CN110468082A - 一种阿氏芽孢杆菌ocb-6及其应用 - Google Patents

一种阿氏芽孢杆菌ocb-6及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)OCB‑6及其应用。该菌株已于2019年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019528。本发明所述的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)OCB‑6具有高效降解废弃油基钻井岩屑中总石油烃(Total petroleum hydrocarbons TPH)的能力，抗逆性较强，可作为废弃油基钻井岩屑污染物生物处理的优良菌株，应用前景好。

Description

一种阿氏芽孢杆菌OCB-6及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种阿氏芽孢杆菌OCB-6及其应用。
背景技术
近年来我国的页岩气开采快速增长，2015年重庆市涪陵页岩气田产量已达11亿m3，预计至2020年我国页岩气年产量将突破300亿m3。页岩气开发给社会带来巨大效益的同时，但也带来了比较严重的环境危害。页岩气开采必须使用具有稳定流变性能、水损性能和润滑特性的油基钻井液，因钻井液中添加有5％～10％石蜡基油(又称白油)被称为油基钻井液，故而废弃油基钻井岩屑(泥浆)中的污染物成分复杂，TPH含量较高，如若处理不当，极易造成对土壤、水体等环境的危害。
目前，废弃油基钻井岩屑中有机污染物的处理方法有破乳法、焚烧处理法、热解析法和循环回收利用法等，但存在成本较高，二次污染风险大等问题。自然界的微生物种类繁多，能将复杂有机物转化为简单有机物，达到无害化的效果，且投资运行费用低、耗能少、操作简便、无二次污染。因此，废弃钻井泥浆的微生物处理技术越来越受到关注，因而筛选获得能高效降解废弃油基钻井岩屑中有机污染物的菌株显得尤为必要。
发明内容
本发明针对现有废弃油基钻井岩屑中有机污染物无害化处理的技术难题，采取生物降解措施，筛选获得了一株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)OCB-6，以及其在降解废弃油基钻井岩屑中TPH的应用。
为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明从重庆市璧山区页岩气钻井平台采集废弃油基钻井岩屑样品，通过驯化、分离纯化得到细菌菌株OCB-6。该菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上培养48h，菌落为圆形，乳白色，直径为2～3mm，表面湿润。
提取所述的菌株OCB-6的总DNA，扩增16S rDNA片段，测得的16S rDNA序列如SEQID NO.1所示。将所测得的16S rDNA序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，OCB-6与GenBank中的模式菌株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)B8W22T的相似度最高(99.7％)，因而菌株OCB-6在分类上属于阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)。
基于以上特征，本发明对阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)OCB-6进行了保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2019年7月8日，保藏编号为CCTCC NO：M 2019528。
同时，本发明提供了所述的阿氏芽孢杆菌OCB-6在降解废弃油基钻井岩屑中有机污染物的应用，特别对废弃油基钻井岩屑中TPH的降解效果。
优选的，所述的阿氏芽孢杆菌OCB-6的菌悬液或其培养液或其发酵物对废弃油基钻井岩屑中有机污染物的降解应用也在本发明的保护范围内。
在本发明的另一方面，还提供了所述的阿氏芽孢杆菌OCB-6在修复废弃油基钻井岩屑污染环境介质中的应用，所述的介质为土壤或水。
另外本发明所述的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)OCB-6在制备降解废弃油基钻井岩屑有机污染物的生物制剂中的应用，所述的生物制剂包含阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)OCB-6或其菌悬液或其培养液或其发酵物。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)OCB-6，该菌株能有效降解废弃油基钻井岩屑中的TPH，纯培养条件下，接菌培养7d后，其对TPH的降解率达62.05％；野外条件下，接菌处理120d后，对废弃油基钻井岩屑中的TPH降解率达到91.45％，处理效果显著。同时，阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)OCB-6具有较强抗逆能力，可作为优良降解菌用于废弃油基钻井岩屑中有机污染物的生物处理，应用前景良好。
附图说明
图1是阿氏芽孢杆菌OCB-6在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落和菌体形态；
图2是阿氏芽孢杆菌OCB-6的16S rDNA序列的系统发育图。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1菌株OCB-6的分离、纯化和保存
从重庆璧山县页岩气钻井平台采集废弃油基钻井岩屑样品，低温保存带回实验室。
分别制备：
微量元素液：MgSO42g，MnSO45g，FeSO4·7H2O 5g，CaCl25g，ZnSO45g，蒸馏水1L。
MS培养基：NH4Cl 0.6g，K2HPO40.5g，KH2PO40.5g，微量元素液16mL，pH自然，水1000mL。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，pH自然，水1000mL。
取废弃油基钻井岩屑样品5.0g，加入到95mL MS培养基中，30℃、140r/min振荡培养7d；吸取1mL培养液，继续加入新鲜已灭菌的99mL含1％石蜡油的MS培养基，30℃、140r/min继续振荡培养7d，重复此操作3次。最后吸取1mL驯化培养液，采用梯度稀释法，于牛肉膏蛋白胨培养基上涂布，30℃恒温培养。待长出菌落后，从平板上挑选形态不同的菌落在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线培养。待培养16h，挑取单个菌落，结合显微镜染色观察，重复上述步骤，直至纯化为止。纯化菌株接入牛肉膏蛋白胨培养基试管斜面，培养36h，4℃保存。
如图1所示，本实施例的分离纯化得到的菌株OCB-6在牛肉膏蛋白胨培养基上培养48h，菌落为圆形，乳白色，直径2～3mm，表面湿润。
实施例2菌株OCB-6的鉴定
用LB培养液培养菌株OCB-6，对数生长期，离心收集待测菌株，提取菌株OCB-6的总DNA，以总DNA为模板，用27F和1492R为引物，扩增16S rDNA片段，PCR反应用Bio-RADMyCyclerTM仪器。
27F：AGAGTTGATC CTGGCTCAG；
1492R：CGGTTACCTT GTTACGACTT。
反应体系(50μl)：2×PCRMix25μl，引物27F和1492R(10μM)各1μl，DNA模板1μl，加超纯水补足至50μl；引物27F和1492R的核苷酸序列如SEQID No.2和SEQID No.3所示。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸8min。
PCR扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检测后，送到上海生工生物工程有限公司进行序列测定。用软件DNAMAN 8.0进行基因序列相似度的计算。所测序列结果如SEQIDNo.1。
将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库中进行比对，菌株OCB-6的16S rDNA序列与数据库中的模式菌株Bacillus aryabhattai B8W22T(阿氏芽孢杆菌B8W22)的相似度最高，为99.7％。根据NCBI比对结果，选择相似性最高的模式菌株作为参比菌株，用MEGA 6.0软件的邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树(图2)，自展值(bootstrap)1000。
基于以上特征，将菌株OCB-6鉴定为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)。该菌株于2019年7月8日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019528。
实施例3阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)OCB-6降解废弃油基钻井岩屑中TPH效果实验
将OCB-6接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基上活化培养，待活化培养的菌悬液OD600＝1.0时，取菌液1.5mL，4℃，3000rpm离心15min，弃上清，无菌生理盐水洗涤菌体2次，用1.5mL无菌水悬浮，接种到已灭菌的废弃油基钻井岩屑浓度为100g/L的MS培养基，以不接菌为对照，30℃，140rpm振荡培养7d，采用萃取-重量法测定培养液中的TPH含量。
TPH降解率(％)＝(W1-W2)×100/W1；其中W1为对照TPH残留量，W2为接菌处理TPH残留量。
测定结果表明，接种OCB-6菌株处理7d，TPH降解率达到62.05％。
实施例4阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)OCB-6的抗逆性实验
耐酸或碱能力测定：配制牛肉膏蛋白胨培养液，以10mol/LNaOH溶液和10mol/LHCl溶液调节培养液pH值为4，5，6，7，8，9和10，121℃灭菌30min后，按1％(v/v)接种菌悬液，重复3次；置于30℃、150r/min培养48h，测定OD600。
耐盐能力测定：配制牛肉膏蛋白胨培养液，调节pH为7；在此基础上，分别培养液的NaC1浓度为1％、2％、4％、6％、8％和10％，121℃灭菌，冷却后按1％(v/v)接种菌株，重复3次，30℃、150r/min培养48h，测定OD600值。
生长温度范围测定：配制牛肉膏蛋白胨培养液，调节pH为7，121℃灭菌，冷却后按1％(v/v)接种菌悬液，分别于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃条件下，150r/min培养48h，重复3次，测定OD600值。
测定结果表明，阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)OCB-6抗逆性优良，其生长初始pH＝5.0～10.0；其耐盐能力较强，能在含6％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中生长；生长温度范围较广，能在10～35℃温度范围内生长。
实施例5阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)OCB-6降解废弃油基钻井岩屑有机污染物实验
称取废弃油基钻井钻屑1.5kg，按1％(m/m)接种OCB-6菌剂(OD600＝1.6)，混合均匀；随后按废弃油基钻井钻屑:自然土＝1:2称取自然土3.0kg，充分拌匀。以不接菌为对照，重复3次。室温25℃处理120d(2016.11至2017.3月)，期间注意保持处理体系湿度25％左右。分别测定自然土本底、初始污染土和处理120d的接菌和不接菌处理样品的TPH含量。以W1代表初始样品的TPH含量，W2代表处理120d的未接菌样品或接菌样品。
废弃油基钻井岩屑TPH降解率(％)＝(W1-W2)×100/W1；
如表1所示，经过120d处理，OCB-6对废弃油基钻屑中的TPH的去除率达到了91.45％，对照仅为15.23％，二者差异显著，OCB-6表现出了良好的降解TPH潜力。
表1菌株OCB-6对废弃油基钻井岩屑处理效果
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种阿氏芽孢杆菌OCB-6及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1426
<212> DNA
<213> （Bacillus aryabhattai）
<400> 1
gcgggtgcta taatgcagtc gagcgagtcc cttcgggggc tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtaggc aacctgcctc tcagactggg ataacatagg gaaacttatg ctaataccgg 120
ataggttttt ggatcgcatg atctgaaaag aaaagatggc ttttcgctat cactgggaga 180
tgggcctgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaacggcc taccaaggcg acgatgcgta 240
gccgacctga gagggtgacc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatttt ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgaa 360
cgatgaaggt cttcggattg taaagttctg ttgtcaggga cgaacacgta ccgttcgaac 420
agggcggtac cttgacggta cctgacgaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 480
cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg 540
gctatgtaag tctggtgtta aagcccgggg ctcaaccccg gttcgcatcg gaaactgtgt 600
agcttgagtg cagaagagga aagcggtatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcggcttt ctggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa 720
gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780
ggtgttgggg gtttcaatac cctcagtgcc gcagctaacg caataagcac tccgcctggg 840
gagtacgctc gcaagagtga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cccgctgacc 960
gctctggaga cagagcttcc cttcggggca gcggtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tctttagttg 1080
ccagcattca gttgggcact ctagagagac tgccgtcgac aagacggagg aaggcgggga 1140
tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggttggta 1200
caacgggatg ctacctcgcg agaggacgcc aatctcttaa aaccaatctc agttcggatt 1260
gtaggctgca actcgcctac atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacggga gtttgcaaca 1380
cccgaagtcg gtgaggtaac cgcaaggagc cagccgccga aggtgg 1426
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(27F)
<400> 2
agagttgatc ctggctcag 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(1492R)
<400> 3
cggttacctt gttacgactt 20

Claims (7)

1.一种阿氏芽孢杆菌OCB-6，其特征在于，该菌株已于2019年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019528。
2.根据权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌OCB-6，其特征在于，所述的菌株为革兰氏阳性菌，产生芽孢；菌体杆状，有运动性，专性好氧。
3.根据权利要求1所述阿氏芽孢杆菌OCB-6，其特征在于，所述菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板培养48h，形成的菌落为圆形，乳白色，直径为2～3mm，表面湿润。
4.根据权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌OCB-6，其特征在于，所述的菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
5.权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌OCB-6在降解废弃油基钻井岩屑中TPH的应用。
6.权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌OCB-6菌剂、或其菌悬液、或其发酵液在降解废弃油基钻井岩屑中TPH的应用。
7.权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌OCB-6在制备降解废弃油基钻井岩屑中TPH的生物制剂中的应用。
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