CN109554303B - 一种金橙黄微小杆菌和制剂及其应用 - Google Patents

一种金橙黄微小杆菌和制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物生物技术和微生物采油技术领域，涉及一种金橙黄微小杆菌和制剂及其应用。该金橙黄微小杆菌的保藏编号为：CGMCC No.14606。本发明的金橙黄微小杆菌菌株，能以稠油为唯一的碳源和能源在好氧和厌氧条件下乳化降解原油；降解后的稠油中饱和烃如正构二十八烷的降解率达到了91.4％，芳香烃中如萘的降解率达到了41.9％。该菌株及其降解性质可以用于降解环境中原油污染，也可以用于微生物采油，提高采油率。

Description

一种金橙黄微小杆菌和制剂及其应用
技术领域
本发明属于微生物生物技术和微生物采油技术领域，更具体地，涉及一种金橙黄微小杆菌和制剂及其应用。
背景技术
石油资源是一种不可再生资源，是工业社会的重要能源，在经济，社会和生活的发展中占有十分基础性的地位。提高原油采收率在石油工业开采的整个过程中，占有举足轻重的地位。
微生物采油技术(MEOR)是生物技术与生物工程开拓性的应用于油田开发的一项创新性技术，是在国内外的研究和应用都发展十分迅速的一项提高采收率的技术，也是21世纪非常有应用前景的一项高新性生物技术。微生物提高石油采收率技术是利用微生物在地层中的繁殖活动及其代谢产物与原油或油藏的相互作用，达到提高石油采收率的目的，到目前已经有多年的历史，在国内外都有较为广泛的应用。目前普遍认为微生物提高原油采收率主要表现在两个方面，一方面是微生物菌体生长代谢的作用，另一方面是微生物菌体所产生的代谢产物的作用。在油、水、气和岩石共存的复杂油藏环境中，这两个方面共同作用促进油藏内部残余油的采出。作为一项新的三次采油技术，微生物采油与其他现存的三次采油技术相比具有成本低，适应性强，对产油层低伤害和无环境污染，采油有效期长，投入产出比低等优势，必将成为老油田开发的一项具有重要地位的技术。
微生物提高稠油采收率是针对原油粘度高的特点，特异性的激活油藏中的解烃菌，降解原油中的重质组分(长链烷烃﹑芳香烃或胶质等)，从而降低稠油粘度，提高稠油的流动性。作为解烃菌主要碳源的原油，其组分十分复杂，按类型可以分为饱和烃、芳香烃、胶质和沥青质等组分，其中饱和烃尤其是短链饱和烃和小分子芳香烃被认为是最易被解烃菌利用的组分，而长链饱和烃和芳香烃组分是造成原油高粘度的重要因素之一。因此，稠油解烃菌(优先降解长链饱和烃和多环芳烃组分)的筛选是微生物提高稠油采收率中的最关键步骤。目前，国内外已经有关于微生物偏向利用长链饱和烃的报道，更有研究指向微生物可以利用多环芳烃，甚至是胶质组分，这为微生物降解原油中重质组分以降低原油粘度，从而提高原油尤其是稠油在地层中的流动性提供理论依据。因此，原油重质组分的专一降解对于稠油降粘更具有最直接、最本质的意义。
CN103045502A公开一种低温用的解烃菌的用途，使用的温度为4-34℃，最适为15-25℃。可以烷烃或原油为唯一碳源生长。可降解C12-C36的正构烷烃和原油。对加入的1g/L的烷烃或5g/L的原油，降解率均可达70％以上。在25℃，振荡培养7d，以5g/L柴油作为唯一碳源降解率为85％，以5g/L原油作为唯一碳源，对稀油作用7d后降解率97.05％，对稠油降解率61.08％，因此具有很好的海洋生物修复的应用前景。然而，该菌株不能用于34℃以上高温的情况。
因此，需要开发一种可在更高温度下，专一降解稠油中长链烷烃和芳香烃的菌株。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种可专一降解稠油中长链烷烃和芳香烃的菌株。
本发明的第一方面提供一种金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)，该金橙黄微小杆菌的保藏编号为：CGMCC No.14606。该菌种的保藏信息如下：保藏日期：2017年9月12日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；分类命名：金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)。本发明中亦命名其为Q23菌株，其是从江苏油田油水样采出水中分离、并以粘度为1146mPa·s普通稠油为唯一碳源的情况下在40℃反复驯化培养而获得。本发明的金橙黄微小杆菌在LB平板上培养一天的菌落特征：直径大小2～4mm，菌落呈圆形、表面扁平、光滑、边缘整齐、不透明、橙色。
本发明的金橙黄微小杆菌的细胞形态特征：革兰氏染色阳性，菌体呈不规则的杆状，周生鞭毛，能运动，兼性厌氧生长，细胞大小1.0～3.2μm(长)×0.4～0.6μm(宽)，大多数菌体呈单个或成对，有的排列成直角或V字形。
本发明的金橙黄微小杆菌的生理生化特征：菌落不透明，有光泽，橙色，较小，光滑，边缘规整，微凸起。不生孢，耐热，生长温度5～55℃，最适35～45℃，不抗酸，可在碱性条件下生长，生长pH范围5.0-12，兼性厌氧。NaCl耐受性0～10％。接触酶实验，运动性实验，革兰氏染色，V-P实验，氧化酶抗性实验，明胶﹑淀粉和酪素水解，硝酸盐还原到亚硝酸盐实验均为阳性，自养生长，葡萄糖产气实验，苯丙氨酸脱氢酶实验，NaCl和KCl需求实验，尿囊素和尿素盐需求实验，溶菌酶抗性实验，H2S产气实验皆为阴性，能够利用葡萄糖，蔗糖，阿拉伯糖，甘露醇产酸，不能利用木糖产酸，能利用柠檬酸盐和丙酸盐。降解长链烷烃和多环芳烃等大分子原油组分，产生生物乳化剂。
表1为本发明的金橙黄微小杆菌Q23菌株的部分生理生化实验结果。
表1
Figure BDA0001421077480000031
Figure BDA0001421077480000041
注：+大于等于90％为阳性；－小于等于90％为阴性；+W弱反应；ND未测定。
本发明的金橙黄微小杆菌的16S rDNA基因序列长度为1603bp，序列如SEQ ID NO：1所示，在GenBank中的登录号为KU933354，与(Exiguobacterium aurantiacum)的16S rDNA(登录号为HM030747.1)序列相似性为99％。
参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rDNA基因序列在GenBank中的搜索结果，经多项分类鉴定Q23属于金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)。
本发明的金橙黄微小杆菌可以在营养培养基，如：普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长，也可以在添加碳源如葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基中生长，也可以以原油和多环芳烃为碳源生长。菌株在5～55℃之间可以好氧生长，也可以厌氧生长。Q23菌株在半固体穿刺培养基中靠近底部能生长，但较表层生长慢，表明其具有兼性厌氧生长的特性，可以在低氧或无氧的环境中生长，具备环境修复和微生物采油的潜在应用价值。
本发明的第二方面提供一种金橙黄微小杆菌制剂，该金橙黄微小杆菌制剂的活性组分为上述的金橙黄微小杆菌。
本发明的所述金橙黄微小杆菌制剂可以为固体制剂或液体制剂。由本发明的金橙黄微小杆菌制备所述微小杆菌制剂的过程可以参照所属领域的常规操作进行。
本发明的第三方面提供上述金橙黄微小杆菌和/或金橙黄微小杆菌制剂在发酵培养生产用于乳化油品的乳化剂中的应用。
具体方法包括将上述金橙黄微小杆菌和/或金橙黄微小杆菌制剂在营养培养基中发酵培养，所得发酵液直接作为乳化剂，或从发酵液中分离提取含有表面活性剂的组分作为乳化剂。
其中，所述营养培养基优选为普通肉汤培养基、LB培养基、营养琼脂培养基或包括碳源的无机盐培养基；优选地，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、原油、正构烷烃和芳香烃中的至少一种。
本发明的第四方面提供上述金橙黄微小杆菌和/或金橙黄微小杆菌制剂在降解稠油、正构烷烃和芳香烃中至少一种中的应用。
具体方法包括将上述金橙黄微小杆菌和/或金橙黄微小杆菌制剂与待降解的稠油、正构烷烃和芳香烃中的至少一种混合，使金橙黄微小杆菌在混合体系中培养生长，从而降解所述稠油、正构烷烃和芳香烃中的至少一种。
优选地，该方法还包括：向混合体系中加入培养基以促进金橙黄微小杆菌的生长，从而促进稠油、正构烷烃或芳香烃的降解，所述培养基为普通肉汤培养基、LB培养基、营养琼脂培养基或无机盐培养基。
本发明中，所述正构烷烃优选为长链烷烃，包括但不限于：正十六烷、正二十烷、正二十四烷、正二十八烷；所述芳香烃优选为多环芳烃，包括但不限于：萘、菲、蒽、芘。
由于该应用是用于降解稠油、正构烷烃和多环芳烃中的至少一种，采用的无机盐培养基可不包括碳源，本发明的金橙黄微小杆菌能以待降解的稠油、正构烷烃或多环芳烃为碳源生长繁殖，即，所述无机盐培养基的组成可以为：K2HPO4 0.5～1g/L、KH2PO4 0.5～1g/L、NaNO3 3～5g/L、MgSO4 0.4～0.6g/L、(NH4)2SO4 0.5～1g/L、FeSO4 0.03～0.05g/L、酵母粉0.05～0.2g/L，pH 6.8～7.2；可以理解，采用的无机盐培养基也可酌情包括少量的碳源，例如葡萄糖、蔗糖类碳源。具体的降解过程优选在35～45℃最适温度条件下进行，以利于金橙黄微小杆菌的生长繁殖。
本发明的第五方面提供上述金橙黄微小杆菌和/或金橙黄微小杆菌制剂在驱油中的应用。
具体方法包括将上述金橙黄微小杆菌和/或金橙黄微小杆菌制剂在营养培养基中发酵培养，所得发酵液用于驱油以提高原油采收率；或者，将所得发酵液与含有铜绿假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的菌液复配后用于驱油；
优选地，所述营养培养基为普通肉汤培养基、LB培养基、营养琼脂培养基或包括碳源的无机盐培养基；所述碳源优选包括葡萄糖、蔗糖、原油、正构烷烃和芳香烃中的至少一种。
根据本发明，所述铜绿假单胞菌可为施氏假单胞菌A18(Pseudomonas stutzeri，ATCC17588)。
根据本发明，对于葡萄糖、蔗糖等糖类碳源，其在培养基中的含量通常为5～20g/L，而当本发明的培养基中采用稠油、正构烷烃或芳香烃(例如长链烷烃正十六烷、正二十烷、正二十四烷、正二十八烷；多环芳烃中的萘、菲、蒽、芘等中的一种或多种)作为菌种生长碳源时，稠油在发酵培养基中的含量优选为0.5～10g/L，正构烷烃在发酵培养基中的含量优选为200～2000mg/L，芳香烃在发酵培养基中的含量优选为100～1000mg/L。优选地，无机盐培养基中除碳源为的其他成分可以为：K2HPO4 0.5～1g/L、KH2PO4 0.5～1g/L、NaNO3 3～5g/L、MgSO4 0.4～0.6g/L、(NH4)2SO4 0.5～1g/L、FeSO4 0.03～0.05g/L、酵母粉0.05～0.2g/L，pH 6.8～7.2。具体的培养条件通常是在35～45℃，100～200rpm摇床培养3～14天。
本发明的金橙黄微小杆菌具有很高的降解石油及芳香烃的能力。用菌株Q23生长细胞进行降解实验结果表明，该菌在40℃温度条件下，通过基础培养基生长繁殖过程能同时降解加入的10g/L的稠油或5g/L的长链烷烃或5g/L的芳香烃，其基础培养基组成为g/L：K2HPO4 1，KH2PO4 1，NaNO3 5，MgSO4 0.2，(NH4)2SO4 2，FeSO4 0.03，酵母粉0.2，pH 6.8～7.2。旋转摇床150rpm转速培养14d，一种在40℃下粘度为1146mPa·s的稠油降解率均可达61.7％，一种在40℃下粘度为2154.2mPa·s的原油降解率均可达43.4％。傅立叶红外傅立叶红外光谱测定(IR)分析结果表明：微生物作用后的原油在3000～3200cm-1之间的吸收峰明显增加，说明稠油中羟基含量增加，稠油的氧化程度增加。在500～2000cm-1之间出现了很多新的吸收峰，而且原来和新出现的吸收峰都明显增加，这些是碳碳单键，碳碳双键等官能团的吸收峰。表明微生物降解稠油后产生了许多新的官能基团。该菌作用50％在40℃下粘度为1146mPa·s的稠油，能降低原油粘度68.5％，作用50％在40℃下粘度为2154.2mPa·s的原油，能降低原油粘度52.3％。
本发明的金橙黄微小杆菌在其生长繁殖过程中能够产生生物表面活性剂乳化稠油，特别是能够以稠油为唯一碳源生产乳化剂并降解稠油中的长链烷烃和多环芳烃。在本发明的一项研究实验中，将该菌在40℃温度条件下，通过无机盐培养基生长繁殖过程能分别降解加入的500mg/L的正十六烷﹑正二十烷﹑正二十四烷﹑正二十八烷的混合物。其基础培养基组成为g/L：K2HPO4 1，KH2PO4 1，NaNO3 5，MgSO4 0.2，(NH4)2SO4 2，FeSO4 0.03，酵母粉0.2，pH 6.8～7.2。旋转摇床120rpm转速培养14天，金橙黄微小杆菌Q23在7天时正十六烷的降解率大约为84.3％，Q23在7天时正二十烷降解率达到92.4％。Q23在7天时对正二十四烷的降解率达到98.5％。Q23在7天时对正二十八烷的降解率达到是97.6％。以上结果说明，Q23能够降解长链的正构烷烃。在本发明的另一项研究实验中，将该菌在40℃温度条件下，通过无机盐培养基生长繁殖过程能分别降解加入的500mg/L的萘、菲、蒽、芘的混合物。其基础培养基组成为g/L：K2HPO4 1，KH2PO4 1，NaNO3 5，MgSO4 0.2，(NH4)2SO4 2，FeSO4 0.03，酵母粉0.2，pH 6.8～7.2。旋转摇床120rpm转速培养14天，金橙黄微小杆菌Q23在7天时萘的降解率大约为100％，Q23在7天时菲降解率达到100％。Q23在7天时对蒽的降解率达到75.4％。Q23在7天时对芘的降解率达到是43.8％。以上结果说明，Q23能够降解不同系列的多环芳烃。
本发明的另一研究实验表明，金橙黄微小杆菌能够在5％的粘度为1146mPa·s稠油中生长繁殖，降解7天后的原油脱水，气相-质谱对降解后的正构烷烃和芳香烃分析后得出，该菌株能够降解稠油中正构烷烃系列(正十六烷在正构烷烃的相对含量从5.48％到5.23％，正二十烷在正构烷烃的相对含量从5.99％到4.13％，正二十四烷在正构烷烃的相对含量从2.59％到0.43％，正二十八烷在正构烷烃的相对含量从2.69％到0.23％)。说明该菌种能够降解石油中的正构烷烃，而且长链的正构烷烃降解速率明显快于短链的正构烷烃。该菌株能够降解稠油中的萘系列(芳香烃中相对含量从4.82％到2.8％)，菲系列(芳香烃中相对含量从4.36％到2.52％)，噻吩系列(芳香烃中相对含量从1.98％到0.55％)，芴系列(芳香烃中相对含量从1.93％到0.78％)，屈系列(芳香烃中相对含量从6.51％到3.67％)，C21-三芳甾烷(芳香烃中相对含量从3.66％到1.96％)，芘系列(芳香烃中相对含量从1.52％到0.88％)和苯并芘(芳香烃中相对含量从1.33％到0.66％)。说明该菌株能够高效降解稠油中存在的一些列芳香烃物质。
本发明的金橙黄微小杆菌可降解各种稠油，例如可以是直接开采出的稠油，也可以是废弃原油，例如可包括石油工业生产中形成的油田污水中的废弃油渣。所降解的长链烷烃可以包括石油中包含正构烷烃中的任一种或多种，也可以降解多环芳烃包括萘、菲、蒽、芘中的任一种或多种。
本发明的金橙黄微小杆菌进行物理模拟驱油实验，结果表明：该菌株与一株施氏假单胞菌A18(Pseudomonas stutzeri，ATCC17588)复配发酵液使均质岩心的驱油效率率提高14.1％，非均质岩心驱油效率提高15.2％。可见本发明的表面活性剂可有效提高原油采收率，在微生物采油、驱油过程中具有一定的应用潜力。
综合而言，本发明提供的菌能够在35～45℃最适温度条件下，以稠油、正构烷烃或多环芳烃为碳源和能源生长，对40℃下粘度为1146mPa·s的稠油的降解率可达61.7％；对40℃下粘度为2154.2mPa·s的原油降解率达到43.4％。该菌株及其发酵液在高温条件下能很好的乳化稠油，进而对正构烷烃和芳香烃进行降解，降低稠油的粘度，最高可降粘度68.5％，金橙黄微小杆菌和一株施氏假单胞菌A18发酵液等比例复配应用于物理模拟驱油实验，使均质岩心的驱油效率率提高14.1％，非均质岩心驱油效率提高15.2％。该菌株能够在含500mg/L正十六烷﹑正二十烷﹑正二十四烷﹑正二十八烷的正构烷烃混合物中生长，7天正十六烷的降解率大约为84.3％，正二十烷降解率达到92.4％。正二十四烷的降解率达到98.5％，正二十八烷的降解率达到是97.6％。该菌株也能够在含有500mg/L萘、菲、蒽、芘的芳香烃混合物中生长，7天时萘的降解率大约为100％，菲降解率达到100％。蒽的降解率达到75.4％。芘的降解率达到是43.8％。该菌株还能够降解稠油中的正构烷烃和芳香烃，在5％的稠油中生长繁殖，降解7天后的原油脱水，气相-质谱对降解后的芳香烃分析后得出，该菌株能够降解稠油中正构烷烃系列(正十六烷在正构烷烃的相对含量从5.48％到5.23％，正二十烷在正构烷烃的相对含量从5.99％到4.13％，正二十四烷在正构烷烃的相对含量从2.59％到0.43％，正二十八烷在正构烷烃的相对含量从2.69％到0.23％)。该菌株能也够降解稠油中的萘系列(芳香烃中相对含量从4.82％到2.8％)，菲系列(芳香烃中相对含量从4.36％到2.52％)，噻吩系列(芳香烃中相对含量从1.98％到0.55％)，芴系列(芳香烃中相对含量从1.93％到0.78％)，屈系列(芳香烃中相对含量从6.51％到3.67％)，C21-三芳甾烷(芳香烃中相对含量从3.66％到1.96％)，芘系列(芳香烃中相对含量从1.52％到0.88％)和苯并芘(芳香烃中相对含量从1.33％到0.66％)。说明该菌株能够降解石油污染环境中的正构烷烃和芳香烃。因此该菌株在油田开发和生物修复方面具有良好的应用前景。
本发明的金橙黄微小杆菌菌株，能以稠油为唯一的碳源和能源在好氧和厌氧条件下乳化降解原油；降解后的稠油中饱和烃如正构二十八烷的降解率达到了91.4％，芳香烃中如萘的降解率达到了41.9％。该菌株及其降解性质可以用于降解环境中原油污染，也可以用于微生物采油，提高采油率。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。
图1示出了利用乳化稳定分析仪分析的这四株菌的稠油乳状液的稳定系数分析结果。
图2为金橙黄微小杆菌Q23对正构十六烷和正构二十八烷为唯一碳源的降解率和生长曲线实验结果。
图3为金橙黄微小杆菌Q23对萘和芘为唯一碳源的降解率和生长曲线实验结果。
图4为金橙黄微小杆菌Q23对稠油中正构烷烃和芳香烃对的降解率实验结果。
图5为金橙黄微小杆菌Q23降解稠油的傅里叶红外光谱实验结果。
图6为金橙黄微小杆菌Q23降解稠油的四组分分析实验结果。
图7为金橙黄微小杆菌Q23乳化稠油的稳定性实验结果。
用于专利程序的微生物保藏：
保藏日期：2017年9月12日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.14606；
分类命名：金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的金橙黄微小杆菌Q23及特点和应用中所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。
实施例1：本发明提供的金橙黄微小杆菌Q23菌株的筛选和育种
取江苏油田采出水水样，振荡均匀后用移液管取10ml，无菌接种至100ml无机盐基础培养基中(培养基组成g/L：稠油5，K2HPO4 1，KH2PO4 1，NaNO3 5，MgSO4 0.2，(NH4)2SO4 2，FeSO4 0.03，酵母粉0.2，蒸馏水1000ml，pH7.2，121℃灭菌30min，40℃摇床往复振荡培养7天。将富集的摇瓶用无菌水进行稀释，稀释到10-5、10-6、10-7，涂布到无机盐培养基+稠油和LB平板上，40℃培养2d，挑选菌落形态和大小不同的菌株。观察生长出的菌落。挑取单菌落并用显微镜检验其纯度。将40℃下生长的各个菌落，接种至营养肉汤培养基中，培养至OD600为0.8左右，作为种子液以10％(v/v)比例接入100ml无机盐稠油培养基中，40℃摇床往复振荡培养7d。然后以此发酵液作为种子液，接种至新鲜的无机盐稠油培养基，反复该步骤3～4次。最终得到乳化稠油效果较好的菌株15株，其中有代表性的菌株为Q5﹑Q13﹑Q23﹑Q34，经16S rRNA基因鉴定，Q5属于棒杆菌，Q13属于芽孢杆属，Q23属于微小杆菌属，Q34属于假单胞菌属，乳化实验比较和对比，这四种菌均能够使原油乳化分散在体系中，但是金橙黄微小杆菌Q23具有突出的乳化原油稳定效果，图1显示了利用乳化稳定分析仪分析的这四株菌的稠油乳状液的稳定系数分析结果，其中，稳定系数越小，说明乳状液稳定性越强。
实施例2：本发明提供的金橙黄微小杆菌Q23菌株的形态特征和生理生化特征
参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》(Vol.Ⅷ)的实验方法进行，检测本发明的Q23菌落形态，革兰氏染色，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽孢，生长温度，生长pH范围，NaCl耐受性。V-P，氧化酶抗性实验，明胶﹑淀粉和酪素水解，硝酸盐还原到亚硝酸盐实验，自养生长实验，葡萄糖产气实验，苯丙氨酸脱氢酶实验，NaCl和KCl需求实验，尿囊素和尿素盐需求实验，溶菌酶抗性实验，H2S产气实验，葡萄糖，蔗糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇产酸实验，柠檬酸盐和丙酸盐需求等实验。
结果表明，菌落不透明，有光泽，橙色，较小，光滑，边缘规整，微凸起。革兰氏染色阳性，菌体呈细长，不规则的杆状，周生鞭毛，能运动，兼性厌氧生长，培养1天以上不产生芽孢，细胞大小1.0～3.2μm(长)×0.4～0.6μm(宽)，大多数菌体呈单个或成对，有的排列成直角或V字形。耐热，生长温度5～55℃，最适35～45℃，不抗酸，可在碱性条件下生长，生长pH范围5.0-12，NaCl耐受性0～10％。接触酶实验，运动性实验，革兰氏染色，V-P实验，氧化酶抗性实验，明胶﹑淀粉和酪素水解，硝酸盐还原到亚硝酸盐实验均为阳性，自养生长，葡萄糖产气实验，苯丙氨酸脱氢酶实验，NaCl和KCl需求实验，尿囊素和尿素盐需求实验，溶菌酶抗性实验，H2S产气实验皆为阴性，能够利用葡萄糖，蔗糖，阿拉伯糖，甘露醇产酸，不能利用木糖产酸，能利用柠檬酸盐和丙酸盐。
实施例3：本发明提供金橙黄微小杆菌Q23菌株的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定
将本发明的Q23菌株接种于LB培养基，40℃摇床培养(120rpm)24h，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用正相引物8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ ID NO：2)和反向引物1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’，SEQ ID NO：3)，用这对引物对其16SrDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送上海美集公司进行测序。PCR条件为：94℃，10min；94℃，45s，55℃，45s，72℃90s，30个循环；72℃10min，4℃保存。16SrDNA基因序列长度为1603bp(SEQ ID NO：1)，在GenBank中的登录号为KU933354，与(Exiguobacterium aurantiacum)的16SrDNA(登录号为HM030747.1)序列相似性为99％。鉴定本发明的Q23为金橙黄微小杆菌(Exiguobacterium aurantiacum)。
实施例4：本发明提供的金橙黄微小杆菌Q23菌株对两种稠油的降粘和降解实验
将菌株Q23在LB斜面上40℃划线培养，24h后用无菌水将菌体洗下，将菌浓为106cfu/mL的菌液作为种子液接入100mL以2％粘度为1146和2154.2mPa·s稠油分别为唯一碳源的无机盐培养基(K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，NaNO3 5g/L，MgSO4 0.2g/L，(NH4)2SO4 2g/L，FeSO4 0.03g/L，酵母粉0.2g/L，pH7.2)中，40℃振荡培养(120rpm)7d。培养结束后，利用平板计数法测定了发酵液的菌浓，结果表明发酵液中的Q23菌浓达到108cfu/mL；转移摇瓶内的所有原油和培养基到预先称重的250mL离心杯中，8000rpm离心10min，除去培养基和菌体。80℃温箱烘干到恒重，称重，计算离心杯的重量变化。培养体系中对粘度为1146mPa·s的稠油的代谢速率达到0.176g/d(表2)；对粘度为2154.2的稠油的代谢速率达到0.124g/d(表2)。此外，菌株Q23可以产生一定量的表面活性剂，使稠油发生乳化降粘。其对50％粘度为1146mPa·s的稠油合降粘率(降解降粘率+乳化降粘率)为68.5％(表2)，对50％粘度为2154.2的稠油综合降粘率(降解降粘率+乳化降粘率)为52.3％(表2)。
表2菌株Q23的降粘能力
Figure BDA0001421077480000141
实施例5：本发明提供的金橙黄微小杆菌Q23菌株在正构烷烃(正十六烷，正二十八烷)和芳香烃(萘，芘)中的生长和降解实验
将菌株Q23在LB斜面上40℃划线培养，24h后用无菌水将菌体洗下，将菌浓为106cfu/mL的菌液作为种子液分别接入100mL浓度为500mg/L的正十六烷、正二十八烷、萘和芘为唯一碳源的无机盐培养基(K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，NaNO3 5g/L，MgSO4 0.2g/L，(NH4)2SO4 2g/L，FeSO4 0.03g/L，酵母粉0.2g/L，pH7.2)中，40℃振荡培养(120rpm)14d。培养结束后，用分光光度计测量该菌在此体系中的OD600吸光度，用GC-FID测定多环芳烃的剩余量并计算降解率。Q23对正十六烷和正二十八烷的吸光度和降解率如图2所示，Q23对萘和芘的吸光度和降解率如图3所示。
实施例6：本发明提供的金橙黄微小杆菌Q23菌株在正构烷烃混合物和芳香烃混合物为碳源下的降解实验
将菌株Q23在LB斜面上35℃划线培养，24h后用无菌水将菌体洗下，将菌浓为106cfu/mL的菌液作为种子液分别接入100mL浓度为500mg/L的正构烷烃(正十六烷、正二十烷、正二十四烷、正二十八烷等比例混合)或芳香烃(萘、菲、蒽、芘等比例混合)为唯一碳源的无机盐培养基(K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，NaNO3 5g/L，MgSO4 0.2g/L，(NH4)2SO4 2g/L，FeSO40.03g/L，酵母粉0.2g/L，pH7.2)中，40℃振荡培养(120rpm)7d。培养结束后，用GC-FID测定混合正构烷烃和多环芳烃的含量并计算降解率，该实验做3个平行。降解率如表3所示。
表3金橙黄微小杆菌Q23对正构烷烃混合物和芳香烃混合物的降解率
Figure BDA0001421077480000151
实施例7：本发明提供的金橙黄微小杆菌Q23菌株对稠油中的正构烷烃和芳香烃降解后的气相-质谱分析
将菌株Q23在LB斜面上40℃划线培养，24h后用无菌水将菌体洗下，将菌浓为106cfu/mL的菌液作为种子液分别接入100mL含5％粘度为1146mPa·s的稠油的无机盐培养基(K2HPO4 1g/L，KH2PO4 1g/L，NaNO3 5g/L，MgSO4 0.2g/L，(NH4)2SO4 2g/L，FeSO4 0.03g/L，酵母粉0.2g/L，pH7.2)中，40℃振荡培养(120rpm)7d。培养后将原油离心去除培养基，电解脱水，将降解后的原油按照四组分分析分成饱和烃，芳香烃，胶质和沥青质，将饱和烃和芳香烃用气相-质谱分析其中的芳香烃组分并定量。其饱和烃和芳香烃的降解结果如图4所示。
实施例8：本发明提供的金橙黄微小杆菌Q23菌株发酵液对柴油的乳化
乳化指数的测定方法如下：取带刻度试管，加入柴油5ml，再加入5ml的Q23发酵液，剧烈振荡1分钟，室温静置24小时后测量，以乳化层的高度除以有机相的总高度，再乘100％，即EI24，如果EI24>50％，则认为该乳状液是稳定的。
金橙黄微小杆菌Q23菌株在以豆油为碳源的培养基(培养基组成g/L：豆油8，K2HPO41g/L，KH2PO4 1g/L，NaNO3 5g/L，MgSO4 0.2g/L，(NH4)2SO4 2g/L，FeSO4 0.03g/L，酵母粉0.2g/L，pH7.2，121℃灭菌30min)中生长，40℃振荡培养3天，用其发酵液对0号柴油进行乳化活性分析，分析结果表明，以豆油为碳源生长，本发明的菌株Q23发酵液能很好的乳化柴油，EI24为100％。而作为对照的以豆油为碳源的原始培养基，EI24仅为1％左右，基本看不到乳化层。
实施例9：本发明提供的金橙黄微小杆菌Q23菌株对稠油的降解的傅立叶红外实验
菌株Q23对粘度为1146mPa·s稠油具有很好的降解及降粘作用，将微生物作用前后的原油脱水，用溴化钾压片，采用美国的Nicolet-560E.S.P红外光谱仪扫描，扫描波长为4000～400cm-1。傅立叶红外光谱测定(IR)分析结果见图6，结果表明，微生物作用后的稠油在2800～3000cm-1之间的吸收峰明显增加，在700～1800cm-1之间出现了很多新的吸收峰，表明微生物降解稠油后产生了许多新的官能基团。
对菌株Q23对粘度为1146mPa·s的稠油降解前后的饱和烃、芳香烃、胶质、沥青质四组分含量进行分析，分析结果见图6，可以看出：微生物降解后原油的化学组分发生了一定程度的变化，饱和烃相对含量上升了5.8％，而芳香烃和胶质相对含量降低了7.4％。
实施例10：本发明提供的金橙黄微小杆菌Q23菌株需氧性实验
将Q23菌株进行半固体培养基穿刺培养，40℃恒温下放置24h后，观察其生长情况。结果表明，在半固体斜面中靠近顶部和底部生长都较为旺盛，表明其具有兼性厌氧生长的特性，可以在低氧乃至无氧的环境中生长，具备微生物采油的潜在应用价值。
实施例11：本发明提供金橙黄微小杆菌Q23菌株乳化稠油乳状液稳定性分析实验
利用全能近红外线稳定分析仪对摇瓶中微生物乳化后的油水体系(Q23菌株在以糖蜜为碳源的培养基中生长，40℃振荡发酵培养5天，用其发酵液对原油进行乳化)进行乳化分析。扫描程序为0～60min，每1分钟扫描一次，60～180分钟，每5分钟扫描一次。根据全能近红外线稳定分析仪扫描结果得到微生物乳化原油的稳定系数。Q23乳化原油的稳定性很强，静置48小时也不能完全使乳状液完全分层，根据全能近红外线稳定分析仪扫描结果(如图7所示)得到微生物乳化原油的稳定系数为1.04。说明Q23乳化原油后乳状液具有很强的稳定性。
实施例12：本发明提供金橙黄微小杆菌Q23菌株与施氏假单胞菌A18(ATCC17588)物理模拟驱油实验
利用胶结岩心模拟油藏条件，岩心分为均质岩心和三层非均质岩心，参数如下表4和表5，温度为40℃，压力为5MPa，驱替速度为1.0mL/min。
表4均质岩心的参数
孔隙度(％) 长*宽*高(cm<sup>3</sup>) 渗透率(10<sup>-3</sup>μm<sup>2</sup>)
23.7 30.0×4.5×4.5 500
表5非均质岩心参数
Figure BDA0001421077480000181
实验步骤：
①装填岩心，抽真空2h后饱和地层水；
②测定岩心孔隙度、渗透率；
③用粘度为50mPa·s的原油饱和岩心，出口设背压阀，加压至5MPa并全程保持，计算含油饱和度，老化岩心3d；
④一次水驱，注地层水至待产出液含水率达到现场含水率98％，
⑤注入0.4PV复配菌株(VQ23:VA18＝1:1)，空白岩心注入0.4PV地层水，40℃恒温下放置7d；
⑥二次水驱，注地层水至待产出液含水率达98％，计算驱油效率。
实验结果如表6所示。
表6微生物物理模拟驱油结果
项目 一次水驱采收率(％) 最终采收率(％) 提高采收率(％)
空白均质岩心 31.32 / /
A18均质岩心 30.15 37.21 7.06
Q23+A18均质岩心 32.15 53.31 21.16
空白非均质岩心 24.84 / /
A18非均质岩心 27.38 36.80 9.42
Q23+A18非均质岩心 25.09 49.71 24.62
上述物理模拟驱油结果表明，菌株Q23发酵液能大幅地提高原油采收率。在物理模拟驱油实验中，相比于单独使用施氏假单胞菌A18，本发明的复配菌株(Q23的无机盐发酵液与A18菌液按1：1复配)使均质岩心的稠油油藏原油的采收率继续提高14.1％，非均质岩心采收率继续提高15.2％。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 中国石油化工股份有限公司
中国石油化工股份有限公司石油勘探开发研究院
<120> 一种金橙黄微小杆菌和制剂及其应用
<130> 170031
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1603
<212> DNA
<213> Exiguobacterium aurantiacum
<400> 1
gcccttagag tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag 60
tcgagcgcag gaaatcgacg gaacccttcg gggggaagtc gacggaatga gcggcggacg 120
ggtgagtaac acgtaaagaa cctgccctca ggtctgggat aaccacgaga aatcggggct 180
aataccggat gggtcatcgg accgcatggt ccgaggatga aaggcgcttc ggcgtcgcct 240
ggggatggct ttgcggtgca ttagctagtt ggtggggtaa tggcccacca aggcgacgat 300
gcatagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct 360
acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc 420
gtgaacgatg aaggccttcg ggtcgtaaag ttctgttgta agggaagaac aagtgccgca 480
ggcaatggcg gcaccttgac ggtaccttgc gagaaagcca cggctaacta cgtgccagca 540
gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca 600
ggcggcctct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggc cattggaaac 660
tgggaggctt gagtatagga gagaagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag 720
agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctttggc ctataactga cgctgaggcg 780
cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag 840
tgctaggtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgaagc taacgcatta agcactccgc 900
ctggggagta cggtcgcaag gctgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg 960
tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaactctt gacatccccc 1020
tgaccggcac agagatgtgc cttccccttc gggggcaggg gtgacaggtg gtgcatggtt 1080
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtcc 1140
ttagttgcca ccattcagtt gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1200
gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgagttgg gctacacacg tgctacaatg 1260
gacggtacaa agggcagcga agccgcgagg tggagccaat cccagaaagc cgttctcagt 1320
tcggattgca ggctgcaact cgcctgcatg aagtcggaat cgctagtaat cgcaggtcag 1380
catactgcgg tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt 1440
tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt agggagccag ccgccgaagg tgggacagat 1500
gattggggtg aagtcgtaac aaggtagccg tatcggaagg tgcggctgga tcacctcctt 1560
aagggcgatc ccaatcacta gtgaattcgc ggccgcctgc agg 1603
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggaggtga tccagcc 17

Claims (12)

1.一株金橙黄微小杆菌（Exiguobacterium aurantiacum），其特征在于，该金橙黄微小杆菌的保藏编号为：CGMCC No.14606。
2.一种金橙黄微小杆菌制剂，其特征在于，该金橙黄微小杆菌制剂的活性组分为权利要求1所述的金橙黄微小杆菌。
3.权利要求1所述的金橙黄微小杆菌和/或权利要求2所述的金橙黄微小杆菌制剂在发酵培养生产用于乳化油品的乳化剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，将权利要求1所述的金橙黄微小杆菌和/或权利要求2所述的金橙黄微小杆菌制剂在营养培养基中发酵培养，所得发酵液直接作为乳化剂，或从发酵液中分离提取含有表面活性剂的组分作为乳化剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述营养培养基为普通肉汤培养基、LB培养基、营养琼脂培养基或包括碳源的无机盐培养基。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、原油、正构烷烃和芳香烃中的至少一种。
7.权利要求1所述的金橙黄微小杆菌和/或权利要求2所述的金橙黄微小杆菌制剂在降解稠油、正构烷烃和芳香烃中至少一种中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，将权利要求1所述的金橙黄微小杆菌和/或权利要求2所述的金橙黄微小杆菌制剂与待降解的稠油、正构烷烃和芳香烃中的至少一种混合，使金橙黄微小杆菌在混合体系中培养生长，从而降解所述稠油、正构烷烃和芳香烃中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，该应用还包括：向混合体系中加入培养基以促进金橙黄微小杆菌的生长，所述培养基为普通肉汤培养基、LB培养基、营养琼脂培养基或无机盐培养基。
10.权利要求1所述的金橙黄微小杆菌和/或权利要求2所述的金橙黄微小杆菌制剂在驱油中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其中，将权利要求1所述的金橙黄微小杆菌和/或权利要求2所述的金橙黄微小杆菌制剂在营养培养基中发酵培养，所得发酵液用于驱油以提高原油采收率；或者，将所得发酵液与含有施氏假单胞菌A18（Pseudomonas stutzeri，ATCC17588）的菌液复配后用于驱油。
12.根据权利要求11所述的应用，其中，所述营养培养基为普通肉汤培养基、LB培养基、营养琼脂培养基或包括碳源的无机盐培养基；所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、原油、正构烷烃和芳香烃中的至少一种。
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