ES2237215T3 - Nueva enzima termoestable que digiere el colageno, nuevo microorganismo que produce la enzima y procedimiento para producir la enzima. - Google Patents
Nueva enzima termoestable que digiere el colageno, nuevo microorganismo que produce la enzima y procedimiento para producir la enzima.Info
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Abstract
Una enzima termoestable que descompone el colágeno que se puede obtener a partir de una bacteria que pertenece al género Bacillus, donde: (1) la bacteria es Gram-negativa o Gram-indefinida; (2) la bacteria tiene capacidad de formar esporas; (3) la bacteria tiene motilidad; (4) la bacteria crece a 70ºC, no crece a 30ºC ni 80ºC; (5) crece a pH 5 y no crece a pH 7; (6) la bacteria tiene forma de bastón; (7) la bacteria es negativa a la catalasa; (8) la bacteria es negativa a la oxidasa; (9) la bacteria es negativa al ensayo O/F; (10) la bacteria tiene actividad de producción de acetoína; y (11) la bacteria tiene actividad de descomposición de la gelatina, y dicha enzima se caracteriza además por los siguientes rasgos: (a) la enzima tiene mayor actividad de hidrólisis hacia el colágeno y la gelatina que la caseína y la albúmina; (b) el pH óptimo de reacción está entre 3, 5 y 4, 5; (c) la temperatura óptima de reacción está entre 65ºC y 70ºC; (d) la enzima retiene más del 60% de su actividad original después del tratamiento térmico a 60ºC y pH 6, 0 durante 4 horas; (e) la enzima es estable entre pH 3 y 6; y (f) el peso molecular de la enzima estimado por electroforesis en gel de SDS- poliacrilamida es aproximadamente 46000.
Description
Nueva enzima termoestable que digiere el
colágeno, nuevo microorganismo que produce la enzima y
procedimiento para producir la enzima.
La presente invención se refiere a una enzima
termoestable que descompone el colágeno producida por un nuevo
microorganismo, y a dicho microorganismo y a un método para la
producción de dicha enzima por dicho microorganismo. Concretamente,
la presente invención se refiere a una enzima termoestable novedosa
que descompone el colágeno, que tiene la máxima reactividad
(especificidad de sustrato) para el colágeno, producida por un
microorganismo novedoso del género Bacillus, a dicho
microorganismo novedoso y a un proceso para producir dicha enzima
por dicho microorganismo.
Las enzimas que descomponen el colágeno y que
descomponen la gelatina se han utilizado ampliamente en la
industria. Por ejemplo, los péptidos de colágeno, que son productos
de la hidrólisis del colágeno por estas enzimas, son útiles como
material para cosmética, por sus interesantes actividades
fisiológicas tales como los efectos de conservación de la humedad o
la actividad de activación de la inmunidad. Por tanto, los péptidos
de colágeno se usan ampliamente con propósitos médicos y cosméticos.
Además, la gelatina, que es una forma desnaturalizada del colágeno,
se usa como el agente de recubrimiento de películas fotográficas, y
las enzimas que descomponen la gelatina se usan para el reciclado
de las películas fotográficas y de rayos X. Se conocen muchas
clases de proteasas que descomponen la gelatina; sin embargo, la
descomposición del colágeno por estas proteasas es aún difícil.
Para la hidrólisis del colágeno deberían usarse proteasas de metal
específicas, llamadas "colagenasa".
Recientemente se han hecho muchos intentos para
el uso eficaz de los residuos orgánicos. Por ejemplo, el compostaje
de basuras es un ejemplo concreto del biorreciclado de residuos
orgánicos. Más del 30% de la proteína animal se compone de
colágeno, por lo tanto, las basuras producidas por las actividades
diarias de cocina en casas y restaurantes y los residuos de las
fábricas de procesado de carne deberían contener grandes cantidades
de colágeno.
Por su estructura específica altamente ordenada,
el colágeno es generalmente insoluble en agua y difícil de
descomponer y por lo tanto la degradación del colágeno avanza muy
despacio durante el compostaje. La mayoría de las partes no
utilizables producidas en las industrias ganaderas se componen de
colágeno, y, por lo tanto, se tratan por incineración, causando
problemas como el calentamiento de la tierra o la generación de
dióxido de carbono o dioxina que causan la polución del aire.
Estos problemas deben resolverse desde el punto
de vista de hacer un uso eficaz de los materiales.
Es bien sabido que la temperatura de los residuos
orgánicos sube a 50-65ºC ó más durante el proceso de
compostaje. Por lo tanto, si se usan enzimas termoestables o
microorganismos termo filos que sean activos incluso bajo tales
condiciones de compostaje a alta temperatura, el compostaje de
residuos orgánicos debería avanzar más eficazmente.
Hoy en día, las colagenasas industriales son las
de los microorganismos (bacterias), y como ejemplo concreto, puede
mencionarse una colagenasa de actinomicetos del género
Streptomyces. Se conocen también otras colagenasas
microbianas; por ejemplo, colagenasas de Clostridium
hystolyticum (Biochemistry 1984, 23, 3077-3085)
y Cytophaga sp. (Biosci, Biotech, Biochem., 1993, 57,
1894-1898) son los ejemplos concretos.
Respecto al ejemplo de la enzima que se usa
industrialmente, es necesario que la enzima sea termoestable desde
el punto de vista de la velocidad de tratamiento y del objeto que
se va a tratar.
Sin embargo, todas las colagenasas conocidas son
de origen mesófilo y carecen de termoestabilidad, y estas
circunstancias dificultan sus aplicaciones industriales eficaces.
Hasta ahora aún no se ha desarrollado para aplicaciones
industriales una enzima de descomposición del colágeno con
suficiente termoestabilidad (que tenga una temperatura óptima
elevada).
Por lo general, es difícil usar colágeno a escala
industrial porque no hay suficiente enzima termoestable para actuar
eficazmente a escala industrial. Por lo tanto, es obvio que el
problema antes mencionado puede resolverse perfectamente si se
desarrolla una enzima que tenga una alta actividad frente al
colágeno.
Como se mencionó antes, el objeto de esta
invención es descubrir una enzima termoestable que descomponga el
colágeno.
Los inventores de esta invención han llevado a
cabo un estudio exhaustivo para encontrar en la naturaleza un
microorganismo que produzca una enzima termoestable que descompone
el colágeno, y han encontrado una prometedora bacteria termófila
perteneciente al género Bacillus que produce dicha enzima en
el suelo de Sendai, Japón, y han logrado la presente invención.
El microorganismo, que se usa para producir una
enzima termoestable que descompone el colágeno de esta invención,
pertenece al género Bacillus, y se califica como cepa
NTAP-1. Se ha hecho el depósito de esta cepa de
acuerdo con el requisito de depósito según el Tratado de Budapest
en el Instituto de Industrias de Tecnología Biótica de la Agencia
de Ciencia Industrial de la Tecnología que pertenece al Ministerio
de Comercio e Industria Internacional de Japón y aceptado por el
número de aceptación FERM BP-6926 el 1 de noviembre
de 1999. (Esta cepa se depositó originalmente el 27 de agosto de
1999 bajo número de entrada FERM P-17535.) (en la
memoria, la cepa se abrevia solo como cepa
NTAP-1).
Los inventores han encontrado que la enzima útil
industrialmente puede obtenerse por el uso de esta cepa, y la enzima
obtenida puede utilizarse como catalizador de bioconversión.
El primer punto importante de esta invención es
una enzima termoestable que descompone el colágeno que se puede
obtener a partir de una bacteria que pertenece al género
Bacillus, en donde: (1) la bacteria es
Gram-negativa o Gram-indefinida;
(2) la bacteria tiene capacidad de formar esporas; (3) la bacteria
tiene motilidad; (4) la bacteria crece a 70ºC, no crece a 30ºC ni a
80ºC; (5) crece a pH 5 y no crece a pH 7; (6) la bacteria tiene
forma de bastón; (7) la bacteria es negativa a catalasas; (8) la
bacteria es negativa a oxidasas; (9) la bacteria es negativa al
ensayo O/F; (10) la bacteria tiene actividad de producción de
acetoína; y (11) la bacteria tiene actividad de descomposición de
gelatina, y dicha enzima se caracteriza además por las siguientes
características: (a) la enzima tiene mayor actividad de hidrólisis
hacia el colágeno y la gelatina que la caseína y la albúmina; (b)
el pH óptimo de reacción está entre 3,5 y 4,5; (c) la tempe-
ratura óptima de reacción está entre 65ºC y 70ºC; (d) la enzima conserva más del 60% de su actividad original después de un tratamiento térmico a 60ºC y a pH 6,0 durante 4 horas; (e) la enzima es estable entre pH de 3 a 6; y (f) el peso molecular de la enzima estimado por electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida es de aproximadamente 46000.
ratura óptima de reacción está entre 65ºC y 70ºC; (d) la enzima conserva más del 60% de su actividad original después de un tratamiento térmico a 60ºC y a pH 6,0 durante 4 horas; (e) la enzima es estable entre pH de 3 a 6; y (f) el peso molecular de la enzima estimado por electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida es de aproximadamente 46000.
En consecuencia, pueden esperarse una acción y un
efecto excelentes que pueden usarse para la descomposición del
colágeno a 70ºC o temperaturas inferiores. Y lo que es más deseable,
dicha enzima termoestable que descompone el co-
lágeno de esta invención la produce el microorganismo que pertenece al género Bacillus o Bacillus sp. cepa NTAP-1.
lágeno de esta invención la produce el microorganismo que pertenece al género Bacillus o Bacillus sp. cepa NTAP-1.
El segundo punto importante de esta invención es
un método de producción de la enzima termoestable que descompone el
colágeno de la invención que comprende el uso de un microorganismo
que tiene los siguientes rasgos, es decir, por las siguientes
características: (1) la bacteria es Gram-negativa o
Gram-indefinida, (2) la bacteria tiene la capacidad
de formar esporas, (3) la bacteria tiene motilidad, (4) la bacteria
crece a 70ºC, no crece a 30ºC ni 80ºC y crece a pH 5, no crece a pH
7, (6) la bacteria tiene forma de bastón, (7) la bacteria es
negativa a catalasas, (8) la bacteria es negativa a oxidasas, (9)
la bacteria es negativa al ensayo O/F, (10) la bacteria tiene
actividad productora de acetoína y (11) la bacteria tiene actividad
de descomposición de la gelatina, purificando y acumulando la
enzima termoestable que descompone el colágeno.
De forma conveniente, el método de producción de
dicha enzima termoestable que descompone el colágeno, donde el
microorganismo que pertenece al género Bacillus es la cepa
NTAP-1 de bacterias del género Bacillus.
El tercer punto importante de esta invención es
un microorganismo de nuevo desarrollo que pertenece a un género
Bacillus, que produce dicha enzima termoestable que
descompone el colágeno, convenientemente dicho microorganismo es la
cepa con la denominación Bacillus sp. NTAP-1
que se ha depositado de acuerdo con el requisito de depósitos según
el Tratado de Budapest en el Instituto de Tecnologías Bióticas de
la Agencia de Ciencia Industrial de la Tecnología perteneciente al
Ministerio de Comercio e Industria Internacional de Japón y
aceptado por número de entrada FERM BP-6926 el 1 de
noviembre de 1999. (Esta cepa fue depositada originalmente el 27 de
agosto de 1999 bajo número de entrada FERM
P-17535).
Los inventores de esta invención han encontrado
que entre los microorganismos que pertenecen al género
Bacillus hay un microorganismo novedoso que produce la
enzima termoestable que descompone el colágeno, y han realizado la
presente invención.
La Fig.1 es un gráfico que muestra la estabilidad
térmica de la enzima termoestable que descompone el colágeno, la
Fig.2 es un gráfico que muestra la estabilidad al pH de dicha
enzima termoestable que descompone el colágeno, la Fig.3 es un
gráfico que muestra la dependencia con la temperatura de la
reacción de dicha enzima termoestable que descompone el colágeno y
la Fig.4 es un gráfico que muestra la dependencia con el pH de la
reacción de dicha enzima termoestable que descompone el
colágeno.
Se ilustrará más en detalle la presente
invención.
A. Se han mencionado antes las características
microbiológicas de las bacterias usadas para producir una enzima
termoestable que descompone el colágeno. Además, este microorganismo
puede conservarse por el método de congelación (alrededor de -
80ºC).
B. Condiciones de cultivo.
nombre del medio de cultivo: medio GGY
componentes del medio: medio que contiene 1,5% de
glucosa, 1,5% de gelatina y 0,01% de extracto de levadura.
pH del medio: 4,8
condiciones de esterilización del medio: 20
minutos a 120ºC
temperatura del medio: 60ºC
condiciones aeróbicas
C. Componente del agente protector: disolución
acuosa al 30% de glicerol (no es necesario ajustar el pH del agente
protector)
no es necesario ajustar el pH del agente
protector
condiciones de esterilizado del agente protector:
20 minutos a 120ºC.
Las características de la enzima termoestable que
descompone el colágeno de esta invención se ilustrarán más
minuciosamente con referencia a los dibujos.
La Fig.1 es el gráfico que muestra la actividad
remanente relativa de la enzima termoestable que descompone el
colágeno después de tratamiento térmico durante 1 hora a varias
temperaturas, y en este gráfico se toma la actividad después del
tratamiento térmico a 30ºC como el 100%.
La Fig.2 es el gráfico que muestra la actividad
remanente relativa de la enzima termoestable que descompone el
colágeno después de tratamiento a varios pHs durante 1 hora, y en
este gráfico, la actividad después de tratamiento a pH 4,1 se toma
como el 100%.
La Fig.3 es el gráfico que muestra la actividad
relativa de la enzima termoestable que descompone el colágeno a
varias temperaturas, y en este gráfico se toma la actividad de la
enzima a 60ºC que indica la máxima actividad como el 100%.
La Fig.4 es el gráfico que muestra la actividad
relativa de la enzima termoestable que descompone el colágeno a
varios pHs y en este gráfico, la actividad de la enzima a pH 3,8
que indica el valor de actividad máxima se toma como el 100%.
Se diluyen varias clases de muestras como suelos,
abonos, aguas de río y lago de 100 a 10000 veces con 0,85% de NaCl,
y se extiende 0,1 ml de dicha disolución diluida en un medio
agar-agar GGY, después se dejan durante 2 ó 3 días a
70ºC. La colonia desarrollada en el medio se aisló e inoculó en 5
ml de medio líquido GGY y se cultivó con agitación durante 2 ó 3
días a 70ºC. Se evalúa la actividad de la enzima que descompone el
colágeno de varios cientos de tipos de aislados usando el
sobrenadante del cultivo de acuerdo con el método descrito en el
Ejemplo 2.
Se seleccionó la cepa que indica la máxima
actividad de descomposición del colágeno y se denominó cepa
NTAP-1.
NTAP-1.
Las características taxonómicas de la cepa
NTAP-1 pueden ilustrarse como sigue.
(1) morfología de la célula: forma cilíndrica
(0,8x2-3 \mum), curvada y adquiere forma de
cadena por envejecimiento.
(2) tinción de Gram: negativa o indefinida
(3) capacidad de formación de esporas: sí
(4) movilidad: sí
(5) forma y característica de las colonias:
circular, arrugada o ligeramente convexa, transparente y con
superficie suave.
(6) temperatura de crecimiento: crece a 70ºC,
pero no crece a 80ºC.
(7) catalasa: negativa
(8) oxidasa: negativa
(9) ensayo O/F: negativo
(10) ensayo bioquímico:
- Descompone
- glucosa, fructosa, sorbosa, D-arabinosa, L-arabinosa, ribosa, D-xilitol, L-xilitol, D-turanosa, L-turanosa, D-lixosa, D-tagatosa, ácido 5-cetoglucónico.
- No descompone
- glicelol, eritritol, adonitol, \beta-metil-D-xilosa, galactosa, manosa, ramnosa, dulcitol, \alpha-metil-D-manosa, \alpha-metil-D-glucosa, N-acetil-glucosamina, amidaglina, arbutina, esculina, salicina, celobiosa, maltosa, azúcar de leche, melibiosa, azúcar de caña, trehalosa, inulina, melezitosa, rafinosa, glicógeno, xilitol, gentiobiosa, D-fucosa, L-fucosa, D-arabitol, ácido 2-cetoglucónico.
- Actividad enzimática
| \beta-galactositasa | negativa | |
| arginina dihidrolasa | negativa | |
| ligina descarboxilasa | negativa | |
| ureasa | negativa | |
| triptófano desaminasa | negativa | |
| gelatinasa | positiva |
- Otros
| uso de ácido cítrico | no | |
| producción de H2S | no | |
| producción de indol | negativa | |
| producción de acetoína | positivo | |
| reducción de nitrato | positivo | |
| crecimiento anaeróbico | observado ligeramente | |
| crecimiento a pH 7 | no | |
| crecimiento a pH 5,1 | sí | |
| crecimiento a 30ºC | no. |
De las características taxonómicas mencionadas
antes, la colocación taxonómica de estas bacterias se indica en el
Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol 2
p1104-1139, autor: S.H. Sneath, editor: P.H. Snerth
et al. (editorial Williams & Willkins).
Esta bacteria es una bacteria con forma de bastón
formadora de esporas. Aunque la naturaleza
Gram-negativa de la bacteria es distinta de la
naturaleza Gram-positiva de especies conocidas del
género Bacillus, se reconoce que es una cepa del género
Bacillus porque crece aeróbicamente.
Entre las especies conocidas del género
Bacillus, se sabe que B. acidocaldarius, B.
lichenformis o B. coagulans son termófilas y acidófilas.
Sin embargo, esta cepa no debería ser B. lichenformis ni
B. coagulance porque B. lichenformis y B.
coagulance son catalasa-positivas y pueden
crecer a 40ºC pero no a 65ºC. Asimismo, es diferente de la especie
estándar de B. acidocaldarius porque produce acetoína. Por
tanto, no es posible confirmar si es una especie modificada de B.
acidocaldarius o si pertenece a una especie diferente; no puede
especificarse la especie de esta
bacteria.
bacteria.
Se vierten 5 ml de medio (pH 4,8) que contiene
1,5% de glucosa, 1,5% de gelatina y 0,01% de extracto de levadura en
un tubo de ensayo de 5 ml y se esteriliza durante 20 minutos a
120ºC. Se inocula en dicho medio NTAP-1 (el nombre
abreviado de género Bacillus NTAP-1 para
discriminar el microorganismo de esta invención) y se cultiva con
agitación durante 4 días. Se centrífuga el medio de cultivo durante
20 minutos a 8000 r.p.m., y se mide la actividad de la enzima que
descompone del colágeno en el sobrenadante. A saber, se mezclan 0,4
ml de líquido de enzima con 0,1 ml de tampón de acetato sódico 1M
(pH 4,5) y la mezcla se preincuba durante 5 minutos a 60ºC. Después
se suspenden 3 mg de Azocoll (polvo de colágeno combinado con
colorante azoico: producto de Sigma Co., Ltd), y la reacción de la
enzima se lleva a cabo a 60ºC con agitación durante 1 hora. Después
de la reacción, se enfría la mezcla de reacción en hielo, y se
separa el Azocoll insoluble por centrifugación.
Durante la reacción de la enzima, la enzima
descompone el Azocoll y el sobrenadante se vuelve rojo. Midiendo la
absorbancia del sobrenadante a 518 nm, se estima la actividad de la
enzima termoestable que descompone del colágeno. La cantidad de
enzima que hace que la absorbancia a 518 nm aumente en 0,001 por
minuto en dichas condiciones se define como 1 unidad (U). La
concentración de la actividad de enzima del líquido sobrenadante
obtenido del líquido cultivado es 3,1 U/ml.
Se vierten 6 litros del mismo medio del Ejemplo 2
en un fermentador con recipiente de 10 litros. Después de
esterilizarse durante 30 minutos a 120ºC, se inoculan en dicho
medio 200 ml de cultivo de NTAP-1. El cultivo se
lleva a cabo a 60ºC con aireación de 6 l/min durante 4 días. Se
mide la actividad termoestable de descomposición del colágeno del
cultivo sobrenadante. La actividad de enzima del líquido
sobrenadante es 5,0 U/ml.
El sobrenadante resultante se usó como material
de partida, la purificación y concentración de la enzima
termoestable que descompone el colágeno se llevaron a cabo de
acuerdo con el siguiente proceso.
Se añade sulfato amónico al líquido sobrenadante
y el precipitado formado por sulfato amónico a 40% de saturación, se
recogió y disolvió en 585 ml de tampón de acetato 0,01 M (pH 5,0).
Se añadió a la disolución Phenil-Sepharose (producto
de AmeshamPharmacia Biotech.), se agitó y se mezcló durante 1 hora,
después se filtró la mezcla y se separó la resina. La actividad
enzimática absorbida a la resina se eluyó con una mezcla 1:1 de
tampón de ácido acético 0,01M (pH 5,0) y etilenglicol, y la
fracción activa se dializó después frente a un tampón de fosfato
0,01M (pH 7,0).
Después, se pasó la disolución a través de una
columna de DEAE-Sephadex (AmeshamPharmacia Biotech)
previamente equilibrada con tampón de fosfato 0,01M (pH 7,0). Se
usó el gradiente lineal (0-1M) de cloruro sódico
para eluir la actividad enzimática de la columna. Se fraccionó el
eluato en unas 90 fracciones y se midió la actividad enzimática de
cada fracción de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1.
Después, se añade sulfato amónico a las
fracciones activas (233 ml) a 20% de saturación. La actividad
enzimática se absorbe en una columna por paso de la disolución de
enzima a través de la columna de phenyl-Sepharose
(AmeshamPharmacia Biotech) que previamente se equilibra con tampón
de ácido acético 0,01M (pH 5,0).
Después, se eluyó la actividad enzimática
absorbida en la columna lavando la columna con una pendiente lineal
de concentración (0-50%) de etilenglicol en el
tampón regulador. La disolución eluida se divide en 90 fracciones
aproximadamente y se mide la actividad enzimática de cada fracción
de acuerdo con el método de medida descrito en el Ejemplo 1. De las
fracciones de la disolución eluida se recogen fracciones activas
(total 48 ml).
Esta disolución se dializa frente a un tampón de
fosfato 0,01M (pH 7,0), después se aplica a una columna de
MONO-Q (AmeshamPharmacia Biotech) que previamente se
equilibra con el mismo tampón. La actividad se eluye lavando la
columna con un gradiente lineal (0-1M) de cloruro
sódico.
Se recogen fracciones activas (10,6 ml) y se
concentran hasta 0,5 ml usando Centricon (concentrador centrífugo:
Amicon Co., Ltd.: dicho concentrador tiene una membrana de
ultrafiltración hecha de un derivado celulósico en el fondo del
recipiente. Cuando la disolución mezclada compuesta de enzima y
proteína se vierte al recipiente y se centrífuga a 6000 r.p.m., la
proteína contenida en la disolución se queda en la membrana,
mientras que el agua o iones de bajo peso molecular pasan a través
de la película y se recuperan como un líquido filtrado), y se
separan por un método de cromatografía de filtración en gel, y se
recoge 1,2 ml de fracción con una actividad más alta. El
rendimiento de actividad de la fracción disuelta del líquido
cultivado es 1,4% y la concentración de la enzima activada es 416
U/ml.
La disolución de enzima así obtenida se analizó
por electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida de
acuerdo con el procedimiento de Laemmli (Laemmli, Reino Unido,
Nature, 1970, 227, 680-685) y se estimó que el peso
molecular de la enzima termoestable que descompone el colágeno es
de aproximadamente 46000.
Después de suspender 5 mg de Azocoll en 0,4 ml de
tampón de acetato sódico 0,01M (pH 4,5), se añaden 0,1 ml de
disolución de enzima, cuya concentración en enzima se ajusta
convenientemente por dilución, y se deja reaccionar durante 1 hora a
60ºC con agitación constante. Después de la reacción, la mezcla de
reacción se enfría en hielo durante 1 hora y después se centrífuga.
Se mide la absorbancia a 518 nm del sobrenadante. Se usó como
disolución blanco la mezcla de reacción preparada por el mismo
proceso excepto usando agua en lugar de la disolución de enzima. Se
midió la absorbancia a 518 nm de la mezcla de reacción en la cual
el Azocoll que se añadió se solubilizó perfectamente. Los
mismos experimentos se llevan a cabo a varias concentraciones de enzima, y se determina la cantidad de enzima que da aproximadamente 50% de degradación bajo estas condiciones (para solubilizar aproximadamente 2,5 mg de Azocoll).
mismos experimentos se llevan a cabo a varias concentraciones de enzima, y se determina la cantidad de enzima que da aproximadamente 50% de degradación bajo estas condiciones (para solubilizar aproximadamente 2,5 mg de Azocoll).
Por el mismo proceso que se mencionó antes, se
suspenden (o disuelven) respectivamente 5 mg de colágeno, gelatina,
caseína o seroalbúmina de vaca (todos son productos de Nacalai
Tesque, Co.) en 0,4 ml de disolución tampón de acetato sódico 0,01M
(pH 4,5), después se añaden 0,1 ml de disolución de enzima de
concentración previamente decidida y se deja reaccionar durante 1
hora a 60ºC con agitación constante. Después de la reacción, la
mezcla de reacción se mantuvo a 4ºC durante 20 minutos y se
centrifugó. En los casos en que se usa caseína o seroalbúmina
bovina se añaden a la mezcla de reacción 0,5 ml de ácido
tricloroacético al 50% y se mantiene a 4ºC durante 20 minutos,
luego se centrifuga. Se midió la absorción del sobrenadante a 280
nm. A partir del valor de absorción a 280 nm cuando todas las
proteínas están perfectamente solubilizadas se miden los grados de
descomposición de todas las proteínas. En la Tabla 1 se da una
relación de los grados de solubilización relativos de todas las
proteínas cuando el grado de descomposición del Azocoll se considera
del 100%.
observaciones
| +++: | tiene actividad relativa mayor que 80% respecto a Azocoll |
| \pm: | tiene actividad relativa inferior a 20% respecto a Azocoll |
| -: | no reacciona. |
Los resultados obtenidos se muestran en la Fig.1.
Esta enzima es estable hasta 60ºC. Mientras, se investiga la
estabilidad de las enzimas cuando las enzimas se tratan a varios pH.
A continuación se da una relación de los tampones que se deben usar
en el intervalo específico de pH.
pH 2,5 a 3,5: tampón 1M
glicina-HCl
pH 3,5 a 5,5: tampón 1M acetato sódico
pH 6,0 a 8,0: tampón 1M fosfato sódico
pH 8,0 a 9,0: tampón 1M
glicina-NaOH
pH 9,0 a 10,0: tampón 1M fosfato sódico.
Después de añadir 0,0025 ml de estos tampones y
0,0025 ml de disolución acuosa al 1% de Tween 80 a 0,02 ml de
líquido de enzima, se ponen a la temperatura de 60ºC durante 1
hora. Luego, se añaden 0,05 ml de tampón de ácido acético 1M (pH
4,0) a este líquido de enzima tratado y se mide la actividad. El
resultado obtenido indica que esta enzima es estable en el
intervalo de pH de 3 a 6 (Fig.2).
(Experimento para investigar la temperatura
óptima de reacción y el pH óptimo de reacción de la enzima
termoestable que descompone el colágeno).
Se midió la actividad de la enzima termoestable
que descompone el colágeno de esta invención a 30, 40, 50, 60, 70 y
80ºC. Se usó el método descrito en el Ejemplo 1 excepto cambiando
la temperatura de reacción. Los resultados mostraron que esta
enzima exhibía la máxima actividad a 60ºC (referirse a la Fig.
3).
En segundo lugar, se mide la actividad de esta
enzima a varios pH (de pH 2,5 a 7,2). El método para la medida de la
actividad se basó en el método descrito en el Ejemplo 1 excepto
cambiando el componente del tampón que se ha de usar en el sistema
de reacción como sigue: tampón 0,01M de glicina-HCl
(pH 2,5 a 7,2), tampón 0,01M de acetato sódico (pH 4 a 6) o tampón
0,01M de fosfato potásico (pH 6 a 8). Los resultados mostraron que
esta enzima mostraba la máxima actividad a pH 3,7 a 3,9 (referirse
a la Fig. 4).
Obviamente, de los ejemplos mencionados antes por
la presente invención se hace posible preparar eficazmente una
enzima termoestable que descompone el colágeno que es excelente a
la temperatura óptima, pH óptimo y especificidad de sustrato de
colágeno por el uso del microorganismo novedoso mencionado antes.
Por tanto, la presente invención posibilita utilizar los materiales
que no se utilizan en las industrias ganaderas, y contribuye en
gran medida a la producción de péptidos de colágeno que tienen
aplicaciones potenciales en las industrias médica, farmacéutica y
alimentaria.
Claims (7)
1. Una enzima termoestable que descompone el
colágeno que se puede obtener a partir de una bacteria que pertenece
al género Bacillus, donde: (1) la bacteria es
Gram-negativa o Gram-indefinida; (2)
la bacteria tiene capacidad de formar esporas; (3) la bacteria
tiene motilidad; (4) la bacteria crece a 70ºC, no crece a 30ºC ni
80ºC; (5) crece a pH 5 y no crece a pH 7; (6) la bacteria tiene
forma de bastón; (7) la bacteria es negativa a la catalasa; (8) la
bacteria es negativa a la oxidasa; (9) la bacteria es negativa al
ensayo O/F; (10) la bacteria tiene actividad de producción de
acetoína; y (11) la bacteria tiene actividad de descomposición de la
gelatina, y dicha enzima se caracteriza además por los
siguientes rasgos: (a) la enzima tiene mayor actividad de hidrólisis
hacia el colágeno y la gelatina que la caseína y la albúmina; (b) el
pH óptimo de reacción está entre 3,5 y 4,5; (c) la temperatura
óptima de reacción está entre 65ºC y 70ºC; (d) la enzima retiene más
del 60% de su actividad original después del tratamiento térmico a
60ºC y pH 6,0 durante 4 horas; (e) la enzima es estable entre pH 3 y
6; y (f) el peso molecular de la enzima estimado por electroforesis
en gel de SDS-poliacrilamida es aproximadamente
46000.
2. Una enzima de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la bacteria es una bacteria del género Bacillus cepa
NTAP-1.
3. Un método para producir una enzima de acuerdo
con la reivindicación 1 ó 2, comprendiendo el método el uso de una
bacteria como se definió en la reivindicación 1 para acumular la
enzima en un medio de cultivo, para purificar la enzima y para
recogerla.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
donde la bacteria es una bacteria del género Bacillus
cepa
NTAP-1.
NTAP-1.
5. Una bacteria perteneciente al género
Bacillus, la cual bacteria produce una enzima de acuerdo con
la reivindicación 1.
6. Una bacteria de acuerdo con la reivindicación
5, que es Bacillus sp. NTAP-1 depositada
según el Tratado de Budapest en el Instituto de Tecnología Biótica
de la Agencia de Ciencia Industrial de la Tecnología perteneciente
al Ministerio de Comercio e Industria Internacional de Japón y
aceptada con el número de entrada FERM BP-6926 el 1
de noviembre de 1999 (depositada bajo el número de entrada original
FERM P-17535 el 27 de agosto de 1999).
7. El uso de una enzima de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 para descomponer el colágeno.
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