus属細菌ＮＴＡＰ−１株の略称）の白金耳を接種し、４日間振とう培養した。培養液を８０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、得られた培養液上清の耐熱性コラーゲン分解酵活性を測定した。すなわち、１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）０．１ｍｌに酵素液０．４ｍｌを混合し、６０℃で５分間温置した。ついでそこにAzocoll（アゾ色素結合コラーゲン粉末；シグマ社製）３ｍｇを懸濁し、６０℃で１時間攪拌することにより酵素反応を行なった。反応後、反応液を氷冷し静置することにより不溶性のAzocoll部分と液体部分（上清）を分離した。酵素反応の進行に伴ってAzocollが可溶化し、上清は赤色に着色するので、５１８ｎｍの吸光度を測定することにより、耐熱性コラーゲン分解酵素の活性を見積もった。この条件下で５１８ｎｍの吸光度を１分間に０．００１増加させる酵素量を１ユニット（Ｕ）と定義した。得られた培養液上清の酵素活性の濃度は３．１Ｕ／ｍｌであった。
【００１３】
実施例３
実施例２と同じ培地６リットルを１０リットル通気攪拌培養装置に仕込み、１２０℃で３０分間滅菌後、ＮＴＡＰ−１の前培養液２００ｍｌを接種した。６０℃、通気量１分間あたり６リットルの通気量で４日間通気撹拌培養を行った。培養液を遠心分離することにより菌体を除去し、上清の耐熱性コラーゲン分解酵素活性を測定した結果、上清中の酵素活性濃度は５．ＯＵ／ｍｌであった。
【００１４】
上で得られた上清を出発材料として、耐熱性コラーゲン分解酵素の精製・濃縮を以下のようにして行なった。この上清液に硫酸アンモニウムを加え硫酸アンモニウム４０％飽和で沈殿した画分を集め、０．０１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）５８５ｍｌに溶解した。この溶液にフェニル−セフアロース樹脂（アマシャムファルマシア社製）を加え、１時間撹拌混合した後、混合液をろ過して樹脂を取り出した。この樹脂の吸着画分を０．０１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）とエチレングリコール、１：１の混合溶液で溶出させ、セロファンチューブを透析膜として０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で透析した。
【００１５】
次いで、予め０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファデックス（アマシャムファルマシア社製）のカラムに通し、カラムを塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０−１Ｍ）をかけながら平衡化バッファーで洗浄することにより、カラムに吸着していた酵素活性を溶出させた。溶出液をおよそ９０本の画分に分け、各画分中の酵素活性を実施例１に記載した方法で測定した。 溶出液の分画中で活性の高い画分２３３ｍｌを集めた。ついでこの活性画分に硫酸アンモニウムを２０％飽和で加え、予め０．０１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化したフェニル-セフアロースカラム（アマシャムファルマシア社製）に負荷することにより、酵素活性をカラムに吸着させた。次いで、エチレングリコールの直線濃度勾配（０−５０％）をかけながらカラムを平衡化バッファーで洗浄することにより、カラムに吸着していた酵素活性を溶出させた。溶出液をおよそ９０本の画分に分け、各画分中の酵素活性を実施例１に記載した方法で測定した。溶出液の分画中で活性の高い画分（合計量４８ｍｌ）を集た。
【００１６】
この溶淡をセロファンチューブを透析膜として０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で透析し、予め同じバッファーで平衡化したＭＯＮＯ−Ｑカラム（アマシャムファルマシア社製）に通し、酵素活性をカラムに吸着させた。次に、カラムを塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０−１Ｍ）をかけながら平衡化バッファーで洗浄することにより、カラムに吸着していた酵素活性を溶出させた。溶出液の分画中で活性の高い画分１０．６ｍｌを集めた。セントリコン（遠心濃縮器：アミコン社製：該濃縮装置は、容器の底にセルロースの誘導体でできた限外濾過膜が張ってあり、容器に酵素・蛋白質の溶液を入れ、1分間に6000回転（6000rpm）くらいの遠心力をかけると、溶液中のタンパクは膜の上に残り、水や低分子のイオンなどは遠心力により膜を通過して濾液として回収されるものである。）で０．５ｍｌに濃縮しゲル炉過クロマトグラフィーにより分画して溶出液中の活性の高い画分１．２ｍｌを集めた。この溶出画分の培養液からの活性収率は１．４％、酵素活性の濃度は４１６Ｕ／ｍｌであった。この酵素液をLaemmliの処方（Laemmli, U. K., Nature, 1970, 227,680-685）によるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ、耐熱性コラーゲン分解酵素の分子量は約４６０００であると見積もられた。
【００１７】
実施例４（耐熱性コラーゲン分解酵素の基質特異性を調べた実験）
５ｍｇのAzocoll を０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）０．４ｍｌに懸濁し、そこに適宜希釈して酵素濃度を調整した酵素液０．１ｍｌを加え、６０℃で１時間、しんとうさせながら反応させた。反応後、反応液を氷上で２０分間放置したのち遠心分離し、上清の５１８ｎｍにおける吸光度を求めた。その場合、酵素液を水で置き換えた場合の反応液を対照とした。Azocollが完全に可溶化したときの５１８ｎｍにおける吸光度を求めるとともに、いくつかの酵素濃度についてこの実験を行い、この条件下でおよそ50％の分解率を与える（約２．５ ｍｇのAzocollを可溶化する）酵素量を決定した。次に上と同様にして、５ｍｇのコラーゲン、ゼラチン、カゼイン、または牛血清アルブミン（いずれもナカライテスク社製）を０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）０．４ｍｌに懸濁（または溶解）し、さきに決定した酵素濃度の酵素液０．１ｍｌを加え、６０℃で1時間、しん盪させながら反応させた。反応後、反応液を４℃で２０分間放置したのち遠心分離した。なお、基質をカゼインまたは牛血清アルブミンとした場合には、５０％トリクロロ酢酸０．０５ｍｌを反応液に加え、４℃で２０分間放置したのち遠心分離した。上清の２８０ｎｍにおける吸光度を求めた。各蛋白質が完全に可溶化したときの２８０ｎｍにおける吸光度から、各蛋白質の分解率を求めた。Azocollの分解速度を１００％としたときの各蛋白質の相対的可溶化速度を表１に示した。
【００１８】
【表１】
Azocollの分解速度を１００％としたときの
各蛋白質の相対的可溶化速度
【００１９】
実施例５（耐熱性コラーゲン分解酵素の耐熱性を既知の市販コラーゲン分解酵素と比較した実験）
本発明の耐熱性コラーゲン分解酵素を０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に対して十分透析した。また、Streptomyces由来のコラゲナーゼ（新田ゼラチン製）を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して十分透析した。透析後、各酵素液を６０℃でさまざまな時間熱処理し、残存する酵素活性を求めた。本発明の耐熱性コラーゲン分解酵素の活性は実施例１にて述べた方法にしたがって求めた。またStreptomyces由来のコラゲナーゼの活性は、実施例１にて述べた方法における１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）をリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に置き換えて行った。なお、熱処理に用いた各酵素の濃度は、加熱処理しない場合の酵素活性測定において、５１８ｎｍにおける吸光度が１．０となるように設定した。その結果、Streptomyces由来のコラゲナーゼは６０℃１分間の熱処理によりほぼ完全に失活した（残存活性１％以下である）のに対し、本発明の耐熱性コラーゲン分解酵素は６０℃で４時間の熱処理後も、熱処理前の６５％以上の活性を保持していた。
【００２０】
実施例６（耐熱性コラーゲン分解酵素の熱安定性とｐＨ安定性を調べた実験）
１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）０．００２５ｍｌと１％Tween ８０水溶液０．００２５ｍｌを酵素液０．００２ｍｌに加えた後３０℃〜８０℃の温度に３０分間保ち、処理後、直ちに氷水で１０分間冷却し、残存活性を測定した。その結果を第１図に示す。本酵素は６０℃まで安定であった。一方、酵素をさまざまなｐＨで処理したときの酵素の安定性を調べた。ｐＨ２．５〜３．５の範囲は１Ｍグリシンー塩酸バッファー、ｐＨ３．５〜５．５の範囲は１Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ６．０〜８．０の範囲は１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ８．０〜９．０の範囲は１Ｍトリスー塩酸バッファー、ｐＨ９．０〜１０．０の範囲は１Ｍグリシンー水酸化ナトリウムバッファーを使用した。これらのバッファー０．００２５ｍｌと１％ Tween ８０水溶液０．００２５ｍｌを酵素液０．０２ｍｌに加えた後６０℃に１時間放置した。この処理酵素液に１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）を０．０５ｍｌを加えた後活性を測定した。その結果、本酵素はｐＨ３から６の間で安定であった（図２）。
【００２１】
実施例７（耐熱性コラーゲン分解酵素の反応至適温度と反応至適ｐＨを調べた実験）
本発明の耐熱性コラーゲン分解酵素の活性を３０、４０、５０、６０、７０、８０℃の各温度で求めた。活性測定方法は、反応温度を変えた以外は実施例１に記載した方法によった。その結果、本酵素は６０℃でもっとも高い活性を示した（図３）。次に、本酵素の活性を反応系のｐＨをさまざまに変えて（ｐＨ２．５〜７．２）測定した。なおｐＨに応じて、反応系の緩衝液を０．０１Ｍのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜４）、０．０１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４〜６）、または０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６〜８）で置き換えた以外は、実施例１に記載した方法により酵素活性を測定した。その結果、本酵素はｐＨ３．７〜３．９付近でもっとも高い活性を示した（図４）。
【００２２】
【発明の効果】
以上述べたように、前記新規な微生物を使用することにより、前記実施例から明らかなように、至適温度、および至適ｐＨ、およびコラーゲン基質特異性の優れた耐熱性コラーゲン分解酵素を効率良く得ることができ、従来未利用であった畜産資源をバイオリサイクリングに利用することができ、種々の資材などとして用途の広がりを見せるコラーゲンの生産に貢献するところ大であるという優れた効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 耐熱性コラーゲン分解酵素の熱安定性。各温度で1時間熱処理後の残存酵素活性を、３０℃の処理の時の活性を１００％としたときの相対値で示した。
【図２】 耐熱性コラーゲン分解酵素のｐＨ安定性。各ｐＨで１時間処理後の残存酵素活性を、ｐＨ４．１で処理した時の活性を１００％としたときの相対値で示した。
【図３】 熱性コラーゲン分解酵素の反応の温度依存性。各温度における活性を、最大活性を示した６０℃における酵素活性を１００％としたときの相対活性で示した。
【図４】 耐熱性コラーゲン分解酵素の反応のｐＨ依存性。各ｐＨにおける活性を、最大活性を示したｐＨ３．８ における酵素活性を１００％としたときの相対活性で示した。
Claims (6)
- バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属し、（１）グラム染色性は陰性または不定性であり、（２）胞子形成能があり、（３）運動性があり、（４）７０℃で生育するが、３０℃または８０℃では生育せず、（５）ｐＨ５では生育するが、ｐＨ７では生育せず、（６）桿菌であり、（７）カタラーゼ陰性であり、（８）オキシダーゼ陰性であり、（９）Ｏ／Ｆ試験陰性であり、（１０）アセトイン産生能をもち、（１１）（ａ）至適ｐＨがｐＨ３．５〜４．５にあり、（ｂ）反応至適温度が６５〜７０℃であり、（ｃ）６０℃、ｐＨ６．０で４時間の熱処理後も、処理前の６０％以上の活性を保持し、（ｄ）ｐＨ３−６の間で安定であり、（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分子量約４６０００であることにより特徴付けられる（ｆ）カゼイン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲンのなかでコラーゲンおよびゼラチンをもっとも効率良く加水分解する耐熱性酵素を産生する新規な微生物から得られる耐熱性コラーゲン分解酵素。
- バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属ＮＴＡＰ−１株であることを特徴とする請求項１に記載の耐熱性コラーゲン分解酵素。
- （１）グラム染色性は陰性または不定性であり、（２）胞子形成能があり、（３）運動性があり、（４）７０℃で生育するが、３０℃または８０℃では生育せず、（５）ｐＨ５では生育するがｐＨ７では生育せず、（６）桿菌であり、（７）カタラーゼ陰性であり、（８）オキシダーゼ陰性であり、（９）Ｏ／Ｆ試験陰性であり、（１０）アセトイン産生能をもち、（１１）（ａ）至適ｐＨがｐＨ３．５〜４．５にあり、（ｂ）反応至適温度が６５〜７０℃であり、（ｃ）６０℃、ｐＨ６．０で４時間の熱処理後も、処理前の６０％以上の活性を保持し、（ｄ）ｐＨ３−６の間で安定であり、（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分子量約４６０００であることにより特徴付けられる（ｆ）カゼイン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲンのなかでコラーゲンおよびゼラチンをもっとも効率良く加水分解する耐熱性酵素を産生する新規なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物を用いて、（ａ）反応至適ｐＨがｐＨ３．５〜４．５にあり、（ｂ）反応至適温度が６５〜７０℃であり、（ｃ）６０℃、ｐＨ６．０で４時間の熱処理後も、処理前の６０％以上の活性を保持し、（ｄ）ｐＨ３−６の間で安定であり、（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分子量約４６０００であることによって特徴付けられる（ｆ）カゼイン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲンのなかでコラーゲンおよびゼラチンをもっとも効率良く加水分解する能力を持つ耐熱性コラーゲン分解酵素を培養物中に精製蓄積させ、これを採取することを特徹とする耐熱性コラーゲン分解酵素の製造方法。
- バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ属ＮＴＡＰ−１株であることを特徴とする請求項３に記載の耐熱性コラーゲン分解酵素の製造方法。
- バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属し、請求項１に記載の（１）グラム染色性は陰性または不定性であり、（２）胞子形成能があり、（３）運動性があり、（４）７０℃で生育するが、３０℃または８０℃では生育せず、（５）ｐＨ５では生育するが、ｐＨ７では生育せず、（６）桿菌であり、（７）カタラーゼ陰性であり、（８）オキシダーゼ陰性であり、（９）Ｏ／Ｆ試験陰性であり、（１０）アセトイン産生能をもち、（１１）（ａ）至適ｐＨがｐＨ３．５〜４．５にあり、（ｂ）反応至適温度が６５〜７０℃であり、（ｃ）６０℃、ｐＨ６．０で４時間の熱処理後も、処理前の６０％以上の活性を保持し、（ｄ）ｐＨ３−６の間で安定であり、（ｅ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動での分子量約４６０００であることにより特徴付けられるカゼイン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲンのなかでコラーゲンおよびゼラチンをもっとも効率良く加水分解する耐熱性酵素を産生する新規な微生物。
- 通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、バチルス エスピー ＮＴＡＰ−１（Bacillus sp. NTAP-1）と表示され、平成１１年１１月１日に原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管請求により受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６９２６として受託された（平成１１年８月２７日に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７５３５として原寄託された。）請求項５に記載の微生物。
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