CN109055261B

CN109055261B - 一株中高温可降解原油的枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN109055261B
Application number: CN201810900999.3A
Authority: CN
Inventors: 李霜; 王丹; 李壮壮; 戴杰
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2018-08-09
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2038-08-09
Also published as: CN109055261A

Abstract

本发明涉及一株中高温可降解原油的枯草芽孢杆菌及其应用，该菌株是从胜利油田被原油污染的土壤中分离纯化，通过以原油为唯一碳源筛选获得，该原油降解菌株经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BL‑27，保藏编号为CCTCC NO：M 2018402。BL‑27菌株能以石油烃为唯一碳源生长，在最适生长条件下在降解反应5天后对0.3%（V/V）的原油的去除率达到65%左右，原油降解率较高，反应速率较快，且具有耐中高温、耐碱、耐盐等优点，对表面活性剂的耐受性高，在微生物采油、生物修复、洗油工艺及原油污染水处理工艺中具有很大的应用前景。

Description

一株中高温可降解原油的枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株中高温可降解原油的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BL-27及其应用。

技术背景

原油作为重要的能源和诸多工业产业的原料，随着经济发展及日常生活中对原油产品的需要增加，且仍然没有找到合适的替代品，故可能导致其稀缺性，从而增加其成本。但在海洋和陆地各类原油工业活动、城市化原油及其衍生产品的利用、污水的排放以及意外泄漏等过程均不可避免地导致原油污染。而这种污染对地球上所有的生命形式都造成了直接或间接的健康风险。由此，提高原油采收率和原油污染的修复技术便成了石油工业的两大热点问题。

近年来，生物技术已逐渐应用于能源领域和环境领域，微生物采油技术和生物修复技术就是其中之一。微生物提高原油采收率技术及生物修复技术相较于传统的物理化学技术，都具有经济高效，环境友好，可持续发展等特点，在应用过程中有显著的优势。而其技术的关键是掌握微生物本身及其代谢产物对原油的作用机制。但由于原油的组成复杂，生物可利用性有限，而微生物对原油的作用能力也存在很大的差异，故在研究的过程中，很有必要先一步筛选出高效的原油降解菌，为实现微生物提高原油采收率技术及生物修复技术等应用提供夯实的基础。

发明内容

本发明目的在于提供一株中高温可降解原油的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BL-27及其应用。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种可降解原油的枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BL-27，已于2018年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M 2018402。

本发明的枯草芽孢杆菌BL-27是从胜利油田被原油污染土壤中分离纯化得到的。参考《常见细菌系统鉴定手册》，根据BL-27菌株的形态特征和生理生化特征，以及根据分析其16S rDNA基因序列并在NCBI数据库GenBank进行Blast比对的结果，与Bacillus subtilis菌株的最高同源性100％，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。

本发明所述的枯草芽孢杆菌BL-27菌株具有以下特征：

（1）菌落形态特征：该菌株在LB平板培养基上37℃培养12h即形成白色不透明圆形菌落，边缘不规则，直径1-3mm，为革兰氏阳性菌，菌体形态为较粗的短杆状，菌体长度约1.7µm。

（2）本发明的枯草芽孢杆菌BL-27生理生化特征：兼性厌氧，生长温度25-50℃，最佳生长温度45℃；生长pH范围在4.0-10.0，最佳生长pH为7.0-8.0；耐受盐度为0-90g/L，最适生长盐度为10g/L。

本发明的另一目的在于提供上述枯草芽孢杆菌BL-27在油污染生物降解中的应用。本发明中提供了一种具体应用方式，包括如下步骤：

（1）将枯草芽孢杆菌BL-27于平板活化菌种，之后接一环生长良好的单菌落于LB培养基中培养；

（2）将步骤（1）获取的培养液转接入含石油烃的无机盐培养基中培养，进行油污染生物降解。

本发明的枯草芽孢杆菌BL-27在最适生长温度45℃，最佳pH7.0，最适生长盐度10g/L的情况下，150rpm培养5d得到对0.3%（V/V）原油的最高降解率达到65%。

本发明的枯草芽孢杆菌BL-27对多种表面活性剂：SDS、Tween 80、Triton-X 100、Rhamnolipids、Surfactin表现出很好的耐受性；菌株BL-27在化学表面活性剂（SDS、Tween80）存在的情况下，对底物原油的利用具有明显的促进作用，在SDS浓度为50mg/L时，降解率可提高14%，5d原油降解率可达79%，吐温80浓度为500mg/L时，5d原油降解率可达78%，而添加生物表面活性剂（Rhamnolipids，Surfactin）无显著影响。

本发明的枯草芽孢杆菌BL-27在以6种不同品质的原油为唯一碳源的条件下均表现出一定的降解能力，其降解效率为：扬子>长庆>X476>沾3>新春>K126。

本发明的枯草芽孢杆菌BL-27能够利用石油烃为唯一碳源进行生长代谢，具有耐中高温、耐碱、耐盐、耐表面活性剂、底物种类丰富、原油降解率效率较高、速率较快等有利于采油工业和环境生物修复等领域的显著应用价值，可应用于微生物采油、洗油工艺、含油污水生物降解以及油污土壤的生物修复工艺。

附图说明

图1是菌株BL-27以不同正构烷烃和柴油培养96h时的菌浓度；

图2是菌株BL-27在不同温度下的生长柱状图；

图3是菌株BL-27在不同pH下的生长柱状图；

图4是菌株BL-27在不同盐度下的生长柱状图；

图5是菌株BL-27在不同表面活性剂不同浓度下的生长情况；

图6是菌株BL-27在不同浓度表面活性剂下对原油的降解率；

图7是菌株BL-27对不同油品的5d降解率；

本发明所述的生物材料，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BL-27，已于2018年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2018402。保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围及保护范围的限定。

实施例1

本实施例说明本发明的枯草芽孢杆菌BL-27的分离纯化、筛选及鉴定方法。

该枯草芽孢杆菌BL-27是从胜利油田被原油污染的普通土壤中分离纯化、筛选得到的。具体步骤如下：

（一）菌株的分离纯化：

取2-3g土壤（采自胜利油田油污土样）添加到装有50mL原油无机盐培养基（其成分组成为：NH₄NO₃ 3g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄ 0.1g/L、FeSO₄0.01g/L、CaCl₂0.01g/L、原油（源自中石化引进的沙特原油）0.3%（V/V）；pH值为7.0-7.2）的250mL三角瓶中，在37℃，150rpm的条件下摇床振荡培养96h。在超净工作台中用移液枪取初步培养液1mL于装有50mL原油无机盐培养基的250mL三角瓶中传代培养96h，以2%的接种量进行转接培养；按上述方法连续富集培养3代，取最后一次培养液于无菌蒸馏水中稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8。分别取10^-5、10^-6、10^-7和10^-8稀释度稀释液100μL使用无菌涂布棒均匀涂布到固体LB培养基（其成分组成为：NaCl 10g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、琼脂粉2wt%；pH值为7.0-7.2）平板上，平放静置10min后，倒置于37℃恒温培养箱培养，待平板上形成高度分散的单菌落，根据菌落外观形态挑取单菌落至LB斜面培养基上，将斜面置于培养箱中在37℃下培养至形成菌苔；将斜面置于4℃冰箱中保藏；所得到的斜面菌种经染色镜检为纯菌后进行下一步筛选。

（二）菌株的筛选：按照原油无机盐培养基（其成分组成为：NH₄NO₃ 3g/L、KH₂PO₄1.5g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄ 0.1g/L、FeSO₄ 0.01g/L、CaCl₂0.01g/L、原油（源自中石化引进的沙特原油）0.3%（V/V）；pH值为7.0-7.2）配方配制培养基，其中以原油为唯一碳源。将经过原油富集培养所分离获得的单个菌株分别接种到原油培养基中，通过观察菌株在原油培养基中的生长情况以及对原油的乳化情况来进一步筛选菌株。

实验步骤如下；

（1）将配制好的培养基分装入250mL的三角瓶中，每个三角瓶中装液量为50mL；将分装完毕的三角瓶用八层纱布和牛皮纸封口，将其置于高温高压灭菌锅中灭菌，控制灭菌条件为121℃、20min；

（2）待灭菌后将三角瓶取出在烘箱中60℃烘干纱布及牛皮纸后，置于超净台中冷却降温，后取分离纯化后的单菌落接种，每个样品做3组平行；然后将接种后的培养基放置在恒温摇床中培养，培养条件控制为45℃、150rpm；

（3）将原油乳化情况良好的菌液作为种子液接种到新鲜原油无机盐培养基中进行转接富集，根据菌株在原油培养基中的生长状况，选取生物量较大以及对原油乳化效果较好的菌株。

（4）将最后一次富集培养液于无菌蒸馏水中稀释10^-1、 10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8。分别取10^-5、10^-6、10^-7和10^-8稀释度稀释液100μL使用无菌涂布棒均匀涂布到固体LB平板培养基上，平放静置10min，后倒置于45℃恒温培养箱培养，待平板上形成高度分散的单菌落，将其置于4℃冰箱中保藏。

（三）菌株的鉴定：

（1）菌落形态特征：该菌株编号BL-27，在LB平板培养基上37℃培养12h即形成白色不透明圆形菌落，边缘不规则，直径1-3mm；菌株BL-27为革兰氏阳性菌，菌体形态为较粗的短杆状，直径约1.7µm，兼性厌氧。

（2）将上述优选出的BL-27菌株的单菌落用LB培养基活化后利用DNA快速提取试剂盒提取菌株的总DNA，采用细菌16S rDNA序列的通用引物：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

1492R：5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'

对BL-27菌株的16S rDNA序列进行 PCR 扩增，将纯化后的DNA片段送金唯智生物公司测序，得到的16S rDNA基因全长为1462bp，全序列如SEQ ID NO：1所示。

将BL-27菌株的16S rDNA序列提交到NCBI数据库GenBank进行Blast比对发现：BL-27菌株与Bacillus subtilis菌株的最高同源性99％，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。本发明已将该菌株于2018年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2018402。

实施例2

本实施例说明本发明中的枯草芽孢杆菌BL-27可以烃类为唯一碳源进行生长利用。

种子培养基（LB培养基）：蛋白胨10 g/L，酵母粉 5 g/L， NaCl 10g/L；

无机盐培养基：NH₄NO₃ 3g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄0.1g/L、FeSO₄ 0.01g/L、CaCl₂0.01g/L、分别以C₇H₁₆-C₂₅H₅₂（源自阿拉丁试剂公司）、柴油（源自中石化某加油站）0.3%（V/V）为唯一碳源；pH值为7.0。

将本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27首先于45℃平板活化菌种，12h后接一环生长良好的单菌落于50mL LB培养基/250mL三角瓶中，45℃，200rpm培养12h，然后按照6%(V/V)接种量转接入装液量为100mL无机盐培养基/250mL三角瓶，45℃、150rpm培养96h，每12h取发酵液1mL于离心机中12000r/min离心5min后，除上清液用无菌水重悬菌体，震荡混匀，用紫外分光光度计测菌体量的OD₆₀₀。

结果如图1所示：分别以C₇H₁₆-C₂₅H₅₂的正构烷烃及柴油为唯一碳源培养96h时都可生长，柴油为碳源时菌浓度最高，可达3.68×10⁸CFU/mL；在正构烷烃中更有利于利用C₁₂H₂₆-C₂₃H₄₈，菌浓度平均为2.9×10⁸CFU/mL。

实施例3

本实施例说明本发明中的枯草芽孢杆菌BL-27对温度的耐受性及不同温度下对原油降解的影响。

种子培养基（LB培养基）：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L， NaCl 10g/L；

原油无机盐培养基：NH₄NO₃ 3g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄ 0.1g/L、FeSO₄ 0.01g/L、CaCl₂0.01g/L、原油（源自中石化引进的沙特原油）0.3%（V/V）；pH值为7.0，其中以原油为唯一碳源。

（一）枯草芽孢杆菌BL-27对温度的耐受性。

本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27首先于45℃平板活化菌种，12h后接一环生长良好的单菌落于50mL LB培养基/250mL三角瓶中，45℃，200rpm培养12h，然后按照2%(V/V)接种量转接入装液量为50mL LB培养基/250mL三角瓶中，分别在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，200rpm培养24h，每4h取培养基1mL于离心机中12000r/min离心5min后，除上清液用无菌水重悬菌体，震荡混匀，用紫外分光光度计测菌体量的OD₆₀₀。

结果如图2所示：本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27在25-50℃的条件下生长良好，其最适生长温度为45℃。

（二）枯草芽孢杆菌BL-27在不同温度下对原油降解的影响。

本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27首先于45℃平板活化菌种，12h后接一环生长良好的单菌落于50mL LB培养基/250mL三角瓶中，45℃，200rpm培养12h，然后按照6%(V/V)接种量转接入装液量为100mL的原油无机盐培养基/250mL三角瓶中，分别在30℃、37℃、45℃（每种条件下3个平行样），150rpm培养5d，然后利用石油醚（60-90℃）等体积萃取发酵液，充分振荡后静置10min，取有机相溶液，利用紫外分光光度计法测原油降解率，即根据已知原油质量，以石油醚定容后，在225nm紫外光下，制作标准曲线。以等体积石油醚为萃取溶剂，对残余原油及空白对照原油进行反复萃取回收，萃取液利用紫外分光光度计和标准曲线计算石油降解率(η)按(1)式：

（1）

式中：M ₁—对照组石油质量（g）；M ₂—样品组石油质量（g）；

结果如表1显示：本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27在30-45℃、培养5d的条件下均对原油降解作用明显，其中在最适温度45℃的条件下原油降解率可达65%左右。

表1：枯草芽孢杆菌BL-27在不同温度下5d的原油降解率

温度	30℃	37℃	45℃
				5d原油降解率	40%	47.81%	64.33%

实施例4

本实施例说明本发明中的枯草芽孢杆菌BL-27对pH的耐受性及不同pH值下对原油或柴油降解的影响。

含石油烃无机盐培养基：NH₄NO₃ 3g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄ 0.1g/L、FeSO₄ 0.01g/L、CaCl₂0.01g/L、原油（源自中石化引进的沙特原油）或柴油（源自中石化某加油站）0.3%（V/V），其中以原油或柴油为唯一碳源。

（一）枯草芽孢杆菌BL-27对pH的耐受性。

本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27首先于45℃平板活化菌种，12h后接一环生长良好的单菌落于50mL LB培养基（pH为7.0）/250mL三角瓶中，45℃，200rpm培养12h，然后按照2%(V/V)接种量转接入装液量为50mL LB培养基/250mL三角瓶中，该LB培养基pH值分别1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，200rpm培养24h，每4h取培养基1mL于离心机中12000r/min离心5min后，除上清液用无菌水重悬菌体，震荡混匀，用紫外分光光度计测菌体量的OD₆₀₀。

结果如图3显示：本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27在初始pH 值为4.0-10.0的条件下生长良好，其最适pH为 7.0。

（二）枯草芽孢杆菌BL-27在不同pH下对原油或柴油降解的影响。

本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27首先于45℃平板活化菌种，12h后接一环生长良好的单菌落于50mL LB培养基（pH为7.0）/250mL三角瓶中，45℃，200rpm培养12h，然后按照6%( V/V )接种量转接入装液量为100mL原油（柴油）无机盐培养基/250mL三角瓶中，分别在pH值为7.0、8.0、9.0、10.0，150rpm培养5d，然后利用石油醚（60-90℃）等体积萃取发酵液，充分振荡后静置10min，取有机相溶液，利用紫外分光光度计法测原油降解率。

结果如表2显示：本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27在pH为7.0-9.0、培养5d的条件下对柴油降解作用明显，其中在最适pH为7.0的条件下柴油降解率达66.23%；在pH为7.0培养5d的条件下对原油降解作用明显，其降解率达64.33%。

表2：枯草芽孢杆菌BL-27在不同pH下5d的原油（柴油）降解率

pH	7.0	8.0	9.0	10.0
					5d柴油降解率	66.23%	44.65%	37.02%	17.30%
5d原油降解率	64.33%	33.25%	19.05%	7.89%

实施例5

本实施例说明本发明中的枯草芽孢杆菌BL-27对盐度的耐受性及不同盐度下对原油（柴油）降解的影响。

原油（柴油）无机盐培养基：NH₄NO₃ 3g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、NaCl（不同含量）、MgSO₄ 0.1g/L、FeSO₄ 0.01g/L、CaCl₂0.01g/L、原油（源自中石化引进的沙特原油）或柴油（源自中石化某加油站）0.3%（V/V），pH为7.0，其中以原油或柴油为唯一碳源。

（一）枯草芽孢杆菌BL-27对盐度的耐受性。

本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27首先于45℃平板活化菌种，12h后接一环生长良好的单菌落于50mL LB培养基（NaCl 10g/L）/250mL三角瓶中，45℃，200rpm培养12h，然后按照2%(V/V)接种量转接入装液量为50mL LB培养基/250mL三角瓶中，该LB培养基盐度（NaCl含量）分别0g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L，200rpm培养24h，每4h取培养基1mL于离心机中12000r/min离心5min后，除上清液用无菌水重悬菌体，震荡混匀，用紫外分光光度计测菌体量的OD₆₀₀。

结果如图4显示：本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27耐盐度为 0-90g/L，其最适生长盐浓度为 10g/L。

（二）枯草芽孢杆菌BL-27在不同盐度下对原油或柴油降解的影响。

本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27首先于45℃平板活化菌种，12h后接一环生长良好的单菌落于50mL LB培养基（NaCl 10g/L）/250mL三角瓶中，45℃，200rpm培养12h，然后按照6%(V/V)接种量转接入装液量为100mL原油（柴油）无机盐培养基/250mL三角瓶中，盐度（NaCl含量）分别为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L，150rpm培养5d，然后利用石油醚（60-90℃）等体积萃取发酵液，充分振荡后静置10min，取有机相溶液，利用紫外分光光度计法测原油降解率。

结果如表3显示：本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27在盐度为10g/L-50g/L、培养5d的条件下对柴油降解作用明显，其中在盐度为10g/L-40g/L的条件下柴油降解率达60%以上；在盐度为10g/L、20g/L培养5d的条件下对原油降解作用明显。

表3：枯草芽孢杆菌BL-27在不同盐度下5d的原油（柴油）降解率

盐度（g/L）	10	20	30	40	50	60	70
								5d柴油降解率	66.23%	64.18%	64.37%	61.95%	34.42%	16.19%	16.19%
5d原油降解率	64.33%	47.81%	33.49%	24.27%	17.53%	10.74%	10.19%

实施例6

本实施例说明本发明中的枯草芽孢杆菌BL-27对各种表面活性剂的耐受性及表面活性剂存在的情况下对原油降解的影响。

原油无机盐培养基：NH₄NO₃ 3g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄ 0.1g/L、FeSO₄ 0.01g/L、CaCl₂0.01g/L、pH为7.0，以原油为唯一碳源0.3%（V/V），其中原油为中石化引进的沙特原油。

（一）枯草芽孢杆菌BL-27对表面活性剂的耐受性。

本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27首先于45℃平板活化菌种，12h后接一环生长良好的单菌落于50mL LB培养基/250mL三角瓶中，45℃，200rpm培养12h，然后按照2%(V/V)接种量转接入装液量为50mL LB培养基/250mL三角瓶中，该LB培养基分别添加6种化学及生物表面活性剂CTAB（溴化十六烷三甲基铵）、SDS（十二烷基硫酸钠）、Triton-X 100（聚乙二醇辛基苯基醚）、Tween 80、Rhamnolipids、Surfactin，添加量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L和500mg/L，45℃，200rpm培养24h，每6h取培养基1mL于离心机中12000r/min离心5min后，去除上清液后用1mL无菌水重悬菌体，震荡混匀，用紫外分光光度计测菌体量的OD₆₀₀。

结果如图5所示：本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27可以耐受SDS、Tween 80、Triton-X 100、Rhamnolipids和Surfactin等化学表活剂和生物表活剂。其中对Tween 80、Surfactin和SDS等表面活性剂表现出很好的耐受性，在500mg/L浓度下均不影响菌株的生长，Rhamnolipids和Triton X-100在浓度大于50mg/L时对菌株的生长有明显抑制作用，菌株不耐受的表面活性剂为CTAB。

（二）枯草芽孢杆菌BL-27在不同表面活性剂下对原油降解的影响。

本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27首先于45℃平板活化菌种，12h后接一环生长良好的单菌落于50mL LB培养基/250mL三角瓶中，45℃，200rpm培养12h，然后按照6%(V/V)接种量转接入装液量为100mL的原油无机盐培养基/250mL三角瓶中，分别添加4种化学及生物表面活性剂SDS（十二烷基硫酸钠）、Tween 80、Rhamnolipids、Surfactin，添加量分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L和500mg/L，以无表面活性剂为对照，45℃，150rpm培养4d，然后利用石油醚（60-90℃）等体积萃取发酵液，充分振荡后静置10min，取有机相溶液，利用紫外分光光度计法测原油降解率。

结果表明：如图6所示，50-500mg/L浓度下的4种表活剂对本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27的原油降解效率无抑制作用。SDS浓度为50mg/L时，降解率可提高14%，5d原油降解率可达79%；吐温80浓度为500mg/L时，5d原油降解率可达78%；而添加生物表面活性剂（Rhamnolipids，Surfactin）对原油的降解效率无显著影响。

实施例7

本实施例说明本发明中的枯草芽孢杆菌BL-27对不同来源的原油的降解作用。

种子培养基（LB培养基）：蛋白胨10 g/L，酵母粉 5 g/L， NaCl 10g/L。

原油无机盐培养基：NH₄NO₃ 3g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄ 0.1g/L、FeSO₄ 0.01g/L、CaCl₂0.01g/L、原油（源自中石化引进的沙特原油（扬子）及胜利油田提供的不同品质原油）0.3%（V/V），其中以原油或柴油为唯一碳源。

本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27首先于45℃平板活化菌种，12h后接一环生长良好的单菌落于50mL LB培养基/250mL三角瓶中，45℃，200rpm培养12h，然后按照6%(V/V)接种量转接入装液量为100mL无机盐培养基/250mL三角瓶中，该无机盐培养基分别以6种不同品质的原油为唯一碳源，45℃，150rpm培养5d，然后利用石油醚（60-90℃）等体积萃取发酵液，充分振荡后静置10min，取有机相溶液，利用紫外分光光度计法测原油降解率。

结果如图7所示：本发明提供的枯草芽孢杆菌BL-27对不同品质的原油都有一定降解作用，但油品不同，降解率有所差别，其降解效率为：扬子>长庆>X476>沾3>新春>K126。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株中高温可降解原油的枯草芽孢杆菌及其应用

<130> xb18080902

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1462

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis BL-27)

<400> 1

tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60

cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120

tggttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct ttggctacca cttacagatg 180

gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taatggctca ccaaggcaac gatgcgtagc 240

cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300

gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360

atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag 420

ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540

ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600

acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660

ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720

cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780

gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840

agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900

atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 960

cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080

cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200

aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260

cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320

ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380

ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttaggagc cagccgccga aggtgggaca gatgattggg 1440

gtgaagtcgt acaaagggta ac 1462

Claims

1.一株中高温可降解原油的枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BL-27，保藏编号为CCTCC NO：M 2018402。

2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在油污染生物降解中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将枯草芽孢杆菌BL-27于平板活化菌种，之后接一环生长良好的单菌落于LB培养基中培养；

(2)将步骤(1)获取的培养液转接入含石油烃的无机盐培养基中培养，进行油污染生物降解。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，降解温度为30～45℃。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，降解温度为45℃。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，降解pH为7.0-9.0。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，降解pH为7.0。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，无机盐培养基中含NaCl10g/L-40g/L。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，无机盐培养基中含NaCl10g/L。

10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，无机盐培养基碳源为原油时，在无机盐培养基中添加化学表面活性剂；所述化学表面活性剂选用SDS或Tween 80；浓度为50mg/L～500mg/L。

11.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，无机盐培养基碳源为原油时，在无机盐培养基中添加50mg/L SDS或500mg/L Tween 80。

12.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，无机盐培养基的成分为：NH₄NO₃ 3g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、K₂HPO₄ 1.5g/L、NaCl 10g/L-40g/L、MgSO₄ 0.1g/L、FeSO₄0.01g/L、CaCl₂ 0.01g/L、碳源0.3％(V/V)；所述碳源为石油烃或含石油烃油类。