TW202128571A - 污泥分解用細菌、微生物分解細菌、微生物製劑、污泥分解方法及污泥分解裝置 - Google Patents

Abstract

本發明提供：一種污泥分解用細菌，其具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有97%以上的同一性的鹼基序列；一種細菌，其具有16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力，所述16S rRNA基因相對於序列編號1中記載的鹼基序列而包含鹼基的變異數為兩個鹼基以下的鹼基序列；以及一種靶微生物分解用微生物製劑，其包含下述細菌（a1）。細菌（a1）為具有16S rRNA基因的細菌，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有90%以上的同一性的鹼基序列。

Description

污泥分解用細菌、微生物分解細菌、微生物製劑、污泥分解方法及污泥分解裝置

本發明是有關於一種污泥分解用細菌、微生物分解細菌、微生物製劑、污泥分解方法及污泥分解裝置。

於利用活性污泥法進行污水淨化時，產生包含分解有機物而增殖的微生物的被稱為剩餘污泥的污泥。自廢水處理設備排出的剩餘污泥於產業廢棄物中佔據達40%以上的比例，因此，認為，於使產業廢棄物減容化時，有效果的是該剩餘污泥的減容化。通常，剩餘污泥是於脫水、乾燥後經焚燒處理（非專利文獻1：「2015年度事業、產業廢棄物排出/處理狀況調查報告書，2013年度實績（概要版）」[online（線上）]，2016年3月，環境省大臣官房廢棄物/再利用對策部，[2018年8月31日檢索]，互聯網＜URL:https://www.e-stat.go.jp/stat-search/file-download?statInfId=000031403476&fileKind=2＞；非專利文獻2：山本昌幸，「關於髒水的燃燒技術」，日本燃料學會誌，一般社團法人日本燃燒學會，2011年，第53卷，164號，p91-96）。

但是，於對剩餘污泥進行焚燒處理時，會產生溫室效應氣體，因此未必是對環境造成的影響小的處理方法。 [現有技術文獻] [非專利文獻]

[非專利文獻1]「2015年度事業、產業廢棄物排出/處理狀況調查報告書，2013年度實績（概要版）」[online（線上）]，2016年3月，環境省大臣官房廢棄物/再利用對策部，[2018年8月31日檢索]，互聯網＜URL:https://www.e-stat.go.jp/stat-search/file-download?statInfId=000031403476&fileKind=2＞ [非專利文獻2]山本昌幸，「關於髒水的燃燒技術」，日本燃料學會誌，一般社團法人日本燃燒學會，2011年，第53卷，164號，p91-96

[發明所欲解決之課題] 近年來，對於地球環境的意識在社會整體中提高，從而要求對環境造成的影響更小的剩餘污泥的減容化方法、即構成剩餘污泥的微生物的分解方法。

本發明的目的在於提供一種污泥分解用細菌、微生物分解細菌、微生物製劑、污泥分解方法及污泥分解裝置。

[解決課題之手段] 即，本發明是有關於以下例示的[1]～[18]。 [1] 一種污泥分解用細菌（以下，有時記載為「本發明的污泥分解用細菌」），具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有97%以上的同一性的鹼基序列。 [2] 一種細菌（以下，有時記載為「本發明的細菌」），具有16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力，所述16S rRNA基因中，相對於序列編號1中記載的鹼基序列而鹼基的變異數為兩個鹼基以下。 [3] 如[2]所述的細菌，其中靶微生物為靶細菌。 [4] 如[2]或[3]所述的細菌，其中靶微生物為靶死細菌。 [5] 如[1]至[4]中任一項所述的細菌，具有包含序列編號1中記載的鹼基序列的16S rRNA基因。 [6] 一種細菌，其為以受託編號NITE BP-03020寄存的細菌。 [7] 一種污泥分解用微生物製劑（以下，有時記載為「本發明的微生物製劑」），包含細菌（a1）， 細菌（a1）：具有16S rRNA基因的細菌，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有90%以上的同一性的鹼基序列。 [8] 如[7]所述的污泥分解用微生物製劑，其中細菌（a1）具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有95%以上的同一性的鹼基序列。 [9] 如[7]所述的污泥分解用微生物製劑，其中細菌（a1）具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有97%以上的同一性的鹼基序列。 [10] 如[7]所述的污泥分解用微生物製劑，其中細菌（a1）具有包含序列編號1中記載的鹼基序列的16S rRNA基因。 [11] 如[7]至[10]中任一項所述的污泥分解用微生物製劑，其中細菌（a1）具有靶微生物分解能力。 [12] 如[7]至[11]中任一項所述的污泥分解用微生物製劑，其於溫度20℃下分解污泥。 [13] 如[7]所述的污泥分解用微生物製劑，其中細菌（a1）為以受託編號NITE BP-03020寄存的細菌。 [14] 如[7]至[13]中任一項所述的污泥分解用微生物製劑，進而包含微生物（a2），並且相對於細菌（a1）及微生物（a2）的總數的細菌（a1）數量為0.1%以上且小於100%， 微生物（a2）：與細菌（a1）不同的微生物。 [15] 如[14]所述的污泥分解用微生物製劑，其中微生物（a2）包含選自由具有16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力的細菌、具有靶微生物分解能力的芽孢桿菌（bacillus）屬細菌、及具有靶微生物分解能力的類芽孢桿菌（paenibacillus）屬細菌所組成的群組中的至少一種，所述16S rRNA基因包含與序列編號7中記載的鹼基序列具有90%以上的同一性的鹼基序列。 [16] 一種污泥分解用微生物製劑，包含細菌（a1）的培養物， 細菌（a1）：具有16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力的細菌，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有90%以上的同一性的鹼基序列。 [17] 一種污泥分解方法（以下，有時記載為「本發明的分解方法」），包括使如[1]至[6]中任一項所述的細菌或如[7]至[16]中任一項所述的污泥分解用微生物製劑作用於污泥的步驟。 [18] 一種污泥分解裝置（以下，有時記載為「本發明的分解裝置」），使用如[1]至[6]中任一項所述的細菌或如[7]至[16]中任一項所述的污泥分解用微生物製劑。

[發明的效果] 根據本發明，可提供一種污泥分解用細菌、微生物分解細菌、微生物製劑、微生物的分解方法及分解裝置。

以下，對於用於實施本發明的形態進行詳細說明。再者，本發明並不限定於以下的實施形態。

（共通用語的說明） 於本說明書中，「微生物」為肉眼無法判別結構的之類的微小生物，為除了大型多細胞生物以外的生物。「靶微生物」為由本發明的細菌或微生物製劑分解的微生物。作為靶微生物，可列舉細菌、真菌等，其中，較佳為細菌，更佳為構成剩餘污泥的細菌。靶微生物可為活菌亦可為死菌。

「靶細菌」是指成為靶微生物的細菌。靶細菌可為活菌亦可為死菌，亦可包含活菌及死菌。活菌是指活著的細菌、例如進行代謝的細菌。死菌是指死亡的細菌、例如並不進行代謝的細菌。活菌與死菌例如可使用碘化丙啶（propidium iodide，PI）等色素來判別。「靶死細菌」是指靶細菌中死亡的細菌。就分解效率的觀點而言，靶細菌較佳為靶死細菌。剩餘污泥中的微生物的約50%為死菌。靶死細菌例如亦可藉由對靶細菌進行加熱、高壓蒸汽滅菌、紫外線照射、福馬林（formalin）處理、酸處理等而獲得。另外，靶死細菌亦可經粉碎。

作為靶微生物，例如可列舉：細球菌（Micrococcus）屬細菌、芽孢桿菌（Bacillus）屬細菌、葡萄球菌（Staphylococcus）屬細菌、類芽孢桿菌（Paenibacillus）屬細菌、乳桿菌（Lactobacillus）屬細菌等革蘭氏陽性菌（Gram-positive bacteria），艾氏菌（Escherichia）屬細菌、醋酸桿菌（Acetobacter）屬細菌、葡糖桿菌（Gluconobacter）屬細菌等革蘭氏陰性菌（Gram-negative bacteria），啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）等真菌類。

於本說明書中，「靶微生物分解能力」是指對靶微生物進行代謝並將構成靶微生物的生物體分子的一部分或全部轉換為不同的分子的能力。作為生物體分子，例如可列舉：糖、蛋白質、核酸、脂質等。

（本發明的污泥分解用細菌） 本發明的污泥分解用細菌具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有97%以上的同一性的鹼基序列。作為具有16S rRNA基因的細菌，可列舉短芽孢桿菌（Brevibacillus）屬細菌，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有97%以上的同一性的鹼基序列。作為短芽孢桿菌屬細菌，可列舉：類短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）、橋石短芽孢桿菌（Brevibacillus choshinensis）、美麗短芽孢桿菌（Brevibacillus formosus）、土壤短芽孢桿菌（Brevibacillus agri）、硝化短芽孢桿菌（Brevibacillus nitrificans）、短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）、茹氏短芽孢桿菌（Brevibacillus reuszeri）、嗜湖短芽孢桿菌（Brevibacillus limnophilus）、人參土壤短芽孢桿菌（Brevibacillus panacihumi）、明膠短芽孢桿菌（Brevibacillus gelatini）。

本發明的污泥分解用細菌可具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列相比較而同一性或相同性為97.5%以上、98%以上、98.5%以上、98.8%以上、99.0%以上、99.3%以上、99.5%以上、99.8%以上或99.9%以上的鹼基序列。污泥分解用細菌可為具有包含序列編號1中記載的鹼基序列的16S rRNA基因的細菌，作為其代表菌株，可列舉後述的類短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）（受託編號NITE BP-03020）。本發明的污泥分解用細菌亦可包含本發明的細菌。

本發明的污泥分解用細菌可具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列相比較而產生了一個鹼基或數個鹼基的取代、缺失或附加的鹼基序列。一個鹼基或數個鹼基例如可為1個～25個鹼基，亦可為1個～10個鹼基，亦可為1個～5個鹼基。所述變異為16S rRNA的表達及功能並不喪失的變異。

本發明的污泥分解用細菌可具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含對序列編號1中記載的鹼基序列中所含的、約15個鹼基以上、較佳為約18個～約500個鹼基、更佳為約18個～約200個鹼基、進而佳為約18個～約50個鹼基連續的序列或其互補序列於嚴格條件（stringent conditions）下進行雜交（hybridize）的鹼基序列。嚴格條件是指不形成非特異性的雜交體（hybrid）的條件，例如可列舉於60℃、1×SSC、0.1% SDS、較佳為68℃、0.1×SSC、0.1% SDS中清洗1次以上的條件等。

本發明的污泥分解用細菌具有污泥分解能力。污泥較佳為剩餘污泥。污泥分解能力可根據反應條件（污泥及污泥中所含的靶微生物的種類及濃度、包含污泥分解用細菌的溶液的組成、溫度、pH值、細菌數量等）而發生變化。作為調查是否具有污泥分解能力的方法，例如可列舉使污泥與欲調查污泥分解能力的細菌於適當的培養基或緩衝液中反應一定時間後，調查培養基或緩衝液中的污泥的分解的方法。作為調查分解的方法，並無特別限定，例如可列舉：測定污泥的濁度的方法；利用SLP（Silkworm Larvae Plasma，家蠶幼蟲血漿）試劑檢測污泥中所含的靶微生物的方法；利用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測污泥中所含的靶微生物的去氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的方法；測定污泥的乾燥重量的方法；測定污泥中所含的靶微生物的乾燥重量的方法；使用高效液相層析法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）、質譜法（Mass Spectrometry，MS）、薄層層析法（Thin-Layer Chromatography，TLC）、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）、氣相層析法（Gas Chromatography，GC）等檢測源自污泥中所含的靶微生物的分解物的方法。

於藉由濁度來調查污泥分解能力的情況下，具有污泥分解能力是指自對污泥添加污泥分解用細菌起經過規定時間後的濁度較添加前的濁度非偶然地降低。添加後的濁度例如為添加前的濁度的80%以下，較佳為50%以下，更佳為30%以下。於藉由乾燥重量來調查污泥分解能力的情況下，具有污泥分解能力例如是指添加後的乾燥污泥重量較添加前的乾燥污泥重量非偶然地降低，例如，添加後的乾燥污泥重量為添加前的95%以下，較佳為90%以下。通常，細菌於具有靶微生物分解能力時，具有污泥分解能力。

（本發明的細菌） 本發明的細菌具有16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力，所述16S rRNA基因中，相對於序列編號1中記載的鹼基序列而鹼基的變異數為兩個鹼基以下。於本說明書中，16S rRNA基因較佳為細菌本來具有的內在性的16S rRNA基因。亦可為人工誘發變異的16S rRNA。作為具有16S rRNA基因的細菌，可列舉短芽孢桿菌（Brevibacillus）屬細菌，可列舉類短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis），所述16S rRNA基因中，相對於序列編號1中記載的鹼基序列而鹼基的變異數為兩個鹼基以下。本發明的細菌亦可包含本發明的污泥分解用細菌。

作為本發明的細菌的一實施形態，可列舉具有包含序列編號1中記載的鹼基序列的16S rRNA基因、且具有靶微生物分解能力的細菌。

作為具有包含序列編號1中記載的鹼基序列的16S rRNA基因的細菌的代表菌株，可列舉：作為類短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）（受託編號NITE BP-03020，原寄存日：2019年9月17日）並基於布達佩斯（Budapest）條約寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心（NPMD，地址：〒292-0818 千葉縣木更津市上總鐮足（Kazusa-kamatari）2-5-8 122號房間）的菌株。關於該菌株的菌學性質，將於後敘述。

本發明的細菌可具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列相比較而同一性或相同性為98.5%以上、98.8%以上、99.0%以上、99.3%以上、99.5%以上、99.8%以上、99.9%以上的鹼基序列，本發明的細菌亦可具有包含序列編號1中記載的鹼基序列的16S rRNA基因。

相對於序列編號1中記載的鹼基序列而鹼基的變異數為兩個鹼基以下的細菌可具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列相比較而產生了一個鹼基或兩個鹼基的取代、缺失或附加的鹼基序列。所述變異為16S rRNA的表達及功能並不喪失的變異。

本發明的細菌可具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含對序列編號1中記載的鹼基序列中所含的、約15個鹼基以上、較佳為約18個～約500個鹼基、更佳為約18個～約200個鹼基、進而佳為約18個～約50個鹼基連續的序列或其互補序列於嚴格條件下進行雜交的鹼基序列。嚴格條件是指不形成非特異性的雜交體的條件，例如可列舉於60℃、1×SSC、0.1% SDS、較佳為68℃、0.1×SSC、0.1% SDS中清洗1次以上的條件等。

本發明的細菌的靶微生物分解能力可根據反應條件（靶微生物的種類及濃度、包含細菌的溶液的組成、溫度、pH值、細菌數量等）而發生變化。靶微生物例如為靶細菌，較佳為靶死細菌。

例如，將本發明的細菌的代表菌株Bb.parabrevis NITE BP-03020與細球菌屬細菌死菌分別製備成濁度（OD660）0.2，並以體積比1：100混合，之後，於20℃～35℃的溫度條件下、且6.5～8.0的pH值條件下進行反應，藉此，可使一週後的濁度降低50%左右，並分解細球菌屬細菌。

本發明的細菌可藉由對象微生物（欲調查是否為本發明的細菌的微生物）的16S rRNA基因的鹼基序列的分析、及靶微生物的分解能力的測定而斷定。具體而言，若對象微生物具有16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力，則可斷定為該微生物為本發明的細菌，所述16S rRNA基因中，相對於序列編號1中記載的鹼基序列而鹼基的變異數為兩個鹼基以下。

16S rRNA基因的鹼基序列的分析例如可利用以下方法進行。首先，使用公知的方法，自對象微生物提取基因組（genome）DNA，使16S rRNA基因增幅。使16S rRNA基因增幅的方法並無特別限制，可列舉本領域技術人員通常使用的使用通用引物（universal primer）的PCR法等。視需要，將利用PCR法獲得的增幅產物精製，並供給至DNA測序儀（sequencer）等，從而可確定鹼基序列。進行所獲得的鹼基序列與序列編號1中記載的序列的比較。

作為調查是否具有靶微生物分解能力的方法，例如可列舉：使對象微生物與靶微生物於適當的培養基或緩衝液中反應一定時間後，調查培養基或緩衝液中的靶微生物的分解的方法。調查分解的方法並無特別限定，例如可列舉：測定包含靶微生物的溶液的濁度的方法；利用SLP試劑檢測靶微生物的方法；利用PCR檢測靶微生物的DNA的方法；測定靶微生物的乾燥菌體重量的方法；使用高效液相層析法（HPLC）、質譜法（MS）、薄層層析法（TLC）、核磁共振（NMR）、氣相層析法（GC）等檢測源自靶微生物的分解物的方法。

於藉由濁度來調查靶微生物的分解的情況下，具有靶微生物分解能力是指自對包含靶微生物的溶液添加本發明的細菌起經過規定時間後的濁度較添加前的濁度非偶然地降低。添加後的濁度例如為添加前的濁度的80%以下，較佳為50%以下，更佳為30%以下。於藉由乾燥菌體重量來調查靶微生物的分解的情況下，具有靶微生物分解能力例如是指添加後的乾燥菌體重量較添加前的乾燥菌體重量非偶然地降低，例如，添加後的乾燥菌體重量為添加前的95%以下，較佳為90%以下。通常，細菌於具有污泥分解能力時，具有靶微生物分解能力。

基於該些鹼基序列分析及靶微生物分解能力的測定的結果，可判斷對象微生物是否為本發明的細菌。

（本發明的微生物製劑） 本發明的微生物製劑的一實施形態包含以下的細菌（a1）。 ＜細菌（a1）＞ 細菌（a1）具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列相比較而具有90%以上的同一性的鹼基序列。

細菌（a1）可具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列相比較而同一性或相同性為93%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上的鹼基序列，細菌（a1）亦可具有包含序列編號1中記載的鹼基序列的16S rRNA基因。作為細菌（a1），可列舉短芽孢桿菌（Brevibacillus）屬細菌，可為類短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）。細菌（a1）可為以受託編號NITE BP-03020寄存的細菌。

另外，細菌（a1）可具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列相比較而產生了一個鹼基或數個鹼基的取代、缺失或附加的鹼基序列。一個鹼基或數個鹼基例如可為1個～135個鹼基，亦可為1個～100個鹼基，亦可為1個～50個鹼基，亦可為1個～25個鹼基，亦可為1個～5個鹼基。所述變異為16S rRNA的表達及功能並不喪失的變異。

細菌（a1）可具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含對序列編號1中記載的鹼基序列中所含的、約15個鹼基以上、較佳為約18個～約500個鹼基、更佳為約18個～約200個鹼基、進而佳為約18個～約50個鹼基連續的序列或其互補序列於嚴格條件下進行雜交的鹼基序列。

細菌（a1）的16S rRNA基因的鹼基序列的分析可與所述本發明的細菌同樣地進行。

細菌（a1）較佳為具有靶微生物分解能力。細菌（a1）的靶微生物分解能力可與所述本發明的細菌同樣地進行評價。

就靶微生物分解能力良好的方面而言，作為細菌（a1），較佳為包含選自類短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）、本發明的污泥分解用細菌、本發明的細菌、以及以下的A群組的細菌中的至少一種細菌。細菌（a1）可為單一細菌，亦可為多種細菌。 A群組：污染短芽孢桿菌（Brevibacillus invocatus）、中孢短芽孢桿菌（Brevibacillus centrosporus）、波茨坦短芽孢桿菌（Brevibacillus borstelensis）、levickii短芽孢桿菌（Brevibacillus levickii）、馬賽短芽孢桿菌（Brevibacillus massiliensis）、人參土短芽孢桿菌（Brevibacillus ginsengisoli）、側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）、黃褐色短芽孢桿菌（Brevibacillus fulvus）、流水短芽孢桿菌（Brevibacillus fluminis）、沈積物短芽孢桿菌（Brevibacillus sediminis）、熱紅短芽孢桿菌（Brevibacillus thermoruber）、艾登短芽孢桿菌（Brevibacillus aydinogluensis）。

本發明的微生物製劑具有污泥分解能力。污泥分解能力可利用所述本發明的污泥分解用細菌一欄中記載的方法來評價。微生物製劑的污泥分解能力較佳為源自微生物製劑中所含的細菌（a1）或微生物（a2）或該些的培養物。微生物製劑可於溫度37℃以下、溫度30℃、溫度25℃或溫度20℃下分解污泥，亦可於溫度20℃～40℃的範圍內分解污泥。例如，自將本發明的微生物製劑添加至包含靶微生物的溶液中起第5天的溶液的濁度於溫度25℃下為溫度30℃的溶液的濁度的2倍以下，於溫度20℃下為溫度30℃的溶液的濁度的3倍以下，較佳為2.5倍以下。

微生物製劑除了包含細菌（a1）以外，亦可包含細菌（a1）的培養物、微生物（a2）、添加劑（b）、載體（c）等。作為微生物製劑的具體例，可列舉包含細菌（a1）、微生物（a2）、添加劑（b）及載體（c）的微生物製劑。

＜細菌（a1）的培養物＞ 本發明的微生物製劑的一實施形態包含細菌（a1）的培養物。細菌（a1）的培養物包含例如細菌（a1）的分泌物、代謝物、由細菌（a1）產生的蛋白質、糖、酶及使該些懸浮的液體培養基。具體而言，培養物包含在經控制的條件下於規定的液體培養基中、或於包含碳源及氮源的液體培養基中增殖的細菌（a1）的培養物。包含細菌（a1）的培養物的靶微生物分解用製劑中亦可包含細菌（a1）的活菌。細菌（a1）的培養物亦可為培養了細菌（a1）的上清液。培養上清液例如可利用離心分離、過濾操作等自培養了細菌（a1）的液體培養基中去除細菌（a1）而獲得。另外，培養物亦可包含細菌（a1）的片段。細菌（a1）的片段例如亦可藉由對細菌（a1）進行超音波破碎、珠粒磨碎、化學溶解處理而獲得。細菌（a1）的培養物較佳為具有靶微生物分解能力。

＜微生物（a2）＞ 微生物（a2）為與細菌（a1）不同的微生物。微生物（a2）只要不是使微生物製劑的污泥分解能力喪失的之類的微生物，則並無特別限制。微生物（a2）可為單一微生物，亦可為多種微生物。微生物（a2）可為提高細菌（a1）的增殖能力或穩定性的細菌，亦可為提高細菌（a1）的培養物的穩定性的細菌。

微生物（a2）可藉由微生物的16S rRNA基因的鹼基序列的分析、生理生化性狀試驗等來斷定。微生物（a2）可具有靶微生物分解能力，亦可不具有靶微生物分解能力。對象微生物的16S rRNA基因的鹼基序列的分析、及靶微生物分解能力的測定可與所述本發明的細菌同樣地進行。

作為微生物（a2），可為革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌，例如可列舉：膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus）屬細菌、類芽孢桿菌屬細菌、芽孢桿菌屬細菌、醋酸桿菌屬細菌、葡糖桿菌屬細菌、乳桿菌屬細菌、戈登氏菌（Gordonia）屬細菌、微桿菌（Microbacterium）屬細菌、紅球菌（Rhodococcus）屬細菌、鞘胺醇單胞菌（Sphingomonas）屬細菌、艾氏菌屬細菌、啤酒酵母菌。

微生物（a2）較佳為包含具有靶微生物分解能力的細菌，例如較佳為包含選自由具有16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力的細菌（以下，有時記載為「細菌（a21）」）、具有靶微生物分解能力的芽孢桿菌屬細菌、及具有靶微生物分解能力的類芽孢桿菌屬細菌所組成的群組中的至少一種，所述16S rRNA基因包含與序列編號7中記載的鹼基序列具有90%以上的同一性的鹼基序列。

作為具有16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力的細菌，可列舉膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus）屬細菌，所述16S rRNA基因包含與序列編號7中記載的鹼基序列具有90%以上的同一性的鹼基序列。細菌（a21）可具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號7中記載的鹼基序列相比較而同一性或相同性為93%以上、95%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、99.9%以上的鹼基序列，細菌（a21）亦可具有包含序列編號7中記載的鹼基序列的16S rRNA基因。細菌（a21）亦可為作為膨脹芽孢桿菌屬（Tumebacillus sp.）（受託編號NITE BP-02779，原寄存日：2018年9月11日）並基於布達佩斯條約寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心（NPMD，地址：〒292-0818 千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8 122號房間）的菌。關於該菌株的菌學性質，示於後述的表6～表9中。

細菌（a21）例如可為：藻渣膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus algifaecis）、鳥型膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus avium）、鞭毛型膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus flagellates）、人參土膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus ginsengisoli）、解脂膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus lipolyticus）、淺黃膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus luteolus）、永久冰凍膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus permanentifrigoris）、土壤膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus soli）。

作為具有靶微生物分解能力的芽孢桿菌屬細菌，例如可列舉：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解澱粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

作為具有靶微生物分解能力的類芽孢桿菌屬細菌，例如可列舉多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。

就靶微生物分解能力的觀點而言，相對於細菌（a1）及微生物（a2）的總數的細菌（a1）數量可為0.1%以上，亦可為1%以上，亦可為10%以上，亦可為50%以上，亦可為75%以上，亦可為90%以上，亦可為95%以上，且可為100%以下，亦可小於100%。

相對於細菌（a1）及微生物（a2）的總數的細菌（a1）數量較佳為相對於微生物製劑中所含的所有細菌的細菌（a1）的比例。作為算出相對於細菌（a1）及微生物（a2）的總數的細菌（a1）數量的方法，可列舉：利用克隆文庫（clone library）法、下一代測序儀分析、定量PCR來算出的方法等。

作為利用克隆文庫法及下一代測序儀分析來算出細菌的存在比例的方法，具體而言，自微生物製劑中所含的細菌（a1）及微生物（a2）中提取基因組DNA，取得多個16S rRNA基因的鹼基序列（以下，將所取得的多個鹼基序列數記載為讀出數），並分別確定所取得的鹼基序列是源自細菌（a1）或微生物（a2）的哪一者的鹼基序列。其次，可算出相對於讀出數的源自細菌（a1）的鹼基序列數並設為相對於細菌（a1）及微生物（a2）的總數的細菌（a1）數量。

作為下一代測序儀分析中使用的下一代測序儀，只要可將DNA片段設為樣板（template）並檢測一個鹼基一個鹼基地再合成時的螢光強度且確定鹼基序列，則並無特別限制。作為下一代測序儀，例如可列舉：MiSeq、HiSeq 2500（依諾米那（Illumina）公司製造），5500xl SOLiDTM、離子質子TM（Ion ProtonTM）、離子PGMTM（Ion PGMTM）（賽默飛世爾科學（ThermoFisher Scientific）公司製造），GS FLX+（羅氏診斷產品（Roche-diagnostics）股份有限公司製造）等。

作為藉由定量PCR來算出細菌的存在比例的方法，具體而言，分別算出微生物製劑中所含的細菌（a1）的16S rRNA基因拷貝數（copy number）、與細菌（a1）及微生物（a2）的16S rRNA基因拷貝數。其次，可算出相對於細菌（a1）及微生物（a2）的16S rRNA基因拷貝數的細菌（a1）的16S rRNA基因拷貝數並設為相對於細菌（a1）及微生物（a2）的總數的細菌（a1）數量。

作為定量PCR中使用的實時PCR裝置，只要包括可利用PCR使DNA增幅的熱循環器、及用於檢測增幅產物的分光螢光光度計，則並無特別限制。作為實時PCR裝置，例如可列舉：步驟一加（StepOnePlus）（應用生物系統（Applied Biosystems）公司製造），熱循環器晶粒實時系統（Thermal Cycler Dice Real Time System）（寶生物（TaKaRa bio）股份有限公司製造），光循環器96系統（LightCycler 96 System）（羅氏診斷產品（Roche-diagnostics）股份有限公司製造）等。

作為定量PCR中使用的主混合物（Master Mix），可列舉：法斯特SYBR綠色主混合物（Fast SYBR Green Master Mix）、帕瓦SYBR綠色主混合物（Power SYBR Green Master Mix）、SYBR選擇主混合物（SYBR Select Master Mix）、帕瓦阿普SYBR綠色主混合物（PowerUp SYBR Green Master Mix）（賽默飛世爾科學（ThermoFisher Scientific）公司製造）等。

＜添加劑（b）＞ 作為添加劑（b），例如可列舉界面活性劑、分散劑、輔助劑、保護劑等。添加劑（b）的種類及濃度可於細菌（a1）不滅絕、或該細菌所具有的靶微生物分解能力不喪失的條件下適宜確定。

＜載體（c）＞ 作為載體（c），例如可列舉無機微粒子載體。作為無機微粒子載體，可為金屬及其無機鹽類或氧化物，可為含有碳者，亦可為被化學性地分類為無機物者。另外，亦可為有機態碳的含量小於1%左右的純物質或混合物。

無機微粒子載體的中心粒徑較佳為1 μm～100 μm，更佳為4 μm～75 μm，進而佳為13 μm～25 μm。於中心粒徑處於此種範圍的情況下，存在細菌（a1）容易擔載於無機微粒子載體上的傾向。此處，所謂中心粒徑，是指基於雷射繞射/光散射法的體積基準的粒度分佈中的中徑（D50）。無機微粒子載體的比重並無特別限制，較佳為1.2～3.5。

出於提高培養初期的良率的目的，無機微粒子載體視需要亦可使用各種凝聚劑進行凝聚。作為凝聚劑，例如可列舉非離子性、陽離子性、陰離子性的高分子凝聚劑等。

作為微生物製劑的製造方法，例如可列舉：將細菌（a1）與無機微粒子載體混合，使細菌（a1）擔載於無機微粒子載體上，對其進行培養並回收所獲得的微生物製劑的方法。

作為培養方法，可使用分批、半批式、流加、連續的任一種方式。作為培養方法，例如，就有效率地製備增殖慢且菌體產率低的微生物的觀點而言，亦可如日本專利特開平9-187272號公報中所記載般，使用使對培養微生物的容器（以下，稱為反應槽）供給的對象化合物的濃度隨培養時間的經過而進行對數增加的連續培養方式。

於本發明中，微生物的製劑化手段只要不喪失細菌（a1）的靶微生物分解能力，則並無特別限定，可利用公知的製劑化手段。作為微生物製劑的形態，可為液體或固體（包括膠囊封入體、瓊脂狀、粉末狀等），亦可為該些的凍結體、凍結乾燥體等。於微生物製劑為液體的情況下，可設為懸浮於培養基、緩衝液、生理食鹽水等中的菌懸浮液。液體可為酸性或中性。於微生物製劑為固體或凍結乾燥體的情況下，例如，可於將所培養的細菌濃縮後，進行適當的乾燥或凍結乾燥，而製成固體或凍結乾燥體。此時，亦可添加賦形劑等。

（污泥分解方法） 本發明的分解方法包括使本發明的污泥分解用細菌、本發明的細菌或本發明的微生物製劑作用於污泥的步驟。本發明的污泥分解用細菌、本發明的細菌及本發明的微生物製劑所具有的靶微生物分解能力對於包含靶微生物的剩餘污泥的處理有用，藉由本發明的分解方法，可使剩餘污泥減容化。

使本發明的污泥分解用細菌、本發明的細菌或本發明的微生物製劑作用於污泥例如是指使本發明的污泥分解用細菌、本發明的細菌或本發明的微生物製劑或懸浮有該些的溶液與污泥接觸。本發明的污泥分解用細菌、本發明的細菌或本發明的微生物製劑藉由分解污泥中所含的靶微生物，而分解污泥。

關於使本發明的污泥分解用細菌、本發明的細菌或本發明的微生物製劑作用於污泥的步驟，只要為本發明的污泥分解用細菌、本發明的細菌或細菌（a1）不滅絕、或該細菌所具有的靶微生物分解能力不喪失的條件，則並無特別限制。所述步驟例如可於溫度為20℃～40℃的條件下進行，亦可於25℃～30℃的條件下進行。另外，可於pH值為6.5～8.0的條件下進行，亦可於7.0～7.5的條件下進行。

相對於污泥的本發明的污泥分解用細菌、本發明的細菌或本發明的微生物製劑的添加量可考慮到靶微生物的種類及濃度、反應系統的容積等而適宜設定。

於本發明的分解方法中，確認污泥經分解的方法並無特別限制，可利用本領域技術人員通常可使用的方法來進行。作為此種確認方法，例如可列舉所述污泥分解能力的評價方法或靶微生物分解能力的評價方法。

（污泥分解裝置） 作為污泥分解裝置，若為可使用本發明的污泥分解用細菌、本發明的細菌或本發明的微生物製劑來削減剩餘污泥的裝置，則並無特別限定，例如可列舉產生剩餘污泥的污泥處理裝置、排水處理裝置等。另外，例如，亦可於存在剩餘污泥的現有的污泥處理裝置、排水處理裝置等中添加本發明的污泥分解用細菌、本發明的細菌或本發明的微生物製劑而設為污泥分解裝置。

先前，為了分解剩餘污泥，進行了如下處理等：臭氧、鹼、次氯酸等的化學處理，珠磨機、超音波破碎等的物理處理，使用於高溫條件下或鹼條件下發揮作用的微生物的生物學處理，但為了進行該些處理，需要將剩餘污泥轉移到另外的槽（tank）中，設備成本及運轉成本增多。本發明的污泥分解用細菌、本發明的細菌及本發明的微生物製劑可直接投入到剩餘污泥中，因此，可抑制準備新設備的成本，並且亦無需變更先前進行的污泥分解方法。 [實施例]

[實驗1. 具有靶微生物分解能力的微生物的探索] （方法） 自環境（水）中存在的微生物群分離出數個菌株。

（結果） 對於經分離的菌株的每一個調查細球菌屬細菌分解能力，結果，於一個菌株中確認到細球菌屬細菌分解能力。以下，將確認到細球菌屬細菌分解能力的菌株記載為「菌株A」。

[實驗2. 具有細球菌屬細菌分解能力的菌株的16S rRNA基因的鹼基序列分析] （材料） ·802培養基：將10 g聚蛋白腖（polypeptone）、2 g酵母提取物、1 g硫酸鎂七水合物溶解於超純水中，將pH值調節為7.0後，製備成1000 mL，並進行高壓蒸汽滅菌而成的培養基 ·克隆（cloning）用正向引物（27f：序列編號2） ·克隆用反向引物（1492r：序列編號3） ·序列分析用引物（339F：序列編號4，536R：序列編號5，907F：序列編號6）

（方法） 使用DNA簡易提取（easy extract for DNA）（AMR股份有限公司製造）自菌株A中提取DNA，並作為用於利用PCR使16S rRNA基因增幅的模板DNA而使用。

PCR是於以下條件下進行。將25.0 μL的科達福克斯2×PCR緩衝液（2×PCR buffer for KOD FX）（東洋紡股份有限公司製造）、10.0 μL的dNTP mix（2 mM）、1.5 μL的克隆用正向引物及克隆用反向引物（分別為10 pmol/μL）、0.58 μL的模板DNA、10.4 μL的滅菌水、1.0 μL的DNA聚合酶（科達福克斯（KOD FX），1 U/μL，東洋紡股份有限公司製造）添加至微型管中並進行混合。將微型管供給至PCR裝置，進行模板DNA的增幅反應。反應是以（1）94℃、2分鐘、（2）98℃、10秒、（3）50℃、30秒、（4）68℃、1.5分鐘進行，（2）～（4）的步驟是反覆進行35個循環。對PCR後的增幅產物進行精製。

將經精製的PCR後的增幅產物150 ng相當量、序列分析用引物（10 μM）0.32 μL、及比格戴終結者（BigDye Terminator）v3.1（應用生物系統（Applied Biosystems）公司製造）8.0 μL混合，向其中添加滅菌超純水而製備將液量設為20.0 μL的反應液。將該反應液供給至PCR裝置，進行增幅反應。反應是以（1）96℃、1分鐘、（2）96℃、10秒、（3）50℃、5秒、（4）60℃、4分鐘進行，（2）～（4）的步驟是反覆進行25個循環。對所獲得的反應液進行精製，並將精製液供給至DNA序列分析（3730xl DNA 分析儀（3730xl DNA Analyzer）），確定自菌株A中提取的模板DNA的16S rRNA基因的鹼基序列。

（結果） 對於所獲得的鹼基序列，相對於國際鹼基序列資料庫（DDBJ/ENA（EMBL）/GenBank）進行同源分析。於基準株中，相對於類短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）IFO12334的16S rRNA基因的鹼基序列，顯示出99.8%的同一性。然而，具有與所獲得的鹼基序列完全一致的16S rRNA基因的微生物並不存在。

將此時的16S rRNA基因的鹼基序列示於序列編號1中。根據以上內容，暗示有：具有包含序列編號1中記載的鹼基序列的16S rRNA基因的細菌具有靶微生物分解能力。

[實驗3. 具有包含序列編號1中記載的鹼基序列的16S rRNA基因的Bb.parabrevis的形態觀察及生理/生化性狀試驗] （方法） 對菌株A進行形態觀察及生理/生化性狀試驗。該些試驗是藉由利用光學顯微鏡的形態觀察、巴羅（BARROW）等人的方法（「考恩與斯蒂爾醫學細菌鑑定手冊」（第三版，1993年），劍橋大學出版社（Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria 3rd Edition 1993、Cambridge University Press.））及API50CHB（生物梅里埃（bioMerieux）公司製造，里昂（Lyon），法國（France））來進行。將試驗結果示於表1～表3中。

（結果） 如圖1所示，菌株A的菌落（colony）為圓形且具有奶油狀的形態。另外，如圖2所示，菌株A為桿菌，革蘭氏染色為陰性。關於菌株A，就表4中所示的方面而言，具有與16S rRNA基因的相同性最高的Bb.parabrevis IFO12334不同的特徵。因此，暗示有：菌株A為與現有的Bb.parabrevis不同的新種類的菌株。將菌株A作為類短短芽孢桿菌NITE BP-03020（Brevibacillus parabrevis NITE BP-03020）來寄存。

[表1]

培養溫度（℃）	30
細胞形態	桿菌（1.0×2.0-3.0 μm）
革蘭氏染色性	-
有無芽孢	+（有膨脹）
運動性	+
菌落形態	培養基：營養瓊脂（Nutrient Ager）
培養時間：24 hr
直徑：1 mm
色調：奶油色
形狀：圓形
隆起狀態：透鏡狀
周緣：所有邊緣
表面的形狀等：平滑
透明度：不透明
黏稠度：黃油狀
繁育溫度試驗 （℃）	37	+
45	+
過氧化氫酶（catalase）反應	+
氧化酶（oxidase）反應	+
產生來自葡萄糖的酸/氣體 （酸產生/氣體產生）	-/-
O/F測驗（氧化/發酵）	-/-

+：陽性，-：陰性

[表2]

基質成分	試驗 結果	基質成分	試驗 結果	基質成分	試驗 結果
控制（control）	-	a-甲基-D-葡萄糖苷*	-	D-塔格糖（D-tagatose）*	-
丙三醇*	-	N-乙醯基葡萄糖胺*	-	D-岩藻糖（D-fucose）*	-
赤藻糖醇（erythritol）*	-	苦杏仁苷（amygdalin）*	-	L-岩藻糖*	-
D-阿拉伯糖（D-arabinose）*	-	熊果苷（arbutin）*	-	D-阿拉伯糖醇 （D-arabitol）*	-
L-阿拉伯糖*	-	七葉苷（Aesculin）*	+	L-阿拉伯糖醇*	-
核糖（ribose）*	-	水楊苷（salicin）*	-	葡萄糖酸鹽（gluconate）*	-
D-木糖（D-xylose）*	-	纖維雙糖（cellobiose）*	-	2-酮基葡萄糖酸鹽 （2-ketogluconate）*	-
L-木糖*	-	麥芽糖（maltose）*	-	5-酮基葡萄糖酸鹽*	-
核糖醇（adonitol）*	-	乳糖（lactose）*	-	b-半乳糖苷酶（b-galactosidase）*	-
b-甲基-D-木糖*	-	蜜二糖（melibiose）*	-	精胺酸二水解酶（arginine dihydrolase）**	-
半乳糖（galactose）*	-	蔗糖（saccharose）*	-	離胺酸脫羧酶（lysine decarboxylase）**	-
葡萄糖*	-	海藻糖（trehalose）*	-	鳥胺酸脫羧酶**	-
果糖（fructose）*	-	菊糖（inulin）*	-	檸檬酸的利用性**	+
甘露糖（mannose）*	-	松三糖（melicitose）*	-	H2 S產生**	-
山梨糖（sorbose）*	-	棉子糖（raffinose）*	-	尿素酶（urease）**	-
鼠李糖（rhamnose）*	-	澱粉*	-	色胺酸脫胺酶（tryptophan deaminase）**	-
甜醇（dulcitol）*	-	肝醣（glycogen）*	-	產生吲哚**	-
肌醇（inositol）*	-	木糖醇*	-	產生乙偶姻（acetoin）（VP）**	-
甘露醇（mannitol）*	-	龍膽二糖（gentiobiose）*	-	明膠酶（gelatinase）**	+
山梨糖醇*	-	D-松二糖（D-turanose）*	-	硝酸鹽還原**	-
a-甲基-D-甘露糖苷 （α-methyl-D-mannoside）*	-	D-來蘇糖（D-lyxose）*	-

*發酵性試驗，**生化試驗 +：陽性，-：陰性

[表3]

試驗項目	試驗結果
繁育
50℃	+
55℃	-
20℃	+
厭氧	-
水解
酪蛋白	+
Tween80（脂酶活性）	+
澱粉	-
同化
葡萄糖	+
海藻糖	+
丙三醇	+
甘露醇	+
麥芽糖	+

[表4]

基質成分	類短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis） IFO12334	菌株A
葡萄糖	氧化	未氧化
甘露醇	氧化	未氧化
七葉苷	陰性	陽性
利用檸檬酸	陰性	陽性
明膠酶	陰性	陽性
硝酸鹽還原	還原	未還原

[實驗4. Bb.parabrevis NITE BP-03020的靶微生物分解能力評價]

（材料） ·802培養基：將10 g聚蛋白腖、2 g酵母提取物、1 g硫酸鎂七水合物溶解於超純水中，將pH值調節為7.0後，製備成1000 mL，並進行高壓蒸汽滅菌而成的培養基 ·A液：將4.35 g磷酸氫二鉀、1.70 g磷酸二氫一鉀、8.92 g磷酸氫二鈉十二水合物、0.34 g氯化銨溶解於超純水中後，製備成200 mL，並進行高壓蒸汽滅菌而成的溶液 ·B液：將4.50 g硫酸鎂七水合物溶解於超純水後，製備成200 mL，並進行高壓蒸汽滅菌而成的溶液 ·C液：將5.50 g氯化鈣無水物溶解於超純水後，製備成200 mL，並進行高壓蒸汽滅菌而成的溶液 ·D液：將0.05 g氯化鐵六水合物溶解於超純水後，製備成200 mL，並利用0.2 μm的針筒過濾器（syringe filter）進行過濾滅菌而成的溶液

（方法） 對微球菌（靶微生物）於802培養基中在溫度25℃下進行培養，進行集菌及清洗後，對於超純水986 mL，以濁度（OD660）為0.2的方式進行混合，進行高壓蒸汽滅菌，獲得基質溶液。對986 mL的基質溶液混合3.0 mL A液、3.0 mL B液、3.0 mL C液、3.0 mL D液、及1.8 mL 1%磷酸溶液，獲得將無機培養基設為溶媒的含靶微生物的溶液。含靶微生物的溶液中所含的靶微生物為靶死細菌。

將Bb.parabrevis NITE BP-03020播種至802培養基中，於30℃下培養24小時～48小時。培養後，相對於含靶微生物的溶液5.0 mL而添加Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養液50 μL，於25℃、200 rpm下進行振盪，經時性地利用簡易濁度計（簡易OD監視器 迷你伏特（miniphoto）518R，泰太科（TAITEC）公司製造）對試管的濁度（OD660）進行測定。將結果示於圖3中。另外，將利用相同的方法培養的解聚糖類芽孢桿菌（Paenibacillus glycanilyticus）的培養液50 μL添加至含靶微生物的溶液50 mL中，並將測定濁度而得的結果示於圖4中。陰性對照是未添加Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養液的含靶微生物的溶液的濁度（OD660）。

如圖3所示，於陰性對照中，含靶微生物的溶液的濁度幾乎未發生變化，相對於此，於添加了Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養液的含靶微生物的溶液中，濁度降低至添加前的50%以下。另外，如圖4所示，於添加了類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）的培養液的含靶微生物的溶液中，未發現濁度的降低。根據以上結果，得知Bb.parabrevis具有靶微生物分解能力。

[實驗5. 包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物的微生物製劑的靶微生物分解能力評價] （方法） 將Bb.parabrevis NITE BP-03020、Bb.parabrevis NBRC3331、Bb.parabrevis NBRC12333、Bb.parabrevis NBRC12334、Bb.parabrevis NBRC12374分別播種至802培養基中，於30℃下培養24小時～48小時。培養後，利用0.2 μm的針筒過濾器對培養液進行過濾，獲得培養上清液（培養物）。相對於含靶微生物的溶液5.0 mL而添加培養上清液50 μL，於25℃、200 rpm下進行振盪，經時性地利用簡易濁度計（簡易OD監視器 迷你伏特（miniphoto）518R，泰太科（TAITEC）公司製造）對試管的濁度（OD660）進行測定。將結果示於圖5中。陰性對照是未添加Bb.Parabrevis的培養上清液的含靶微生物的溶液的濁度（OD660）。含靶微生物的溶液是使用與實驗4相同的溶液。Bb.parabrevis NBRC3331、Bb.parabrevis NBRC12333、Bb.parabrevis NBRC12334、及Bb.parabrevis NBRC12374是自獨立行政法人製品評價技術基盤機構取得。

（結果） 關於Bb.parabrevis NITE BP-03020以外的各Bb.parabrevis菌株，亦是藉由添加培養上清液而含靶微生物的溶液的濁度降低。因此，得知：Bb.parabrevis NITE BP-03020以外的Bb.parabrevis亦具有靶微生物分解能力。另外，得知：Bb.parabrevis的培養物亦具有靶微生物分解能力。

進而，添加了Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養上清液的含靶微生物的溶液與添加了其他Bb.parabrevis菌株的培養上清液的含靶微生物的溶液相比，濁度更降低。得知：Bb.parabrevis NITE BP-03020的靶微生物分解能力優於其他Bb.parabrevis菌株。

[實驗6. 包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物的微生物製劑對於多個靶微生物的分解能力評價] （材料） ·LB液體培養基：相對於500 mL的超純水而以10個的比例溶解LB肉湯（LB Broth）、1.1 G每片（1.1 G PER TABLET）（西格瑪（SIGMA）公司製造）並進行高壓蒸汽滅菌而成的培養基 ·802培養基：與實驗4相同 ·細菌用培養基：將20 g葡萄糖、5 g聚蛋白腖、3 g酵母提取物、3 g肉提取物、2 g硫酸銨、1 g磷酸二氫一鉀、0.5 g硫酸鎂七水合物溶解於超純水中並將pH值調節為7.0，之後，製備成1000 mL，並進行高壓蒸汽滅菌而成的培養基 ·YM培養基：將20 g葡萄糖、5 g蛋白腖、3 g酵母提取物、3 g麥芽提取物（malt extract）溶解於超純水中，並進行高壓蒸汽滅菌而成的培養基

對表5中記載的靶微生物於表5中記載的培養基及培養溫度下進行培養，進行集菌及清洗後，對於超純水986 mL，以濁度（OD660）為0.2～0.3的方式進行混合，並進行高壓蒸汽滅菌，獲得基質溶液。對基質溶液混合與實驗4相同的A液～D液及磷酸溶液，獲得將各個種類的細菌（死菌）設為靶微生物的含靶微生物的溶液。

[表5]

靶微生物	培養基	培養溫度(℃)
溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）	802培養基	25
啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）	YM培養基	37
大腸桿菌（Escherichia coli）	LB培養基	37
類短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）	802培養基	30
氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）	細菌用培養基	30

除了含靶微生物的溶液的種類以外，利用與實驗5相同的方法，對各含靶微生物的溶液添加Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養上清液，經時性地測定濁度。將結果示於圖6～圖10中。

（結果） 添加了Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養上清液的含靶微生物的溶液與陰性對照相比，濁度均降低，得知：Bb.parabrevis及其培養物可分解各個種類的靶微生物。

[實驗7. 包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物的微生物製劑的污泥分解能力評價] （材料） 對剩餘污泥進行清洗後，對於超純水986 mL，以濁度（OD660）為0.2的方式進行混合，並進行高壓蒸汽滅菌，獲得剩餘污泥基質溶液。剩餘污泥基質溶液中的靶微生物為死菌。準備對986 mL剩餘污泥基質溶液混合3.0 mL A液、3.0 mL B液、3.0 mL C液、3.0 mL D液、及1.8 mL 1%磷酸而成的含剩餘污泥的溶液。

（方法） 除了使用含剩餘污泥的溶液作為包含靶微生物的溶液以外，利用與實驗5相同的方法，對含剩餘污泥的溶液添加Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養上清液，經時性地測定含剩餘污泥的溶液的濁度。

（結果） 如圖11所示，藉由添加Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養上清液，確認到含剩餘污泥的溶液的濁度的降低。因此，得知：Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物具有污泥分解能力。

[實驗8. 包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物的微生物製劑的靶微生物分解能力的溫度感受性評價] （方法） 使對含靶微生物的溶液添加Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養上清液後的振盪溫度發生變化，除此以外，利用與實驗5相同的方法，經時性地測定含靶微生物的溶液的濁度。振盪溫度為20℃、25℃、30℃或37℃。

（結果） 如圖12所示，添加了Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養上清液的含靶微生物的溶液於振盪溫度20℃～37℃下，濁度降低。得知：包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物的微生物製劑即便於溫度20℃下亦具有靶微生物分解能力。

[實驗9. 包含Bb.parabrevis NITE BP-03020、枯草芽孢桿菌沙漠亞種DSM022148（B.subtilis subsp.inaquosorum DSM022148）、及膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）的各培養物上清液的複合微生物製劑的污泥分解能力評價] （材料） 對剩餘污泥進行清洗後，對於超純水986 mL，以濁度（OD660）為0.15的方式進行混合，並進行高壓蒸汽滅菌，獲得剩餘污泥基質溶液。剩餘污泥基質溶液中的靶微生物為死菌。準備對986 mL剩餘污泥基質溶液混合3.0 mL A液、3.0 mL B液、3.0 mL C液、3.0 mL D液、及1.8 mL 1%磷酸而成的含剩餘污泥的溶液。

枯草芽孢桿菌沙漠亞種DSM022148（B.subtilis subsp.inaquosorum DSM022148）是使用自環境中分離出的細菌。將枯草芽孢桿菌沙漠亞種DSM022148（B.subtilis subsp.inaquosorum DSM022148）的16S rRNA基因的鹼基序列示於序列編號8中。Bb.parabrevis NITE BP-03020與膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）的16S rRNA基因序列的同一性為87%，Bb.parabrevis NITE BP-03020與枯草芽孢桿菌沙漠亞種DSM022148（B.subtilis subsp.inaquosorum DSM022148）的16S rRNA基因序列的同一性為89%。

（方法） 將Bb.parabrevis NITE BP-03020播種至802培養基中，於30℃下培養24小時～48小時。將枯草芽孢桿菌沙漠亞種DSM022148（B.subtilis subsp.inaquosorum DSM022148）播種至802培養基中，於37℃下培養24小時～48小時。將膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）播種至R2A培養基中，於25℃下培養24小時～48小時。培養結束後，利用0.2 μm的針筒過濾器對培養液進行過濾，獲得培養上清液（培養物）。相對於含剩餘污泥的溶液5.0 mL而添加各培養上清液50 μL，於25℃、200 rpm下進行振盪，經時性地利用簡易濁度計（簡易OD監視器 迷你伏特（miniphoto）518R，泰太科（TAITEC）公司製造）對試管的濁度（OD660）進行測定。於三種混合上清液添加區，各添加16.7 μL的各培養上清液。將結果示於圖13中。陰性對照是未添加培養上清液的含靶微生物的溶液的濁度（OD660）。

（結果） 如圖13所示，與單獨添加Bb.parabrevis NITE BP-03020、枯草芽孢桿菌沙漠亞種DSM022148（B.subtilis subsp.inaquosorum DSM022148）、及膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）的培養上清液相比，藉由混合添加各培養上清液，而確認到含剩餘污泥的溶液的大幅的濁度的降低。因此，得知：包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物及其他兩種菌的複合微生物製劑亦具有污泥分解能力。

[參考實驗1. 具有靶微生物分解能力的微生物的探索] （方法） 使用將細球菌（Micrococcus）屬細菌作為碳源的培養基，並對環境（水）中存在的微生物群進行培養，藉此，對分解細球菌（Micrococcus）屬細菌的微生物進行富集培養。其次，自經富集培養的微生物群分離出增殖良好的數個菌株。

（結果） 對於經分離的菌株的每一個調查細球菌屬細菌分解能力，結果，於一個菌株中確認到細球菌屬細菌分解能力。以下，有時將確認到細球菌屬細菌分解能力的菌株記載為「菌株B」。

[參考實驗2. 具有細球菌屬細菌分解能力的菌株的16S rRNA基因的鹼基序列分析] （材料） ·R2A培養基：相對於1000 mL的超純水而以3.2 g的比例溶解R2A肉湯（R2A Broth）、大高（DAIGO）（日本製藥股份有限公司製造）並進行高壓蒸汽滅菌而成的培養基 ·克隆用正向引物（27f：序列編號2） ·克隆用反向引物（1492r：序列編號3） ·序列分析用引物（339F：序列編號4，536R：序列編號5，907F：序列編號6）

（方法） 使用DNA簡易提取（easy extract for DNA）（AMR股份有限公司製造）自菌株B中提取DNA，並作為用於利用PCR使16S rRNA基因增幅的模板DNA而使用。

PCR是於以下條件下進行。將25.0 μL的科達福克斯2×PCR緩衝液（2×PCR buffer for KOD FX）（東洋紡股份有限公司製造）、10.0 μL的dNTP mix（2 mM）、1.5 μL的克隆用正向引物及克隆用反向引物（分別為10 pmol/μL）、0.58 μL的模板DNA、10.4 μL的滅菌水、1.0 μL的DNA聚合酶（科達福克斯（KOD FX），1 U/μL，東洋紡股份有限公司製造）添加至微型管中並進行混合。將微型管供給至PCR裝置，進行模板DNA的增幅反應。反應是以（1）94℃、2分鐘、（2）98℃、10秒、（3）50℃、30秒、（4）68℃、1.5分鐘進行，（2）～（4）的步驟是反覆進行35個循環。對PCR後的增幅產物進行精製。

將經精製的PCR後的增幅產物150 ng相當量、序列分析用引物（10 μM）0.32 μL、及比格戴終結者（BigDye Terminator）v3.1（應用生物系統（Applied Biosystems）公司製造）8.0 μL混合，向其中添加滅菌超純水而製備將液量設為20.0 μL的反應液。將該反應液供給至PCR裝置，進行增幅反應。反應是以（1）96℃、1分鐘、（2）96℃、10秒、（3）50℃、5秒、（4）60℃、4分鐘進行，（2）～（4）的步驟是反覆進行25個循環。對所獲得的反應液進行精製，並將精製液供給至DNA序列分析（3730xl DNA 分析儀（3730xl DNA Analyzer）），確定自菌株B中提取的模板DNA的16S rRNA基因的鹼基序列。

（結果） 對於所獲得的鹼基序列，相對於國際鹼基序列資料庫（DDBJ/ENA（EMBL）/GenBank）進行同源分析。於基準株中，相對於永久冰凍膨脹芽孢桿菌Eurl_9.5（Tumebacillus permanentifrigoris Eurl_9.5）的16S rRNA基因的鹼基序列，顯示出同一性為98.1%。然而，具有與所獲得的鹼基序列完全一致的16S rRNA基因的微生物並不存在。

將所獲得的16S rRNA基因的鹼基序列示於序列編號7中。根據該情況，暗示有：具有包含序列編號7中記載的鹼基序列的16S rRNA基因的細菌具有微生物分解能力。

[參考實驗3. 具有包含序列編號7中記載的鹼基序列的16S rRNA基因的膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus）屬細菌的形態觀察及生理/生化性狀試驗] （方法） 對菌株B進行形態觀察及生理/生化性狀試驗。該些試驗是藉由利用光學顯微鏡的形態觀察、巴羅（BARROW）等人的方法（「考恩與斯蒂爾醫學細菌鑑定手冊」（第三版，1993年），劍橋大學出版社（Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria 3rd Edition 1993、Cambridge University Press.））及API50CHB（生物梅里埃（bioMerieux）公司製造，里昂（Lyon），法國（France））來進行。將試驗結果示於表6～表9中。

（結果） 菌株B於10℃下並不繁育，但於16S rRNA基因的相同性最高的永久冰凍膨脹芽孢桿菌Eurl_9.5（Tumebacillus permanentifrigoris Eurl_9.5）中並未發現此種特徵。因此，暗示有：菌株B為與現有的膨脹芽孢桿菌（Tumebacillus）不同的新的種類。將菌株B作為膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）來寄存。

[表6]

試驗項目	結果
培養溫度（℃）	25
細胞形態	桿菌（0.8-0.9×3.0-5.0 μm）
革蘭氏染色性	+
有無孢子	+
運動性	-
菌落形態	培養基：R2A瓊脂
培養時間：48 hr
直徑：1 mm-2 mm
色調：黃色
形狀：圓形
隆起狀態：透鏡上（中央隆起）
周緣：波狀
表面的形狀等：平滑
透明度：不透明
黏稠度：黃油狀
繁育溫度試驗 （℃）	37	+
45	-
過氧化氫酶反應	+w
氧化酶反應	-
產生來自葡萄糖的酸/氣體 （酸產生/氣體產生）	-/-
O/f測驗（氧化/發酵）	-/-

+：陽性，-：陰性，+w：反應弱

[表7]

試驗項目 （發酵性試驗）	試驗 結果	試驗項目 （發酵性試驗）	試驗 結果	基質成分 （發酵性試驗）	試驗 結果
控制	-	α-甲基-D-葡萄糖苷	-	D-塔格糖	-
丙三醇	-	N-乙醯基葡萄糖胺	-	D-岩藻糖	-
赤藻糖醇	-	苦杏仁苷	-	L-岩藻糖	-
D-阿拉伯糖	-	熊果苷	-	D-阿拉伯糖醇	-
L-阿拉伯糖	-	七葉苷	-	L-阿拉伯糖醇	-
核糖	-	水楊苷	-	葡萄糖酸鹽	-
D-木糖	-	纖維雙糖	-	2-酮基葡萄糖酸鹽	-
L-木糖	-	麥芽糖	-	5-酮基葡萄糖酸鹽	-
核糖醇	-	乳糖	-
β-甲基-D-木糖	-	蜜二糖	-
半乳糖	-	蔗糖	-
葡萄糖	-	海藻糖	-
果糖	-	菊糖	-
甘露糖	-	松三糖	-
山梨糖	-	棉子糖	-
鼠李糖	-	澱粉	-
甜醇	-	肝醣	-
肌醇	-	木糖醇	-
甘露醇	-	龍膽二糖	-
山梨糖醇	-	D-松二糖	-
α-甲基-D-甘露糖苷	-	D-來蘇糖	-

+：陽性，-：陰性

[表8]

基質成分 （生化試驗）	試驗結果
β-半乳糖苷酶	-
精胺酸二水解酶	-
離胺酸脫羧酶	-
鳥胺酸脫羧酶	-
檸檬酸的利用性	-
H2 S產生	-
尿素酶	-
色胺酸脫胺酶	-
產生吲哚	-
產生乙偶姻（VP）	-
明膠酶	-
硝酸鹽還原	-

+：陽性，-：陰性

[表9]

試驗項目	試驗結果
10℃下的繁育	-
pH值9.0下的繁育	+
澱粉的水解	+

+：陽性，-：陰性

[參考實驗4. 膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）對於靶細菌（死菌）的分解能力評價] （材料） ·R2A培養基：相對於1000 mL的超純水而以3.2 g的比例溶解R2A肉湯（R2A Broth）、大高（DAIGO）（日本製藥股份有限公司製造）並進行高壓蒸汽滅菌而成的培養基 ·LB液體培養基：相對於500 mL的超純水而以10個的比例溶解LB肉湯（LB Broth）、1.1 G每片（1.1 G PER TABLET）（西格瑪（SIGMA）公司製造）並進行高壓蒸汽滅菌而成的培養基 ·802培養基：將10 g聚蛋白腖（polypeptone）、2 g酵母提取物、1 g硫酸鎂七水合物溶解於超純水中並將pH值調節為7.0，之後，製備成1000 mL，並進行高壓蒸汽滅菌而成的培養基 ·細菌用培養基：將20 g葡萄糖、5 g聚蛋白腖、3 g酵母提取物、3 g肉提取物、2 g硫酸銨、1 g磷酸二氫一鉀、0.5 g硫酸鎂七水合物溶解於超純水中並將pH值調節為7.0，之後，製備成1000 mL，並進行高壓蒸汽滅菌而成的培養基

·含有靶細菌（死菌）的無機培養基：將986 mL基質溶液、3.0 mL A液、3.0 mL B液、3.0 mL C液、3.0 mL D液、及1.8 mL 1%磷酸混合而成的培養基 再者，作為所述基質溶液及A液～D液，使用以下溶液。 基質溶液：對表10記載的靶細菌於表5記載的條件下進行培養，進行集菌及清洗後，對於超純水986 mL，以濁度（OD660）為0.2的方式進行混合，並進行高壓蒸汽滅菌而成的溶液 A液：使4.35 g磷酸氫二鉀、1.70 g磷酸二氫一鉀、8.92 g磷酸氫二鈉十二水合物、0.34 g氯化銨溶解於超純水中後，製備成200 mL，並進行高壓蒸汽滅菌而成的溶液 B液：使4.50 g硫酸鎂七水合物溶解於超純水後，製備成200 mL，並進行高壓蒸汽滅菌而成的溶液 C液：使5.50 g氯化鈣無水物溶解於超純水後，製備成200 mL，並進行高壓蒸汽滅菌而成的溶液 D液：使0.05 g氯化鐵六水合物溶解於超純水後，製備成200 mL，並利用0.2 μm的針筒過濾器進行過濾滅菌而成的溶液

[表10]

靶細菌	培養基	培養溫度（℃）
細球菌（Micrococcus ）	802培養基	25
芽孢桿菌（Bacillus ）	細菌用培養基	25
葡萄球菌（Staphylococcus ）	R2A培養基	30
乳桿菌（Lactobacillus ）	802培養基	25
類芽孢桿菌（Paenibacillus ）	細菌用培養基	25
艾氏菌（Escherichia ）	LB培養基	37
醋酸桿菌（Acetobacter ）	802培養基	25

（方法） 將膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）播種至R2A培養基中，於25℃下培養24小時～48小時。

培養結束後，向試管中添加膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）培養液50 μL、與含有靶細菌（死菌）的無機培養基5.0 mL，以25℃、200 rpm的條件使其反應，經時性地利用簡易濁度計（簡易OD監視器 迷你伏特（miniphoto）518R，泰太科（TAITEC）公司製造）對試管的濁度（OD660）進行測定。算出含有靶細菌（死菌）的無機培養基的濁度（OD660）顯示出陰性對照的濁度（OD660）的50%的經過天數，並按照以下基準判定分解能力的有無。 A：0天以上且小於2.0天 B：2.0天以上且小於5.0天 C：5.0天以上 再者，陰性對照是使用未添加膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）的含有靶細菌（死菌）的無機培養基的濁度（OD660）。

（結果） 將結果示於表11中。藉由添加膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779），確認到含有靶細菌（死菌）的無機培養基的濁度的降低。因此，膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）可分解靶微生物（靶死細菌）。

[表11]

靶細菌（死菌）	結果	細胞形態	革蘭氏染色
細球菌（Micrococcus ）	A（0.7天）	球菌	陽性
芽孢桿菌（Bacillus ）	A（0.8天）	桿菌	陽性
葡萄球菌（Staphylococcus ）	A（1.9天）	球菌	陽性
乳桿菌（Lactobacillus ）	A（1.9天）	桿菌	陽性
類芽孢桿菌（Paenibacillus ）	A（1.1天）	桿菌	陽性
艾氏菌（Escherichia ）	A（0.6天）	桿菌	陰性
醋酸桿菌（Acetobacter ）	A（0.7天）	桿菌	陰性

[參考實驗5. 膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）對於靶細菌（活菌）的分解能力評價] （材料） ·含有靶細菌（活菌）的無機培養基：將986 mL滅菌水、3.0 mL A液、3.0 mL B液、3.0 mL C液、3.0 mL D液、1.8 mL 1%磷酸、及靶細菌（活菌）混合而成的溶液 再者，作為A液～D液，使用與參考實驗4相同者。另外，以含有靶細菌（活菌）的無機培養基的濁度（OD660）為0.2的方式混合靶細菌（活菌）。

（方法） 除了使用含有靶細菌（活菌）的無機培養基以外，利用與參考實驗4相同的方法評價膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）對靶細菌（活菌）的分解能力。

（結果） 將結果示於表12中。藉由添加膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779），確認到含有靶細菌（活菌）的無機培養基的濁度的降低。因此，膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）可分解靶細菌（活菌）。

[表12]

靶細菌（活菌）	結果	細胞形態	革蘭氏染色
細球菌（Micrococcus ）	B（2.0天）	球菌	陽性
葡萄球菌（Staphylococcus ）	A（1.5天）	球菌	陽性

[參考實驗6. 膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）對於剩餘污泥（死菌）的分解能力評價（1）] ·含有剩餘污泥（死菌）的無機培養基：將986 mL基質溶液、3.0 mL A液、3.0 mL B液、3.0 mL C液、3.0 mL D液、及1.8 mL 1%磷酸混合而成的培養基 基質溶液：對剩餘污泥進行清洗後，對於超純水986 mL，以濁度（OD660）為0.2的方式進行混合，並進行高壓蒸汽滅菌而成的溶液 除了使用所述溶液作為基質溶液以外，使用與參考實驗4相同者。

（方法） 除了使用含有剩餘污泥（死菌）的無機培養基以外，利用與參考實驗4相同的方法評價膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）對剩餘污泥（死菌）的分解能力。

（結果） 將結果示於表13中。藉由添加膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779），確認到剩餘污泥（死菌）的濁度的降低。因此，膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）可分解剩餘污泥（死菌）。

[表13]

靶細菌（死菌）	結果	細胞形態	革蘭氏染色
剩餘污泥	B（3.2天）	-	-

[參考實驗7. 膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）對於剩餘污泥（死菌）的分解能力評價（2）] （材料） 使用與參考實驗6相同的材料。

（方法） 利用與參考實驗4相同的方法進行反應。反應是以5連進行，且於反應開始後第4天全量回收試管中殘存的剩餘污泥。將所回收的剩餘污泥乾燥後，測定剩餘污泥的乾燥重量，並於陰性對照群組與添加有膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumeb acillus sp. NITE BP-02779）的群組中進行有意差檢定（t檢定，單側）。

（結果） 將結果示於圖14中。與陰性對照群組相比較，於添加有膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）的群組中，確認到剩餘污泥的乾燥重量的非偶然的降低（p＜0.01）。因此，藉由添加膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779），可削減剩餘污泥。

[參考實驗8. 各種細菌對於細球菌（Micrococcus）屬細菌的分解能力評價] （材料） 作為含有靶細菌的無機培養基，準備參考實驗4中使用的包含細球菌（Micrococcus）屬細菌作為靶細菌的含有靶細菌（死菌）的無機培養基。作為評價有無微生物分解能力的細菌，準備表14中所示的細菌。

[表14]

膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp.NITE BP-02779）

藻渣膨脹芽孢桿菌NBRC108765t（Tumebacillus algifaecis NBRC108765t）

蜂疫芽孢桿菌IFO 3343t（Bacillus alvei IFO 3343t）

栗褐芽孢桿菌ATCC 14574t（Bacillus badius ATCC 14574t）

短芽孢桿菌IFO 3331（Bacillus brevis IFO 3331）

短芽孢桿菌JCM 2503t（Bacillus brevis JCM 2503t）

蠟狀芽孢桿菌JCM 2152t（Bacillus cereus JCM 2152t）

蠟狀芽孢桿菌var. juroi ATCC 21281（Bacillus cereus var.juroi ATCC 21281）

環狀芽孢桿菌ATCC 13403（Bacillus circulans ATCC 13403）

環狀芽孢桿菌IFO 3329（Bacillus circulans IFO 3329）

凝結芽孢桿菌JCM 2257t（Bacillus coagulans JCM 2257t）

堅強芽孢桿菌JCM 2512t（Bacillus firmus JCM 2512t）

緩慢芽孢桿菌JCM 2511t（Bacillus lentus JCM 2511t）

地衣芽孢桿菌ATCC 14594（Bacillus licheniformis ATCC 14594）

地衣芽孢桿菌ATCC 27811（Bacillus licheniformis ATCC 27811）

地衣芽孢桿菌IFO 12195（Bacillus licheniformis IFO 12195）

地衣芽孢桿菌IFO 12197（Bacillus licheniformis IFO 12197）

地衣芽孢桿菌IFO 12200t（Bacillus licheniformis IFO 12200t）

浸麻芽孢桿菌JCM 2500t（Bacillus macerans JCM 2500t）

巨大芽孢桿菌ATCC 13639（Bacillus megaterium ATCC 13639）

巨大芽孢桿菌IFO 12108（Bacillus megaterium IFO 12108）

巨大芽孢桿菌JCM 2506t（Bacillus megaterium JCM 2506t）

森田芽孢桿菌ATCC 21282（Bacillus moritai ATCC 21282）

飼料芽孢桿菌IFO 13638t（Bacillus pabuli IFO 13638t）

多黏類芽孢桿菌IFO 3020（Paenibacillus polymyxa IFO 3020）

多黏類芽孢桿菌JCM 2507t（Paenibacillus polymyxa JCM 2507t）

短小芽孢桿菌IFO 12092t（Bacillus pumilus IFO 12092t）

球形芽孢桿菌SC1713（Bacillus sphaericus SC1713）

球形芽孢桿菌ATCC 14577（Bacillus sphaericus ATCC 14577）

球形芽孢桿菌IFO 3341（Bacillus sphaericus IFO 3341）

球形芽孢桿菌IFO 3525（Bacillus sphaericus IFO 3525）

球形芽孢桿菌IFO 3526（Bacillus sphaericus IFO 3526）

球形芽孢桿菌IFO 3527（Bacillus sphaericus IFO 3527）

球形芽孢桿菌IFO 3528（Bacillus sphaericus IFO 3528）

枯草芽孢桿菌JCM 1465t（Bacillus subtilis  JCM 1465t）

枯草芽孢桿菌168 NBRC111470（Bacillus subtilis 168 NBRC111470）

枯草芽孢桿菌ATCC 14593（Bacillus subtilis ATCC 14593）

枯草芽孢桿菌IFO 03108（Bacillus subtilis IFO 03108）

枯草芽孢桿菌IFO 03134（Bacillus subtilis IFO 03134）

枯草芽孢桿菌IFO 13169（Bacillus subtilis IFO 13169）

枯草芽孢桿菌IFO 3026（Bacillus subtilis IFO 3026）

解澱粉芽孢桿菌NBRC3037（Bacillus amyloliquefaciens NBRC3037）

蘇雲金芽孢桿菌ATCC 13366（Bacillus thuringensis ATCC 13366）

強壯芽孢桿菌IFO 13635（Bacillus validus IFO 13635）

（方法） 利用與參考實驗4相同的方法，將含有靶細菌的無機培養基與包含成為評價對象的細菌的培養液混合，評價成為評價對象的細菌的微生物分解能力。算出含有靶細菌的無機培養基的濁度（OD660）顯示出陰性對照的濁度（OD660）的50%的經過天數，並按照以下的基準判定有無微生物分解能力。 A：0天以上且小於1.0天 B：1.0天以上且小於4.0天 C：4.0天以上 再者，陰性對照是使用並未添加包含成為評價對象的細菌的培養液的、含有靶細菌的無機培養基的濁度（OD660）。

（結果） 將結果示於表15中。另外，進行表14中記載的評價對象細菌的16S rRNA基因的鹼基序列、與膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）的16S rRNA基因的鹼基序列（序列編號7）的相同性檢索，並將算出的同一性比例示於表15中。將表15中記載的細菌的16S rRNA基因的鹼基序列表示為序列編號9～序列編號18。該些為獨立行政法人製品評價技術基盤機構生物技術中心（NBRC）在線目錄＜https://www.nite.go.jp/nbrc/catalogue/NBRCDispSearchServlet?lang=jp＞或國立生物工學資訊中心（NCBI）資料庫目錄＜https://www.ncbi.nlm.nih.gov/＞中所收錄的序列。

膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）及藻渣膨脹芽孢桿菌NBRC108765t（Tumebacillus algifaecis NBRC108765t）為A判定，而芽孢桿菌（Bacillus）屬細菌及類芽孢桿菌（Paenibacillus）屬細菌為B判定或C判定。因此，膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）及藻渣膨脹芽孢桿菌NBRC108765t（Tumebacillus algifaecis NBRC108765t）較芽孢桿菌（Bacillus）屬細菌及類芽孢桿菌（Paenibacillus）屬細菌而言，靶微生物（靶死細菌）分解能力更優異。

膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）的16S rRNA基因的鹼基序列與藻渣膨脹芽孢桿菌NBRC108765t（Tumebacillus algifaecis NBRC108765t）的16S rRNA基因的鹼基序列的同一性為92.8%。另一方面，膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）的16S rRNA基因的鹼基序列與芽孢桿菌（Bacillus）屬細菌或類芽孢桿菌（Paenibacillus）屬細菌的16S rRNA基因的鹼基序列的同一性小於90%。根據該情況，認為16S rRNA基因的鹼基序列的同一性與膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）為90%以上的細菌的靶微生物分解能力優異。藻渣膨脹芽孢桿菌NBRC108765t（Tumebacillus algifaecis NBRC108765t）可自NBRC獲得，其16S rRNA基因的鹼基序列以登記編號JX110710（Accession No. JX110710）收錄於GenBank/EMBL/DDBJ資料庫中。

[表15]

評價對象細菌	結果	序列同一性
膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）	A （0.3天）	-
藻渣膨脹芽孢桿菌NBRC108765t（Tumebacillus algifaecis NBRC108765t）	A （0.8天）	＞90% （92.8）
多黏類芽孢桿菌JCM 2507t（Paenibacillus polymyxa JCM 2507t）	B （1.1天）	＜90% （85.3）
解澱粉芽孢桿菌NBRC3037（Bacillus amyloliquefaciens NBRC3037）	B （1.2天）	＜90% （86.7）
枯草芽孢桿菌IFO 3134（Bacillus subtilis IFO 3134）	B （2.2天）	＜90% （86.7）
枯草芽孢桿菌IFO 3026（Bacillus subtilis IFO 3026）	B （2.9天）	＜90% （86.7）
枯草芽孢桿菌IFO 13169（Bacillus subtilis IFO 13169）	B （2.9天）	＜90% （86.7）
球形芽孢桿菌IFO 3341（Bacillus sphaericus IFO 3341）	B （3.3天）	＜90% （86.8）
球形芽孢桿菌IFO 3528（Bacillus sphaericus IFO 3528）	B （3.6天）	＜90% （86.8）
地衣芽孢桿菌IFO 12197（Bacillus licheniformis IFO 12197）	B （3.6天）	＜90% （87.0）
枯草芽孢桿菌168 NBRC111470（Bacillus subtilis 168 NBRC111470）	C （4.2天）	＜90% （86.7）
其他（33株）	C （＞4.2天）	＜90%

[參考實驗9. 包含膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）與大腸桿菌（Escherichia coli）的混合溶液的靶微生物分解能力評價] （材料） 作為含有靶細菌的無機培養基，準備參考實驗4中使用的包含細球菌（Micrococcus）屬細菌作為靶細菌的含有靶細菌（死菌）的無機培養基。另外，準備包含膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）與大腸桿菌DH5α（Escherichia coli DH5α）的溶液。

（方法） 首先，將膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）於25℃下培養24小時，將大腸桿菌DH5α（Escherichia coli DH5α）於37℃下培養24小時。

培養後，準備將膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）培養液（製備成OD660=0.2）、與大腸桿菌DH5α（Escherichia coli DH5α）培養液（製備成OD660=0.2）以表16中所示的比率混合而成的混合溶液。將所製備的微生物製劑50 μL與含有靶細菌的無機培養基5.0 mL添加至試管中，以25℃、200 rpm的條件進行反應，於2天後利用簡易濁度計（簡易OD監視器，迷你伏特（miniphoto）518R，泰太科（TAITEC）公司製造）對混合液的濁度（OD660）進行測定。算出添加有微生物製劑的含有靶細菌的無機培養基的濁度（OD660）相對於陰性對照的濁度（OD660）的比例作為靶微生物的殘存率，並按照以下基準評價靶微生物分解能力。 A：0%以上且小於50% B：50%以上且小於70% C：70%以上 再者，陰性對照是使用未添加混合溶液的含有靶細菌的無機培養基的濁度（OD660）。

（結果） 將結果示於表16中。包含膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）與大腸桿菌（Escherichia coli）的溶液顯示出良好的靶微生物分解能力。

[表16]

微生物製劑	靶微生物的殘存率（%）
相對於微生物製劑中所含的 細菌（a1）與細菌（a2）的總和 的細菌（a1）的比例   T/（T+E）×100	100%	A（5%）
50%	A（22%）
25%	A（28%）
13%	A（35%）
6.3%	A（39%）
3.1%	A（36%）
1.6%	A（43%）
0.78%	A（42%）
0.39%	A（45%）
0.20%	A（48%）
0%	C（124%）
陰性對照	C（100%）

T：膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）的菌數 E：大腸桿菌DH5α（Escherichia coli DH5α）的菌數 靶微生物的殘存率（%）=OD660（添加有微生物製劑）/OD660（陰性對照）×100

[參考實驗10. 膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）培養物的靶微生物分解能力評價] （材料） 作為含有靶細菌（活菌）的磷酸緩衝液，使用將66 mM磷酸鉀緩衝液（pH值為6.24）10 mL、及細球菌（Micrococcus）屬細菌乾燥菌體（西格瑪-奧德里奇（SIGMA-ALDRICH）公司製造）10 mg混合而成的溶液。

（方法） 首先，對膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）於R2A培養基中培養一定時間。

培養後，對培養液進行離心分離，回收去除了菌體的培養上清液。向96孔板中添加所回收的培養上清液100 μL與含有靶細菌的磷酸緩衝液100 μL，使用酶標儀（microplate reader）（分子器件（Molecular Device）公司製造）經時性測定ABS450 nm。算出細球菌（Micrococcus）屬細菌分解能力（單位每毫升（UNITS/mL）），並按照以下的基準評價靶微生物分解能力。 S：200（UNITS/mL）以上 A：100（UNITS/mL）以上且小於200（UNITS/mL） B：20（UNITS/mL）以上且小於100（UNITS/mL） C：小於20（UNITS/mL） 再者，細球菌（Micrococcus）屬細菌分解能力（UNITS/mL）是使用以下式子算出。 細球菌（Micrococcus）屬細菌分解能力（UNITS/mL） ={△ABS450 nm/分鐘（添加有培養上清液的含有靶細菌的磷酸緩衝液）-△ABS450 nm/分鐘（未添加培養上清液的含有靶細菌的磷酸緩衝液）}/（0.001×0.1）

（結果） 將結果示於表17中。得知：對膨脹芽孢桿菌屬NITE BP-02779（Tumebacillus sp. NITE BP-02779）培養一定時間而成的培養上清液具有靶微生物分解能力。

[表17]

培養時間（小時）	細球菌（Micrococcus）屬細菌分解能力
0	C（13 UNITS/mL）
21	A（121 UNITS/mL）
28	S（249 UNITS/mL）
46	S（250 UNITS/mL）
53	S（252 UNITS/mL）
68	A（153 UNITS/mL）

無

圖1是表示實驗3中類短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis）（以下，有時記載為「Bb.parabrevis」）NITE BP-03020的形態的照片。 圖2是表示實驗3中Bb.parabrevis NITE BP-03020的革蘭氏染色（Gram staining）的結果的照片。 圖3是表示實驗4中Bb.parabrevis NITE BP-03020的靶微生物分解能力的圖表。 圖4是表示實驗4中解聚糖類芽孢桿菌（Paenibacillus glycanilyticus）的靶微生物分解能力的圖表。 圖5是表示實驗5中包含多株Bb.parabrevis的培養物的微生物製劑的靶微生物分解能力的圖表。 圖6是表示實驗6中包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物的微生物製劑的靶微生物（溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus））分解能力的圖表。 圖7是表示實驗6中包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物的微生物製劑的靶微生物（啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae））分解能力的圖表。 圖8是表示實驗6中包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物的微生物製劑的靶微生物（大腸桿菌（Escherichia coli））分解能力的圖表。 圖9是表示實驗6中包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物的微生物製劑的靶微生物（類短短芽孢桿菌（Brevibacillus parabrevis））分解能力的圖表。 圖10是表示實驗6中包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物的微生物製劑的靶微生物（氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans））分解能力的圖表。 圖11是表示實驗7中包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物的微生物製劑的污泥分解能力的圖表。 圖12是表示實驗8中各種溫度條件下的包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物的微生物製劑的靶微生物分解能力的圖表。 圖13是表示實驗9中包含Bb.parabrevis NITE BP-03020的培養物與其他細菌的培養物的混合物的微生物製劑的污泥分解能力的圖表。 圖14是表示參考實驗7中添加膨脹芽孢桿菌屬（Tumebacillus sp.）（NITE BP-02779）後的剩餘污泥的乾燥重量的圖。

Claims (18)

1. 一種細菌，其為污泥分解用，具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有97%以上的同一性的鹼基序列。
2. 一種細菌，具有16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力，所述16S rRNA基因中，相對於序列編號1中記載的鹼基序列而鹼基的變異數為兩個鹼基以下。
3. 如請求項2所述的細菌，其中所述靶微生物為靶細菌。
4. 如請求項2或請求項3所述的細菌，其中所述靶微生物為靶死細菌。
5. 如請求項1至請求項4中任一項所述的細菌，具有包含序列編號1中記載的鹼基序列的16S rRNA基因。
6. 一種細菌，其為以受託編號NITE BP-03020寄存的細菌。
7. 一種污泥分解用微生物製劑，包含細菌（a1）， 細菌（a1）：具有16S rRNA基因的細菌，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有90%以上的同一性的鹼基序列。
8. 如請求項7所述的污泥分解用微生物製劑，其中所述細菌（a1）具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有95%以上的同一性的鹼基序列。
9. 如請求項7所述的污泥分解用微生物製劑，其中所述細菌（a1）具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有97%以上的同一性的鹼基序列。
10. 如請求項7所述的污泥分解用微生物製劑，其中所述細菌（a1）具有包含序列編號1中記載的鹼基序列的16S rRNA基因。
11. 如請求項7至請求項10中任一項所述的污泥分解用微生物製劑，其中所述細菌（a1）具有靶微生物分解能力。
12. 如請求項7至請求項11中任一項所述的污泥分解用微生物製劑，其於溫度20℃下分解污泥。
13. 如請求項7所述的污泥分解用微生物製劑，其中所述細菌（a1）為以受託編號NITE BP-03020寄存的細菌。
14. 如請求項7至請求項13中任一項所述的污泥分解用微生物製劑，進而包含微生物（a2），並且相對於所述細菌（a1）及所述微生物（a2）的總數的所述細菌（a1）數量為0.1%以上且小於100%， 微生物（a2）：與細菌（a1）不同的微生物。
15. 如請求項14所述的污泥分解用微生物製劑，其中所述微生物（a2）包含選自由具有16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力的細菌、具有靶微生物分解能力的芽孢桿菌屬細菌、及具有靶微生物分解能力的類芽孢桿菌屬細菌所組成的群組中的至少一種，所述16S rRNA基因包含與序列編號7中記載的鹼基序列具有90%以上的同一性的鹼基序列。
16. 一種污泥分解用微生物製劑，包含細菌（a1）的培養物， 細菌（a1）：具有16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力的細菌，所述16S rRNA基因包含與序列編號1中記載的鹼基序列具有90%以上的同一性的鹼基序列。
17. 一種污泥分解方法，包括使如請求項1至請求項6中任一項所述的細菌或如請求項7至請求項16中任一項所述的污泥分解用微生物製劑作用於污泥的步驟。
18. 一種污泥分解裝置，使用如請求項1至請求項6中任一項所述的細菌或如請求項7至請求項16中任一項所述的污泥分解用微生物製劑。

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