CN105829522A - 新型微生物 - Google Patents

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Abstract

提供黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)，其为弗拉特杆菌(Frateribacillus)属的新种，具有如下特性：1)革兰氏染色为阴性且形成孢子；2)氧化酶试验为阴性，过氧化氢酶试验为阳性，为需氧性；3)在包含1％的糖和0.2％的NaCl的LB培养基(pH8.0)中，作为该糖加入D?半乳糖或蔗糖时，不进行酸生成，但加入D?葡萄糖、乳糖、D?甘露糖醇、甘油或N?乙酰葡糖胺时，进行酸生成；等。上述新型微生物对屎尿、污泥等有机废弃物的处理等是有用的。

Description

新型微生物
技术领域
本发明涉及作为新弗拉特杆菌属(Frateribacillus属)的新种的新型微生物。更详细而言，涉及具有新型的特性的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)。
背景技术
以往的有机废弃物的处理主要通过焚烧处理来进行。焚烧处理中，存在确保对有机废弃物焚烧时产生的废气、通过焚烧得到的灰烬进行填埋处理的场所等各种问题。作为解决这些问题的手段，提出了使用微生物对有机废弃物进行堆肥化的处理方法。如果利用使用该堆肥化的处理方法，则可以使用所得处理物作为堆肥，因此可以减轻或消除由上述焚烧所导致的各种问题，可以期待能够持续的循环型社会的构筑。
以往的堆肥化的过程中，霉菌等真菌、被称为放线菌的放线菌目(Actinomycetales目)的细菌、高温放线菌属(Thermoactinomyces属)等高温放线菌科(Thermoactinomycetaceae科)的细菌、芽孢杆菌属(Bacillus属)、土芽孢杆菌属(Geobacillus属)等芽孢杆菌科(Bacillaceae科)的细菌将有机物分解/同化而负责堆肥化。这些微生物具有孢子形成能力，在升温至自各个体的生长温度以上的环境下，以孢子的状态表现出耐热性，可以稳定地保留于堆肥内，因此，在生长最适温度下将有机废弃物分解/同化后也重新形成堆肥，可以重复用于堆肥化。
堆肥化中，与厌氧性发酵相比，需氧性发酵的有机物的分解快且能够降低恶臭，所以优选。利用需氧性发酵的堆肥化的过程中，利用通气的需氧性发酵开始，10天以内堆肥内部的温度变为超过45℃的高温，高温状态被长期维持直至堆肥化结束。在45℃～70℃的堆肥内的高温环境下，小单孢菌科(Micromonosporaceae科)、链霉菌科(Streptomycetaceae科)、高温单孢菌科(Thermomonosporanceae科)、链孢囊菌科(Streptosporangiaceae科)等放线菌目的放线菌群、嗜热性且具有丝状形态的高温放线菌科的细菌群负责有机物的分解(非专利文献1)。另外，土芽孢杆菌属所属的芽孢杆菌科的细菌群也存在于高温环境下的堆肥内(非专利文献2、非专利文献3)。在高温状态的堆肥内部，属于限于这些的分类群的菌群主要负责堆肥化，各科(family)内的菌种由性状类似的菌构成，因此一般在变为高温以后的堆肥内部的菌群为多样性低的状态。
专利文献1中记载了使用无氧芽孢杆菌(Anoxybacillus)属的菌株制造堆肥的方法，专利文献2中记载了使用芽孢杆菌(Bacillus)属的菌株制造堆肥的方法，但均利用芽孢杆菌科的细菌。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-24569号公报
专利文献2：日本特开2008-278890号公报
专利文献3：日本特开2005-13063号公报
非专利文献
非专利文献1：生物科学和生物工程杂志(Journal of bioscience andbioengineering)，Vol.99，p1-11，2005
非专利文献2：系统与进化微生物学国际杂志(International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology)，Vol.52，p2251-2255，2002
非专利文献3：系统和应用微生物学(Systematic and Applied Microbiology)，Vol.34，p419-423，2011
发明内容
发明要解决的问题
此处，废弃物处理中产出的有机废弃物遍及有机性污泥、食品残渣物、动物粪尿等多种形式，根据废弃物原料的种类而堆肥内的pH、盐浓度、腐植酸浓度、C/N比(碳率)有较大变化。因此，为了有效地对多样的有机废弃物进行堆肥化处理，期望添加与已有的菌群不同的菌群使其在堆肥中生长，通过多样的菌种将有机物分解/同化。另外，添加的菌群具有孢子形成能力，因此可以维持休眠状态，可以期望耐于环境的变化。这是由于，稳定的孢子的状态容易保管、搬运进而能够重新形成堆肥重复使用，从该方面出发是经济的。
为了解决上述课题，迄今为止本发明人等探索了能够用于堆肥化的新型的细菌，发现了属于在80℃以上的环境下生长的新型的属的超嗜热菌(专利文献3)。
然而，为了更有效地将有机废弃物进行堆肥化，正在寻求新型的微生物。
本发明的课题在于，提供对屎尿、污泥等有机废弃物的处理等有用的新型微生物。
用于解决问题的方案
本发明人等发现了新型微生物，通过将其分离、鉴定，从而完成了本发明。
即，本发明如以下所述。
〔1〕黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)，其为弗拉特杆菌属(Frateribacillus属)的新种，具有如下1)～10)的特性：
1)革兰氏染色为阴性的杆菌且形成孢子；
2)氧化酶试验为阴性，过氧化氢酶试验为阳性，为需氧性；
3)在包含1％的糖和2％的NaCl的LB培养基(pH8.0)中，作为该糖加入D-半乳糖或蔗糖时不进行酸生成，但在加入D-葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、甘油或N-乙酰葡糖胺时进行酸生成；
4)最适生长温度为45℃～55℃，在35℃以下或65℃以上没有确认到增殖；
5)最适pH为7.0～8.0，在pH5.7以下或pH10.0以上没有确认到增殖；
6)在CYC培养基中添加NaCl直至终浓度达到7％也确认到增殖；
7)主要的甲基萘醌类为甲基萘醌类(MK)7；
8)作为细胞壁肽聚糖的氨基酸组成，包含丙氨酸、谷氨酸和内消旋型二氨基庚二酸(meso-DAP)；
9)基因组DNA的鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)含量为51.2％～52.4％；
10)最主要的菌体脂肪酸为异(iso)-C16：0。
〔2〕根据上述〔1〕所述的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)，其具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因由与序列号1或序列号8～序列号19中的任一者所示的碱基序列具有98.7％以上的同源性的碱基序列构成。
〔3〕根据上述〔1〕或〔2〕所述的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)，其与YM17株：NITE BP-01764；YM17-2株：NITE BP-01948；YM17-3株：NITE BP-01949；YM17-4株：NITE BP-01950或YM17-5株：NITE BP-01925的DNA-DNA杂交同源值为70％以上。
〔4〕根据上述〔1〕～〔3〕中任一项所述的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillusflavoalbus)，其中，作为菌体脂肪酸，进一步包含反异-C15：0、C16：0、反异-C17：0、异-C17：0中的任一种以上。
〔5〕根据上述〔1〕～〔4〕中任一项所述的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillusflavoalbus)，其为作为菌体脂肪酸包含异-C16：0进而包含反异(anteiso)-C15：0、反异-C17：0、异-C17：0的黄白弗拉特杆菌亚种黄白菌(Frateribacillus flavoalbussubsp.flavoalbus)。
〔6〕根据上述〔1〕～〔4〕中任一项所述的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillusflavoalbus)，其为作为菌体脂肪酸包含异-C16：0进而包含反异-C15：0、C16：0、反异-C17：0的黄白弗拉特杆菌亚种粪球菌(Frateribacillus flavoalbu ssubsp.fimetarium)。
〔7〕根据上述〔1〕～〔6〕中任一项所述的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillusflavoalbus)，其用于有机废弃物的处理。
〔8〕根据上述〔7〕所述的黄白弗拉特杆菌，其中，有机废弃物为屎尿、有机性污泥、食品残渣物或动物粪尿。
〔9〕根据上述〔1〕～〔8〕中任一项所述的黄白弗拉特杆菌，其为YM17株(NITE BP-01764)、NaCl＿20131016＿04株、YM17-2株(NITE BP-01948)、YM17-3株(NITE BP-01949)、YM17-4株(NITE BP-01950)、NaCl＿20131016＿19株、YM17-5株(NITE BP-01925)、NaCl＿20131016＿24株、NaCl＿20131016＿28株、NaCl＿20131016＿30株、NaCl＿20131016＿34株、NaCl＿20131016＿37株或NaCl＿20131016＿38株中的任一者。
〔10〕一种有机废弃物的处理方法，其中，使用上述〔1〕～〔9〕中任一项所述的黄白弗拉特杆菌。
〔11〕一种蛋白质的分解方法，其中，使用上述〔1〕～〔9〕中任一项所述的黄白弗拉特杆菌。
〔12〕一种堆肥的制造方法，其具备如下工序：将〔1〕～〔9〕中任一项所述的前述黄白弗拉特杆菌的发酵产物添加/混合到有机废弃物中得到第一混合物的工序；调整第一混合物的水分量的工序；将第一混合物作为原料进行需氧性发酵得到第一发酵产物的工序；和，得到第一发酵产物的总重量中的水分率满足基准值的物质作为堆肥的工序。
〔13〕根据〔12〕所述的堆肥的制造方法，其还具备如下工序：将堆肥的一部分加入到其他有机废弃物中得到第二混合物的工序；调整第二混合物的水分量的工序；将第二混合物作为原料进行需氧性发酵得到第二发酵产物的工序；和，得到第二发酵产物的总重量中的水分率满足基准值的物质作为堆肥的工序。
发明的效果
根据本发明得到的新型微生物为新属弗拉特杆菌(Frateribacillus)属的新种。该新型微生物对屎尿、污泥等有机废弃物的处理、蛋白质的分解等是有用的，另外，可以用于各种用途。
附图说明
图1为示出YM17株的细胞照片的图(实施例1)。
图2为示出通过邻接法制成的系统树的图(实施例1)。
图3为示出与YM17株分离的12株的16S rRNA基因的系统树的图(实施例2)。
图4的A、图4的B为示出堆肥培养中的菌的状态的图(实施例2)。
图5的A、图5的B为示出明胶酶谱法的结果的图(实施例2)。
图6为堆肥的制造方法的流程图。
具体实施方式
以下，列举实施方式对本发明进行说明，但本发明不限定于以下的实施方式。
[新型微生物]
本发明的实施方式的黄白弗拉特杆菌是指具有如下1)～10)的特性的新型弗拉特杆菌属(弗拉特杆菌属)：
1)革兰氏染色为阴性的杆菌且形成孢子；
2)氧化酶试验为阴性，过氧化氢酶试验为阳性，为需氧性；
3)在包含1％的糖和2.0％的NaCl的LB培养基(pH8.0)中，作为该糖加入D-半乳糖或蔗糖时，不进行酸生成，但加入D-葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、甘油或N-乙酰葡糖胺时，进行酸生成；
4)最适生长温度为45℃～55℃，在35℃以下或65℃以上没有确认到增殖；
5)最适pH为7.0～8.0，在pH5.7以下或pH10.0以上没有确认到增殖；
6)在CYC培养基中添加NaCl直至终浓度7％也确认到增殖；
7)主要的甲基萘醌类为MK7；
8)作为细胞壁肽聚糖的氨基酸组成，包含丙氨酸、谷氨酸和内消旋型二氨基庚二酸(meso-DAP)；
9)基因组DNA的GC含量为51.2％～52.4％；
10)最主要的菌体脂肪酸为异-C16：0。
作为该“主要的甲基萘醌类”，可以举出：包含81.8％以上的MK7的物质。
另外，作为“主要的菌体脂肪酸”，可以举出：包含34.1％以上且42.6％以下的异-C16：0的物质。
进而，作为“菌体脂肪酸”包含异-C16：0进而包含反异-C15：0、C16：0、反异-C17：0、异-C17：0中的任一种以上。本发明的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)优选包含总计86.1％以上的这些脂肪酸。
进而，本发明的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)优选具有16SrRNA基因，所述16S rRNA基因由对序列号1或序列号8～19中的任一者所示的碱基序列具有98.7％以上的同源性的碱基序列构成。
进而，本发明的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)优选与YM17株、YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株或YM17-5株的DNA-DNA杂交的同源值为70％以上。
作为这样的本发明的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)，可列举出：具有上述1)～10)的性质且作为菌体脂肪酸包含异-C16：0进而包含反异-C15：0、反异-C17：0、异-C17：0的黄白弗拉特杆菌亚种黄白菌(Frateribacillus flavoalbussubsp.flavoalbus)。
作为这样的黄白弗拉特杆菌亚种黄白菌(Frateribacillus flavoalbussubsp.flavoalbus)，可以举出：后述的YM17株、YM17-5株等。
另外，作为本发明的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)，具有上述1)～10)的性质，进而还可以举出：作为菌体脂肪酸包含异-C16：0进而包含反异-C15：0、C16：0、反异-C17：0的黄白弗拉特杆菌亚种粪球菌(Frateribacillus flavoalbussubsp.fimetarium)。
作为这样的黄白弗拉特杆菌亚种粪球菌，可以举出：NaCl＿20131016＿04株、YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株、NaCl＿20131016＿19株、NaCl＿20131016＿24株、NaCl＿20131016＿28株、NaCl＿20131016＿30株、NaCl＿20131016＿34株、NaCl＿20131016＿37株和NaCl＿20131016＿38株等。
作为本发明的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)所列举的YM17株具有上述特性，且16SrRNA的碱基序列与序列表序列号1中记载的碱基序列为100％相同。
本菌株根据本申请人的申请、在独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)专利微生物保藏中心基于布达佩斯条约进行了国际保藏。以下，记载规定保藏的内容。
(1)保藏机构名称：独立行政法人制品评价技术基盘机构 专利微生物保藏中心
(2)联系地址：〒292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8
电话号码0438-20-5580
(3)保藏编号：NITE BP-01764
(4)用于识别的标识：YM17
(5)原保藏日：2013年11月29日
另外，同样地对于作为本发明的黄白弗拉特杆菌所列举的YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株和YM17-5株，也根据本申请人的申请，在独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)专利微生物保藏中心基于布达佩斯条约进行了国际保藏。实施例等中示出规定它们的保藏的内容。
本发明的黄白弗拉特杆菌中也包括相当于该黄白弗拉特杆菌的菌株的突变株。另外，黄白弗拉特杆菌中，也包括黄白弗拉特杆菌亚种、黄白弗拉特杆菌亚种粪球菌的突变株。
本发明中的该突变株是指通过导入化学突变、自然突变、形态突变、转染等基因工程学手法改变了其物理特性、化学特性且具有上述1)～10)的全部特性的菌株。
[有机废弃物的处理方法/堆肥的制造方法]
本发明的黄白弗拉特杆菌可以用于有机性污泥、食品残渣物或动物粪尿等有机废弃物的处理。通过在这些有机废弃物中加入黄白弗拉特杆菌，也可以制造堆肥等。
使用本发明的黄白弗拉特杆菌的有机废弃物的处理方法中，不仅在有机废弃物中加入黄白弗拉特杆菌，还可以在有机废弃物的处理中包括有用的其他工序。
此处，参照图6，并且作为有机废弃物的处理方法的1个方式，对堆肥的制造方法进行说明。此处，示出使用了堆积型发酵槽的例子，但制造设备不限定于此。需要说明的是，作为堆积型发酵槽，优选使用：以俯视被3面分隔成大致“コ”字状的、堆积型发酵槽。
首先，在步骤101中，作为发酵产物，准备包含上述黄白弗拉特杆菌的黄白弗拉特杆菌的发酵产物。另外，准备有机废弃物。然后，将准备好的有机废弃物配置于堆积型发酵槽内。
接着，步骤103中，在有机废弃物中添加·混合规定量的发酵产物，得到第一混合物。需要说明的是，作为任意工序的步骤102中，可以从数据库取出期望的数据，对有机废弃物规定最佳的发酵产物的添加量、需氧性发酵条件后，进行步骤103以后的工序。
步骤105中，调整第一混合物的水分量。通常，刚刚制备后的第一混合物的总重量中的水分率为40～80％左右。由此，高于上限值时添加回流堆肥(后述的步骤112中取出的堆肥)，低于下限值时添加水分。
步骤108中，例如从配置于堆积型发酵槽的床的空气管对第一混合物进行强制通气(换气)，或使用装载机翻动第一混合物，由此对第一混合物进行需氧性发酵得到第一发酵产物。作为需氧性发酵的条件，优选1周内翻动1次左右。
步骤110中，判断第一发酵产物的总重量中的水分率是否满足基准值。水分率不满足基准值时，重复步骤105或步骤108。水分率以第一发酵产物的总重量基准计优选小于30％。这是由于，为了维持作为堆肥的性能，优选以堆肥总重量中的固体成分量变为70％以上的方式进行调整。水分率以第一发酵产物的总重量基准计更优选为20～30％。需要说明的是，作为任意工序，可以在步骤111中关联发酵产物的添加量、需氧性发酵的条件等而存储于数据库。
步骤112中，取出水分率满足基准值的物质作为堆肥。至此的发酵时间为45～60天左右。由以上，可以由有机废弃物制造堆肥。
可以直接使用所得堆肥，也可以在步骤203中将堆肥的一部分加入到其他有机废弃物中得到第二混合物，进而进行与上述步骤103～步骤112同样的工序，从而进一步制造堆肥。
以往的有机废弃物的处理中，焚烧有机废弃物、填埋处理所得灰烬，因此，存在确保废气、填埋处理场所等由焚烧所导致的各种问题。然而，根据实施方式的有机废弃物的处理方法，可以使用所得处理物作为肥料，因此，可以减轻或消除上述由焚烧所导致的各种问题，实现能够持续的循环型社会的构筑。进而，通过上述方法得到的堆肥的矿物质丰富。
假定对堆肥进行焚烧处理时，堆肥的水分量低，从而即使不加入矿物燃料，也能够焚烧，因此，与如果不加入矿物燃料则无法焚烧的以往的焚烧处理方法相比，可以大幅削减被认为是温室效应气体的二氧化碳(CO2)气体排出量。另外，堆肥的重量为原来的有机废弃物的重量的10～30％左右，因此可以将进行焚烧时的燃料费抑制得较低而且可以减小埋设焚烧后的堆肥时的用地面积。
以往的使用微生物的有机废弃物的处理(堆肥的制造)中，必须根据有机废弃物原料而仔细调整发酵条件。这是由于，根据废弃物原料的种类而堆肥内的pH、盐浓度、腐植酸浓度、C/N比有较大变化。然而，利用上述新型微生物则不需要仔细调整发酵条件，因此例如可以将图6的步骤102、步骤111简略化或省略。
进而，由于可以使用大量包含对堆肥化有效的菌的回流堆肥，因此，步骤103中，将废弃物原料和回流堆肥混合后的堆肥化进行的初期的开始变快。另外，由于附带设备简单，因此可以将附带设备费抑制为较低，且可以将运转费用抑制为较低。
[其他实施方式]
进而，本发明的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)可以用于蛋白质的分解。另外，使用本发明的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)的蛋白质的分解方法中，不仅在蛋白质、包含蛋白质的分解对象中加入黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)，而且在蛋白质的分解中也可以包括有用的其他工序。
以下，列举实施例更具体地说明本发明，当然本发明并不限定于此。
实施例
〔实施例1〕
黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)的分离·鉴定
1.菌株的分离
从鹿儿岛县曾于市的堆肥化场的堆肥中分离出YM17株。
即，在包含50μg/mL新生霉素(Novobiocin)的4mL的1/2营养培养基(Nutrientmedium)(蛋白胨：0.25％、氯化钠：0.25％、酵母提取物：0.1％、肉提取物：0.05％、pH7.4)中加入该堆肥400mg，在55℃下培养2天，然后将该液体培养液涂布于包含50μg/mL新生霉素的1/2营养琼脂培养基，培养4天，分离出YM17株的菌落。
2.分类学性质
A.试验方法
菌株的分类学性质按照“新生化学实验讲座第17卷微生物实验法(东京化学同人发行)”、“修订版微生物的分类和鉴定＜下＞(学会出版中心发行)”、“微生物的分类·鉴定实验法(Springer Japan发行)”、BERGEY‘S MANUAL OF Systematic Bacteriology所述的方法进行分析。分离菌株的分类和鉴定通过与International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology杂志所述的种的比较来进行。
将通过该解析得到的形态性质、培养性质、生理学性质、生长范围和化学分类学性质示于表2-1、表2-5。另外，将在55℃下培养YM17株的细胞照片示于图1。图1中，可以确认，YM17株为杆菌，在细胞的末端形成孢子。图1的条表示10μm。需要说明的是，表2(表2-1～表2-5)中也一并示出实施例2中分离出的12个菌株的分类学性质。
B.试验培养基
各培养基的pH如表2-1中所述。除了石蕊牛奶以外，各培养基在121℃下进行15分钟的高压釜灭菌。石蕊牛奶在110℃下进行10分钟的高压釜灭菌。对克里斯坦森尿素培养基的尿素、OF试验培养基的糖、考察了来自糖的酸生成的糖类进行过滤器灭菌，以成为记载的终浓度的方式加入到各培养基中。需要说明的是，来自糖的酸生成使用包含1％的糖和2％的NaCl的LB培养基(pH8.0)进行考察。
(1)CYC琼脂培养基(蔗糖：3％、酪蛋白氨基酸：0.6％、硝酸钠：0.3％、酵母提取物：0.2％、磷酸氢二钾：0.1％、硫酸镁七水合物：0.05％、氯化钾：0.05％、硫酸铁七水合物：0.001％、琼脂：1.5％)
(2)CYC液体培养基(蔗糖：3％、酪蛋白氨基酸：0.6％、硝酸钠：0.3％、酵母提取物：0.2％、磷酸氢二钾：0.1％、硫酸镁七水合物：0.05％、氯化钾：0.05％、硫酸铁七水合物：0.001％)
(3)肉汁琼脂培养基(肉提取物：1％、蛋白胨：1％、氯化钠：0.5％、琼脂：1.5％)
(4)肉汁液体培养基(肉提取物：1％、蛋白胨：1％、氯化钠：0.5％)
(5)石蕊牛奶(脱脂牛奶：10％、1％石蕊液：数滴)
(6)VP培养基(酵母提取物：0.1％、胰蛋白胨：0.7％、大豆蛋白胨：0.5％、葡萄糖：1％、氯化钠：0.5％、琼脂：0.3％)
(7)SIM培养基(肉提取物：0.3％、蛋白胨：3％、硫代硫酸钠：0.005％、盐酸半胱氨酸：0.02％、柠檬酸铁铵：0.05g、琼脂：0.5％)
(8)LB琼脂培养基(胰蛋白胨：1％、氯化钠：0.5％、酵母提取物：0.5％、琼脂：1.5％)
(9)SY琼脂培养基(硫酸铵：0.2％、磷酸氢二钠：0.14％、磷酸二氢钾：0.07％、硫酸镁七水合物：0.02％、硫酸铁七水合物：0.0005％、硫酸锰五水合物：0.0005％、葡萄糖：1％)
(10)营养琼脂培养基(肉提取物：0.3％、蛋白胨：0.5％、琼脂：1.5％)
(11)西蒙氏培养基(Simmons Medium)(磷酸二氢铵：0.1％、磷酸氢二钾：0.1％、氯化钠：0.5％、柠檬酸钠：0.2％、硫酸镁七水合物：0.02％、琼脂：1.5％、BTB：0.008％)
(12)克氏培养基(Christensen Medium)(酵母提取物：0.05％、半胱氨酸盐酸盐：0.01％、氯化钠：0.5％、柠檬酸钠：0.3％、葡萄糖：0.02％、磷酸二氢钾：0.1％、琼脂：1.5％、酚红：0.0012％)
(13)硝酸盐培养基(葡萄糖：1.0％、磷酸二氢钾：0.1％、硫酸镁七水合物：0.05％、氯化钾：0.02％、硝酸钠：0.1％)
(14)铵盐培养基(葡萄糖：1.0％、磷酸二氢钾：0.1％、硫酸镁七水合物：0.05％、氯化钾：0.02％、硫酸铵：0.078％)
(15)克里斯坦森尿素培养基(Christensen's urea medium)(蛋白胨：0.1％、氯化钠：0.5％、葡萄糖：0.1g、KH2PO4：0.2％、酚红：0.0008％、琼脂：1.5％、尿素：2％)
(16)OF试验培养基(蛋白胨：0.2％、氯化钠：0.5％、磷酸氢二钾：0.03％、琼脂：0.2％、BTB：0.008％、糖：1％)
C.脂肪酸的分析
1)试样调整和利用气相色谱法的分析
在5L的三角烧瓶中加入了3L的CYC液体培养基的主培养培养基中接种经过种子培养的菌，在52℃下从对数增殖期后期进行培养至稳定期初期，通过离心回收菌体。
将经过回收的菌体用生理盐水清洗2次。将约500mg～700mg的湿菌体加入至带螺旋盖的离心管中。加入1mL的碱皂化液，进行密封，在100℃下保持5分钟。5分钟后，充分振荡10秒，进一步在100℃下保持30分钟。将离心管冷却，然后加入2mL的盐酸甲醇试剂，进行密封，在80℃下保持10分钟。将离心管冷却后，加入1.25mL的抽提用溶剂，缓慢搅拌10分钟。将离心管以1000rpm进行5分钟离心，然后将上层移至其他带螺旋盖的离心管，加入3mL的清洗液。再次进行密封，搅拌5分钟。将该离心管以1000rpm进行5分钟离心，然后将溶剂层取至玻璃安瓿，用氮气使其干燥。各试剂的组成如下述所示。将所得干燥试样作为脂肪酸分析试样，通过TechnoSuruga Laboratory Co.，Ltd.的气相色谱仪进行分析。将所得结果示于表1。
2)试剂
(1)碱皂化液(氢氧化钠：7.5g、甲醇：25mL、超纯水：25mL)
(2)盐酸甲醇试剂(6N盐酸：21.7mL、甲醇：18.3mL)
(3)抽提用溶剂(己烷：10mL、叔丁基甲基醚：10mL)
(4)清洗液(氢氧化钠：0.586g、超纯水：48.8mL)
[表1]
黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)的菌体脂肪酸组成
D.细胞壁肽聚糖
1)试样调整
将约2g的湿菌体悬浮于6mL的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)，通过超声波破碎机(TAITEC株式会社制造的VP-30S)进行30分钟处理，将细胞破碎。将破碎液在温度4℃下、以3000rpm进行10分钟离心，回收上清。将上清在温度4℃下、以9000rpm进行60分钟离心，去除上清，将沉淀物移至新的离心管。在沉淀物中加入6mL的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)并进行清洗，然后在温度4℃下、以9000rpm进行60分钟离心，去除上清。在沉淀物中加入2mL的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)和400μL的25％十二烷基硫酸钠(SDS)，在100℃下保持40分钟。进一步加入预先加热至65℃的10mL的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)，进行搅拌，然后在温度30℃下、以9000rpm进行60分钟离心。
去除上清，在沉淀物中加入预先加热至65℃的5mL的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)并进行清洗，然后在温度30℃下、以9000rpm进行30分钟离心，去除上清。进行该清洗操作2次。清洗后，在沉淀物中加入2mL的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.6)和100μL的1mg/mL链霉蛋白酶液，在37℃下保持2小时。在该链霉蛋白酶反应后的液体中加入5mL的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.6)，清洗细胞壁成分，然后在温度4℃下、以9000rpm进行30分钟离心，去除上清。进行该清洗操作2次。
在清洗后的沉淀物中加入2mL的5％三氯乙酸水溶液，在100℃下保持20分钟。将该悬浮液移至玻璃制的带螺旋盖的离心管，加入5mL的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)并进行清洗，然后在室温下、以1000rpm进行1分钟离心，去除上清。进行该清洗操作2次。在清洗后的沉淀物中加入3mL的乙醇，在室温下、以1000rpm进行1分钟离心，去除上清。在沉淀物中加入3mL的二乙醚，在室温下、以1000rpm进行1分钟离心，去除上清，使沉淀物干燥，将其作为细胞壁试样。
2)利用薄层色谱法(TLC)的分析
在5mg的细胞壁试样中加入250μL的4N盐酸，在100℃下进行16小时水解反应。水解反应后，在装有氢氧化钾的干燥器内去除盐酸，将所得处理液供试于TLC。
TLC板使用Merck株式会社制造、TLC纤维素板、Cat.No.1.05716.0001。构成氨基酸的检测中，将第一维用异丙醇：乙酸：超纯水＝75：10：15的展开溶剂展开，将第二维用甲醇：吡啶：10N盐酸：超纯水＝64：8：2：14展开。展开后，对TLC板喷涂茚三酮试剂，检测细胞壁肽聚糖中所含的氨基酸。另外，二氨基庚二酸的异构型的检测使用相同的TLC板，用甲醇：吡啶：10N盐酸：超纯水＝64：8：2：14进行展开，通过与标准品的迁移率的比较进行特定。其结果确认了，作为细胞壁肽聚糖的氨基酸组成，包含丙氨酸、谷氨酸和内消旋型二氨基庚二酸(meso-DAP)。
E.甲基萘醌类
1)试样调整
在约500mg的干燥菌体中加入20mL的氯仿：甲醇＝2：1液体，在冷暗处缓慢搅拌一晩。将该悬浮液过滤，将滤液用热水浴温度30℃的旋转蒸发仪进行浓缩干固。将干固物溶于3mL的丙酮，在氮气中浓缩至约200μL。将该浓缩液供试于Merck株式会社制造、HPTLC硅胶60F254板、Cat.No.1.05628.0001，将甲苯作为展开溶剂进行展开。展开后，将TLC板干燥，在UV灯(254nm)下确认甲基萘醌类的谱带，将该部分的硅胶用刮铲刮下，放入试验管中。在刮下的硅胶中加入4mL的丙酮，缓慢搅拌，进行过滤器过滤，去除硅胶颗粒。将所得上清通过氮气浓缩至约200μL，将其作为HPLC的试样。
2)利用高效液相色谱法(HPLC)的分析
将试样25μL注入到HPLC中。柱使用ODS柱(株式会社资生堂制造、CAPCELL PAK C18UG120 HPLC PACKED COLUMN Cat.No.61504)，展开溶剂使用甲醇：异丙醇＝2：1液体。以移动速度1.5mL/分钟、柱温40℃进行展开，在UV(270nm)下进行检测。HPLC的机械使用Hewlett-Packard Company制造的Series 1100 HPLC System。进行该分析多次，结果MK7的含量在第1次为83.9％、在第2次为85.2％，因此确认了，主要的甲基萘醌类为MK7。
F.GC含量
1)DNA调整
基因组DNA的提取按照参考文献1的方法进行。
即，将0.9g～1.6g的湿菌体用生理盐水-0.1M EDTA(pH8.0)进行清洗，然后悬浮于5mL的同一溶液。以终浓度1mg/mL添加蛋清溶菌酶，在35℃下使其溶菌，然后使溶菌液冷冻。在冷冻品中加入等量的三羟基甲基氨基甲烷(Tris)-SDS(pH 9.0)，在60℃的热水浴中进行融化，保持10分钟。之后，进行冰冷，加入等量的水饱和苯酚，振荡10分钟。离心并回收上清，加入2倍量的乙醇，将纤维状的DNA用玻璃棒卷取。将卷取的DNA用70％、90％、99.5％的乙醇进行阶段性清洗，去除苯酚。将DNA干燥后，用适量的0.1×SSC溶液溶解，加入RNase，在35℃下使其反应30分钟以上，去除RNA。冰冷后，加入1/5量的水饱和苯酚，同样地进行振荡、离心，去除乙醇沉淀、苯酚，用0.1×SSC溶液进行溶解、RNase处理。
对RNase处理后的DNA进行苯酚处理，离心，分离回收DNA溶解级分，在DNA溶解级分中加入1/10量的乙酸EDTA和0.6倍量的异丙醇，再次卷取DNA。将卷取后的DNA用70％、90％、99.5％的乙醇进行清洗，干燥，然后以DNA浓度变为500μg/mL以上的方式用0.1×SSC溶液进行溶解。DNA的纯度低时，重复利用苯酚的蛋白质的去除和RNase处理。
参考文献1：Saito，H.&Miura，K.1963.Preparation of transformingdeoxyribonucleic acid by phenol treatment.Biochim.Biophys.Acta 72：619-629.
2)试剂
(1)生理盐水-0.1M EDTA(NaCl：8.77g、EDTA·2Na·2H2O：37.22g、pH：8.0、超纯水：以总液量成为1000mL的方式加入)
(2)Tris-SDS(Tris：12.1g、SDS：20.0g、pH9.0、超纯水：以总液量成为1000mL的方式加入)
(3)20×SSC(NaCl：175g、柠檬酸三钠：77.4g、超纯水：以总液量变为1000mL的方式加入。0.1×SSC和1×SSC是将20×SSC用超纯水稀释而制成的)
(4)乙酸EDTA(A液：CH3COONa·3H2O：81.65g/超纯水200mL、B液：CH3COOH：36.03g/超纯水200mL。将A液和B液混合调整为pH7.0。EDTA·2Na·2H2O：74.45mg/形成作为调整液200mL的乙酸EDTA)
3)GC含量的测定
GC含量的测定使用DNA GC kit(YAMASA CORPORATION制造)。将7μg相当量的DNA溶解于20μL的0.1×SSC，在100℃使其热变性10分钟，立即进行冰冷。冰冷后，加入20μL的4U/mL核酸酶P1溶液，在50℃下使其反应1小时。核酸酶P1处理后，加入20μL的2.4U/mL碱性磷酸酶溶液，在37℃下使其反应1小时，将其供试于HPLC。
HPLC的柱使用ODS柱(株式会社资生堂制造、CAPCELL PAK C18 UG120 HPLCPACKED COLUMN Cat.No.61504)，展开溶剂使用0.02M NH4H2PO4：乙腈＝20：1液体。以移动速度1.0mL/分钟、柱温40℃进行展开，在UV(270nm)下进行检测。以附属于DNA GC kit的标准作为基准，计算YM17株的GC含量，结果GC含量为51.4％。
[表2-1]
黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)的分类学解析的结果
*除了生长温度和化学分类学性质的其他试验在培养温度55℃下进行。
[表2-2]
黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)的分类学解析的结果
*除了生长温度和化学分类学性质的其他试验在培养温度55℃下进行。
[表2-3]
黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)的分类学解析的结果
*除了生长温度和化学分类学性质的其他试验在培养温度55℃下进行。
[表2-4]
黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)的分类学解析的结果
*除了生长温度和化学分类学性质的其他试验在培养温度55℃下进行。
[表2-5]
G.16S rRNA基因的碱基序列的解析
1)聚合酶链式反应(PCR反应)
通过菌落直接PCR法扩增YM17株的16S rRNA基因。PCR反应使用Tks Gflex(商标)DNA Polymerase(TAKARA BIO INC.制造)和EU10F引物(序列表序列号2)、EU1500R引物(序列表序列号3)。PCR反应液的组成按照Tks Gflex(商标)DNA Polymerase的说明书所述的混合比例。PCR反应如下：进行94℃下1分钟的热处理1个循环，然后进行98℃下10秒、55℃下15秒、68℃下1分钟30秒的反应30个循环。
2)序列反应
所得PCR反应物通过Wizard(注册商标)SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega Corporation制造)进行纯化。使用纯化产物和EU10F引物、EU520F引物(序列表序列号4)、EU907R引物(序列表序列号5)或EU1500R引物进行序列反应，确定分离菌株的16SrRNA基因的碱基序列。
将YM17株的16S rRNA基因的碱基序列示于序列表序列号1。
对于YM17株的16S rRNA基因碱基序列，进行作为基因数据库的国家生物技术信息中心(The National Center for Biotechnology Information)的BLAST同源检索(http：//blast.Ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，结果与YM17株的16S rRNA基因显示出最高同源性的种为无孢子皂硫-洛克菌(Mechercharimyces asporophorigenens)，同源性为91％。
接着，通过国家生物技术信息中心(The National Center for BiotechnologyInformation)的基因数据库收集与YM17株近缘种的16S rRNA基因，进行系统解析。
将收集好的16S rRNA基因碱基序列通过Clustal X 2.0.12程序进行比对，通过邻接法制成系统树。将所得系统树示于图2。括号内的数字表示GenBank的登记号，YM16表示利用与本发明同样的方法由本发明人等分离出的菌株。
H.YM17株的鉴定和分类
1)YM17株
如图2的系统解析所示那样，YM17株的16S rRNA基因形成大致分为芽孢杆菌科、环脂酸芽孢杆菌科(Alicyclobacillaceae科)、高温放线菌科的分支。
YM17株所示的杆菌的形态、细胞内进行芽胞形成的形态为在芽孢杆菌科、环脂酸芽孢杆菌科中可见的性质，与形成丝状性的菌丝的高温放线菌科(Thermoactinomycetaceae科)明显不同。
将YM17株与属于芽孢杆菌科和环脂酸芽孢杆菌科的种的16S rRNA基因序列的同源性进行比较。将结果示于表3。全部属中同源性变为89％以下，YM17株与属于芽孢杆菌科和环脂酸芽孢杆菌科的种在分类学上有较大不同。图2的系统树中，进行与YM17株分支接近的酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、极端嗜热砂地菌(Calditerricola satsumensis)、嗜热卡达卡利杆菌(Caldalkalibacillus thermarum)、马兜铃热杆菌属(Caldibacillus debilis)和YM17株的分类学性质的比较。将结果示于表4。
表4中，除了YM17株以外的数据由International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology(2002)，52，1681-1685；Journal of General Microbiology(1971)，67，9-15；International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(2011)，61,631-636；International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology(2006)，56，1217-1221和International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology(2004)，54，2197-2201获得。
环脂酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus属)，在主要的脂肪酸的特征性质是具有ω-环己烷-C17：0、ω-环己烷-C19：0作为主要脂肪酸，与YM17株不同。
极端嗜热菌属(Calditerricola属)为能够在75℃以上生长的高度嗜热性细菌，与YM17株不同。
卡达卡利杆菌(Caldalkalibacillus属)在革兰氏染色为阳性、DNA的碱基组成为45％的方面与YM17株不同。
热杆菌属(Caldibacillus属)在65℃以上也生长，未见来自葡萄糖的酸生成，因此与YM17株不同。
由以上判定，YM17株为新科(弗拉特杆菌科，Frateribacillus)、新属(弗拉特杆菌属，Frateribacillus)的新种，将YM17株命名为黄白弗拉特杆菌(以下，有时简单称为黄白弗拉特杆菌，Frateribacillus flavoalbus)。
[表3]
YM17株与属于芽孢杆菌科和环脂酸芽孢杆菌科的种的16S rRNA基因的同源性
*括号内的数字表示GenBank的登记号。
[表4]
〔实施例2〕
黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)种的分离
根据上述实施例1表明，黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)种与已知的科/属/种不同。因此，为了明确黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)种的特性，进行YM17株以外的属于黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)种的菌株的分离。
1.黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)种的分离
将鹿儿岛县曾于市的堆肥化场和鹿儿岛市的堆肥化场的堆肥作为分离源，尝试了黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)种的菌株的分离。
将上述实施例1中的YM17株的培养性状作为参考，将CYC琼脂培养基中添加或没有添加7％或10％的氯化钠和50μg/mL氨苄西林的培养基作为分离培养基，在55℃的培养温度下培养6天，进行菌的分离，结果丝状细菌的大量的菌落和杆菌状的细菌的菌落出现在分离培养基上。
从其中分离杆菌状的细菌的菌落，通过用于检测如下2.所示的黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)种的特异性PCR进行判定，结果如表5所示那样，总计12个菌株判定为黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)种。
特别是，CYC琼脂培养基中添加有7％氯化钠和50μg/mL氨苄西林的培养基中的分离频率高，使用该培养基，在55℃下进行培养，由此可以有效地分离黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)种。
对于分离出的12个菌株，分别设为NaCl＿20131016＿04株、YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株、NaCl＿20131016＿19株、YM17-5株、NaCl＿20131016＿24株、NaCl＿20131016＿28株、NaCl＿20131016＿30株、NaCl＿20131016＿34株、NaCl＿20131016＿37株或NaCl＿20131016＿38株。
其中，对于YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株和YM17-5株，根据本申请人的申请，在独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)专利微生物保藏中心基于布达佩斯条约进行国际保藏。以下，记载规定保藏的内容。
YM17-2株
(1)保藏机构名称：独立行政法人制品评价技术基盘机构 专利微生物保藏中心
(2)联系地址：〒292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8
电话号码0438-20-5580
(3)保藏编号：NITE BP-01948
(4)用于识别的标识：YM17-2
(5)原保藏日：2014年10月6日
YM17-3株
(1)保藏机构名称：独立行政法人制品评价技术基盘机构 专利微生物保藏中心
(2)联系地址：〒292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8
电话号码0438-20-5580
(3)保藏编号：NITE BP-01949
(4)用于识别的标识：YM17-3
(5)原保藏日：2014年10月6日
YM17-4株
(1)保藏机构名称：独立行政法人制品评价技术基盘机构 专利微生物保藏中心
(2)联系地址：〒292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8
电话号码0438-20-5580
(3)保藏编号：NITE BP-01950
(4)用于识别的标识：YM17-4
(5)原保藏日：2014年10月6日
YM17-5株
(1)保藏机构名称：独立行政法人制品评价技术基盘机构 专利微生物保藏中心
(2)联系地址：〒292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8
电话号码0438-20-5580
(3)保藏编号：NITE BP-01925
(4)用于识别的标识：YM17-5
(5)原保藏日：2014年8月28日
2.用于检测黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)种的特异性PCR
如下进行用于检测黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)种的特异性PCR。首先，YM17株的16S rRNA基因使用特异性的碱基序列，制成TIP155F1引物(5’-ATACCGGATAAGAGGCTTTT-3’)(序列表序列号6)和TIP155R1引物(5’-TGGTACCGTCACGCTAAGA-3’)(序列表序列号7)。
PCR反应中使用Tks Gflex(商标)DNA聚合酶(DNA Polymerase)、TIP155F1引物、TIP155R1引物和分离菌株的DNA。PCR反应液的组成按照Tks Gflex(商标)DNA Polymerase的说明书记载的混合比例。PCR反应如下：进行94℃下1分钟的热处理1个循环，然后进行98℃下10秒、55℃下15秒、68℃下1分钟的反应25个循环，将电泳中在328bp附近确认到扩增产物的菌株判定为黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)种。
[表5]
3.分离菌株的分类学解析
利用与针对YM17株的实施例1同样的方法考察通过上述1.和2.分离出的12个菌株的分类学性质，将结果示于表2-1～表2-5。
4.分离菌株的16S rRNA基因的碱基序列的解析
针对YM17株利用与实施例1同样的方法考察通过上述1.和2.分离出的12个菌株的16S rRNA基因的碱基序列。各株的16S rRNA基因的碱基序列分别示于序列表序列号8～19。序列号8与NaCl＿20131016＿04株对应，序列号9与YM17-2株对应，序列号10与YM17-3株对应，序列号11与YM17-4株对应，序列号12与NaCl＿20131016＿19株对应，序列号13与YM17-5株对应，序列号14与NaCl＿20131016＿24株对应，序列号15与NaCl＿20131016＿28株对应，序列号16与NaCl＿20131016＿30株对应，序列号17与NaCl＿20131016＿34株对应，序列号18与NaCl＿20131016＿37株对应，序列号19与NaCl＿20131016＿38株对应。
将YM17株的16S rRNA基因和这些12个菌株的16S rRNA基因的碱基序列的同源性示于表6。如表6所示那样，分离出的12个菌株的16S rRNA基因的碱基序列与YM17株的16SrRNA基因的碱基序列具有98.7％以上的同源性。
[表6]
5.DNA-DNA杂交
使用通过上述1.和2.分离出的6个菌株和YM17株的基因组DNA进行DNA-DNA杂交试验。另外，作为阴性对照，使用作为近缘属的极端嗜热砂地菌(Calditerricolasatsumensis)YMO81株的DNA。DNA的调整通过与〔实施例1〕的利用GC含量测定调整的方法相同的方法进行。
所得基因组DNA浓度均为500μg/mL以上、OD260/OD280值为1.8以上、OD260/OD230值为2.0以上且是没有RNA混入、能够用于DNA-DNA杂交试验的高品质。
DNA-DNA杂交试验按照参考文献2和微生物的分类·鉴定实验法(Springer Japan发行)所述的方法。
首先，进行DNA板的制作。将基因组DNA溶液用0.1×SSC稀释制成100μg/mL。将稀释后的DNA溶液在100℃下进行5分钟加热形成一条链，然后立即进行冰冷。将热变性后的DNA溶液用PBS-Mg溶液进行10倍稀释制成10μg/mL。将制成10μg/mL的DNA溶液分别注入微板的孔中各100μL，微板上加封，在30℃下静置3小时以上。之后，弃去孔内的DNA溶液，作为试验用的DNA板。背景对照使用鲑鱼精子DNA。
与DNA板的准备并行地进行DNA的光敏生物素标记。配制500μg/mL的DNA溶液30μL，在超声波清洗机中进行10分钟处理，切断DNA。在切断后的DNA溶液中加入25μL的1mg/mL光敏生物素液，使DNA完全溶解，然后边冰冷边在250W的低压汞灯下照射30分钟，对DNA进行光敏生物素标记。为了去除剩余的光敏生物素，在照射后的DNA溶液中加入540μL的0.1MTris-HCl缓冲液(pH9.0)，然后加入600μL的2-丁醇并混合。以15000rpm进行5秒离心，弃去包含过剩的光敏生物素的上清。加入2-丁醇去除过剩的光敏生物素的操作总计进行2次。将光敏生物素标记后的DNA溶液在100℃下加热5分钟，然后立即进行冰冷，用于杂交。
接着，进行杂交操作。在DNA板的各孔中分别注入200μL的预杂交溶液，在37℃下静置15分钟。将热变性后的300μL的光敏生物素标记DNA溶液与6mL的杂交溶液混合。从DNA板的各孔去除预杂交溶液，将包含光敏生物素标记DNA的杂交溶液分别各注入100μL，密封DNA板。将该DNA板在46℃下静置2小时以上，进行杂交处理。杂交处理后，弃去包含光敏生物素标记DNA的杂交溶液，用300μL的1×SSC溶液清洗各孔的操作总计进行3次。
在清洗后的各孔中分别注入100μL的链霉亲和素酶溶液。在37℃下静置30分钟，然后弃去链霉亲和素酶溶液。用100μL的1×SSC溶液清洗各孔，然后进一步用300μL的1×SSC溶液清洗各孔总计3次。在清洗后的各孔中加入100μL的荧光基质溶液，用酶标仪测定荧光强度(激发波长360nm，测定波长450nm)。在37℃下保温，每隔1分钟测定荧光强度。DNA的各组合的荧光强度从6孔的反复中算出中央值4孔的平均值，将粘附有鲑鱼精子DNA的孔的平均荧光强度值作为背景值减去从而算出。同源值用相对于将相同菌株的DNA用于孔和标记的同源的数值的百分率来表示。
参考文献2：Ezaki，T.,Hashimoto，Y.&Yabuuchi，E.,1989.Fluorometricdeoxyribonucleic acid-deoxyribonucleic acid hybridization in microdilutionwells as an alternative to membrane filter hybridization in whichradioisotopes are used to determine genetic relatedness among bacterialstrains.International journal of systematic bacteriology.39：p224-229
试剂
(1)PBS-Mg溶液(MgCl2：0.95g/PBS100mL)
(2)0.1M Tris-HCl缓冲液(Tris：12.1g、EDTA·2Na：0.4g、pH9.0、超纯水：以总液量成为1000mL的方式加入)
(3)预杂交溶液(20×SSC：1mL、50×Denhardt液：1mL、10mg/mL变性鲑鱼DNA：0.1mL、甲酰胺：5mL、超纯水：2.9mL)
(4)杂交溶液(20×SSC：1mL、50×Denhardt液：1mL、10mg/mL变性鲑鱼DNA：0.1mL、甲酰胺：5mL、硫酸葡聚糖：0.25g、超纯水：2.8mL)
(5)链霉亲和素酶溶液(链霉亲和素-β-D-半乳糖苷酶结合物：10μL、0.5％牛血清白蛋白(级分V，fraction V)/PBS溶液：10mL)
(6)荧光基质溶液(10mg/mL 4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷(4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside)溶液：100μL、PBS+1mmolMgCl2溶液：10mL)
将DNA-DNA杂交试验的结果示于表7。
如表7所示那样，YM-17株、YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株、YM17-5株、NaCl＿20131016＿37株和NaCl＿20131016＿38株的彼此的DNA-DNA同源值全部为70％以上。
如参考文献3所示那样，微生物分类学中，如果DNA-DNA同源值为70％以上，则可以认为是同种，因此，确认了这些7个株为同种。
参考文献3：Stackebrandt，E.&Ebers，J.，2006.Taxonomic parametersrevisited：tarnished gold standards.Microbiol.Today Nov.：p152-155
[表7]
6.黄白弗拉特杆菌的性质
根据上述的各解析、试验，确认了黄白弗拉特杆菌为具有如下1)～10)的特征作为性质的种：
1)革兰氏染色为阴性的杆菌且形成孢子；
2)氧化酶试验为阴性，过氧化氢酶试验为阳性，为需氧性；
3)向包含1％的糖和2％的NaCl的LB培养基(pH8.0)中，作为该糖加入D-半乳糖或蔗糖时不进行酸生成，但在加入D-葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、甘油或N-乙酰葡糖胺时进行酸生成；
4)最适生长温度为45℃～55℃，在35℃以下或65℃以上没有确认到增殖；
5)最适pH为7.0～8.0，在pH5.7以下或pH10.0以上没有确认到增殖；
6)在CYC培养基中添加NaCl直至终浓度达到7％也确认到增殖；
7)主要的甲基萘醌类为MK7；
8)作为细胞壁肽聚糖的氨基酸组成，包含丙氨酸、谷氨酸和内消旋型二氨基庚二酸(meso-DAP)；
9)基因组DNA的胞嘧啶(GC)含量为51.2％～52.4％；
10)最主要的菌体脂肪酸为异-C16：0。
7.黄白弗拉特杆菌种内的亚种分类
将YM17株和分离出的12株(NaCl＿20131016＿04株、YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株、NaCl＿20131016＿19株、YM17-5株、NaCl＿20131016＿24株、NaCl＿20131016＿28株、NaCl＿20131016＿30株、NaCl＿20131016＿34株、NaCl＿20131016＿37株和NaCl＿20131016＿38株)的16S rRNA基因的系统树示于图3。如图3所示那样，YM17株和YM17-5株的16S rRNA基因与其他菌株分支。
另外，如表8所示那样，YM17株和YM17-5株的主要菌体脂肪酸上位4种为异-C16：0、反异-C17：0、反异-C15：0、异-C17：0，与此相对，YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株、NaCl＿20131016＿37株和NaCl＿20131016＿38株为异-C16：0、C16：0、反异-C17：0、反异-C15：0，是不同的。因此，YM17株·YM17-5株与其他菌株在黄白弗拉特杆菌(Frateribacillusflavoalbus)中为同种，但为不同的亚种。
[表8]
根据以上结果，将YM17株和YM17-5株这2株命名为弗拉特杆菌亚种黄白菌(Frateribacillus flavoalbus subsp.flavoalbus)，将NaCl＿20131016＿04株、YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株、NaCl＿20131016＿19株、NaCl＿20131016＿24株、NaCl＿20131016＿28株、NaCl＿20131016＿30株、NaCl＿20131016＿34株、NaCl＿20131016＿37株和NaCl＿20131016＿38株这11株命名为黄白弗拉特杆菌亚种粪球菌(Frateribacillusflavoalbus subsp.fimetarium)。
即，黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)为由弗拉特杆菌的亚种黄白菌和黄白弗拉特杆菌亚种粪球菌这2个亚种组成的新属/新种。
8.黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)的蛋白质分解活性
接着，考察黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)的蛋白质分解活性。在基本培养基(氯化钠：2.0％、酵母提取物：0.1％)中加入2.0％的明胶或0.4％的酪蛋白，将pH调整为8.0，然后加入1.5％的琼脂，在120℃下进行20分钟高压釜灭菌，制成试验培养基。
在试验培养基上涂布YM17株、NaCl＿20131016＿04株、YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株、NaCl＿20131016＿19株、YM17-5株、NaCl＿20131016＿24株、NaCl＿20131016＿28株、NaCl＿20131016＿30株、NaCl＿20131016＿34株、NaCl＿20131016＿37株或NaCl＿20131016＿38株，在55℃下培养7天。培养后，在试验培养基中滴加盐酸-氯化汞溶液(氯化汞15g、浓盐酸20mL、蒸馏水100mL)，通过晕圈形成，考察蛋白质的分解活性。试验的结果如下：13个菌株中全部可见明胶和酪蛋白的分解活性。
9.黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)的堆肥环境中的生长和有机物分解活性
考察黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)的堆肥中的生长和有机物分解活性。
使用经过过滤器过滤灭菌的包含10％酵母提取物溶液1mL、1％酪蛋白溶液或灭菌水3mL、2％NaCl的LB培养基(pH8.0)在55℃下培养1天菌种，对进行了2次120℃、30分钟的高压釜灭菌的10g堆肥添加该培养1天后的菌的培养液1mL，用经过灭菌的药勺混合以使水分遍布在整个堆肥中。混合物以气相处于充分的状态密闭容器，在55℃下进行3天培养(以下，称为堆肥培养)。将代替菌的培养液添加有经过灭菌的包含2％NaCl的LB培养基(pH8.0)的样品作为阴性对照。作为试验菌，使用YM17株、YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株、YM17-5株、NaCl＿20131016＿37株和NaCl＿20131016＿38株。
通过显微镜观察堆肥培养3天后的培养物，结果添加有YM17株、YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株、YM17-5株、NaCl＿20131016＿37株或NaCl＿20131016＿38株的培养液的试验区中，全部确认到菌的良好的生长。另一方面，没有添加菌的培养物的阴性对照中没有见菌体。图4的A、图4的B中示出YM17株或阴性对照的酪蛋白添加堆肥培养3天后的显微镜照片。
如图4的A的圆所示那样，对于YM17株，可以确认菌体的良好的生长。另一方面，如图4的B所示那样，阴性对照中，仅观察到堆肥的固体物，未见菌体。
从堆肥培养3天后的培养物中提取蛋白质。首先，在培养物中加入30mL的Tris-HCl(pH8.0)形成悬浮液，在室温下静置3小时。将静置后的悬浮液过滤(滤纸：ADVANTEC MFS,INC.，型号NO.5B，110mm)，回收滤液。为了将残留的残渣物用Tris-HCl(pH8.0)清洗，将滤液调整为总量30mL。在30mL的滤液中加入14.2g的硫酸铵，缓慢搅拌，使硫酸铵溶解。硫酸铵溶解后，在冰上静置一晩。将静置后的液体以4℃、10000g离心30分钟，去除上清，回收沉淀物。将沉淀物用1mL的Tris-HCl(pH8.0)溶解，将溶解物放入透析膜Spectra/Por(注册商标)1(制造商Spectrum Laboratories，Inc.，)，MW 6000-8000)中，在Tris-HCl(pH8.0)中透析并进行脱盐处理。脱盐后，用Tris-HCl(pH8.0)调整，使液量为2mL，作为酶谱的供试试样。
在酶谱法用的电泳凝胶中加入作为基质的终浓度0.1％的明胶。将脱盐后的蛋白质溶解液15μL和加样缓冲液5μL混合，将20μL的混合液供试于酶谱法。
将电泳后的凝胶放置在包含0.2％Triton(特里同)X的Tris-HCl(pH8.0)中10分钟，然后弃取本缓冲液，用不含TritonX的Tris-HCl(pH8.0)进行2次清洗。将清洗后的凝胶浸渍于包含2mM的CaCl2和2mM的MgSO4的20mL的Tris-HCl(pH8.0)中，在55℃下静置16小时，进行活性培养。活性培养后，弃去包含2mM的CaCl2和2mM的MgSO4的20mL的Tris-HCl(pH8.0)，对凝胶进行30分钟的考马斯染色，考马斯染色后进行脱色，考察蛋白质的分解活性。
酶谱法的结果如下：从未添加酪蛋白的堆肥培养中提取出的蛋白质也显示出明胶分解活性，但从添加酪蛋白的堆肥培养中提取出的蛋白质显示出更强的活性。另外，未添加菌的培养液的阴性对照中，无论有无添加酪蛋白，从堆肥培养中提取出的蛋白质都不显示明胶分解活性。
这是由于，添加菌的培养液时，未添加酪蛋白的堆肥培养的情况下，也可见蛋白质的分解活性，蛋白质残留在作为基材的堆肥中，活性被诱导。另外，通过添加酪蛋白进行堆肥培养，更强地体现出活性诱导。
根据以上的结果表明，YM17株、YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株、YM17-5株、NaCl＿20131016＿37株或NaCl＿20131016＿38株等黄白弗拉特杆菌(Frateribacillusflavoalbus)种在堆肥中也生长，具有蛋白质分解活性。图5的A、图5的B中示出明胶酶谱法的结果。图5的A为使用通过未添加酪蛋白堆肥培养提取出的蛋白质的酶谱法的结果，图5的B为使用通过添加酪蛋白的堆肥培养提取出的蛋白质的酶谱法的结果。
试剂
(1)Tris-HCl(pH8.0)(Tris：6.1g、用浓盐酸调整为pH8.0、超纯水：以总液量变为1000mL的方式加入)
(2)酶谱用电泳凝胶
分隔层(30％丙烯酰胺：2000μL、1.5M Tris-HCl(pH8.5)：1500μL、超纯水：1800μL、10％SDS：60μL、10％APS：50μL、TEMED：5μL、1％明胶：600μL)
堆积层(30％丙烯酰胺：450μL、0.5M Tris-HCl(pH6.5)：750μL、超纯水：1700μL、10％SDS：30μL、10％APS：50μL、TEMED：5μL)
分隔层固化后，将堆积层重叠并使其固化。
(3)10×酶谱用电泳缓冲液(Tris：30.3g、甘氨酸：144g、超纯水：以总液量变为1000mL的方式加入)。酶谱的电泳中，将10×酶谱用电泳缓冲液用超纯水稀释形成1×缓冲液，以终浓度变为0.1％的方式加入SDS。
产业上的可利用性
根据本发明得到的新型微生物作为新属弗拉特杆菌(Frateribacillus)属的新种对屎尿、污泥等有机废弃物的处理等是有用的，另外，可以用于各种用途。
保藏编号
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(4)用于识别的标识：YM17-5
(5)原保藏日：2014年8月28日

Claims (11)

1.黄白弗拉特杆菌(Frateribacillus flavoalbus)，其为弗拉特杆菌(Frateribacillus)属的新种；
具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因由对序列号1或序列号8～序列号19中的任一者所示的碱基序列具有98.7％以上的同源性的碱基序列构成；
与YM17株：NITE BP-01764；YM17-2株：NITE BP-01948；YM17-3株：NITE BP-01949；YM17-4株：NITE BP-01950或YM17-5株：NITE BP-01925的DNA-DNA杂交同源值为70％以上；并且
具有如下1)～10)的特性：
1)革兰氏染色为阴性的杆菌且形成孢子；
2)氧化酶试验为阴性，过氧化氢酶试验为阳性，为需氧性；
3)在包含1％的糖和2.0％的NaCl的LB培养基(pH8.0)中，作为该糖加入D-半乳糖或蔗糖时，不进行酸生成，但加入D-葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、甘油或N-乙酰葡糖胺时，进行酸生成；
4)最适生长温度为45℃～55℃，在35℃以下或65℃以上没有确认到增殖；
5)最适pH为7.0～8.0，在pH5.7以下或pH10.0以上没有确认到增殖；
6)在CYC培养基中添加NaCl直至终浓度达到7％也确认到增殖；
7)主要的甲基萘醌类为MK7；
8)作为细胞壁肽聚糖的氨基酸组成，包含丙氨酸、谷氨酸和内消旋型二氨基庚二酸；
9)基因组DNA的GC含量为51.2％～52.4％；
10)最主要的菌体脂肪酸为异-C16：0。
2.根据权利要求1所述的黄白弗拉特杆菌，其中，作为菌体脂肪酸，进一步包含反异-C15：0、C16：0、反异-C17：0、异-C17：0中的任一种以上。
3.根据权利要求1或2所述的黄白弗拉特杆菌，其为作为菌体脂肪酸包含异-C16：0进而包含反异-C15：0、反异-C17：0、异-C17：0的黄白弗拉特杆菌亚种黄白菌(Frateribacillusflavoalbus subsp.flavoalbus)。
4.根据权利要求1或2所述的黄白弗拉特杆菌，其为作为菌体脂肪酸包含异-C16：0进而包含反异-C15：0、C16：0、反异-C17：0的黄白弗拉特杆菌亚种粪球菌(Frateribacillusflavoalbus subsp.fimetarium)。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的黄白弗拉特杆菌，其用于有机废弃物的处理。
6.根据权利要求5所述的黄白弗拉特杆菌，其中，有机废弃物为屎尿、有机性污泥、食品残渣物或动物粪尿。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的黄白弗拉特杆菌，其为YM17株：NITE BP-01764；YM17-2株：NITE BP-01948；YM17-3株：NITE BP-01949；YM17-4株：NITE BP-01950或YM17-5株：NITE BP-01925中的任一者。
8.一种有机废弃物的处理方法，其使用权利要求1～7中任一项所述的黄白弗拉特杆菌。
9.一种蛋白质的分解方法，其使用权利要求1～7中任一项所述的黄白弗拉特杆菌。
10.一种堆肥的制造方法，其具备如下工序：
将利用权利要求1～7中任一项所述的黄白弗拉特杆菌的发酵产物添加并混合到有机废弃物中得到第一混合物的工序；
调整所述第一混合物的水分量的工序；
将所述第一混合物作为原料进行需氧性发酵得到第一发酵产物的工序；和，
得到所述第一发酵产物的总重量中的水分率满足基准值的物质作为堆肥的工序。
11.根据权利要求10所述的堆肥的制造方法，其还具备如下工序：
将所述堆肥的一部分加入到其他有机废弃物中得到第二混合物的工序；
调整所述第二混合物的水分量的工序；
将所述第二混合物作为原料进行需氧性发酵得到第二发酵产物的工序；和，
得到所述第二发酵产物的总重量中的水分率满足基准值的物质作为堆肥的工序。
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