JP2015116158A

JP2015116158A - 新規微生物

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Publication number: JP2015116158A
Application number: JP2013261679A
Authority: JP
Inventors: 好倫岡村; Yoshitomo Okamura; 山村　正一; Shoichi Yamamura; 正一山村
Original assignee: Sanyu Co Ltd
Current assignee: Sanyu Co Ltd
Priority date: 2013-12-18
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2015-06-25

Abstract

【課題】し尿、汚泥等の有機廃棄物の処理等に有用な新規微生物の提供を課題とする。【解決手段】プラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）の新種であり、次の１）〜３）の特性を有するプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）を提供する。１）主要な構成脂肪酸としてｉｓｏＣ１５：０、ｉｓｏＣ１６：０、Ｃ１６：０、及びｉｓｏＣ１７：０を含む２）細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成としてアラニン、グルタミン酸、及びメソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含む３）主要メナキノンがＭＫ７である【選択図】なし

Description

本発明は、プラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）の新種となる新規微生物に関する。さらに詳しくは、次の１）〜３）の特性を有するプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）に関する。
１）主要な構成脂肪酸としてｉｓｏＣ１５：０、ｉｓｏＣ１６：０、Ｃ１６：０、及びｉｓｏＣ１７：０を含む。
２）細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成としてアラニン、グルタミン酸、及びメソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含む。
３）主要メナキノンがＭＫ７である。

従来、たい肥の製造において、し尿、汚泥などの有機廃棄物に、サーモアクチノミセス属、サーモモノスポラ属、バチルス属、ゲオバチルス属、又は好気性枯草菌等の好熱性微生物を作用させることが行われてきた。しかし、これらの微生物は発酵温度が十分ではなく、肥効作用の低いものしか得られないことから、より効率的に有用なたい肥を製造できる方法の提供が望まれていた。
そこで、本発明者らは、霧島火山地帯の土壌から得られた８５℃以上の温度で生育する細菌培養物に着目し、これを汚泥に加えて通気発酵することで、有用な菌体を多数含み、たい肥として使用できる汚泥発酵物を得た（特許文献１）。さらに本発明者らは、この汚泥発酵物から新規な属に属する超好熱菌を見出している（特許文献２）。

特許第３０６４２２１号公報特開２００５−１３０６３号公報

本発明は、し尿、汚泥等の有機廃棄物の処理等に有用な新規微生物の提供を課題とする。

本発明者らは、し尿、汚泥等の有機廃棄物の処理等に有用な新規微生物を見出し、これを単離、同定することにより、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
〔１〕プラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）の新種であり、次の１）〜３）の特性を有するプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）。
１）主要な構成脂肪酸としてｉｓｏＣ１５：０、ｉｓｏＣ１６：０、Ｃ１６：０、及びｉｓｏＣ１７：０を含む
２）細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成としてアラニン、グルタミン酸、及びメソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含む
３）主要メナキノンがＭＫ７である
〔２〕有機廃棄物の処理に使用する上記〔１〕に記載のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）。
〔３〕有機廃棄物がし尿、有機性汚泥、食品残渣物、又は動物糞尿である上記〔２〕に記載のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）。
〔４〕ＹＭ１６株（ＮＩＴＥＰ−０１７６３）である上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）。
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）を使用する有機廃棄物の処理方法。

本発明によって得られた新規微生物は、プラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）の新種として、し尿、汚泥等の有機廃棄物の処理等に有用であり、また、様々な用途に使用し得る。

ＹＭ１６株の細胞写真を示した図である（実施例）。ＹＭ１６株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を示した図である（実施例）。近隣結合法により作成された系統樹を示した図である（実施例）。

本発明のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）とは、次の１）〜３）の特性を有するプラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）の新種のことをいう。
１）主要な構成脂肪酸としてｉｓｏＣ１５：０、ｉｓｏＣ１６：０、Ｃ１６：０、及びｉｓｏＣ１７：０を含む
２）細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成がとしてアラニン、グルタミン酸、メソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含む
３）主要メナキノンがＭＫ７である

本発明のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）は、「主要な構成脂肪酸」として、ｉｓｏＣ１５：０を２５．０％以上４５．％以下、ｉｓｏＣ１６：０を１０．０％以上２０．０％以下、Ｃ１６：０を５．０％以上１５．０％以下、ｉｓｏＣ１７：０を５．０％以上２５．０％以下含むものが挙げられる。これらの脂肪酸を合計して６０．０％以上、さらには６５．０％以上含むものが好ましい。また、「主要メナキノン」としてＭＫ７を８０．０％以上含むもの、さらには８５．０％以上含むものが挙げられる。

さらに、本発明のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）は、次の４）〜６）のような特性を有するものであってもよい。
４）生育温度が４０℃より高く、６５℃未満である。
５）ＤＮＡの塩基組成が５７．０％〜５９．０％（５８．０±１．０％）である。
６）１６ＳｒＲＮＡの塩基配列は配列表配列番号１に記載の塩基配列と９８．７％以上の同一性を有する。

本発明のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）は、有機性汚泥、食品残渣物、又は動物糞尿等の有機廃棄物の処理に使用することができる。これらの有機廃棄物に、プラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）を加えることにより、たい肥等を製造することも可能である。
本発明のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）を使用する有機廃棄物の処理方法では、有機廃棄物にプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）を加えるのみならず、有機廃棄物の処理において有用なその他の工程を含んでいても良い。

本発明のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）として、例えばプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）ＹＭ１６株が挙げられる。この菌株は、上記１）〜６）の特性を有するとともに、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列が配列表配列番号１に記載の塩基配列と１００％同一である。
本菌株は本出願人の申請により、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターに寄託されている。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
電話番号０４３８−２０−５５８０
（３）受託番号：ＮＩＴＥＰ−０１７６３
（４）識別のための表示：ＹＭ１６
（５）原寄託日：２０１３年１１月２９日

本発明のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）には、このプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）ＹＭ１６株の変異株も含まれる。本発明におけるこの変異株とは化学的変異導入、自然突然変異、形態変異、トランスフェクション等の遺伝子工学的手法により、その物理的特性や化学的特性が改変されたものであり、上記１）〜３）の全ての特性を有するもののことをいう。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。

プラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）の単離・同定
１．菌株の単離
鹿児島県曽於市の堆肥化場の堆肥からＹＭ１６株を単離した。
即ち、５０μｇ／ｍＬＮｏｖｏｂｉｏｃｉｎを含む４ｍＬのＣＹＣ液体培地（スクロース：３％、カザミノ酸：０．６％、硝酸ナトリウム：０．３％、酵母エキス：０．２％、リン酸水素二カリウム：０．１％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０５％、塩化カリウム：０．０５％、硫酸鉄七水和物：０．００１％）に該堆肥４００ｍｇを加え、５５℃で２日間培養した後、この液体培養液を５０μｇ／ｍＬＮｏｖｏｂｉｏｃｉｎを含むＣＹＣ寒天培地に塗布して４日間培養しＹＭ１６菌株のコロニーを単離した。

２．分類学的性質
＜試験方法＞
菌株の分類学的性質は「新生化学実験講座第１７巻微生物実験法（東京化学同人発行）」、「改訂版微生物の分類と同定＜下＞（学会出版センター発行）」、「微生物の分類・同定実験法（シュプリンガー・ジャパン発行）」、ＢＥＲＧＥＹ’ＳＭＡＮＵＡＬＯＦＳｙｅｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙに記載の方法に従って分析した。単離菌株の分類と同定はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ誌に記載されている種との比較により行った。
この解析により得られた形態的性質、培養的性質、生理学的性質、生育範囲及び化学分類学的性質を表２に示した。また、ＹＭ１６株を５５℃で培養した細胞写真を図１に示した。図１において、ＹＭ１６株は糸状性の細胞形態を示し、菌糸上に単一の胞子を形成することが確認できた。図１のバーは１０μｍを表す。

＜試験培地＞
各培地のｐＨは表２中に記載したとおりである。リトマスミルクを除く各培地は１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌をした。リトマスミルクは１１０℃で１０分間オートクレーブ滅菌をした。クリステンセン尿素培地の尿素、ＯＦテスト培地の糖、糖からの酸生成を調べた糖類はフィルター滅菌を行い、記載した終濃度になるように各培地に加えた。
１）ＣＹＣ寒天培地（スクロース：３％、カザミノ酸：０．６％、硝酸ナトリウム：０．３％、酵母エキス：０．２％、リン酸水素二カリウム：０．１％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０５％、塩化カリウム：０．０５％、硫酸鉄七水和物：０．００１％、寒天：１．５％）
２）ＣＹＣ液体培地（スクロース：３％、カザミノ酸：０．６％、硝酸ナトリウム：０．３％、酵母エキス：０．２％、リン酸水素二カリウム：０．１％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０５％、塩化カリウム：０．０５％、硫酸鉄七水和物：０．００１％）
３）肉汁寒天培地（肉エキス：１％、ペプトン：１％、塩化ナトリウム：０．５％、寒天：１．５％）
４）肉汁液体培地（肉エキス：１％、ペプトン：１％、塩化ナトリウム：０．５％）
５）リトマスミルク（スキムミルク：１０％、１％リトマス液：数滴）
６）ＶＰ培地（酵母エキス：０．１％、トリプトン：０．７％、ソイトン：０．５％、グルコース：１％、塩化ナトリウム：０．５％、寒天：０．３％）
７）ＳＩＭ培地（肉エキス：０．３％、ペプトン：３％、チオ硫酸ナトリウム：０．００５％、塩酸システイン：０．０２％、クエン酸鉄アンモニウム：０．０５ｇ、寒天：０．５％）
８）ＬＢ寒天培地（トリプトン：１％、塩化ナトリウム：０．５％、酵母エキス：０．５％、寒天：１．５％）
９）ＳＹ寒天培地（硫酸アンモニウム：０．２％、リン酸水素二ナトリウム：０．１４％、リン酸二水素カリウム：０．０７％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０２％、硫酸鉄七水和物：０．０００５％、硫酸マンガン五水和物：０．０００５％、グルコース：１％）
１０）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ寒天培地（肉エキス：０．３％、ペプトン：０．５％、寒天：１．５％）
１１）Ｓｉｍｍｏｎｓ培地（リン酸二水素アンモニウム：０．１％、リン酸水素二カリウム：０．１％、塩化ナトリウム：０．５％、クエン酸ナトリウム：０．２％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０２％、寒天：１．５％、ＢＴＢ：０．００８％）
１２）Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地（酵母エキス：０．０５％、システイン塩酸塩：０．０１％、塩化ナトリウム：０．５％、クエン酸ナトリウム：０．３％、グルコース：０．０２％、リン酸二水素カリウム：０．１％、寒天：１．５％、フェノールレッド：０．００１２％）
１３）硝酸塩培地（グルコース：１．０％、リン酸二水素カリウム：０．１％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０５％、塩化カリウム：０．０２％、硝酸ナトリウム：０．１％）
１４）アンモニウム塩培地（グルコース：１．０％、リン酸二水素カリウム：０．１％、硫酸マグネシウム七水和物：０．０５％、塩化カリウム：０．０２％、硫酸アンモニウム：０．０７８％）
１５）クリステンセン尿素培地（ペプトン：０．１％、塩化ナトリウム：０．５％、グルコース：０．１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：０．２％、フェノールレッド：０．０００８％、寒天：１．５％、尿素：２％）
１６）ＯＦテスト培地（ペプトン：０．２％、塩化ナトリウム：０．５％、リン酸水素二カリウム：０．０３％、寒天：０．２％、ＢＴＢ：０．００８％、糖：１％）

＜脂肪酸の分析＞
試料調整とガスクロマトグラフィーによる分析
ＣＹＣ液体培地を用いて、菌を５５℃で対数増殖期後期から定常期初期まで培養し、遠心により菌体を回収した。回収した菌体は生理食塩水にて２回洗浄した。約５００ｇから７００ｇの湿菌体をスクリューキャップ付遠心管に入れた。１ｍＬのアルカリけん化液を加え、密栓し１００℃で５分間保った。５分後、１０秒間よく振り、さらに１００℃で３０分間保った。遠心管を冷却した後、２ｍＬの塩酸メタノール試薬を加え、密栓し、８０℃で１０分間保った。遠心管を冷却した後、１．２５ｍＬの抽出用溶媒を加え、１０分間ゆっくり撹拌した。遠心管を１０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上層を別のスクリューキャップ付遠心管に移し、３ｍＬの洗浄液を加えた。再び密栓して５分間撹拌した。この遠心管を１０００ｒｐｍで５分間遠心した後、溶媒層をガラスアンプルに取り、窒素ガスで乾燥させた。各試薬の組成は下記に示した。得られた乾燥試料を脂肪酸分析試料として、株式会社テクノスルガ・ラボでガスクロマトグラフィーにより分析した。この分析を複数回行い、得られた結果を表１に示した。

試薬
１）アルカリけん化液（水酸化ナトリウム：７．５ｇ、メタノール：２５ｍＬ、超純水：２５ｍＬ）
２）塩酸メタノール試薬（６Ｎ塩酸：２１．７ｍＬ、メタノール：１８．３ｍＬ）
３）抽出用溶媒（ヘキサン：１０ｍＬ、ｔ−ブチルメチルエーテル：１０ｍＬ）
４）洗浄液（水酸化ナトリウム：０．５８６ｇ、超純水：４８．８ｍＬ）

＜細胞壁ペプチドグリカン＞
試料調整
２ｇの湿菌体を６ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁し、超音波破砕機（ＴＡＩＴＥＣ社製ＶＰ−３０Ｓ）により３０分間処理して細胞を破砕した。破砕液を温度４℃にて３０００ｒｐｍで１０分間遠心をして、上清を回収した。上清を温度４℃にて９０００ｒｐｍで６０分間遠心をして、上清を取り除き、沈殿物を新しい遠心管に移した。沈殿物に６ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて洗浄した後、温度４℃にて９０００ｒｐｍで６０分間遠心をして、上清を取り除いた。沈殿物に２ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）と４００μＬの２５％ＳＤＳを加え、１００℃で４０分間保った。６５℃に温めておいた１０ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）をさらに加え、撹拌した後、温度３０℃にて９０００ｒｐｍで６０分間遠心した。
上清を取り除き、沈殿物に６５℃に温めておいた５ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて洗浄した後、温度３０℃にて９０００ｒｐｍで３０分間遠心をして上清を取り除いた。この洗浄作業を２回行った。洗浄後、沈殿物に２ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）と１００μＬの１ｍｇ／ｍＬＰｒｏｎａｓｅ液を加え、３７℃で２時間保った。このＰｒｏｎａｓｅ反応後の液に５ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）を加え、細胞壁成分を洗浄した後、温度４℃にて９０００ｒｐｍで３０分間遠心をして上清を取り除いた。この洗浄作業を２回行った。
洗浄後の沈殿物に２ｍＬの５％トリクロロ酢酸水溶液を加え、１００℃で２０分間保った。この懸濁液をガラス製のスクリューキャップ付遠心管に移し、５ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて洗浄した後、室温にて９０００ｒｐｍで３０分間遠心をして、上清を取り除いた。この洗浄作業を２回行った。洗浄後の沈殿物に３ｍＬのエタノールを加え、室温にて９０００ｒｐｍで３０分間遠心をして、上清を取り除いた。沈殿物に３ｍＬのジエチルエーテルを加え、室温にて９０００ｒｐｍで３０分間遠心をして、上清を取り除き、沈殿物を乾燥させて細胞壁試料とした。

ＴＬＣによる分析
５ｍｇの細胞壁試料に２５０μＬの４Ｎ塩酸を加え、１００℃で１６時間加水分解反応を行った。加水分解反応後、水酸化カリウムを置いたデシケーター内で塩酸を取り除き、得られた処理液をＴＬＣに供試した。
ＴＬＣプレートはＭｅｒｃｋ社製ＴＬＣセルロースプレートＮｏ．１．０５７１６．０００１を用いた。構成アミノ酸の検出では一次元目をイソプロパノール：酢酸：超純水＝７５：１０：１５の展開溶媒で展開し、二次元目をメタノール：ピリジン：１０Ｎ塩酸：超純水＝６４：８：２：１４で展開した。展開後ＴＬＣプレートにニンヒドリン試薬をスプレーし、細胞壁ペプチドグリカンに含まれるアミノ酸を検出した。また、ジアミノピメリン酸の異性型の検出は同じＴＬＣプレートを用いて、メタノール：ピリジン：１０Ｎ塩酸：超純水＝６４：８：２：１４で展開し、標準品との移動度の比較により特定した。その結果、細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成としてアラニン、グルタミン酸及びメソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含むことが確認された。

＜メナキノン＞
試料調整
約５００ｍｇの乾燥菌体に２０ｍＬのクロロホルム：メタノール＝２：１液を加え、冷暗所で一晩、緩やかに撹拌した。この懸濁液を濾過し、濾液を湯浴温度３０℃のロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。乾固物を３ｍＬのアセトンに溶かし、窒素ガスで約２００μＬに濃縮した。Ｍｅｒｃｋ社製ＨＰＴＬＣシリカゲル６０Ｆ２５４プレートＮｏ．１．０５６２８．０００１にこの濃縮液を供試し、トルエンを展開溶媒として展開した。展開後にＴＬＣプレートを乾燥して、メナキノンのバンドをＵＶランプ（２５４ｎｍ）の下で確認し、その部分のシリカゲルをスパーテルでかき取り、試験管に入れた。かき取ったシリカゲルに４ｍＬのアセトンを加えて緩やかに撹拌し、フィルター濾過してシリカゲル粒子を除去した。得られた上清を窒素ガスによって約２００μＬまで濃縮し、ＨＰＬＣの試料とした。

ＨＰＬＣによる分析
試料２５μＬをＨＰＬＣに注入した。カラムはＯＤＳカラム（ＳＨＩＳＥＩＤＯ社製ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８ＵＧ１２０Ｓ−５）を用い、展開溶媒にはメタノール：イソプロパノール＝２：１液を用いた。移動速度１．５ｍＬ／分、カラム温度４０℃で展開し、ＵＶ（２７０ｎｍ）で検出した。ＨＰＬＣの機械はＨＥＷＬＥＴＴＰＡＣＫＡＲＴ社製ＳＥＲＩＥＳ１１００を用いた。この分析を複数回行ったところ、ＭＫ７の含有量が１回目は８９．９％であり、２回目は９１．９％であったことから、主要なメナキノンがＭＫ７であることが確認された。

３．１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析
ＰＣＲ反応
ＹＭ１６株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をコロニーダイレクトＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応にはＴｋｓＧｆｌｅｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）とＥＵ１０Ｆプライマー（配列表配列番号２）ＥＵ１５００Ｒプライマー（配列表配列番号３）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成はＴｋｓＧｆｌｅｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅの説明書に記載されている混合割合に従った。ＰＣＲ反応は９４℃で１分の熱処理を１サイクル行った後、９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、６８℃で１分３０秒の反応を３０サイクル行った。

シークエンス反応
得られたＰＣＲ反応物はＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵｐＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により精製した。精製産物とＥＵ１０Ｆプライマー、ＥＵ５２０Ｆプライマー（配列表配列番号４）、ＥＵ９０７Ｒプライマー（配列表配列番号５）、又はＥＵ１５００Ｒプライマーを用いてシークエンス反応を行い、単離菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した。
ＹＭ１６株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を図２および配列表配列番号１に示した。

ＹＭ１６株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列について、遺伝子データベースであるＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＢＬＡＳＴホモロジー検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を行った結果、ＹＭ１６株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と最も高い相同性を示す種はプラニフィラムフィメティコラ（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｍｅｔｉｃｏｌａ）であり、相同性は９７％であった。
続いてＹＭ１６株に近縁種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎの遺伝子データベースより収集し、系統解析を行った。
収集した１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列をＣｌｕｓｔａｌＸ２．０．１２プログラムによりアライメントし、近隣結合法により系統樹を作成した。得られた系統樹を図３に示した。図３中の括弧内の数字はＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号を示し、ＹＭ１７とは本発明者らが本発明と同様の方法で単離した菌株を示す。

４．ＹＭ１６の同定と分類
ＹＭ１６株
図３の系統解析の結果からＹＭ１６株はサーモアクチノマイセタジー科（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科）のプラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）に属すると判定した。プラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）であるプラニフィラムユンナネンセ（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｙｕｎｎａｎｅｎｓｅ）、プラニフィラムフルジダム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｕｌｇｉｄｕｍ）、プラニフィラムフィメティコラ（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｍｅｔｉｃｏｌａ）、及びサーモアクチノマイセタジー科（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科）に属するマカラカリマイセス属（Ｍｅｃｈｅｒｃｈａｒｉｍｙｃｅｓ属）、デスモスポラ属（Ｄｅｓｍｏｓｐｏｒａ属）とＹＭ１６株の分類学的性質を比較した。結果を表３に示した。
表３のうちＹＭ１６株以外のデータはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００５），５５，２１０１−２１０４、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），５７，１８５１−１８５４、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００６），５６，２８３７−２８４２、及びＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９），５９，４５４−４５９から得た。

寒天培地上で気菌糸が確認されないことはサーモアクチノマイセタジー科（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科）内において、他属とは異なるプラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）に特徴的な性質である。ＹＭ１６株も気菌糸が確認されず、ＹＭ１６株はプラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）に属すると判定した。また、主要なメナキノンがＭＫ７であること、細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成としてアラニン、グルタミン酸及びメソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含むこともプラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）とＹＭ１６株に共通する性質である。
生育温度が４５℃から５５℃であること、主要な脂肪酸がｉｓｏＣ１５：０、ｉｓｏＣ１６：０、Ｃ１６：０、ｉｓｏＣ１７：０であること、ＤＮＡの塩基組成が５８．０％であることからＹＭ１６株はプラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）の他種と明確に異なっている。また、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の系統解析でもＹＭ１６はプラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）の他種から離れた枝分かれをする。
以上より、ＹＭ１６株をプラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）の新種と判定し、プラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）と命名した。

［寄託生物材料への言及］
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
電話番号０４３８−２０−５５８０
（３）受託番号：ＮＩＴＥＰ−０１７６３
（４）識別のための表示：ＹＭ１６
（５）原寄託日：２０１３年１１月２９日

Claims

プラニフィラム属（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍ属）の新種であり、次の１）〜３）の特性を有するプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）。
１）主要な構成脂肪酸としてｉｓｏＣ１５：０、ｉｓｏＣ１６：０、Ｃ１６：０、及びｉｓｏＣ１７：０を含む
２）細胞壁ペプチドグリカンのアミノ酸組成としてアラニン、グルタミン酸、及びメソ型ジアミノピメリン酸（ｍｅｓｏ−ＤＡＰ）を含む
３）主要メナキノンがＭＫ７である
有機廃棄物の処理に使用する請求項１に記載のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）。
有機廃棄物がし尿、有機性汚泥、食品残渣物又は動物糞尿である請求項２に記載のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）。
ＹＭ１６株（ＮＩＴＥＰ−０１７６３）である請求項１〜３のいずれかに記載のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）。
請求項１〜４のいずれかに記載のプラニフィラムフィスチュロサム（Ｐｌａｎｉｆｉｌｕｍｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍ）を使用する有機廃棄物の処理方法。