CN114867845A - 污泥分解用细菌、微生物分解细菌、微生物制剂、污泥分解方法及污泥分解装置 - Google Patents
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Abstract
本文提供：具有包含与序列编号1记载的碱基序列97％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因的污泥分解用细菌，具有包含相对于序列编号1记载的碱基序列的碱基变异数为2个碱基以下的碱基序列的16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力的细菌，及包含细菌(a1)的用于分解靶微生物的微生物制剂，其中细菌(a1)是具有包含与序列编号1记载的碱基序列90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因的细菌。
Description
技术领域
本发明涉及污泥分解用细菌、微生物分解细菌、微生物制剂、污泥分解方法及污泥分解装置。
背景技术
如果利用活性污泥法进行污水净化，则会产生称为剩余污泥的污泥，其包含将有机物分解而增殖的微生物。由于从废水处理设备排出的剩余污泥在产业废弃物中占多达40％以上的比例，因此认为在减少产业废弃物的体积时，有效的是减少该剩余污泥的体积。一般来说，剩余污泥在脱水、干燥后会经焚烧处理(非专利文献1：″2015年度事业、产业废弃物排出、处理状况调查报告书，2013年度实绩(概要版)″[在线]，2016年3月，环境省大臣官房废弃物、再循环对策部，[2018年8月31日检索]，互联网<URL：https://www.e-stat.go.jp/stat-search/file-download？statInfId＝000031403476&fileKind＝2>；非专利文献2：山本昌幸，″关于污水的燃烧技术″，日本燃料学会志，一般社团法人日本燃烧学会，2011，第53卷，164号，p91-96)。
但是，如果对剩余污泥进行焚烧处理，则会产生温室效应气体，因此未必是对环境造成影响较少的处理方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：″2015年度事业、产业废弃物排出、处理状况调查报告书，2013年度实绩(概要版)″[在线]，2016年3月，环境省大臣官房废弃物、再循环对策部，[2018年8月31日检索]，互联网<URL：https://www.e-stat.go.jp/stat-search/file-download？statInfId＝000031403476&fileKind＝2>
非专利文献2：山本昌幸，″关于污水的燃烧技术″，日本燃料学会志，一般社团法人日本燃烧学会，2011，第53卷，164号，p91-96
发明内容
发明要解决的问题
近年来，整个社会对于地球环境的意识日益提高，并寻求对环境造成影响更少的减少剩余污泥体积的方法，即，构成剩余污泥的微生物的分解方法。
本发明的目的在于提供污泥分解用细菌、微生物分解细菌、微生物制剂、污泥分解方法及污泥分解装置。
用于解决问题的手段
即，本发明涉及以下例示的[1]～[18]。
[1]污泥分解用细菌(以下，有时记为″本发明所述的污泥分解用细菌″)，其具有包含与序列编号1记载的碱基序列具有97％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因。
[2]细菌(以下，有时记为″本发明所述的细菌″)，其具有相对于序列编号1记载的碱基序列的碱基变异数为2个碱基以下的16S rRNA基因，且具有靶微生物分解能力。
[3]根据[2]所述的细菌，其中靶微生物为靶细菌。
[4]根据[2]或[3]所述的细菌，其中靶微生物为靶死细菌。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的细菌，其具有包含序列编号1记载的碱基序列的16S rRNA基因。
[6]细菌，其以保藏号NITE BP-03020保藏。
[7]污泥分解用微生物制剂(以下，有时记为″本发明所述的微生物制剂″)，其包含细菌(a1)，
细菌(a1)：具有包含与序列编号1记载的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因的细菌。
[8]根据[7]所述的污泥分解用微生物制剂，其中细菌(a1)具有包含与序列编号1记载的碱基序列具有95％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因。
[9]根据[7]所述的污泥分解用微生物制剂，其中细菌(a1)具有包含与序列编号1记载的碱基序列具有97％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因。
[10]根据[7]所述的污泥分解用微生物制剂，其中细菌(a1)具有包含序列编号1记载的碱基序列的16S rRNA基因。
[11]根据[7]～[10]中任一项所述的污泥分解用微生物制剂，其中细菌(a1)具有靶微生物分解能力。
[12]根据[7]～[11]中任一项所述的污泥分解用微生物制剂，其在温度20℃分解污泥。
[13]根据[7]所述的污泥分解用微生物制剂，其中细菌(a1)是以保藏号NITE BP-03020保藏的细菌。
[14]根据[7]～[13]中任一项所述的污泥分解用微生物制剂，其进一步包含微生物(a2)，且相对于细菌(a1)及微生物(a2)的总数，细菌(a1)数为0.1％以上且小于100％，
微生物(a2)：不同于细菌(a1)的微生物。
[15]根据[14]所述的污泥分解用微生物制剂，其中微生物(a2)包含选自由具有包含与序列编号7记载的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶微生物分解能力的细菌，具有靶微生物分解能力的芽孢杆菌属细菌，及具有靶微生物分解能力的类芽孢杆菌属细菌组成的组中的至少1种。
[16]污泥分解用微生物制剂，其包含细菌(a1)的培养物，
细菌(a1)：具有包含与序列编号1记载的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶微生物分解能力的细菌。
[17]污泥分解方法(以下，有时记为″本发明所述的分解方法″)，其包括如下工序：使根据[1]～[6]中任一项所述的细菌或根据[7]～[16]中任一项所述的污泥分解用微生物制剂作用于污泥。
[18]污泥分解装置(以下，有时记为″本发明所述的分解装置″)，其使用根据[1]～[6]中任一项所述的细菌或根据[7]～[16]中任一项所述的污泥分解用微生物制剂。
发明效果
根据本发明，能够提供污泥分解用细菌、微生物分解细菌、微生物制剂、微生物的分解方法及分解装置。
附图说明
图1是表示实验3中副短短芽孢杆菌(Brevibacillus parabrevis)(以下，有时记载为″Bb.parabrevis″)NITE BP-03020的形态的照片。
图2是表示实验3中副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的革兰氏染色结果的照片。
图3是表示实验4中副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的靶微生物分解能力的图表。
图4是表示实验4中解聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glycanilyticus)的靶微生物分解能力的图表。
图5是表示实验5中包含多株副短短芽孢杆菌株的培养物的微生物制剂的靶微生物分解能力的图表。
图6是表示实验6中包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物的微生物制剂的靶微生物(溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus))分解能力的图表。
图7是表示实验6中包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物的微生物制剂的靶微生物(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))分解能力的图表。
图8是表示实验6中包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物的微生物制剂的靶微生物(大肠杆菌(Escherichia coli))分解能力的图表。
图9是表示实验6中包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物的微生物制剂的靶微生物(副短短芽孢杆菌(Brevibacillus parabrevis))分解能力的图表。
图10是表示实验6中包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物的微生物制剂的靶微生物(氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans))分解能力的图表。
图11是表示实验7中包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物的微生物制剂的污泥分解能力的图表。
图12是表示实验8中各种温度条件下的包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物的微生物制剂的靶微生物分解能力的图表。
图13是表示实验9中包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物和其他细菌的培养物的混合物的微生物制剂的污泥分解能力的图表。
图14是表示参考实验7中，添加膨胀芽孢杆菌属物种(Tumebacillus sp.)(NITEBP-02779)后的剩余污泥的干燥重量的图。
具体实施方式
以下，对本发明的具体实施方式详细地进行说明。需要说明的是，本发明并不限定于以下实施方式。
(通用术语的说明)
在本说明书中，“微生物″是肉眼无法辨别结构的那些微小生物，为除了大型多细胞生物以外的生物。″靶微生物″是被本发明所述的细菌或微生物制剂分解的微生物。作为靶微生物，可列举细菌、真菌等，其中优选为细菌，更优选为构成剩余污泥的细菌。靶微生物可为活菌，也可为死菌。
“靶细菌″是指成为靶微生物的细菌。靶细菌可为活菌，也可为死菌，且可包含活菌及死菌。活菌是指存活的细菌，例如在进行代谢的细菌。死菌是指死亡的细菌，例如不进行代谢的细菌。活菌和死菌可使用例如碘化丙啶(propidium iodide，PI)等色素来辨别。“靶死细菌″是指靶细菌中死亡的细菌。从分解效率的观点出发，靶细菌优选为靶死细菌。剩余污泥中微生物的约50％为死菌。靶死细菌也可通过例如对靶细菌进行加热、高压蒸汽灭菌、紫外线照射、福尔马林处理、酸处理等来得到。另外，靶死细菌也可经粉碎而成。
作为靶微生物，例如可列举微球菌(Micrococcus)属细菌、芽孢杆菌(Bacillus)属细菌、葡萄球菌(Staphylococcus)属细菌、类芽孢杆菌(Paenibacillus)属细菌、乳酸杆菌(Lactobacillus)属细菌等革兰氏阳性菌；埃希氏杆菌(Escherichia)属细菌、醋杆菌(Acetobacter)属细菌、葡糖杆菌(Gluconobacter)属细菌等革兰氏阴性菌；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等真菌类。
在本说明书中，“靶微生物分解能力″是指使靶微生物进行代谢，将构成靶微生物的生物分子的一部分或全部转化为不同分子的能力。作为生物分子，例如可列举糖、蛋白质、核酸、脂质等。
(本发明所述的污泥分解用细菌)
本发明所述的污泥分解用细菌具有包含与序列编号1记载的碱基序列具有97％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因。作为具有包含与序列编号1记载的碱基序列具有97％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因的细菌，可列举短芽孢杆菌(Brevibacillus)属细菌。作为短芽孢杆菌属细菌，可列举副短短芽孢杆菌(Brevibacillus parabrevis)、桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、美丽短芽孢杆菌(Brevibacillusformosus)、土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)、硝化短芽孢杆菌(Brevibacillusnitrificans)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、茹氏短芽孢杆菌(Brevibacillusreuszeri)、嗜湖短芽孢杆菌(Brevibacillus limnophilus)、短芽孢杆菌(Brevibacilluspanacihumi)、明胶芽孢杆菌(Brevibacillus gelatini)。
本发明所述的污泥分解用细菌可具有包含与序列编号1记载的碱基序列相比，同一性或同源性为97.5％以上、98％以上、98.5％以上、98.8％以上、99.0％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.8％以上或99.9％以上的碱基序列的16S rRNA基因。污泥分解用细菌也可为具有包含序列编号1记载的碱基序列的16S rRNA基因的细菌，作为其代表性菌株，可列举后述副短短芽孢杆菌(保藏号NITE BP-03020)。本发明所述的污泥分解用细菌可包含本发明所述的细菌。
本发明所述的污泥分解用细菌可具有包含与序列编号1记载的碱基序列相比，发生了1个碱基或数个碱基的置换、缺失或添加的碱基序列的16S rRNA基因。1个碱基或数个碱基例如可为1～25个碱基，可为1～10个碱基，也可为1～5个碱基。上述变异为16S rRNA的表达及功能不丧失的变异。
本发明所述的污泥分解用细菌也可具有16S rRNA基因，该16S rRNA基因包含对序列编号1记载的碱基序列中所含的约15个碱基以上、优选为约18～约500个碱基、更优选为约18～约200个碱基、进一步优选为约18～约50个碱基连续的序列或其互补序列在严格条件下杂交的碱基序列。严格条件是指不形成非特异性杂交的条件，例如可列举在60℃、1×SSC、0.1％SDS、优选为68℃、0.1×SSC、0.1％SDS中清洗1次以上的条件等。
本发明所述的污泥分解用细菌具有污泥分解能力。污泥优选为剩余污泥。污泥分解能力可根据反应条件(污泥及污泥中所含的靶微生物的种类及浓度、包含污泥分解用细菌的溶液的组成、温度、pH、细菌数等)而发生变化。作为调查是否具有污泥分解能力的方法，例如可列举如下方法：使污泥和想要调查污泥分解能力的细菌在适当的培养基或缓冲液中反应一定时间后，调查污泥在培养基或缓冲液中的分解。作为调查分解的方法，没有特别限定，例如可列举如下方法：测定污泥的浊度的方法、利用SLP试剂检测污泥中所含的靶微生物的方法、利用PCR检测污泥中所含的靶微生物的DNA的方法、测定污泥的干燥重量的方法、测定污泥中所含的靶微生物的干燥重量的方法、使用高效液相色谱法(HPLC)；质谱法(MS)；薄层色谱法(TLC)；核磁共振(NMR)；气相色谱法(GC)等检测来自污泥中所含的靶微生物的分解物的方法。
在通过浊度调查污泥分解能力的情况下，具有污泥分解能力是指向污泥中添加污泥分解用细菌后，经过给定时间后的浊度和添加前的浊度相比显著降低。添加后的浊度例如为添加前的浊度的80％以下，优选为50％以下，更优选为30％以下。在利用干燥重量调查污泥分解能力的情况下，具有污泥分解能力是指例如添加后的干燥污泥重量和添加前的干燥污泥重量相比显著降低，例如添加后的干燥污泥重量为添加前的95％以下，优选为90％以下。一般来说，细菌在具有靶微生物分解能力时具有污泥分解能力。
(本发明所述的细菌)
本发明所述的细菌具有相对于序列编号1记载的碱基序列，碱基变异数为2个碱基以下的16S rRNA基因，且具有靶微生物分解能力。在本说明书中，16S rRNA基因优选为细菌本来具有的内源性的16S rRNA基因。也可为人工诱发突变的16S rRNA。作为具有相对于序列编号1记载的碱基序列，碱基变异数为2个碱基以下的16S rRNA基因的细菌，可列举短芽孢杆菌(Brevibacillus)属细菌，还可列举副短短芽孢杆菌(Brevibacillus parabrevis)。本发明所述的细菌可包含本发明所述的污泥分解用细菌。
作为本发明所述的细菌的一个实施方式，可列举具有包含序列编号1记载的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶微生物分解能力的细菌。
作为具有包含序列编号1记载的碱基序列的16S rRNA基因的细菌的代表性菌株，可列举如下菌株，其以副短短芽孢杆菌(Brevibacillus parabrevis)(保藏号NITE BP-03020，原保藏日：2019年9月17日)，基于布达佩斯条约保藏于独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD，地址：
292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室)。关于该菌株的菌学性质，于下文进行叙述。
本发明所述的细菌可具有包含与序列编号1记载的碱基序列相比，同一性或同源性为98.5％以上、98.8％以上、99.0％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.8％以上、99.9％以上的碱基序列的16S rRNA基因，也可具有包含序列编号1记载的碱基序列的16S rRNA基因。
相对于序列编号1记载的碱基序列，碱基变异数为2个碱基以下的细菌可具有包含与序列编号1记载的碱基序列相比，发生了1个碱基或2个碱基的置换、缺失或添加的碱基序列的16S rRNA基因。上述变异为16S rRNA的表达及功能不丧失的变异。
本发明所述的细菌也可具有16S rRNA基因，该16S rRNA基因包含对序列编号1记载的碱基序列中所含的约15个碱基以上、优选为约18～约500个碱基、更优选为约18～约200个碱基、进一步优选为约18～约50个碱基连续的序列或其互补序列在严格条件下杂交的碱基序列。严格条件是指不形成非特异性杂交的条件，例如可列举在60℃、1×SSC、0.1％SDS、优选为68℃、0.1×SSC、0.1％SDS中清洗1次以上的条件等。
本发明所述的细菌的靶微生物分解能力可根据反应条件(靶微生物的种类及浓度、包含细菌的溶液的组成、温度、pH、细菌数等)而发生变化。靶微生物例如为靶细菌，优选为靶死细菌。
例如，分别将本发明所述的细菌的代表性菌株副短短芽孢杆菌NITE BP-03020和微球菌属细菌死菌制备为浊度(OD660)0.2，并以体积比1：100混合，然后在20～35℃的温度条件下，在6.5～8.0的pH条件下进行反应，由此可使1周后的浊度降低50％左右，且将微球菌属细菌分解。
本发明所述的细菌可通过分析对象微生物(本发明所述的细菌或想要调查的微生物)的16S rRNA基因的碱基序列、及测定靶微生物的分解能力来判定。具体来说，如果对象微生物具有相对于序列编号1记载的碱基序列，碱基变异数为2个碱基以下的16S rRNA基因，且具有靶微生物分解能力，则可判定该微生物为本发明所述的细菌。
16S rRNA基因的碱基序列的分析例如可利用以下方法进行。首先，使用公知的方法，从对象微生物提取基因组DNA，并使16S rRNA基因扩增。作为使16S rRNA基因扩增的方法，没有特别限制，可列举本领域技术人员通常使用的使用有通用引物的PCR法等。可根据需要将通过PCR法得到的扩增产物纯化，并用于DNA测序仪等而确定碱基序列。将得到的碱基序列与序列编号1记载的序列进行比较。
作为调查是否具有靶微生物分解能力的方法，例如可列举如下方法：使对象微生物和靶微生物在适当的培养基或缓冲液中反应一定时间后，调查靶微生物在培养基或缓冲液中的分解。调查分解的方法没有特别限定，例如可列举如下方法：测定包含靶微生物的溶液的浊度的方法、利用SLP试剂检测靶微生物的方法、利用PCR检测靶微生物的DNA的方法、测定靶微生物的干燥菌体重量的方法、使用高效液相色谱法(HPLC)；质谱法(MS)；薄层色谱法(TLC)；核磁共振(NMR)；气相色谱法(GC)等检测来自靶微生物的分解物的方法。
在通过浊度调查靶微生物的分解的情况下，具有靶微生物分解能力是指向包含靶微生物的溶液中添加本发明所述的细菌后，经过给定时间后的浊度和添加前的浊度相比显著降低。添加后的浊度例如为添加前的浊度的80％以下，优选为50％以下，更优选为30％以下。在利用干燥菌体重量调查靶微生物的分解的情况下，具有靶微生物分解能力例如是指添加后的干燥菌体重量和添加前的干燥菌体重量相比显著降低，例如添加后的干燥菌体重量为添加前的95％以下，优选为90％以下。一般来说，细菌在具有污泥分解能力时具有靶微生物分解能力。
基于这些碱基序列分析及靶微生物分解能力的测定结果，可判断对象微生物是否为本发明所述的细菌。
(本发明所述的微生物制剂)
本发明所述的微生物制剂的一个实施方式包含以下的细菌(a1)。
<细菌(a1)>
细菌(a1)具有包含与序列编号1记载的碱基序列相比，具有90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因。
细菌(a1)可具有包含与序列编号1记载的碱基序列相比，同一性或同源性为93％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上、99.9％以上的碱基序列的16SrRNA基因，也可具有包含序列编号1记载的碱基序列的16S rRNA基因。作为细菌(a1)，可列举短芽孢杆菌(Brevibacillus)属细菌，也可为副短短芽孢杆菌(Brevibacillusparabrevis)。细菌(a1)也可为以保藏号NITE BP-03020保藏的细菌。
另外，细菌(a1)可具有包含与序列编号1记载的碱基序列相比，发生了1个碱基或数个碱基的置换、缺失或添加的碱基序列的16S rRNA基因。1个碱基或数个碱基例如可为1～135个碱基，可为1～100个碱基，可为1～50个碱基，可为1～25个碱基，也可为1～5个碱基。上述变异为16S rRNA的表达及功能不丧失的变异。
细菌(a1)也可具有16S rRNA基因，该16S rRNA基因包含对序列编号1记载的碱基序列中所含的约15个碱基以上、优选为约18～约500个碱基、更优选为约18～约200个碱基、进一步优选为约18～约50个碱基连续的序列或其互补序列在严格条件下杂交的碱基序列。
细菌(a1)的16S rRNA基因的碱基序列的分析可以和上述本发明所述的细菌同样地进行。
细菌(a1)优选为具有靶微生物分解能力。细菌(a1)的靶微生物分解能力可以和上述本发明所述的细菌同样地评价。
由于靶微生物分解能力良好，因此，作为细菌(a1)，优选为包含副短短芽孢杆菌、本发明所述的污泥分解用细菌、本发明所述的细菌、及选自以下A组的细菌中的至少1种细菌。细菌(a1)可为单一细菌，也可为多种细菌。
A组：污染短芽孢杆菌(Brevibacillus invocatus)、中孢短芽孢杆菌(Brevibacillus centrosporus)、波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)、利氏短芽孢杆菌(Brevibacillus levickii)、马赛短芽孢杆菌(Brevibacillusmassiliensis)、人参土短芽孢杆菌(Brevibacillus ginsengisoli)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、黄褐色短芽孢杆菌(Brevibacillus fulvus)、流水短芽孢杆菌(Brevibacillus fluminis)、沉积物短芽孢杆菌(Brevibacillus sediminis)、热红短芽孢杆菌(Brevibacillus thermoruber)、艾登短芽孢杆菌(Brevibacillusaydinogluensis)。
本发明所述的微生物制剂具有污泥分解能力。污泥分解能力可利用上述本发明所述的污泥分解用细菌一栏中记载的方法来进行评价。微生物制剂的污泥分解能力优选为来自微生物制剂中所含的细菌(a1)或者微生物(a2)或它们的培养物。微生物制剂可在温度37℃以下、温度30℃、温度25℃或温度20℃分解分解污泥，也可在温度20℃～40℃的范围内进行污泥分解。例如，将本发明所述的微生物制剂添加到包含靶微生物的溶液中后，第5天的溶液的浊度在温度25℃下为温度30℃的溶液的浊度的2倍以下，在温度20℃下为温度30℃的溶液的浊度的3倍以下，优选为2.5倍以下。
除了细菌(a1)以外，微生物制剂还可包含细菌(a1)的培养物、微生物(a2)、添加剂(b)、载体(c)等。作为微生物制剂的具体例，可列举包含细菌(a1)、微生物(a2)、添加剂(b)及载体(c)的微生物制剂。
<细菌(a1)的培养物>
本发明所述的微生物制剂的一个实施方式包含细菌(a1)的培养物。细菌(a1)的培养物例如包含细菌(a1)的分泌物、代谢物、由细菌(a1)产生的蛋白质、糖、酶及它们悬浊而成的液体培养基。具体来说，培养物包括在受控制的条件下，在给定的液体培养基中、或包含碳源及氮源的液体培养基中增殖的细菌(a1)的培养物。包含细菌(a1)的培养物的靶微生物分解用制剂中可包含细菌(a1)的活菌。细菌(a1)的培养物可为培养细菌(a1)的上清液。培养上清液例如可通过离心分离、过滤操作等，从培养细菌(a1)的液体培养基中将细菌(a1)除去而得到。另外，培养物可包含细菌(a1)的片段。细菌(a1)的片段例如也可通过将细菌(a1)超声波粉碎、珠粒研磨、化学溶解处理而得到。细菌(a1)的培养物优选具有靶微生物分解能力。
<微生物(a2)>
微生物(a2)为不同于细菌(a1)的微生物。微生物(a2)只要是不使微生物制剂的污泥分解能力失去的那种微生物，则并没有特别限制。微生物(a2)可为单一微生物，也可为多种微生物。微生物(a2)可为提高细菌(a1)的增殖能力或稳定性的细菌，也可为提高细菌(a1)的培养物的稳定性的细菌。
微生物(a2)可通过微生物的16S rRNA基因的碱基序列的分析、生理生化性状试验等来判定。微生物(a2)可具有靶微生物分解能力，也可不具有。对象微生物的16S rRNA基因的碱基序列的分析、及靶微生物分解能力的测定可以和上述本发明所述的细菌同样地进行。
作为微生物(a2)，可为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如可列举膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus)属细菌、类芽孢杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌、醋杆菌属细菌、葡糖杆菌属细菌、乳酸杆菌属细菌、戈登氏菌(Gordonia)属细菌、微杆菌(Microbacterium)属细菌、红球菌(Rhodococcus)属细菌、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)属细菌、埃希氏杆菌属细菌、酿酒酵母。
微生物(a2)优选为包含具有靶微生物分解能力的细菌，例如优选为包含选自由具有包含与序列编号7记载的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶微生物分解能力的细菌(以下，有时记载为″细菌(a21)″)、具有靶微生物分解能力的芽孢杆菌属细菌、及具有靶微生物分解能力的类芽孢杆菌属细菌组成的组中的至少1种。
作为具有包含与序列编号7记载的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶微生物分解能力的细菌，可列举膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus)属细菌。细菌(a21)可具有包含与序列编号7记载的碱基序列相比，同一性或同源性为93％以上、95％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上、99.9％以上的碱基序列的16S rRNA基因，也可具有包含序列编号7记载的碱基序列的16S rRNA基因。细菌(a21)也可为作为膨胀芽孢杆菌属物种(Tumebacillus sp.)(保藏号NITE BP-02779，原保藏日：2018年9月11日)，基于布达佩斯条约保藏于独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD，地址：
292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室)的菌。关于该菌株的细菌学性质，示于后述表6～表9。
细菌(a21)也可为例如Paenibacillus polymyxa(Tumebacillus algifaecis)、鸟型膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus avium)、鞭毛膨胀芽孢杆菌(Tumebacillusflagellates)、人参土膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus ginsengisoli)、解脂膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus lipolyticus)、藤黄膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus luteolus)、永久冰冻膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus permanentifrigoris)、壤膨胀芽孢杆菌(Tumebacillussoli)。
作为具有靶微生物分解能力的芽孢杆菌属细菌，例如可列举枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
作为具有靶微生物分解能力的类芽孢杆菌属细菌，例如可列举多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
从靶微生物分解能力的观点出发，相对于细菌(a1)及微生物(a2)的总数，细菌(a1)数可为0.1％以上，可为1％以上，可为10％以上，可为50％以上，可为75％以上，可为90％以上，可为95％以上，可为100％以下，也可小于100％。
相对于细菌(a1)及微生物(a2)的总数的细菌(a1)数优选为细菌(a1)相对于微生物制剂中所含的全部细菌的比例。作为算出细菌(a1)数相对于细菌(a1)及微生物(a2)的总数的方法，可列举通过克隆文库法(Clone Library Method)、下一代测序分析、定量PCR算出的方法等。
作为通过克隆文库法及下一代测序分析算出细菌的存在比例的方法，具体来说，从微生物制剂中所含的细菌(a1)及微生物(a2)提取基因组DNA而获得多个16S rRNA基因的碱基序列(以下，将获得的多个碱基序列数记为读出数)，分别确定获得的碱基序列是否为来自细菌(a1)或微生物(a2)中的任一种的碱基序列。接着，可算出相对于读出数的来自细菌(a1)的碱基序列数，而作为相对于细菌(a1)及微生物(a2)的总数的细菌(a1)数。
作为下一代测序分析中使用的下一代测序仪，只要能够以DNA片段为模板，检测每1个碱基在再合成时的荧光强度，确定碱基序列，则并没有特别限制。作为下一代测序仪，例如可列举MiSeq、HiSeq 2500(Illumina公司制)、5500xl SOLiDTM、Ion ProtonTM、IonPGMTM(Thermo Fisher Scientific公司制)、GS FLX+(Roche Diagnostics株式会社制)等。
作为通过定量PCR算出细菌的存在比例的方法，具体来说，分别算出微生物制剂中所含的细菌(a1)的16S rRNA基因拷贝数、及细菌(a1)和微生物(a2)的16S rRNA基因拷贝数。接着，可算出相对于细菌(a1)及微生物(a2)的16S rRNA基因拷贝数的细菌(a1)的16SrRNA基因拷贝数，作为相对于细菌(a1)及微生物(a2)的总数的细菌(a1)数。
作为定量PCR中使用的实时PCR装置，只要具备可通过PCR使DNA扩增的热循环仪、及用于检测扩增产物的分光荧光光度计，则并没有特别限制。作为实时PCR装置，例如可列举StepOnePlus(Applied Biosystems公司制)、Thermal Cycler Dice Real Time System(Takarabio株式会社制)、LightCycler 96System(Roche Diagnostics株式会社制)等。
作为用于定量PCR的反应混合物(mastermix)，可列举Fast SYBR Green MasterMix、Power SYBR Green Master Mix、SYBR Select Master Mix、PowerUp SYBR GreenMaster Mix(Thermo Fisher Scientific公司制)等。
<添加剂(b)>
作为添加剂(b)，例如可列举表面活性剂、分散剂、辅助剂、保护剂等。添加剂(b)的种类及浓度可在细菌(a1)不死亡、或该细菌所具有的靶微生物分解能力不丧失的条件下适当确定。
<载体(c)>
作为载体(c)，例如可列举无机微粒子载体。作为无机微粒子载体，可为金属及其无机盐类或氧化物，也可为即使含有碳但在化学上仍被分类为无机物的物质。另外，也可为有机态碳的含量小于1％左右的纯物质或混合物。
无机微粒子载体的中心粒径优选为1μm～100μm，更优选为4μm～75μm，进一步优选为13μm～25μm。当中心粒径在这种范围内时，有细菌(a1)容易负载在无机微粒子载体的倾向。这里，中心粒径是指在基于激光衍射、光散射法的体积基准的粒度分布中的中位粒径(D50)。无机微粒子载体的比重没有特别限制，优选为1.2～3.5。
为了提高培养初期的成品率，也可根据需要，使用各种凝聚剂使无机微粒子载体凝聚。作为凝聚剂，例如可列举非离子性、阳离子性、阴离子性高分子凝聚剂等。
作为微生物制剂的制造方法，例如可列举如下方法：将细菌(a1)和无机微粒子载体混合，将细菌(a1)负载在无机微粒子载体上，对其进行培养，并将得到的微生物制剂回收。
作为培养方法，可使用分批、半分批、补料分批、连续中的任一方式。作为培养方法，例如从有效地制备增殖慢而菌体产率低的微生物的观点出发，可使用如日本专利特开平9-187272号公报所记载的那样，使向培养微生物的容器(以下称为反应槽)中供给的对象化合物的浓度随培养时间经过而对数增加的连续培养方式。
在本发明中，只要细菌(a1)的靶微生物分解能力不丧失，则微生物的制剂化方法没有特别限定，可利用公知的制剂化方法。作为微生物制剂的形态，可为液体或固体(包括胶囊包封体、琼脂状、粉末状等)，也可为它们的冷冻体、冷冻干燥体等。当微生物制剂为液体时，可设为悬浊在培养基、缓冲液、生理盐水等中的细菌悬浊液。液体也可为酸性或中性。当微生物制剂为固体或冷冻干燥体时，例如也可在将所培养的细菌浓缩后，进行适当的干燥或冷冻干燥而制成固体或冷冻干燥体。此时也可添加赋形剂等。
(污泥分解方法)
本发明所述的分解方法包括使本发明所述的污泥分解用细菌、本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂作用于污泥的工序。本发明所述的污泥分解用细菌、本发明所述的细菌及本发明所述的微生物制剂所具有的靶微生物分解能力对包含靶微生物的剩余污泥的处理有用，通过本发明所述的分解方法，可减少剩余污泥的体积。
使本发明所述的污泥分解用细菌、本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂作用于污泥是指：将例如本发明所述的污泥分解用细菌、本发明所述的细菌或者本发明所述的微生物制剂或使它们悬浊而成的溶液和污泥接触。通过本发明所述的污泥分解用细菌、本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂将污泥中所含的靶微生物分解，污泥被分解。
关于使本发明所述的污泥分解用细菌、本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂作用于污泥的工序，只要为本发明所述的污泥分解用细菌、本发明所述的细菌或细菌(a1)不死亡、或该细菌所具有的靶微生物分解能力不丧失的条件，则并没有特别限制。该工序例如可在温度为20～40℃的条件下，也可在25～30℃的条件下。另外，可在pH为6.5～8.0的条件下，也可在7.0～7.5的条件下。
关于对污泥的本发明所述的污泥分解用细菌、本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂的添加量，可考虑靶微生物的种类及浓度、反应系统的容积等来适当设定。
在本发明所述的分解方法中，污泥发生分解的确认方法并没有特别限制，可通过本领域技术人员通常可使用的方法进行。作为这样的确认方法，例如可列举上述污泥分解能力的评价方法或靶微生物分解能力的评价方法。
(污泥分解装置)
作为污泥分解装置，只要为可使用本发明所述的污泥分解用细菌、本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂来减少剩余污泥的装置，则没有特别限定，例如可列举产生剩余污泥的污泥处理装置、排水处理装置等。另外，也可向例如存在剩余污泥的现有的污泥处理装置、排水处理装置等中添加本发明所述的污泥分解用细菌、本发明所述的细菌或本发明所述的微生物制剂，而作为污泥分解装置。
以往，为了分解剩余污泥，进行了臭氧、碱、次亚氯酸等化学处理，珠磨机、超声波粉碎等物理处理，使用有在高温条件下或碱性条件下发挥作用的微生物的生物学处理等，为了进行这些处理，必须将剩余污泥转移到其他槽中，而耗费大量设备成本及运作成本。本发明所述的污泥分解用细菌、本发明所述的细菌及本发明所述的微生物制剂可直接投入剩余污泥中，因此可控制准备新设备的成本，并且也无需改变以往进行的污泥分解方法。
实施例
[实验1.具有靶微生物分解能力的微生物的探索]
(方法)
从存在于环境(水)中的微生物群中分离出多个菌株。
(结果)
对分离出的每个菌株调查微球菌属细菌分解能力，结果在1个菌株中确认到微球菌属细菌分解能力。以下，将确认到微球菌属细菌分解能力的菌株记为″菌株A″。
[实验2.具有微球菌属细菌分解能力的菌株的16S rRNA基因的碱基序列分析]
(材料)
·802培养基：将10g多聚蛋白胨、2g酵母提取物、1g硫酸镁七水合物溶解于超纯水中，将pH调节为7.0后，制备为1000mL，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基
·克隆用正向引物(27f：序列编号2)
·克隆用反向引物(1492r：序列编号3)
·序列分析用引物(339F：序列编号4、536R：序列编号5、907F：序列编号6)
(方法)
使用DNA简易提取试剂盒(EZ-EXTRACT for DNA)(AMR株式会社制)从菌株A提取DNA，用作模板DNA，该模板DNA用于通过PCR使16S rRNA基因扩增。
以如下条件进行PCR。将25.0μL的用于KOD FX的2×PCR缓冲液(东洋纺株式会社制)、10.0μL的dNTP mix(2mM)、1.5μL的克隆用正向引物及克隆用反向引物(各10pmol/μL)、0.58μL的模板DNA、10.4μL的灭菌水、1.0μL的DNA聚合酶(KOD FX，1U/μL，东洋纺株式会社制)加入到微管中并混合。将微管供于PCR装置，进行模板DNA的扩增反应。以(1)94℃、2分钟、(2)98℃、10秒钟、(3)50℃、30秒钟、(4)68℃、1.5分钟进行反应，并将(2)～(4)的工序反复进行35个循环。将PCR后的扩增产物纯化。
制备如下反应液，其将相当于150ng量的已纯化的PCR后的扩增产物、序列分析用引物(10μM)0.32μL、及BigDye Terminator v3.1(Applied Biosystems公司制)8.0μL混合，向其中加入灭菌超纯水而使液量成为20.0μL。将该反应液供于PCR装置，进行扩增反应。以(1)96℃、1分钟、(2)96℃、10秒钟、(3)50℃、5秒钟、(4)60℃、4分钟进行反应，并将(2)～(4)的工序反复进行25个循环。将得到的反应液纯化，将纯化液供于DNA序列分析(3730xl DNA分析仪)，确定从菌株A提取出的模板DNA的16S rRNA基因的碱基序列。
(结果)
对得到的碱基序列相对于国际碱基序列数据库(DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank)进行同源性分析。在基准株中，相对于副短短芽孢杆菌IFO12334的16S rRNA基因的碱基序列，显示出99.8％的同一性。但是，并不存在具有和得到的碱基序列完全一致的16S rRNA基因的微生物。
以序列编号1表示此时的16S rRNA基因的碱基序列。由以上表明具备具有序列编号1记载的碱基序列的16S rRNA基因的细菌具有靶微生物分解能力。
[实验3.具有包含序列编号1记载的碱基序列的16S rRNA基因的副短短芽孢杆菌株的形态观察及生理、生化性状试验]
(方法)
对菌株A进行形态观察及生理、生化性状试验。这些试验是通过利用光学显微镜的形态观察、巴罗(BARROW)等人的方法(Cowan and Steel’s Manual for theIdentification of Medical Bacteria 3rd Edition1993、Cambridge UniversityPress.)及API50CHB(bioMerieux公司制，法国里昂)进行。将试验结果示于表1～表3。
(结果)
如图1所示，菌株A的菌落具有圆形且奶油状的形态。另外，如图2所示，菌株A为杆菌，对革兰氏染色为阴性。在表4所示的方面，菌株A具有不同于16S rRNA基因的同源性最高的副短短芽孢杆菌株IFO12334的特征。因此，表明菌株A为不同于以往的副短短芽孢杆菌株的新种株。以副短短芽孢杆菌NITE BP-03020保藏菌株A。
[表1]
+：阳性、-：阴性
[表2]
*发酵性试验，**生化试验
+：阳性、-：阴性
[表3]
[表4]
[实验4.副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的靶微生物分解能力评价]
(材料)
·802培养基：将10g多聚蛋白胨、2g酵母提取物、1g硫酸镁七水合物溶解于超纯水中，将pH调节为7.0后，制备为1000mL，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基
·A液：将4.35g磷酸氢二钾、1.70g磷酸二氢钾、8.92g磷酸氢二钠12水合物、0.34g氯化铵溶解于超纯水中后，制备为200mL，并进行了高压蒸汽灭菌的溶液
·B液：将4.50g硫酸镁七水合物溶解于超纯水中后，制备为200mL，并进行了高压蒸汽灭菌的溶液
·C液：将5.50g无水氯化钙溶解于超纯水中后，制备为200mL，并进行了高压蒸汽灭菌的溶液
·D液：将0.05g氯化铁六水合物溶解于超纯水中后，制备为200mL，以0.2μm的注射器过滤器进行了过滤灭菌的溶液
(方法)
将微球菌(靶微生物)在802培养基中在温度25℃进行培养，细菌采集及清洗后，以相对于超纯水986mL，浊度(OD660)成为0.2的方式混合，并进行高压蒸汽灭菌，得到基质溶液。在986mL的基质溶液中混合3.0mL A液、3.0mL B液、3.0mL C液、3.0mL D液、及1.8mL1％磷酸溶液，得到将无机培养基作为溶剂的含靶微生物溶液。含靶微生物溶液中所含的靶微生物为靶死细菌。
将副短短芽孢杆菌NITE BP-03020接种到802培养基中，在30℃培养24～48小时。培养后，相对于含靶微生物溶液5.0mL，添加副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养液50μL，在25℃、200rpm下进行振荡，利用简易浊度计(简易OD minitor，miniphoto 518R，TAITEC公司制)，随时间经过测定试管的浊度(OD660)。将结果示于图3。另外，将以相同方法培养的解聚糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glycanilyticus)的培养液50μL添加到含靶微生物溶液50mL中，并测定浊度，将所得的结果示于图4。阴性对照为未添加副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养液的含靶微生物溶液的浊度(OD660)。
如图3所示，阴性对照的含靶微生物溶液的浊度几乎不变，相对于此，添加有副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养液的含靶微生物溶液的浊度降低至添加前的50％以下。另外，如图4所示，添加有类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)的培养液的含靶微生物溶液未观察到浊度降低。由以上结果可知，副短短芽孢杆菌(Bb.parabrevis)具有靶微生物分解能力。
[实验5.包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物的微生物制剂的靶微生物分解能力评价]
(方法)
将副短短芽孢杆菌NITE BP-03020、副短短芽孢杆菌NBRC3331、副短短芽孢杆菌NBRC12333、副短短芽孢杆菌NBRC12334、副短短芽孢杆菌NBRC12374分别接种到802培养基中，在30℃培养24～48小时。培养后，以0.2μm的注射器过滤器将培养液过滤，得到培养上清液(培养物)。相对于含靶微生物溶液5.0mL，添加培养上清液50μL，在25℃、200Am下进行振荡，利用简易浊度计(简易OD minitor，miniphoto 518R，TAITEC公司制)，随时间经过测定试管的浊度(OD660)。将结果示于图5。阴性对照为未添加副短短芽孢杆菌的培养上清液的含靶微生物溶液的浊度(OD660)。含靶微生物溶液使用和实验4相同的溶液。从独立行政法人产品评价技术基础机构获得副短短芽孢杆菌NBRC3331、副短短芽孢杆菌NBRC12333、副短短芽孢杆菌NBRC12334、及副短短芽孢杆菌NBRC12374。
(结果)
关于副短短芽孢杆菌NITE BP-03020以外的各副短短芽孢杆菌株，也通过添加培养上清液，含靶微生物溶液的浊度降低。因此，可知副短短芽孢杆菌NITE BP-03020以外的副短短芽孢杆菌株也具有靶微生物分解能力。另外，可知副短短芽孢杆菌株的培养物也具有靶微生物分解能力。
并且，添加有副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养上清液的含靶微生物溶液和添加有其他副短短芽孢杆菌株的培养上清液的含靶微生物溶液相比，浊度降低。可知副短短芽孢杆菌NITE BP-03020和其他副短短芽孢杆菌株相比，靶微生物分解能力更优异。
[实验6.包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物的微生物制剂对于多种靶微生物的分解能力评价]
(材料)
·LB液体培养基：相对于500mL的超纯水，以10个的比例溶解LB肉汤、1.1g PERTABLET(SIGMA公司制)，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基
·802培养基：和实验4相同
·细菌用培养基：将20g葡萄糖、5g多聚蛋白胨、3g酵母提取物、3g肉汁、2g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶解于超纯水中，将pH调节为7.0后，制备为1000mL，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基
·YM培养基：将20g葡萄糖、5g蛋白胨、3g酵母提取物、3g麦芽提取物溶解于超纯水中，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基
将表5所记载的靶微生物以该表所记载的培养基及培养温度进行培养，细菌采集及清洗后，以相对于超纯水986mL，浊度(OD660)成为0.2～0.3的方式混合，并进行高压蒸汽灭菌，得到基质溶液。在基质溶液中混合和实验4相同的A液～D液及磷酸溶液，得到以各种种类的细菌(死菌)为靶微生物的含靶微生物溶液。
[表5]
除了含靶微生物溶的种类以外，以和实验5相同的方法在各含靶微生物溶液中添加副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养上清液，随时间经过测定浊度。将结果示于图6～图10。
(结果)
添加有副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养上清液的含靶微生物溶液和阴性对照相比，浊度均降低，可知副短短芽孢杆菌及其培养物可分解各种靶微生物。
[实验7.包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物的微生物制剂的污泥分解能力评价]
(材料)
将剩余污泥清洗后，以相对于超纯水986mL，浊度(OD660)成为0.2的方式混合，并进行高压蒸汽灭菌，得到剩余污泥基质溶液。剩余污泥基质溶液中的靶微生物为死菌。准备含剩余污泥溶液，其在986mL剩余污泥基质溶液中混合有3.0mL A液、3.0mL B液、3.0mL C液、3.0mL D液、及1.8mL 1％磷酸。
(方法)
除了使用含剩余污泥溶液作为包含靶微生物的溶液以外，以和实验5相同的方法将副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养上清液添加到含剩余污泥溶液中，并随时间经过测定含剩余污泥溶液的浊度。
(结果)
如图11所示，通过添加副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养上清液，确认到含剩余污泥溶液的浊度降低。因此，可知副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物具有污泥分解能力。
[实验8.包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物的微生物制剂的靶微生物分解能力的温度敏感性评价]
(方法)
除了变更将副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养上清液添加到含靶微生物溶液中后的振荡温度以外，以和实验5相同的方法随时间经过测定含靶微生物溶液的浊度。振荡温度为20℃、25℃、30℃或37℃。
(结果)
如图12所示，添加有副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养上清液的含靶微生物溶液在振荡温度20℃～37℃浊度降低。可知包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020的培养物的微生物制剂在温度20℃也具有靶微生物分解能力。
[实验9.包含副短短芽孢杆菌NITE BP-03020、枯草芽孢杆菌沙漠亚种(B.subtilis subsp.inaquosorum)DSM022148、及膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779的各培养物上清液的复合微生物制剂的污泥分解能力评价]
(材料)
将剩余污泥清洗后，以相对于超纯水986mL，浊度(OD660)成为0.15的方式混合，并进行高压蒸汽灭菌，得到剩余污泥基质溶液。剩余污泥基质溶液中的靶微生物为死菌。准备含剩余污泥溶液，其在986mL剩余污泥基质溶液中混合有3.0mL A液、3.0mL B液、3.0mL C液、3.0mL D液、及1.8mL 1％磷酸。
枯草芽孢杆菌沙漠亚种DSM022148使用从环境中分离出的细菌。以序列编号8表示枯草芽孢杆菌沙漠亚种DSM022148的16S rRNA基因的碱基序列。副短短芽孢杆菌NITE BP-03020和膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779的16S rRNA基因序列的同一性为87％，副短短芽孢杆菌NITE BP-03020和枯草芽孢杆菌沙漠亚种DSM022148的16S rRNA基因序列的同一性为89％。
(方法)
将副短短芽孢杆菌NITE BP-03020接种到802培养基中，在30℃培养24～48小时。将枯草芽孢杆菌沙漠亚种DSM022148接种到802培养基中，在37℃培养24～48小时。将膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779接种到R2A培养基中，在25℃培养24～48小时。培养结束后，以0.2μm的注射器过滤器将培养液过滤，得到培养上清液(培养物)。相对于含剩余污泥溶液5.0mL，添加各培养上清液50μL，在25℃、200rpm下进行振荡，利用简易浊度计(简易ODminitor，miniphoto 518R，TAITEC公司制)，随时间经过测定试管的浊度(OD660)。3种混合上清液添加区中，分别添加各培养上清液16.7μL。将结果示于图13。阴性对照为未添加培养上清液的含靶微生物溶液的浊度(OD660)。
(结果)
如图13所示，和单独添加副短短芽孢杆菌NITE BP-03020、枯草芽孢杆菌沙漠亚种DSM022148、及膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779的培养上清液相比，通过分别混合各者并添加而确认到含剩余污泥溶液的浊度大幅降低。因此，可知包含副短短芽孢杆菌NITEBP-03020的培养物及其他2种菌的复合微生物制剂也具有污泥分解能力。
[参考实验1.具有靶微生物分解能力的微生物的探索]
(方法)
使用以微球菌(Micrococcus)属细菌为碳源的培养基，培养存在于环境(水)中的微生物群，由此富集培养出分解微球菌(Micrococcus)属细菌的微生物。接着，从富集培养后的微生物群分离出增殖良好的数种菌株。
(结果)
对分离出的各菌株调查微球菌属细菌分解能力，结果在1个菌株中确认到微球菌属细菌分解能力。以下，有时将确认到微球菌属细菌分解能力的菌株记为″菌株B″。
[参考实验2.具有微球菌属细菌分解能力的菌株的16S rRNA基因的碱基序列分析]
(材料)
·R2A培养基：相对于1000mL的超纯水，以3.2g的比例溶解R2A肉汤(DAIGO(日本制药株式会社制))，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基
·克隆用正向引物(27f：序列编号2)
·克隆用反向引物(1492r：序列编号3)
·序列分析用引物(339F：序列编号4、536R：序列编号5、907F：序列编号6)
(方法)
使用DNA简易提取试剂盒(EZ-EXTRACT for DNA)(AMR株式会社制)从菌株B提取DNA，用作模板DNA，该模板DNA用于通过PCR使16S rRNA基因扩增。
以如下条件进行PCR。将25.0μL的用于KOD FX的2×PCR缓冲液(东洋纺株式会社制)、10.0μL的dNTP mix(2mM)、1.5μL的克隆用正向引物及克隆用反向引物(各10pmol/μL)、0.58μL的模板DNA、10.4μL的灭菌水、1.0μL的DNA聚合酶(KOD FX，1U/μL，东洋纺株式会社制)加入到微管中并混合。将微管供于PCR装置，进行模板DNA的扩增反应。以(1)94℃、2分钟、(2)98℃、10秒钟、(3)50℃、30秒钟、(4)68℃、1.5分钟进行反应，并将(2)～(4)的工序反复进行35个循环。将PCR后的扩增产物纯化。
制备如下反应液，其将相当于150ng量的已纯化的PCR后的扩增产物、序列分析用引物(10μM)0.32μL、及BigDye Terminator v3.1(Applied Biosystems公司制)8.0μL混合，向其中加入灭菌超纯水而使液量成为20.0μL。将该反应液供于PCR装置，进行扩增反应。以(1)96℃、1分钟、(2)96℃、10秒钟、(3)50℃、5秒钟、(4)60℃、4分钟进行反应，并将(2)～(4)的工序反复进行25个循环。将得到的反应液纯化，将纯化液供于DNA序列分析(3730xl DNA分析仪)，确定从菌株B提取出的模板DNA的16S rRNA基因的碱基序列。
(结果)
对得到的碱基序列相对于国际碱基序列数据库(DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank)进行同源性分析。在基准株中，相对于永久冰冻膨胀芽孢杆菌(Tumebacilluspermanentifrigoris)Eurl_9.5的16S rRNA基因的碱基序列，显示出98.1％的同一性。但是，并不存在具有和得到的碱基序列完全一致的16S rRNA基因的微生物。
以序列编号7表示得到的16S rRNA基因的碱基序列。由此表明含有具有序列编号7记载的碱基序列的16S rRNA基因的细菌具有微生物分解能力。
[参考实验3.含有具有序列编号7记载的碱基序列的16S rRNA基因的膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus)属细菌的形态观察及生理、生化性状试验]
(方法)
对菌株B进行形态观察及生理、生化性状试验。这些试验是通过利用光学显微镜的形态观察、巴罗(BARROW)等人的方法(Cowan and Steel’s Manual for theIdentification of Medical Bacteria 3rd Edition 1993、Cambridge UniversityPress.)及API50CHB(bioMerieux公司制，法国里昂)进行。将试验结果示于表6～表9。
(结果)
菌株B于10℃下不生长，但在16S rRNA基因的同源性最高的永久冰冻膨胀芽孢杆菌(Tumebacillus permanentifrigoris)Eurl_9.5中未发现此类特征。因此，表明菌株B为不同于以往的膨胀芽孢杆菌的新种。以膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779保藏菌株B。
[表6]
+：阳性，-：阴性、+w：反应弱
[表7]
+：阳性、-：阴性
[表8]
+：阳性、-：阴性
[表9]
| 试验项目 | 试验结果 |
| 在10℃生长 | - |
| 在pH9.0生长 | + |
| 淀粉水解 | + |
+：阳性、-：阴性
[参考实验4.膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779对于靶细菌(死菌)的分解能力评价]
(材料)
·R2A培养基：相对于1000mL的超纯水，以3.2g的比例溶解R2A肉汤(DAIGO(日本制药株式会社制))，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基
·LB液体培养基：相对于500mL的超纯水，以10个的比例溶解LB肉汤、1.1g PERTABLET(SIGMA公司制)，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基
·802培养基：将10g多聚蛋白胨、2g酵母提取物、1g硫酸镁七水合物溶解于超纯水中，将pH调节为7.0后，制备为1000mL，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基
·细菌用培养基：将20g葡萄糖、5g多聚蛋白胨、3g酵母提取物、3g肉汁、2g硫酸铵、1g磷酸二氢钾、0.5g硫酸镁七水合物溶解于超纯水中，将pH调节为7.0后，制备为1000mL，并进行了高压蒸汽灭菌的培养基
·含靶细菌(死菌)无机培养基：混合有986mL基质溶液、3.0mL A液、3.0mL B液、3.0mL C液、3.0mL D液、及1.8mL 1％磷酸的培养基
需要说明的是，使用以下溶液作为上述基质溶液及A液～D液。
基质溶液：将表10记载的靶细菌在该表记载的条件下进行培养，细菌采集及清洗后，以相对于超纯水986mL，浊度(OD660)成为0.2的方式混合，并进行了高压蒸汽灭菌的溶液
A液：将4.35g磷酸氢二钾、1.70g磷酸二氢钾、8.92g磷酸氢二钠十二水合物、0.34g氯化铵溶解于超纯水中后，制备为200mL，并进行了高压蒸汽灭菌的溶液
B液：将4.50g硫酸镁七水合物溶解于超纯水中后，制备为200mL，并进行了高压蒸汽灭菌的溶液
C液：将5.50g无水氯化钙溶解于超纯水中后，制备为200mL，并进行了高压蒸汽灭菌的溶液
D液：将0.05g氯化铁六水合物溶解于超纯水中后，制备为200mL，以0.2μm的注射器过滤器进行了过滤灭菌的溶液
[表10]
(方法)
将膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779接种到R2A培养基中，在25℃培养24小时～48小时。
培养结束后，将膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779培养液50μL和含靶细菌(死菌)无机培养基5.0mL添加到试管中，在25℃、200rpm下进行反应，利用简易浊度计(简易ODminitor，miniphoto 518R，TAITEC公司制)，随时间经过测定试管的浊度(OD660)。算出含靶细菌(死菌)无机培养基的浊度(OD660)显示阴性对照的浊度(OD660)的50％的经过天数，并以如下基准判定有无分解能力。
A：0天以上且小于2.0天
B：2.0天以上且小于5.0天
C：5.0天以上
需要说明的是，阴性对照使用未添加膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779的含靶细菌(死菌)无机培养基的浊度(OD660)。
(结果)
将结果示于表11。通过添加膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779，确认到含靶细菌(死菌)无机培养基的浊度降低。因此，膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779能够分解靶微生物(靶死细菌)。
[表11]
| 靶细菌(死菌) | 结果 | 细胞形态 | 革兰氏染色 |
| 微球菌 | A(0.7天) | 球菌 | 阳性 |
| 芽孢杆菌 | A(0.8天) | 杆菌 | 阳性 |
| 葡萄球菌 | A(1.9天) | 球菌 | 阳性 |
| 乳酸杆菌 | A(1.9天) | 杆菌 | 阳性 |
| 类芽孢杆菌 | A(1.1天) | 杆菌 | 阳性 |
| 埃希氏杆菌 | A(0.6天) | 杆菌 | 阴性 |
| 醋杆菌 | A(0.7天) | 杆菌 | 阴性 |
[参考实验5.膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779对于靶细菌(活菌)的分解能力评价]
(材料)
·含靶细菌(活菌)无机培养基：混合有986mL灭菌水、3.0mL A液、3.0mL B液、3.0mL C液、3.0mL D液、1.8mL 1％磷酸、及靶细菌(活菌)的溶液
需要说明的是，使用和参考实验4相同的溶液作为A液～D液。另外，以含靶细菌(活菌)无机培养基的浊度(OD660)为0.2的方式混合靶细菌(活菌)。
(方法)
除了使用含靶细菌(活菌)无机培养基以外，以和参考实验4相同的方法评价膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779对于靶细菌(活菌)的分解能力。
(结果)
将结果示于表12。通过添加膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779，确认到含靶细菌(活菌)无机培养基的浊度降低。因此，膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779能够分解靶细菌(活菌)。
[表12]
[参考实验6.膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779对于剩余污泥(死菌)的分解能力评价(1)]
·含剩余污泥(死菌)无机培养基：混合有986mL基质溶液、3.0mL A液、3.0mL B液、3.0mL C液、3.0mL D液、及1.8mL 1％磷酸的培养基
·基质溶液：将剩余污泥清洗后，以相对于超纯水986mL，浊度(OD660)成为0.2的方式混合，并进行了高压蒸汽灭菌的溶液
除了使用上述溶液作为基质溶液以外，使用和参考实验4相同的溶液。
(方法)
除了使用含剩余污泥(死菌)无机培养基以外，以和参考实验4相同的方法评价膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779对于剩余污泥(死菌)的分解能力。
(结果)
将结果示于表13。通过添加膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779，确认到剩余污泥(死菌)的浊度降低。因此，膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779能够分解剩余污泥(死菌)。
[表13]
| 靶细菌(死菌) | 结果 | 细胞形态 | 革兰氏染色 |
| 剩余污泥 | B(3.2天) | - | - |
[参考实验7.膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779对于剩余污泥(死菌)的分解能力评价(2)]
(材料)
使用和参考实验6相同的材料。
(方法)
以和参考实验4相同的方法进行反应。反应连续进行5次，且在反应开始后第4天将试管中残留的剩余污泥全部回收。将回收的剩余污泥干燥后，测定剩余污泥的干燥重量，并在阴性对照组和膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779添加组中进行显著差异检验(t检验，单侧)。
(结果)
将结果示于图14。相较于阴性对照组，膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779添加群确认到剩余污泥的干燥重量的显著降低(p<0.01)。因此，通过添加膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779，能够减少剩余污泥。
[参考实验8.各种细菌对于微球菌属细菌的分解能力评价]
(材料)
作为含靶细菌无机培养基，准备包含参考实验4中所使用的微球菌属细菌作为靶细菌的含靶细菌(死菌)无机培养基。准备表14所示的细菌作为评价有无微生物分解能力的细菌。
[表14]
(方法)
以和参考实验4相同的方法将含靶细菌无机培养基和包含成为评价对象的细菌的培养液混合，评价成为评价对象的细菌的微生物分解能力。算出含靶细菌无机培养基的浊度(OD660)显示阴性对照的浊度(OD660)的50％的经过天数，并以如下基准微生物判定有无分解能力。
A：0天以上且小于1.0天
B：1.0天以上且小于4.0天
C：4.0天以上
需要说明的是，阴性对照使用未添加包含成为评价对象的细菌的培养液的含靶细菌无机培养基的浊度(OD660)。
(结果)
将结果示于表15。另外，进行表14所记载的评价对象的细菌的16S rRNA基因的碱基序列和膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779的16S rRNA基因的碱基序列(序列编号7)的同源性检索，并将算出的同一性比例示于表15。将表15所记载的细菌的16S rRNA基因的碱基序列表示为序列编号9～18。它们是收录在独立行政法人产品评价技术基础机构生物技术中心(NBRC)在线目录<https://www.nite.go.jp/nbrc/catalogue/NBRCDispSearchServlet？lang＝jp>或国立生物工程信息中心(NCBI)数据库目录<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/>中的序列。
膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779及藻渣膨胀芽孢杆菌NBRC108765t为A判定，而芽孢杆菌属细菌及类芽孢杆菌属细菌为B判定或C判定。因此，膨胀芽孢杆菌属物种NITEBP-02779及藻渣膨胀芽孢杆菌NBRC108765t和芽孢杆菌属细菌及类芽孢杆菌属细菌相比，靶微生物(靶死细菌)分解能力更优异。
膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779的16S rRNA基因的碱基序列和藻渣膨胀芽孢杆菌NBRC108765t的16S rRNA基因的碱基序列的同一性为92.8％。另一方面，膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779的16S rRNA基因的碱基序列和芽孢杆菌属细菌或类芽孢杆菌属细菌的16S rRNA基因的碱基序列的同一性小于90％。由此认为，16S rRNA基因的碱基序列和膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779的同一性为90％以上的细菌的靶微生物分解能力优异。藻渣膨胀芽孢杆菌NBRC108765t能够从NBRC获取，其16S rRNA基因的碱基序列以登录号JX110710收录在GenBank/EMBL/DDBJ数据库中。
[表15]
[参考实验9.包含膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779和大肠杆菌的混合溶液的靶微生物分解能力评价]
(材料)
作为含靶细菌无机培养基，准备包含参考实验4中所使用的微球菌属细菌作为靶细菌的含靶细菌(死菌)无机培养基。另外，准备包含膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779和大肠杆菌DH5α的溶液。
(方法)
首先，将膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779在25℃培养24小时，将大肠杆菌DH5α在37℃培养24小时。
培养后，准备混合溶液，其以表16所示的比率混合有膨胀芽孢杆菌属物种NITEBP-02779培养液(制备为OD660＝0.2)和大肠杆菌DH5α培养液(制备为OD660＝0.2)。将制备的微生物制剂50μL和含靶细菌无机培养基5.0mL添加到试管中，在25℃、200rpm进行反应，2天后利用简易浊度计(简易OD minitor，miniphoto 518R，TAITEC公司制)测定混合液的浊度(OD660)。算出添加有微生物制剂的含靶细菌无机培养基的浊度(OD660)相对于阴性对照的浊度(OD660)的比例作为靶微生物的残留率，并以如下基准评价靶微生物分解能力。
A：0％以上且小于50％
B：50％以上且小于70％
C：70％以上
需要说明的是，阴性对照使用未添加混合溶液的含靶细菌无机培养基的浊度(OD660)。
(结果)
将结果示于表16。包含膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779和大肠杆菌的溶液显示出良好的靶微生物分解能力。
[表16]
T：膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779的菌数
E：大肠杆菌DH5α的菌数
靶微生物的残留率(％)＝OD660(添加有微生物制剂)/OD660(阴性对照)×100
[参考实验10.膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779培养物的靶微生物分解能力评价]
(材料)
作为含靶细菌(活菌)磷酸缓冲液，使用混合有66mM磷酸钾缓冲液(pH6.24)10mL、及微球菌属细菌干燥菌体(SIGMA-ALDRICH公司制)10mg的溶液。
(方法)
首先，将膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779在R2A培养基中培养一定时间。
培养后，将培养液离心分离，回收除去了菌体的培养上清液。将回收的培养上清液100μL和含靶细菌磷酸缓冲液100μL添加到96孔板中，使用酶标仪(Molecular Device公司制)，随时间经过测定ABS450nm。算出微球菌属细菌分解能力(UNITS/mL)，并以如下基准评价靶微生物分解能力。
S：200(UNITS/mL)以上
A：100(UNITS/mL)以上且小于200(UNITS/mL)
B：20(UNITS/mL)以上且小于100(UNITS/mL)
C：小于20(UNITS/mL)
需要说明的是，使用下式算出微球菌属细菌分解能力(UNITS/mL)。
微球菌属细菌分解能力(UNITS/mL)
＝{ΔABS450nm/min(添加有培养上清液的含靶细菌磷酸缓冲液)-ΔABS450nm/min(未添加培养上清液的含靶细菌磷酸缓冲液)}/(0.001×0.1)
(结果)
将结果示于表17。可知，将膨胀芽孢杆菌属物种NITE BP-02779培养一定时间后的培养上清液具有靶微生物分解能力。
[表17]
| 培养时间(小时) | 微球菌属细菌分解能力 |
| 0 | C(13UNITS/mL) |
| 21 | A(121UNITS/mL) |
| 28 | S(249UNITS/mL) |
| 46 | S(250UNITS/mL) |
| 53 | S(252UNITS/mL) |
| 68 | A(153UNITS/mL) |
Claims (18)
1.污泥分解用细菌，其具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含与序列编号1记载的碱基序列具有97％以上同一性的碱基序列。
2.细菌，其具有16S rRNA基因且具有靶微生物分解能力，所述16S rRNA基因相对于序列编号1记载的碱基序列的碱基变异数为2个碱基以下。
3.根据权利要求2所述的细菌，其中所述靶微生物为靶细菌。
4.根据权利要求2或3所述的细菌，其中所述靶微生物为靶死细菌。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细菌，其具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含序列编号1记载的碱基序列。
6.细菌，其以保藏号NITE BP-03020保藏。
7.污泥分解用微生物制剂，其包含细菌(a1)，其中细菌(a1)具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含与序列编号1记载的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列。
8.根据权利要求7所述的污泥分解用微生物制剂，其中所述细菌(a1)具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含与序列编号1记载的碱基序列具有95％以上同一性的碱基序列。
9.根据权利要求7所述的污泥分解用微生物制剂，其中所述细菌(a1)具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含与序列编号1记载的碱基序列具有97％以上同一性的碱基序列。
10.根据权利要求7所述的污泥分解用微生物制剂，其中所述细菌(a1)具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因包含序列编号1记载的碱基序列。
11.根据权利要求7～10中任一项所述的污泥分解用微生物制剂，其中所述细菌(a1)具有靶微生物分解能力。
12.根据权利要求7～11中任一项所述的污泥分解用微生物制剂，其在温度20℃分解污泥。
13.根据权利要求7所述的污泥分解用微生物制剂，其中所述细菌(a1)是以保藏号NITEBP-03020保藏的细菌。
14.根据权利要求7～13中任一项所述的污泥分解用微生物制剂，其进一步包含微生物(a2)，且相对于所述细菌(a1)及所述微生物(a2)的总数，所述细菌(a1)数为0.1％以上且小于100％，其中微生物(a2)是不同于细菌(a1)的微生物。
15.根据权利要求14所述的污泥分解用微生物制剂，其中所述微生物(a2)包含选自由以下组成的组中的至少1种：具有包含与序列编号7记载的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶微生物分解能力的细菌，具有靶微生物分解能力的芽孢杆菌属(Bacillus)细菌，及具有靶微生物分解能力的类芽孢杆菌属(Paenibacillus)细菌。
16.污泥分解用微生物制剂，其包含细菌(a1)的培养物，其中细菌(a1)具有包含与序列编号1记载的碱基序列具有90％以上同一性的碱基序列的16S rRNA基因，且具有靶微生物分解能力。
17.污泥分解方法，其包括使权利要求1～6中任一项所述的细菌或权利要求7～16中任一项所述的污泥分解用微生物制剂作用于污泥的工序。
18.使用权利要求1～6中任一项所述的细菌或权利要求7～16中任一项所述的污泥分解用微生物制剂的污泥分解装置。
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