CN108531422A - 一株类短短芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株类短短芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株类短短芽孢杆菌及其应用。采取的技术方案为：提供了一株类短短芽孢杆菌，在CGMCC的保藏编号：CGMCC No.14835。本发明提供的类短短芽孢杆菌，单独使用即可对含有废水进行极佳的降解，且针对四川省泸州市江阳区当地的含油废水，具有特异性作用。

Description

一株类短短芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株类短短芽孢杆菌及其应用。
背景技术
随着天然气勘探技术的发展越发成熟，天然气的开采变得简单。但是天然气不便运输，为了让天然气到每家每户，就得保证天然气的运输。天然气开采出来后，经过压缩机压缩成为液体之后，能够级大的降低运输难度和成本。
在天然气的压缩过程中，会产生大量采输水，采输水中含有的凝析油和增压机房的废机油混在一起排到废水池中。其中废机油的主要成分为水、灰尘、金属粉末、炭黑、色素、不饱和烃类、有机酸、盐、沥青胶态物质、沥青质、沥青酸、含氧化合物主要是酸、醇、醛、酮、酯、内酯、胶质噻吩类、氢化噻吩类、硫化物、二硫化物、硫醇：脂肪族胺及芳香胺，以及含吡啶环的化合物、芳烃、烯烃。凝析油是指从凝析气田的天然气中凝析出来的液相组分，又称天然汽油，其主要成分是C5～C8烃类的混合物，并含有少量大于C8的烃类以及二氧化硫、噻吩类、硫醇类、硫醚类和多硫化物等杂质，馏分多在20℃～200℃，比重小于0.78，其重质烃类和非烃组分的含量比原油低，挥发性好。这类采输水成分复杂且含有许多的有毒有害物质，达不到国家排放标准，使用常规的化学方法处理，效果不理想且容易造成二次污染。
目前，已有多篇报道公开，一些芽孢杆菌具有降解含油废水的能力，如申请号为：201410354185.6的专利，再如题目为“短短芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌降解原油烃机制研究”的文献等。但这些菌普遍存在诸多局限，如：需要多种菌同时作用才能达到较好的降解效果；针对地域性、特异性含油废水，处理效果弱等。
四川泸州市江阳区存在诸多油井站废水池，每年产生大量含油废水，无法实现有效处理后达标排放，为当地居民生活带来极大的不便与健康威胁。
因此，针对当地提供一种特异性的、处理效果优良的含油废水处理菌剂，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株类短短芽孢杆菌及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株类短短芽孢杆菌，菌种名称：类短短芽孢杆菌，Brevibacillus parabrevis，于2017年10月25日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.14835。
相应的，一株类短短芽孢杆菌，其16SrDNA测序结果如SEQ ID NO 1所示。
相应的，所述的类短短芽孢杆菌在处理含油废水中的应用。
优选的，所述的类短短芽孢杆菌在处理含油废水中的应用，具体步骤为：
(1)将所述类短短芽孢杆菌扩大培养至菌液浓度为107～108CFU/mL，得接种菌液；
(2)将所述接种菌液摇匀，与麸皮按1:1的比例混匀，30℃下晾干，得菌剂；
(3)将稻草、待处理的含废油废水按质量为1:1混合，再按接种量为8％接种所述菌剂，加水调节水分至65％，待堆体温度升至40℃后，进行曝气，至温度降至与外界温度一致为止；反应20天后，废水处理完成。
优选的，步骤(3)所述曝气，具体为：曝气速率为90L/min，曝气时间2h/天。
优选的，所述含油废水为天然气采输水。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种特异性处理四川泸州市江阳区含油废水的菌种，不用与其它菌联合，单独使用即可达到极佳的处理效果。
2、本发明还提供了所述菌种制备成菌剂的制备方法和使用方法，成本低廉、方法简便、效果显著。
具体实施方式
1、培养基的准备：
(1)浮油选择性培养基：称取硝酸铵3g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，无机盐溶液2mL，废机油10mL，琼脂18g，补水至1000ml，调节pH至7.0，在120～122℃下高温灭菌25～30min。
(2)活化培养基：称取硝酸铵3g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，无机盐溶液2mL，废机油10mL，琼脂18g，补水至1000ml，调节pH至7.0，在120～122℃下高温灭菌25～30min。
(3)发酵扩大培养基：称取硝酸铵3g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，无机盐溶液2mL，废机油10mL，琼脂18g，补水至1000ml，调节pH至7.0，在120～122℃下高温灭菌25～30min。
(4)液体培养基：蛋白胨10g，酵母膏2g，牛肉膏5g，氯化钠5g,补水至1000ml，pH7.0，在121℃下高温灭菌30min。
(5)含油液体培养基：硝酸铵3g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，无机盐溶液2mL，废机油10mL，琼脂18g，补水至1000ml，调节pH至7.0，在120～122℃下高温灭菌25～30min。
(6)无机盐溶液(质量分数)：MgSO4 0.4％,CuSO4 0.1％，MnSO4 0.1％，FeSO40.1％,CaCl2 0.1％。
2、类短短芽孢杆菌的筛选
(1)收集四川泸州市江阳区通滩镇金宝山村1社油井站废水池的浮油，富集培养2～3周，培养好的菌液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度梯度依次稀释，分别从各浓度的稀释液中吸取0.1ml菌液，于上述浮油选择性培养基平板均匀涂布，在30℃下恒温培养24h，镜检各菌落形态，挑取短杆状菌落，反复划线分离纯化，获得该菌菌株。
本发明全文使用的含油废水，均来自四川泸州市江阳区通滩镇金宝山村1社油井站废水池。经检测，其具体成分表如表1所示。
表1含油废水成分表
(2)菌株性状特征如下：
形态特征：该菌在浮油选择性分离培养基中的营养细胞为杆状，革兰氏阳性，长0.8～2.0μm，宽0.6～1μm；在30℃培养3～4天形成芽孢，芽孢大小0.6～0.8×1.2～1.5μm，为圆形或圆柱形。
培养性质：该菌置于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板培养：在35℃下培养24h可大量生长，菌落表面凸起，白色，表面不光滑有褶皱，菌落不透明，边缘呈规则圆形，菌落粘性小，随着培养时间的增加变为乳黄色。
分子生物学鉴定：提取该菌株全基因组DNA，PCR扩增16SrDNA片段进行测序，测序结果如SEQ ID NO 1所示。测序结果在NCBI中进行比对，比对结果显示该菌株为类短短芽孢杆菌。
本发明的类短短芽孢杆菌于2017年10月25日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14835。
3、类短短芽孢杆菌的扩大培养
(1)将上述类短短芽孢杆菌接种至活化培养基中，30℃恒温箱中活化培养48h，得活化菌种；将活化菌种接种到扩大发酵培养基，在30℃、120rmp条件下振荡培养48h，得接种菌液，经发酵扩大培养后得到的接种菌液浓度为107～108CFU/mL。
4、将类短短芽孢杆菌用于处理含油废水
(1)实验室观察
将上述扩大的接种菌液按照8％的接种量(即体积为10％含油液体培养基)接种到含油液体培养基中，初始浮油呈现黑色且均匀的分散在培养基表面，有明显的油水分层；接种2～3天后，浮油颜色发生变化，呈现出土黄色或黄白色，浮油变成小圆球状，分散于整个培养基中；接种约4～5天后，小圆球在分散成为更小的小颗粒，均匀地分布于培养基中；接种7天之后，油和水分辨不明显，整个培养基呈黄白色浑浊状液体。
(2)实际生产中的处理
1)将步骤3扩大培养得到的接种菌液摇匀，与麸皮按质量比1:1的比例混匀，30℃下晾干，用自封袋封装成1kg/袋的菌剂。
2)将稻草、待处理的含废油废水按质量为1:1混合，再按接种量为8％接种步骤1)制备的菌剂，混匀后，加水调节混合物水分至65％。将混合物装入微生物处理反应器中，待堆体温度升至40℃后，以90L/min的速率曝气，每天曝气2h，直至温度降至与外界温度一致为止。平均反应20天后，废水达到排放标准。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步解释说明。
实施例一：类短短芽孢杆菌最适接种量优选
使用上述步骤3扩大培养后的接种菌液，接种到5mL/管的液体培养基中，30℃，120rpm恒温摇床培养24h，将培养后的菌液摇匀后，分别接种5mL(接种量5％)、8mL(接种量8％)、10mL(接种量10％)菌液到100mL含油量为10％的含油液体培养基中，30℃，120rpm恒温摇床培养7d，每个接种量做3个平行和1个空白(加相同体积的水代替菌液)。
7d后取出摇瓶，分别将摇瓶内的液体转入500mL空三角瓶中，加入100mL石油醚(沸点为30～60℃)，超声30min，摇床震荡2h，分液漏斗分离，下层为水层，上层为含油的石油醚，用250mL烧杯收集上层液体，45℃挥发掉石油醚，称重。按以下公式计算降解率：
浮油降解率＝(m4-m3)/(m2-m1)×100％
其中，m1：空500mL三角瓶的质量；
m2：装入含油液体后500mL三角瓶的质量；
m3：空250mL烧杯的质量；
m4：挥发掉石油醚后的250mL烧杯的质量。
结果为：5％接种量的浮油降解率为63％，8％接种量的浮油降解率为67％，10％接种量的浮油降解率为66％。
菌液接种量在8％左右较为适宜，接种量增加时，降解率不再增加，甚至呈略下降趋势。接种量过大时，菌间可能因养分、生存空间等条件有限，从而降低生物活性。
实施例二：类短短芽孢杆菌特异性处理油井站废水的效果
(1)以上述步骤3制备的类短短芽孢杆菌扩大培养至1×107CFU/mL，摇匀后与麸皮1:1混匀，制成菌剂，作为处理组。
以短短芽孢杆菌(CGMCC No.2148)扩大培养至1×107CFU/mL，摇匀后与麸皮1:1混匀，制成菌剂，作为对照组。
(2)取四川泸州市江阳区通滩镇金宝山村1社油井站废水池的含油废水，经测定，废水中的含油量为63.56％。
将所述废水分为等量的两份，分别接种处理组和对照组菌剂。接种量均为8％。按上述步骤4的方法进行废水处理，分别于处理的第7、15、30天，取样检测废水的含油量，并计算降解率，结果如表2所示。
表2效果对比表
由上表可以看出，虽然都是有降解油污效果的芽孢杆菌，但针对江阳区本地的特异性含油废水，本发明的类短短芽孢杆菌菌剂处理效果尤佳，对照组的短短芽孢杆菌菌剂效果不理想。发明人在操作中，还试验了其它一些被证明具有一定处理油污效果的短短芽孢杆菌(因未进行微生物保藏，在此未列出实验数据)，但针对该特异性含油废水，处理效果均不理想。
这可能是因为，本发明的类短短芽孢杆菌在该环境下产生了特异性优选变化，尤其适用于当地油污废水处理。
实施例三：类短短芽孢杆菌处理江阳区含油废水效果
使用上述步骤4(将类短短芽孢杆菌用于处理含油废水)中在实际生产中的处理方法，对江阳区当地含油废水进行处理。具体参数及效果如表3所示。
表3处理效果表
效果 例1 例2 例3
废水初始含油量 65.76％ 57.53％ 55.48％
废水第7天含油量 25.01％ 21.03％ 19.80％
油污第7天降解率 61.97％ 63.45％ 64.31％
废水第15天含油量 12.13％ 11.01％ 9.07％
油污第15天降解率 81.55％ 80.86％ 83.65％
废水第30天含油量 4.23％ 3.59％ 2.25％
油污第30天降解率 93.57％ 93.76％ 95.94％
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
中煤科工集团重庆设计研究院有限公司
<120> 一株类短短芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1505
<212> DNA
<213> 类短短芽孢杆菌(Brevibacillus parabrevis)
<400> 1
agggggcgtg ctatacatgc aagtcgagcg agggttttcg gaccctagcg gcggacgggt 60
gagtaacacg taggcaacct gcctctcaga ccgggataac atagggaaac ttatgctaat 120
accggatagg tttttggatt gcatgatccg aaaagaaaag atggcttcgg ctatcactgg 180
gagatgggcc tgcggcgcat tagctagttg gtggggtaac ggcctaccaa ggcgacgatg 240
cgtagccgac ctgagagggt gaccggccac actgggactg agacacggcc cagactccta 300
cgggaggcag cagtagggaa ttttccacaa tggacgaaag tctgatggag caacgccgcg 360
tgaacgatga aggtcttcgg attgtaaagt tctgtgtagg gatttccacc aatggacgaa 420
gtctgatgag cacgccgcgg gacgatgagt ctcgatgtaa agtctgtgtc agggacgaca 480
cgtgccgttc gatagggcgt accttgacgg tacctgacga gaaagccacg gctaactacg 540
tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cgggatttat tgggcgtaaa 600
gcgcgcgcag gcggctatgt aagtctggtg ttaaagcccg gagctcaact ccggttcgca 660
tcggaaactg tgtagcttga gtgcagaaga ggaaagcggt attccacgtg tagcggtgaa 720
atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcggc tttctggtct gtaactgacg 780
ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa 840
acgatgagtg ctaggtgttg ggggtttcaa taccctcagt gccgcagcta acgcaataag 900
cactccgcct ggggagtacg ctcgcaagag tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 960
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 1020
catcccgctg accgctctgg agacagagct tcccttcggg gcagcggtga caggtggtgc 1080
atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1140
ttatctttag ttgccagcat tcagttgggc actctagaga gactgccgtc gacaagacgg 1200
aggaaggcgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1260
acaatggttg gtacaacggg atgctacctc gcgaggggac gccaatctct gaaaaccaat 1320
ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc tacatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg 1380
gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg 1440
ggagtttgca acacccgaag tcggtgaggt aaccgcaagg agccagccgc cgaagtgggt 1500
tgttt 1505

Claims (6)

1.一株类短短芽孢杆菌，其特征在于：菌种名称：类短短芽孢杆菌，Brevibacillusparabrevis，于2017年10月25日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.14835。
2.一株类短短芽孢杆菌，其特征在于：其16SrDNA测序结果如SEQ ID NO 1所示。
3.权利要求1或2所述的类短短芽孢杆菌在处理含油废水中的应用。
4.如权利要求3所述的类短短芽孢杆菌在处理含油废水中的应用，其特征在于：具体步骤为：
(1)将所述类短短芽孢杆菌扩大培养至菌液浓度为107～108CFU/mL，得接种菌液；
(2)将所述接种菌液摇匀，与麸皮按质量为1:1的比例混匀，30℃下晾干，得菌剂；
(3)将稻草、待处理的含油废水按质量为1:1混合，再按接种量为8％接种所述菌剂，加水调节水分至65％，待堆体温度升至40℃后，进行曝气，至温度降至与外界温度一致为止；反应20天后，废水处理完成。
5.如权利要求4所述的类短短芽孢杆菌在处理含油废水中的应用，其特征在于：步骤(3)所述曝气，具体为：曝气速率为90L/min，曝气时间2h/天。
6.如权利要求3所述类短短芽孢杆菌在处理含油废水中的应用，其特征在于：所述含油废水为天然气采输水。
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