JP7100329B2

JP7100329B2 - 汚泥分解用細菌、微生物分解細菌、微生物製剤、汚泥分解方法及び汚泥分解装置

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Publication number: JP7100329B2
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Inventors: 真也平山
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Current assignee: KATAOKA BIO LABORATORY CO., LTD.; Sumitomo Chemical Co Ltd
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Filing date: 2020-12-17
Publication date: 2022-07-13
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Description

NPMD

NITE BP-02779

NPMD

NITE BP-03020

本発明は、汚泥分解用細菌、微生物分解細菌、微生物製剤、汚泥分解方法及び汚泥分解装置に関する。

活性汚泥法により汚水浄化を行うと、有機物を分解して増殖した微生物を含んだ余剰汚泥と呼ばれる汚泥を発生させる。廃水処理設備から排出される余剰汚泥は産業廃棄物の中で４０％以上もの割合を占めるため、産業廃棄物を減容化するには、この余剰汚泥の減容化が効果的と考えられている。一般的に余剰汚泥は、脱水、乾燥後、焼却処理される（非特許文献１：「平成２７年度事業、産業廃棄物排出・処理状況調査報告書、平成２５年度実績（概要版）」［online］、平成２８年３月、環境省大臣官房廃棄物・リサイクル対策部、[平成３０年８月３１日検索]、インターネット＜URL: https://www.e-stat.go.jp/stat-search/file-download?statInfId=000031403476&fileKind=2＞；非特許文献２：山本昌幸、「下水の燃焼技術について」、日本燃料学会誌、一般社団法人日本燃焼学会、２０１１、第５３巻、１６４号、ｐ９１－９６）。

しかしながら、余剰汚泥を焼却処理すると温室効果ガスが発生するため、必ずしも環境に与える影響の少ない処理方法ではなかった。

「平成２７年度事業、産業廃棄物排出・処理状況調査報告書、平成２５年度実績（概要版）」［online］、平成２８年３月、環境省大臣官房廃棄物・リサイクル対策部、[平成３０年８月３１日検索]、インターネット＜URL: https://www.e-stat.go.jp/stat-search/file-download?statInfId=000031403476&fileKind=2＞山本昌幸、「下水の燃焼技術について」、日本燃料学会誌、一般社団法人日本燃焼学会、２０１１、第５３巻、１６４号、ｐ９１－９６

近年、地球環境に対する意識が社会全体で高まってきており、環境に与える影響がより少ない余剰汚泥の減容化方法、即ち、余剰汚泥を構成する微生物の分解方法が求められていた。

本発明は、汚泥分解用細菌、微生物分解細菌、微生物製剤、汚泥分解方法及び汚泥分解装置を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は、以下に例示される［１］～［１８］に関する。
［１］配列番号１に記載の塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、汚泥分解用細菌（以下、「本発明に係る汚泥分解用細菌」と記すことがある。）。
［２］配列番号１に記載の塩基配列に対して、塩基の変異数が２塩基以下である１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、標的微生物分解能を有する細菌（以下、「本発明に係る細菌」と記すことがある。）。
［３］標的微生物が標的細菌である、［２］に記載の細菌。
［４］標的微生物が標的死細菌である、［２］又は［３］に記載の細菌。
［５］配列番号１に記載の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、［１］～［４］のいずれかに記載の細菌。
［６］受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０３０２０として寄託された細菌。
［７］細菌（ａ１）を含む、汚泥分解用微生物製剤（以下、「本発明に係る微生物製剤」と記すことがある。）。
細菌（ａ１）：配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌。
［８］細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、［７］に記載の汚泥分解用微生物製剤。
［９］細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、［７］に記載の汚泥分解用微生物製剤。
［１０］細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、［７］に記載の汚泥分解用微生物製剤。
［１１］細菌（ａ１）は、標的微生物分解能を有する、［７］～［１０］のいずれかに記載の汚泥分解用微生物製剤。
［１２］温度２０℃で汚泥を分解する、［７］～［１１］のいずれかに記載の汚泥分解用微生物製剤。
［１３］細菌（ａ１）は、受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０３０２０として寄託された細菌である、［７］に記載の汚泥分解用微生物製剤。
［１４］微生物（ａ２）をさらに含み、細菌（ａ１）及び微生物（ａ２）の総数に対する細菌（ａ１）数は０．１％以上１００％未満である、［７］～［１３］のいずれかに記載の汚泥分解用微生物製剤。
微生物（ａ２）：細菌（ａ１）と異なる微生物。
［１５］微生物（ａ２）は、配列番号７に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ標的微生物分解能を有する細菌、標的微生物分解能を有するバチルス属細菌、及び標的微生物分解能を有するパエニバシラス属細菌からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、［１４］に記載の汚泥分解用微生物製剤。
［１６］細菌（ａ１）の培養物を含む、汚泥分解用微生物製剤。
細菌（ａ１）：配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、標的微生物分解能を有する細菌。
［１７］［１］～［６］のいずれかに記載の細菌又は［７］～［１６］のいずれかに記載の汚泥分解用微生物製剤を汚泥に作用させる工程を含む、汚泥分解方法（以下、「本発明に係る分解方法」と記すことがある。）。
［１８］［１］～［６］のいずれかに記載の細菌又は［７］～［１６］のいずれかに記載の汚泥分解用微生物製剤を用いた、汚泥分解装置（以下、「本発明に係る分解装置」と記すことがある。）。

本発明によれば、汚泥分解用細菌、微生物分解細菌、微生物製剤、微生物の分解方法及び分解装置を提供可能となる。

実験３において、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｂｒｅｖｉｓ（以下、「Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ」と記載することがある。）ＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の形態を示す写真である。実験３において、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０のグラム染色の結果を示す写真である。実験４において、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の標的微生物分解能を示すグラフである。実験４において、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｇｌｙｃａｎｉｌｙｔｉｃｕｓの標的微生物分解能を示すグラフである。実験５において、複数株のＢｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓの培養物を含む微生物製剤の標的微生物分解能を示すグラフである。実験６において、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物を含む微生物製剤の標的微生物（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）分解能を示すグラフである。実験６において、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物を含む微生物製剤の標的微生物（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）分解能を示すグラフである。実験６において、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物を含む微生物製剤の標的微生物（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）分解能を示すグラフである。実験６において、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物を含む微生物製剤の標的微生物（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）分解能を示すグラフである。実験６において、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物を含む微生物製剤の標的微生物（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ）分解能を示すグラフである。実験７において、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物を含む微生物製剤の汚泥分解能を示すグラフである。実験８において、様々な温度条件下におけるＢｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物を含む微生物製剤の標的微生物分解能を示すグラフである。実験９において、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物と他の細菌の培養物との混合物を含む微生物製剤の汚泥分解能を示すグラフである。参考実験７において、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．（ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９）添加後の余剰汚泥の乾燥重量を示した図である。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。

（共通する用語の説明）
本明細書において、「微生物」とは肉眼では構造が判別できないような微小な生物であり、大型多細胞生物を除く生物である。「標的微生物」とは、本発明に係る細菌又は微生物製剤により分解される微生物である。標的微生物としては細菌、真菌等が挙げられ、中でも細菌が好ましく、余剰汚泥を構成する細菌がより好ましい。標的微生物は、生菌であっても死菌であってもよい。

「標的細菌」とは、標的微生物となる細菌を指す。標的細菌は、生菌であってもよく、死菌であってもよく、生菌及び死菌を含んでもよい。生菌とは生きている細菌、例えば代謝が行われている細菌を指す。死菌とは死んでいる細菌、例えば代謝が行われていない細菌を指す。生菌と死菌とは、例えばｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）等の色素を用いて判別することができる。「標的死細菌」とは、標的細菌のうち死んでいる細菌をいう。標的細菌は、分解効率の観点からは標的死細菌であることが好ましい。余剰汚泥中の微生物の約５０％は死菌である。標的死細菌は、例えば標的細菌に対して加熱、高圧蒸気滅菌、紫外線照射、ホルマリン処理、酸処理などを行うことにより得ることもできる。また、標的死細菌は粉砕されたものでもよい。

標的微生物として、例えばミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌などのグラム陽性菌、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属細菌などのグラム陰性菌、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真菌類が挙げられる。

本明細書において、「標的微生物分解能」とは、標的微生物を代謝して、標的微生物を構成する生体分子の一部又は全部を、異なる分子に変換する能力を指す。生体分子としては、例えば糖、タンパク質、核酸、脂質等が挙げられる。

（本発明に係る汚泥分解用細菌）
本発明に係る汚泥分解用細菌は、配列番号１に記載の塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する。配列番号１に記載の塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌としては、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌が挙げられる。ブレビバチルス属細菌としては、ブレビバチルスパラブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルスチョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルスフォーモサス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｆｏｒｍｏｓｕｓ）、ブレビバチルスアグリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓａｇｒｉ）、ブレビバチルスニトリフィカンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ブレビバチルスブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）、ブレビバチルスレウスゼリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｓｚｅｒｉ）、ブレビバチルスリムノフィルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ブレビバチルスパナチフミ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｎａｃｉｈｕｍｉ）、ブレビバチルスゲラティニ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｇｅｌａｔｉｎｉ）が挙げられる。

本発明に係る汚泥分解用細菌は、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、同一性又は相同性が９７．５％以上、９８％以上、９８．５％以上、９８．８％以上、９９．０％以上、９９．３％以上、９９．５％以上、９９．８％以上又は９９．９％以上である塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。汚泥分解用細菌は、配列番号１に記載の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌であってもよく、その代表的な菌株としては、後述するＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｂｒｅｖｉｓ（受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０３０２０）が挙げられる。本発明に係る汚泥分解用細菌は、本発明に係る細菌を含んでもよい。

本発明に係る汚泥分解用細菌は、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、１塩基又は数塩基の置換、欠失又は付加が起こった塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。１塩基又は数塩基とは、例えば１～２５塩基であってもよく、１～１０塩基であってもよく、１～５塩基であってもよい。上記の変異は、１６ＳｒＲＮＡの発現及び機能が失われない変異である。

本発明に係る汚泥分解用細菌は、配列番号１に記載の塩基配列に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８～約５００塩基、より好ましくは約１８～約２００塩基、さらに好ましくは約１８～約５０塩基の連続した配列又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。ストリンジェントな条件とは、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄する条件等が挙げられる。

本発明に係る汚泥分解用細菌は、汚泥分解能を有する。汚泥は、好ましくは余剰汚泥である。汚泥分解能は、反応条件（汚泥及び汚泥に含まれる標的微生物の種類及び濃度、汚泥分解用細菌を含む溶液の組成、温度、ｐＨ、細菌数等）によって変化し得る。汚泥分解能を有するかどうかを調べる方法としては、例えば汚泥と汚泥分解能を調べたい細菌とを適切な培地又は緩衝液中で一定時間反応させた後、培地又は緩衝液中における汚泥の分解を調べる方法が挙げられる。分解を調べる方法としては、特に限定されないが、例えば汚泥の濁度を測定する方法、ＳＬＰ試薬により汚泥に含まれる標的微生物を検出する方法、ＰＣＲにより汚泥に含まれる標的微生物のＤＮＡを検出する方法、汚泥の乾燥重量を測定する方法、汚泥に含まれる標的微生物の乾燥重量を測定する方法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；質量分析法（ＭＳ）；薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）；核磁気共鳴（ＮＭＲ）；ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）等を用いて汚泥に含まれる標的微生物由来の分解物を検出する方法が挙げられる。

濁度により汚泥分解能を調べる場合、汚泥分解能を有するとは、汚泥に汚泥分解用細菌を添加してから所定時間経過後の濁度が添加前の濁度よりも有意に低下していることをいう。添加後の濁度は、例えば添加前の濁度の８０％以下であり、好ましくは５０％以下であり、より好ましくは３０％以下である。乾燥重量により汚泥分解能を調べる場合、汚泥分解能を有するとは、例えば添加後の乾燥汚泥重量が添加前の乾燥汚泥重量よりも有意に低下しており、例えば添加後の乾燥汚泥重量は、添加前の９５％以下であり、好ましくは９０％以下である。一般に、細菌が標的微生物分解能を有するとき、汚泥分解能を有する。

（本発明に係る細菌）
本発明に係る細菌は、配列番号１に記載の塩基配列に対して、塩基の変異数が２塩基以下である１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、標的微生物分解能を有する。本明細書において、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、細菌が本来有している内在性の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子であることが好ましい。人工的に変異が誘発された１６ＳｒＲＮＡであってもよい。配列番号１に記載の塩基配列に対して、塩基の変異数が２塩基以下である１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌として、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌が挙げられ、ブレビバチルスパラブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）が挙げられる。本発明に係る細菌は、本発明に係る汚泥分解用細菌を含んでもよい。

本発明に係る細菌の一実施形態としては、配列番号１に記載の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、標的微生物分解能を有する細菌が挙げられる。

配列番号１に記載の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌の代表的な菌株としては、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｂｒｅｖｉｓ（受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０３０２０、原寄託日：２０１９年９月１７日）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ、住所：〒２９２－０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８１２２号室）にブダペスト条約に基づいて寄託されている菌株を挙げることができる。該菌株の菌学的性質については後述する。

本発明に係る細菌は、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、同一性又は相同性が９８．５％以上、９８．８％以上、９９．０％以上、９９．３％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、９９．９％以上である塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、配列番号１に記載の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。

配列番号１に記載の塩基配列に対して、塩基の変異数が２塩基以下である細菌は、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、１塩基又は２塩基の置換、欠失又は付加が起こった塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。上記の変異は、１６ＳｒＲＮＡの発現及び機能が失われない変異である。

本発明に係る細菌は、配列番号１に記載の塩基配列に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８～約５００塩基、より好ましくは約１８～約２００塩基、さらに好ましくは約１８～約５０塩基の連続した配列又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。ストリンジェントな条件とは、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上洗浄する条件等が挙げられる。

本発明に係る細菌の標的微生物分解能は、反応条件（標的微生物の種類及び濃度、細菌を含む溶液の組成、温度、ｐＨ、細菌数等）によって変化し得る。標的微生物は、例えば標的細菌であり、好ましくは標的死細菌である。

例えば、本発明に係る細菌の代表的菌株Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０とミクロコッカス属細菌死菌とをそれぞれ濁度（ＯＤ６６０）０．２に調製し、体積比１：１００で混合後、２０～３５℃の温度条件下で６．５～８．０のｐＨ条件下で反応させることにより、１週間後の濁度を５０％程度低下させ、ミクロコッカス属細菌を分解することができる。

本発明に係る細菌は、対象微生物（本発明に係る細菌であるかを調べたい微生物）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析、及び標的微生物の分解能の測定により、特定することができる。具体的には、対象微生物が、配列番号１に記載の塩基配列に対して、塩基の変異数が２塩基以下である１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、標的微生物分解能を有していれば、その微生物は本発明に係る細菌であると特定できる。

１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析は、例えば以下の方法で行うことができる。まず、公知の方法を用いて、対象微生物からゲノムＤＮＡを抽出し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅させる。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅させる方法としては、特に制限されるものではなく、当業者が通常用いるユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲ法等が挙げられる。ＰＣＲ法により得られた増幅産物を、必要に応じて精製し、ＤＮＡシークエンサー等に供して、塩基配列を決定することができる。得られた塩基配列と配列番号１に記載の配列との比較を行う。

標的微生物分解能を有するかどうかを調べる方法としては、例えば、対象微生物と標的微生物とを適切な培地又は緩衝液中で一定時間反応させた後、培地又は緩衝液中における標的微生物の分解を調べる方法が挙げられる。分解を調べる方法は、特に限定されないが、例えば標的微生物を含む溶液の濁度を測定する方法、ＳＬＰ試薬により標的微生物を検出する方法、ＰＣＲにより標的微生物のＤＮＡを検出する方法、標的微生物の乾燥菌体重量を測定する方法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；質量分析法（ＭＳ）；薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）；核磁気共鳴（ＮＭＲ）；ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）等を用いて標的微生物由来の分解物を検出する方法が挙げられる。

濁度により標的微生物の分解を調べる場合、標的微生物分解能を有するとは、標的微生物を含む溶液に本発明に係る細菌を添加してから所定時間経過後の濁度が添加前の濁度よりも有意に低下することをいう。添加後の濁度は、例えば添加前の濁度の８０％以下であり、好ましくは５０％以下であり、より好ましくは３０％以下である。乾燥菌体重量により標的微生物の分解を調べる場合、標的微生物分解能を有するとは、例えば添加後の乾燥菌体重量が添加前の乾燥菌体重量よりも有意に低下しており、例えば添加後の乾燥菌体重量は、添加前の９５％以下であり、好ましくは９０％以下である。一般に、細菌が汚泥分解能を有するとき、標的微生物分解能を有する。

これらの塩基配列解析及び標的微生物分解能の測定の結果に基づき、対象微生物が本発明に係る細菌であるかを判断できる。

（本発明に係る微生物製剤）
本発明に係る微生物製剤の一実施形態は、以下の細菌（ａ１）を含む。
＜細菌（ａ１）＞
細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する。

細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、同一性又は相同性が９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９.９％以上の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、配列番号１に記載の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。細菌（ａ１）として、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌が挙げられ、ブレビバチルスパラブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）であってもよい。細菌（ａ１）は、受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０３０２０として寄託された細菌であってもよい。

また、細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、１塩基又は数塩基の置換、欠失又は付加が起こった塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。１塩基又は数塩基とは、例えば１～１３５塩基であってもよく、１～１００塩基であってもよく、１～５０塩基であってもよく、１～２５塩基であってもよく、１～５塩基であってもよい。上記の変異は、１６ＳｒＲＮＡの発現及び機能が失われない変異である。

細菌（ａ１）は、配列番号１に記載の塩基配列に含まれる、約１５塩基以上、好ましくは約１８～約５００塩基、より好ましくは約１８～約２００塩基、さらに好ましくは約１８～約５０塩基の連続した配列又はその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。

細菌（ａ１）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析は、上述の本発明に係る細菌と同様にして行うことができる。

細菌（ａ１）は、標的微生物分解能を有することが好ましい。細菌（ａ１）の標的微生物分解能は、上述の本発明に係る細菌と同様にして評価することができる。

標的微生物分解能が良好であることから、細菌（ａ１）としては、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｂｒｅｖｉｓ、本発明に係る汚泥分解用細菌、本発明に係る細菌、及び以下Ａ群の細菌より選ばれる少なくとも１種の細菌を含むことが好ましい。細菌（ａ１）は、単一の細菌であってもよいし、複数種の細菌であってもよい。
Ａ群：ブレビバチルスインボカツス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｉｎｖｏｃａｔｕｓ）、ブレビバチルスセントロスポルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルスボルステレンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルスレヴィクキィ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｖｉｃｋｉｉ）、ブレビバチルスマスシリエンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ブレビバチルスジンセンジソリ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、ブレビバチルスラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、ブレビバチルスフルバス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｆｕｌｖｕｓ）、ブレビバチルスフルミニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｆｌｕｍｉｎｉｓ）、ブレビバチルスセディミニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）、ブレビバチルスサーモルバー（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒ）、ブレビバチルスアイディノグルエンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓａｙｄｉｎｏｇｌｕｅｎｓｉｓ）。

本発明に係る微生物製剤は、汚泥分解能を有する。汚泥分解能は、上述の本発明に係る汚泥分解用細菌の欄に記載の方法で評価することができる。微生物製剤の汚泥分解能は、微生物製剤に含まれる細菌（ａ１）もしくは微生物（ａ２）又はこれらの培養物に由来することが好ましい。微生物製剤は、温度３７℃以下、温度３０℃、温度２５℃又は温度２０℃で汚泥分解を分解することができ、温度２０℃～４０℃の範囲で汚泥分解可能であってもよい。例えば、本発明に係る微生物製剤を標的微生物を含む溶液に添加してから５日目の溶液の濁度は、温度２５℃においては温度３０℃の溶液の濁度の２倍以下であり、温度２０℃においては温度３０℃の溶液の濁度の３倍以下であり、好ましくは２．５倍以下である。

微生物製剤は、細菌（ａ１）の他に、細菌（ａ１）の培養物、微生物（ａ２）、添加剤（ｂ）、担体（ｃ）等を含むことができる。微生物製剤の具体例としては、細菌（ａ１）、微生物（ａ２）、添加剤（ｂ）及び担体（ｃ）を含む微生物製剤を挙げることができる。

＜細菌（ａ１）の培養物＞
本発明に係る微生物製剤の一実施形態は、細菌（ａ１）の培養物を含む。細菌（ａ１）の培養物は、例えば細菌（ａ１）の分泌物、代謝物、細菌（ａ１）から産生されるタンパク質、糖、酵素及びこれらが懸濁した液体培地が含まれる。具体的には、培養物は、制御された条件下で所定の液体培地中、又は炭素源及び窒素源を含む液体培地中で増殖させた細菌（ａ１）の培養物が含まれる。細菌（ａ１）の培養物を含む標的微生物分解用製剤には、細菌（ａ１）の生菌が含まれていてもよい。細菌（ａ１）の培養物は、細菌（ａ１）を培養した上清であってもよい。培養上清は、例えば細菌（ａ１）を培養した液体培地から遠心分離、濾過操作等で細菌（ａ１）を除いて得ることができる。また、培養物は、細菌（ａ１）の断片を含んでいてもよい。細菌（ａ１）の断片は、例えば細菌（ａ１）を超音波破砕、ビーズ摩砕、化学的溶解処理により得ることもできる。細菌（ａ１）の培養物は、好ましくは標的微生物分解能を有する。

＜微生物（ａ２）＞
微生物（ａ２）は、細菌（ａ１）と異なる微生物である。微生物（ａ２）は、微生物製剤の汚泥分解能を失わせるような微生物でなければ特に制限されるものではない。微生物（ａ２）は、単一の微生物であってもよいし、複数種の微生物であってもよい。微生物（ａ２）は、細菌（ａ１）の増殖能又は安定性を向上させる細菌であってもよいし、細菌（ａ１）の培養物の安定性を向上させる細菌であってもよい。

微生物（ａ２）は、微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析、生理生化学性状試験等により、特定することができる。微生物（ａ２）は、標的微生物分解能を有していてもよいし、有していなくてもよい。対象微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析、及び標的微生物分解能の測定は、上述の本発明に係る細菌と同様にして行うことができる。

微生物（ａ２）としては、グラム陰性菌又はグラム陽性菌であってもよく、例えばチューメバチルス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、パエニバチルス属細菌、バチルス属細菌、アセトバクタ－属細菌、グルコノバクター属細菌、ラクトバチルス属細菌、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属細菌、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌、エスケリキア属細菌、出芽酵母が挙げられる。

微生物（ａ２）は、標的微生物分解能を有する細菌を含むことが好ましく、例えば配列番号７に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ標的微生物分解能を有する細菌（以下、「細菌（ａ２１）」と記載することがある。）、標的微生物分解能を有するバチルス属細菌、及び標的微生物分解能を有するパエニバチルス属細菌からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。

配列番号７に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ標的微生物分解能を有する細菌としては、チューメバチルス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌が挙げられる。細菌（ａ２１）は、配列番号７に記載の塩基配列と比較し、同一性又は相同性が９３％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９.９％以上の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよく、配列番号７に記載の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有していてもよい。細菌（ａ２１）は、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．（受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９、原寄託日：２０１８年９月１１日）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ、住所：〒２９２－０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８１２２号室）にブダペスト条約に基づいて寄託されている菌であってもよい。該菌株の菌学的性質については、後述する表６～表９に示す。

細菌（ａ２１）は、例えばチューメバチルスアルギファエシス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓａｌｇｉｆａｅｃｉｓ）、チューメバチルスアビウム（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓａｖｉｕｍ）、チューメバチルスフラゲラテス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）、チューメバチルスギンセンギソリ（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、チューメバチルスリポリティカス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｓ）、チューメバチルスルテオラス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｌｕｔｅｏｌｕｓ）、チューメバチルスパーマメンティフリゴリス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｐｅｒｍａｎｅｎｔｉｆｒｉｇｏｒｉｓ）、チューメバチルスソリ（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｏｌｉ）であってもよい。

標的微生物分解能を有するバチルス属細菌としては、例えばバチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルススファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられる。

標的微生物分解能を有するパエニバチルス属細菌としては、例えばパエニバチルスポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ）が挙げられる。

標的微生物分解能の観点から、細菌（ａ１）及び微生物（ａ２）の総数に対する細菌（ａ１）数は、０．１％以上であってもよく、１％以上であってもよく、１０％以上であってもよく、５０％以上であってもよく、７５％以上であってもよく、９０％以上であってもよく、９５％以上であってもよく、１００％以下であってもよく、１００％未満であってもよい。

細菌（ａ１）及び微生物（ａ２）の総数に対する細菌（ａ１）数とは、微生物製剤に含まれる全細菌に対する細菌（ａ１）の割合であることが好ましい。細菌（ａ１）及び微生物（ａ２）の総数に対する細菌（ａ１）数を算出する方法としては、クローンライブラリー法、次世代シーケンサー解析、定量ＰＣＲにより算出する方法等が挙げられる。

クローンライブラリー法及び次世代シーケンサー解析により細菌の存在割合を算出する方法として、具体的には、微生物製剤に含まれる細菌（ａ１）及び微生物（ａ２）からゲノムＤＮＡを抽出して１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を複数取得し（以下、取得した複数の塩基配列数をリード数と記す。）、取得した塩基配列が細菌（ａ１）又は微生物（ａ２）のいずれに由来する塩基配列であるかをそれぞれ決定する。次に、リード数に対する細菌（ａ１）に由来する塩基配列数を算出し、細菌（ａ１）及び微生物（ａ２）の総数に対する細菌（ａ１）数とすることができる。

次世代シーケンサー解析で用いる次世代シーケンサーとしては、ＤＮＡ断片をテンプレートとし、１塩基ずつ再合成する時の蛍光強度を検出し、塩基配列を決定できれば特に制限されるものではない。次世代シーケンサーとしては、例えば、ＭｉＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ２５００（イルミナ社製）、５５００ｘｌＳＯＬｉＤＴＭ、ＩｏｎＰｒｏｔｏｎＴＭ、ＩｏｎＰＧＭＴＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＧＳＦＬＸ＋（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）等が挙げられる。

定量ＰＣＲにより細菌の存在割合を算出する方法として、具体的には、微生物製剤に含まれる細菌（ａ１）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子コピー数と、細菌（ａ１）及び微生物（ａ２）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子コピー数をそれぞれ算出する。次に細菌（ａ１）及び微生物（ａ２）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子コピー数に対する細菌（ａ１）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子コピー数を算出し、細菌（ａ１）及び微生物（ａ２）の総数に対する細菌（ａ１）数とすることができる。

定量ＰＣＲで用いるリアルタイムＰＣＲ装置としては、ＤＮＡをＰＣＲにより増幅することができるサーマルサイクラーと、増幅産物を検出するための分光蛍光光度計と、を備えていれば、特に制限されるものではない。リアルタイムＰＣＲ装置としては、例えば、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（タカラバイオ株式会社製）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）等が挙げられる。

定量ＰＣＲに用いるマスターミックスとしてはＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔeｒＭｉｘ、ＳＹＢＲＳｅｌｅｃｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＰｏｗｅｒＵｐＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等が挙げられる。

＜添加剤（ｂ）＞
添加剤（ｂ）としては、例えば、界面活性剤、分散剤、補助剤、保護剤等が挙げられる。添加剤（ｂ）の種類及び濃度は、細菌（ａ１）が死滅しない、又は当該細菌が有する標的微生物分解能が失われない条件で適宜決定することができる。

＜担体（ｃ）＞
担体（ｃ）としては、例えば、無機微粒子担体が挙げられる。無機微粒子担体としては、金属及びその無機塩類又は酸化物であってもよく、炭素を含有するものであっても化学的に無機物に分類されるものであってもよい。また、有機態炭素の含有量が１％程度未満の純物質又は混合物であってもよい。

無機微粒子担体の中心粒子径は、好ましくは１μｍ～１００μｍであり、より好ましくは４μｍ～７５μｍであり、さらに好ましくは１３μｍ～２５μｍである。中心粒子径がこのような範囲にある場合、細菌（ａ１）が無機微粒子担体に担持されやすくなる傾向にある。ここで、中心粒子径とは、レーザー回折・光散乱法に基づく体積基準の粒度分布におけるメジアン径（Ｄ５０）を指す。無機微粒子担体の比重は、特に制限されないが、１．２～３．５であることが好ましい。

無機微粒子担体は、培養初期の歩留まりを向上させることを目的として、必要に応じて、各種凝集剤を用いて凝集させてもよい。凝集剤としては、例えば、ノニオン性、カチオン性、アニオン性の高分子凝集剤等が挙げられる。

微生物製剤の製造方法としては、例えば、細菌（ａ１）と無機微粒子担体とを混合し、無機微粒子担体上に細菌（ａ１）を担持させ、これを培養して得られる微生物製剤を回収する方法が挙げられる。

培養方法としては、回分、半回分、流加、連続のいずれの方式を用いてもよい。培養方法としては、例えば、増殖が遅く菌体収率の低い微生物を効率的に調製するという観点から、特開平９－１８７２７２号公報に記載されるように、微生物を培養する容器（以下、反応槽という）へ供給する対象化合物の濃度を培養時間の経過に伴い、対数増加させる連続培養方式を用いてもよい。

本発明において、微生物の製剤化手段は、細菌（ａ１）の標的微生物分解能が失われない限り特に限定されず、公知の製剤化手段を利用することができる。微生物製剤の形態としては、液体又は固体（カプセル封入体、寒天状、粉末状等を含む）であってもよく、それらの凍結体、凍結乾燥体等であってもよい。微生物製剤が液体である場合は、培地、緩衝液、生理的食塩水等に懸濁された菌懸濁液としてもよい。液体は、酸性又は中性であってもよい。微生物製剤が固体又は凍結乾燥体である場合は、例えば培養された細菌を濃縮した後、適当な乾燥又は凍結乾燥を行い、固体又は凍結乾燥体としてもよい。その際、賦形剤などを添加してもよい。

（汚泥分解方法）
本発明に係る分解方法は、本発明に係る汚泥分解用細菌、本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤を汚泥に作用させる工程を含む。本発明に係る汚泥分解用細菌、本発明に係る細菌及び本発明に係る微生物製剤が有する標的微生物分解能は、標的微生物を含む余剰汚泥の処理に有用であり、本発明に係る分解方法により、余剰汚泥を減容化することができる。

本発明に係る汚泥分解用細菌、本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤を汚泥に作用させるとは、例えば本発明に係る汚泥分解用細菌、本発明に係る細菌もしくは本発明に係る微生物製剤又はこれらを懸濁した溶液と、汚泥とを接触させることをいう。本発明に係る汚泥分解用細菌、本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤が汚泥に含まれる標的微生物を分解することで、汚泥が分解される。

本発明に係る汚泥分解用細菌、本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤を汚泥に作用させる工程は、本発明に係る汚泥分解用細菌、本発明に係る細菌又は細菌（ａ１）が死滅しない、又は当該細菌が有する標的微生物分解能が失われない条件であれば、特に制限されるものではない。当該工程は、例えば、温度が２０～４０℃の条件下であってもよく、２５～３０℃の条件下であってもよい。また、ｐＨは６．５～８．０の条件下であってもよく、７．０～７．５の条件下であってもよい。

汚泥に対する本発明に係る汚泥分解用細菌、本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤の添加量は、標的微生物の種類及び濃度、反応系の容積等を考慮し、適宜設定することができる。

本発明に係る分解方法において、汚泥が分解されていることの確認方法は、特に制限されるものではなく、当業者が通常用いることができる方法により行われる。このような確認方法としては、例えば、上述の汚泥分解能の評価方法又は標的微生物分解能の評価方法が挙げられる。

（汚泥分解装置）
汚泥分解装置としては、本発明に係る汚泥分解用細菌、本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤を用いて余剰汚泥を削減できる装置であれば特に限定されないが、例えば余剰汚泥が発生する汚泥処理装置、排水処理装置等が挙げられる。また、例えば余剰汚泥が存在する既存の汚泥処理装置、排水処理装置等に本発明に係る汚泥分解用細菌、本発明に係る細菌又は本発明に係る微生物製剤を添加して、汚泥分解装置とすることもできる。

従来、余剰汚泥を分解するために、オゾン、アルカリ、次亜塩素酸等の化学的処理、ビーズミル、超音波破砕等の物理的処理、高温条件下又はアルカリ条件下で働く微生物を用いた生物学的処理等が行われていたが、これらの処理を行うためには、余剰汚泥を別のタンクに移す必要があり、設備コスト及びランニングコストが多くかかっていた。本発明に係る汚泥分解用細菌、本発明に係る細菌及び本発明に係る微生物製剤は、余剰汚泥中に直接投入することができるため、新たな設備を整えるコストを抑えることができるとともに、従来行われている汚泥分解方法を変更する必要もない。

［実験１．標的微生物分解能を有する微生物の探索］
（方法）
環境（水）中に存在する微生物群から数菌株を単離した。

（結果）
単離した菌株ごとにミクロコッカス属細菌分解能を調べたところ、１つの菌株にミクロコッカス属細菌分解能が認められた。以下、ミクロコッカス属細菌分解能が認められた菌株を「菌株Ａ」と記す。

［実験２．ミクロコッカス属細菌分解能を有する菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析］
（材料）
・８０２培地：１０ｇポリペプトン、２ｇ酵母エキス、１ｇ硫酸マグネシウム七水和物を超純水に溶解し、ｐＨを７．０に調節した後、１０００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌した培地
・クローニング用フォワードプライマー（２７ｆ：配列番号２）
・クローニング用リバースプライマー（１４９２ｒ：配列番号３）
・シークエンス解析用プライマー（３３９Ｆ：配列番号４、５３６Ｒ：配列番号５、９０７Ｆ：配列番号６）

（方法）
菌株Ａからイージー・エクストラクトｆｏｒＤＮＡ（エーエムアール株式会社製）を用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅させるための鋳型ＤＮＡとして用いた。

ＰＣＲは以下の条件で行った。２５．０μＬの２×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒｆｏｒＫＯＤＦＸ（東洋紡株式会社製）、１０．０μＬのｄＮＴＰｍｉｘ（２ｍＭ）、１．５μＬのクローニング用フォワードプライマー及びクローニング用リバースプライマー（それぞれ１０ｐｍｏｌ／μＬ）、０．５８μＬの鋳型ＤＮＡ、１０．４μＬの滅菌水、１．０μＬのＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤＦＸ、１Ｕ／μＬ、東洋紡株式会社製）を、マイクロチューブに加え、混合した。マイクロチューブをＰＣＲ装置に供し、鋳型ＤＮＡの増幅反応を行った。反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）５０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）～（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。ＰＣＲ後の増幅産物を精製した。

精製したＰＣＲ後の増幅産物１５０ｎｇ相当量と、シークエンス解析用プライマー（１０μＭ）０．３２μＬと、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）８．０μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０．０μＬとした反応液を調製した。この反応液をＰＣＲ装置に供し、増幅反応を行った。反応は、（１）９６℃、１分間、（２）９６℃、１０秒間、（３）５０℃、５秒間、（４）６０℃、４分間で行い、（２）～（４）の工程は２５サイクル繰り返し行った。得られた反応液を精製し、精製液をＤＮＡシーケンス解析（３７３０ｘｌＤＮＡＡｎａｌｙｚｅｒ）に供して、菌株Ａから抽出した鋳型ＤＮＡの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した。

（結果）
得られた塩基配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）／ＧｅｎＢａｎｋ）に対してホモロジー解析を行った。基準株の中では、ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｂｒｅｖｉｓＩＦＯ１２３３４の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対し、９９．８％の同一性を示した。しかし、得られた塩基配列と完全に一致する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物は存在しなかった。

このときの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。以上より、配列番号１に記載の塩基配列を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌は、標的微生物分解能を有することが示唆された。

［実験３．配列番号１に記載の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するＢｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓの形態観察及び生理・生化学的性状試験］
（方法）
菌株Ａについて、形態観察及び生理・生化学的性状試験を行った。これらの試験は、光学顕微鏡による形態観察、ＢＡＲＲＯＷらの方法（ＣｏｗａｎａｎｄＳｔｅｅｌ’ｓＭａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｅｄｉｃａｌＢａｃｔｅｒｉａ３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ１９９３、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ．）及びＡＰＩ５０ＣＨＢ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）によって行った。試験結果を表１～表３に示す。

（結果）
図１に示すように、菌株Ａのコロニーは、円形でクリーム状の形態を有していた。また、図２に示すように、菌株Ａは桿菌であり、グラム染色に陰性であった。菌株Ａは、表４に示す点で、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の相同性が最も高いＢｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＩＦＯ１２３３４と異なる特徴を有していた。そのため、菌株Ａは、従来のＢｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓとは異なる、新種の株であることが示唆された。菌株ＡをＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０として寄託した。

［実験４．Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の標的微生物分解能評価］

（材料）
・８０２培地：１０ｇポリペプトン、２ｇ酵母エキス、１ｇ硫酸マグネシウム七水和物を超純水に溶解し、ｐＨを７．０に調節した後、１０００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌した培地
・Ａ液:４．３５ｇリン酸水素二カリウム、１．７０ｇリン酸二水素一カリウム、８．９２ｇリン酸水素二ナトリウム１２水和物、０．３４ｇ塩化アンモニウムを超純水に溶解後、２００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
・Ｂ液:４．５０ｇ硫酸マグネシウム７水和物を超純水に溶解後、２００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
・Ｃ液:５．５０ｇ塩化カルシウム無水物を超純水に溶解後、２００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
・Ｄ液:０．０５ｇ塩化鉄６水和物を超純水に溶解後、２００ｍＬに調製し、０．２μｍのシリンジフィルターで濾過滅菌を行った溶液

（方法）
ミクロコッカス（標的微生物）を８０２培地で温度２５℃で培養し、集菌及び洗浄後、超純水９８６ｍＬに対し、濁度（ＯＤ６６０）０．２となるように混合し、高圧蒸気滅菌を行い、基質溶液を得た。９８６ｍＬの基質溶液に３．０ｍＬＡ液、３．０ｍＬＢ液、３．０ｍＬＣ液、３．０ｍＬＤ液、及び１．８ｍＬ１％リン酸溶液を混合し、無機培地を溶媒とする標的微生物含有溶液を得た。標的微生物含有溶液に含まれる標的微生物は標的死細菌である。

Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０を８０２培地に播種し、３０℃で２４～４８時間培養した。培養後、標的微生物含有溶液５．０ｍＬに対してＢｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養液５０μＬを添加し、２５℃、２００ｒｐｍで振とうし、経時的に試験管の濁度（ＯＤ６６０）を簡易濁度計（簡易ＯＤモニター、ｍｉｎｉｐｈｏｔｏ５１８Ｒ、ＴＡＩＴＥＣ社製）で測定した。結果を図３に示す。また、同じ方法で培養したパエニバチルスグリカニリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｇｌｙｃａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）の培養液５０μＬを標的微生物含有溶液５０ｍＬに添加して、濁度を測定した結果を図４に示す。陰性対照は、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養液を添加していない標的微生物含有溶液の濁度（ＯＤ６６０）である。

図３に示すように、陰性対照では、標的微生物含有溶液の濁度がほとんど変化しないのに対して、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養液を添加した標的微生物含有溶液では、添加前の５０％以下にまで濁度が低下した。また、図４に示すように、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．の培養液を添加した標的微生物含有溶液では、濁度の低下は見られなかった。以上の結果より、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓは標的微生物分解能を有することがわかった。

［実験５．Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物を含む微生物製剤の標的微生物分解能評価］
（方法）
Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＢＲＣ３３３１、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＢＲＣ１２３３３、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＢＲＣ１２３３４、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＢＲＣ１２３７４をそれぞれ８０２培地に播種し、３０℃で２４～４８時間培養した。培養後、培養液を０．２μｍのシリンジフィルターで濾過し、培養上清（培養物）を得た。標的微生物含有溶液５．０ｍＬに対して培養上清５０μＬを添加し、２５℃、２００ｒｐｍで振とうし、経時的に試験管の濁度（ＯＤ６６０）を簡易濁度計（簡易ＯＤモニター、ｍｉｎｉｐｈｏｔｏ５１８Ｒ、ＴＡＩＴＥＣ社製）で測定した。結果を図５に示す。陰性対照はＢｂ．Ｐａｒａｂｒｅｖｉｓの培養上清を添加していない標的微生物含有溶液の濁度（ＯＤ６６０）である。標的微生物含有溶液は、実験４と同じ溶液を用いた。Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＢＲＣ３３３１、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＢＲＣ１２３３３、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＢＲＣ１２３３４、及びＢｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＢＲＣ１２３７４は独立行政法人製品評価技術基盤機構から取得した。

（結果）
Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０以外の各Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ株についても、培養上清を添加することで、標的微生物含有溶液の濁度が低下していた。よって、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０以外のＢｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓも、標的微生物分解能を有していることがわかった。また、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓの培養物も、標的微生物分解能を有していることがわかった。

さらに、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養上清を添加した標的微生物含有溶液は、他のＢｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ株の培養上清を添加した標的微生物含有溶液よりも濁度が低下していた。Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０は、他のＢｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ株よりも標的微生物分解能に優れていることがわかった。

［実験６．Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物を含む微生物製剤の複数の標的微生物に対する分解能評価］
（材料）
・ＬＢ液体培地：５００ｍＬの超純水に対し、ＬＢＢｒｏｔｈ，１．１ＧＰＥＲＴＡＢＬＥＴ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌をした培地
・８０２培地：実験４と同じ
・細菌用培地：２０ｇグルコース、５ｇポリペプトン、３ｇ酵母エキス、３ｇ肉エキス、２ｇ硫酸アンモニウム、１ｇリン酸二水素一カリウム、０．５ｇ硫酸マグネシウム七水和物を超純水に溶解し、ｐＨを７．０に調節した後、１０００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌した培地
・ＹＭ培地：２０ｇグルコース、５ｇペプトン、３ｇ酵母エキス、３ｇモルトエキスを超純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した培地

表５に記載の標的微生物を同表に記載の培地及び培養温度で培養し、集菌及び洗浄後、超純水９８６ｍＬに対し、濁度（ＯＤ６６０）０．２～０．３となるように混合し、高圧蒸気滅菌を行い、基質溶液を得た。基質溶液に実験４と同じＡ液～Ｄ液及びリン酸溶液を混合し、様々な種類の細菌（死菌）を標的微生物とする標的微生物含有溶液を得た。

標的微生物含有溶の種類以外は実験５と同じ方法で、各標的微生物含有溶液にＢｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養上清を添加し、濁度を経時的に測定した。結果を図６～図１０に示す。

（結果）
Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養上清を添加した標的微生物含有溶液は、いずれも陰性対照に比べて濁度が低下しており、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ及びその培養物は、様々な種の標的微生物を分解できることがわかった。

［実験７．Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物を含む微生物製剤の汚泥分解能評価］
（材料）
余剰汚泥を洗浄後、超純水９８６ｍＬに対し、濁度（ＯＤ６６０）０．２となるように混合し、高圧蒸気滅菌を行い、余剰汚泥基質溶液を得た。余剰汚泥基質溶液中の標的微生物は、死菌である。９８６ｍＬ余剰汚泥基質溶液に、３．０ｍＬＡ液、３．０ｍＬＢ液、３．０ｍＬＣ液、３．０ｍＬＤ液、及び１．８ｍＬ１％リン酸を混合した余剰汚泥含有溶液を準備した。

（方法）
標的微生物を含む溶液として余剰汚泥含有溶液を用いたこと以外は実験５と同じ方法で、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養上清を余剰汚泥含有溶液に添加し、余剰汚泥含有溶液の濁度を経時的に測定した。

（結果）
図１１に示すように、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養上清を添加することにより、余剰汚泥含有溶液の濁度の低下が認められた。従って、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物は汚泥分解能を有することがわかった。

［実験８．Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物を含む微生物製剤の標的微生物分解能の温度感受性評価］
（方法）
Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養上清を標的微生物含有溶液に添加した後の振とう温度を変化させた以外は実験５と同じ方法で、標的微生物含有溶液の濁度を経時的に測定した。振とう温度は、２０℃、２５℃、３０℃又は３７℃であった。

（結果）
図１２に示すように、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養上清を添加した標的微生物含有溶液は、振とう温度２０℃～３７℃において、濁度が低下していた。Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物を含む微生物製剤は、温度２０℃でも標的微生物分解能を有していることがわかった。

［実験９．Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍＤＳＭ０２２１４８、及びＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９の各培養物上清を含む複合微生物製剤の汚泥分解能評価］
（材料）
余剰汚泥を洗浄後、超純水９８６ｍＬに対し、濁度（ＯＤ６６０）０．１５となるように混合し、高圧蒸気滅菌を行い、余剰汚泥基質溶液を得た。余剰汚泥基質溶液中の標的微生物は、死菌である。９８６ｍＬ余剰汚泥基質溶液に、３．０ｍＬＡ液、３．０ｍＬＢ液、３．０ｍＬＣ液、３．０ｍＬＤ液、及び１．８ｍＬ１％リン酸を混合した余剰汚泥含有溶液を準備した。

Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍＤＳＭ０２２１４８は、環境中から単離された細菌を用いた。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍＤＳＭ０２２１４８の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号８に示す。Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０とＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９との１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の同一性は８７％、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０とＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍＤＳＭ０２２１４８との１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の同一性は８９％であった。

（方法）
Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０を８０２培地に播種し、３０℃で２４～４８時間培養した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍＤＳＭ０２２１４８を８０２培地に播種し、３７℃で２４～４８時間培養した。Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９をＲ２Ａ培地に播種し、２５℃で２４～４８時間培養した。培養終了後、培養液を０．２μｍのシリンジフィルターで濾過し、培養上清（培養物）を得た。余剰汚泥含有溶液５．０ｍＬに対して各培養上清５０μＬを添加し、２５℃、２００ｒｐｍで振とうし、経時的に試験管の濁度（ＯＤ６６０）を簡易濁度計（簡易ＯＤモニター、ｍｉｎｉｐｈｏｔｏ５１８Ｒ、ＴＡＩＴＥＣ社製）で測定した。３種混合上清添加区では、各培養上清を１６．７μＬずつ添加した。結果を図１３に示す。陰性対照は培養上清を添加していない標的微生物含有溶液の濁度（ＯＤ６６０）である。

（結果）
図１３に示すように、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｕｂｓｐ．ｉｎａｑｕｏｓｏｒｕｍＤＳＭ０２２１４８、及びＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９の培養上清を単独で添加するよりも、それぞれを混合して添加することにより余剰汚泥含有溶液の大きな濁度の低下が認められた。従って、Ｂｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓＮＩＴＥＢＰ－０３０２０の培養物及び他２菌を含む複合微生物製剤も汚泥分解能を有することがわかった。

［参考実験１．標的微生物分解能を有する微生物の探索］
（方法）
ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌を炭素源とした培地を用いて、環境（水）中に存在する微生物群を培養することにより、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌を分解する微生物を集積培養した。次に、集積培養された微生物群から、増殖が良好であった数菌株を単離した。

（結果）
単離した菌株ごとにミクロコッカス属細菌分解能を調べたところ、１つの菌株にミクロコッカス属細菌分解能が認められた。以下、ミクロコッカス属細菌分解能が認められた菌株を「菌株Ｂ」と記すことがある。

［参考実験２．ミクロコッカス属細菌分解能を有する菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析］
（材料）
・Ｒ２Ａ培地：１０００ｍＬの超純水に対し、Ｒ２ＡＢｒｏｔｈ, ＤＡＩＧＯ(日本製薬株式会社製)を３.２ｇの割合で溶解し、高圧蒸気滅菌をした培地
・クローニング用フォワードプライマー（２７ｆ：配列番号２）
・クローニング用リバースプライマー（１４９２ｒ：配列番号３）
・シークエンス解析用プライマー（３３９Ｆ：配列番号４、５３６Ｒ：配列番号５、９０７Ｆ：配列番号６）

（方法）
菌株Ｂからイージー・エクストラクトｆｏｒＤＮＡ（エーエムアール株式会社製）を用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅させるための鋳型ＤＮＡとして用いた。

精製したＰＣＲ後の増幅産物１５０ｎｇ相当量と、シークエンス解析用プライマー（１０μＭ）０．３２μＬと、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）８．０μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０．０μＬとした反応液を調製した。この反応液をＰＣＲ装置に供し、増幅反応を行った。反応は、（１）９６℃、１分間、（２）９６℃、１０秒間、（３）５０℃、５秒間、（４）６０℃、４分間で行い、（２）～（４）の工程は２５サイクル繰り返し行った。得られた反応液を精製し、精製液をＤＮＡシーケンス解析（３７３０ｘｌＤＮＡＡｎａｌｙｚｅｒ）に供して、菌株Ｂから抽出した鋳型ＤＮＡの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した。

（結果）
得られた塩基配列を国際塩基配列データベース（ＤＤＢＪ／ＥＮＡ（ＥＭＢＬ）／ＧｅｎＢａｎｋ）に対してホモロジー解析を行った。基準株の中では、ＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｐｅｒｍａｎｅｎｔｉｆｒｉｇｏｒｉｓＥｕｒｌ＿９．５の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対し、同一性９８．１％を示した。しかし、得られた塩基配列と完全に一致する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は存在しなかった。

得られた１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号７に示す。このことから、配列番号７に記載の塩基配列を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌は、微生物分解能を持つことが示唆された。

［参考実験３．配列番号７に記載の塩基配列を有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するチューメバチルス（Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌の形態観察及び生理・生化学的性状試験］
（方法）
菌株Ｂについて、形態観察及び生理・生化学的性状試験を行った。これらの試験は、光学顕微鏡による形態観察、ＢＡＲＲＯＷらの方法（ＣｏｗａｎａｎｄＳｔｅｅｌ’ｓＭａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｅｄｉｃａｌＢａｃｔｅｒｉａ３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ１９９３、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ．）及びＡＰＩ５０ＣＨＢ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）によって行った。試験結果を表６～表９に示す。

（結果）
菌株Ｂは、１０℃で生育しなかったが、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の相同性が最も高いＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｐｅｒｍａｎｅｎｔｉｆｒｉｇｏｒｉｓＥｕｒｌ＿９．５にはこのような特徴がみられなかった。そのため、菌株Ｂは、従来のＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓとは異なる、新種であることが示唆された。菌株ＢをＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９として寄託した。

［参考実験４．Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９の標的細菌（死菌）に対する分解能評価］
（材料）
・Ｒ２Ａ培地：１０００ｍＬの超純水に対し、Ｒ２ＡＢｒｏｔｈ, ＤＡＩＧＯ（日本製薬株式会社製）を３.２gの割合で溶解し，高圧蒸気滅菌をした培地
・ＬＢ液体培地：５００ｍＬの超純水に対し、ＬＢＢｒｏｔｈ，１．１ＧＰＥＲＴＡＢＬＥＴ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌をした培地
・８０２培地：１０ｇポリペプトン、２ｇ酵母エキス、１ｇ硫酸マグネシウム七水和物を超純水に溶解し、ｐＨを７．０に調節した後、１０００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌した培地
・細菌用培地：２０ｇグルコース、５ｇポリペプトン、３ｇ酵母エキス、３ｇ肉エキス、２ｇ硫酸アンモニウム、１ｇリン酸二水素一カリウム、０．５ｇ硫酸マグネシウム七水和物を超純水に溶解し、ｐＨを７．０に調節した後、１０００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌した培地

・標的細菌（死菌）含有無機培地：９８６ｍＬ基質溶液、３．０ｍＬＡ液、３．０ｍＬＢ液、３．０ｍＬＣ液、３．０ｍＬＤ液、及び１．８ｍＬ１％リン酸を混合した培地
なお、上記の基質溶液及びＡ液～Ｄ液としては、以下のものを用いた。
基質溶液:表１０記載の標的細菌を同表記載の条件で培養し、集菌及び洗浄後、超純水９８６ｍＬに対し、濁度（ＯＤ６６０）０．２となるように混合し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
Ａ液:４．３５ｇリン酸水素二カリウム、１．７０ｇリン酸二水素一カリウム、８．９２ｇリン酸水素二ナトリウム１２水和物、０．３４ｇ塩化アンモニウムを超純水に溶解後、２００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
Ｂ液:４．５０ｇ硫酸マグネシウム７水和物を超純水に溶解後、２００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
Ｃ液:５．５０ｇ塩化カルシウム無水物を超純水に溶解後、２００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
Ｄ液:０．０５ｇ塩化鉄６水和物を超純水に溶解後、２００ｍＬに調製し、０．２μｍのシリンジフィルターで濾過滅菌を行った溶液

（方法）
Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９をＲ２Ａ培地に播種し、２５℃で２４時間～４８時間培養した。

培養終了後、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９培養液５０μＬと標的細菌（死菌）含有無機培地５．０ｍＬとを試験管に添加して、２５℃、２００ｒｐｍにて反応させ、経時的に試験管の濁度（ＯＤ６６０）を簡易濁度計（簡易ＯＤモニターｍｉｎｉｐｈｏｔｏ５１８Ｒ、ＴＡＩＴＥＣ社製）で測定した。標的細菌（死菌）含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）が、陰性対照の濁度（ＯＤ６６０）の５０％を示す経過日数を算出し、以下の基準で分解能の有無を判定した。
Ａ：０日以上２．０日未満
Ｂ：２．０日以上５．０日未満
Ｃ：５．０日以上
なお、陰性対照はＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９無添加の標的細菌（死菌）含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）を用いた。

（結果）
結果を表１１に示す。Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９を添加することにより、標的細菌（死菌）含有無機培地の濁度の低下が認められた。従って、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９は標的微生物（標的死細菌）を分解可能であった。

［参考実験５．Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９の標的細菌（生菌）に対する分解能評価］
（材料）
・標的細菌（生菌）含有無機培地：９８６ｍＬ滅菌水、３．０ｍＬＡ液、３．０ｍＬＢ液、３．０ｍＬＣ液、３．０ｍＬＤ液、１．８ｍＬ１％リン酸、及び標的細菌（生菌）を混合した溶液
なお、Ａ液～Ｄ液としては参考実験４と同じものを用いた。また、標的細菌（生菌）含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）は０．２となるように標的細菌（生菌）を混合した。

（方法）
標的細菌（生菌）含有無機培地を用いたこと以外は、参考実験４と同じ方法でＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９の標的細菌（生菌）に対する分解能を評価した。

（結果）
結果を表１２に示す。Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９を添加することにより、標的細菌（生菌）含有無機培地の濁度の低下が認められた。従って、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９は標的細菌（生菌）を分解可能であった。

［参考実験６．Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９の余剰汚泥（死菌）に対する分解能評価（１）］
・余剰汚泥（死菌）含有無機培地：９８６ｍＬ基質溶液、３．０ｍＬＡ液、３．０ｍＬＢ液、３．０ｍＬＣ液、３．０ｍＬＤ液、及び１．８ｍＬ１％リン酸を混合した培地
基質溶液:余剰汚泥を洗浄後、超純水９８６ｍＬに対し、濁度（ＯＤ６６０）０．２となるように混合し、高圧蒸気滅菌を行った溶液
基質溶液として上記のものを用いたこと以外は、参考実験４と同じものを用いた。

（方法）
余剰汚泥（死菌）含有無機培地を用いたこと以外は、参考実験４と同じ方法でＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９の余剰汚泥（死菌）に対する分解能を評価した。

（結果）
結果を表１３に示す。Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９を添加することにより、余剰汚泥（死菌）の濁度の低下が認められた。従って、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９は余剰汚泥（死菌）を分解可能であった。

［参考実験７．Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９の余剰汚泥（死菌）に対する分解能評価（２）］
（材料）
参考実験６と同じものを用いた。

（方法）
参考実験４と同じ方法で反応を行った。反応は５連で行い、反応開始後４日目に試験管中に残存する余剰汚泥を全量回収した。回収した余剰汚泥を乾燥後、余剰汚泥の乾燥重量を測定し、陰性対照群とＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９添加群とで有意差検定（ｔ検定、片側）を行った。

（結果）
結果を図１４に示す。陰性対照群と比較してＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９添加群では余剰汚泥の乾燥重量の有意な低下（ｐ＜０．０１）が認められた。従って、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９を添加することにより余剰汚泥を削減可能であった。

［参考実験８．様々な細菌のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌に対する分解能評価］
（材料）
標的細菌含有無機培地として、参考実験４で用いたＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌を標的細菌として含む標的細菌（死菌）含有無機培地を準備した。微生物分解能の有無を評価する細菌として表１４に示す細菌を準備した。

（方法）
参考実験４と同じ方法で、標的細菌含有無機培地と評価対象となる細菌を含む培養液とを混ぜ、評価対象となる細菌の微生物分解能を評価した。標的細菌含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）が、陰性対照の濁度（ＯＤ６６０）の５０％を示す経過日数を算出し、以下の基準で微生物分解能の有無を判定した。
Ａ：０日以上１．０日未満
Ｂ：１．０日以上４．０日未満
Ｃ：４．０日以上
なお、陰性対照は評価対象となる細菌を含む培養液を添加しなかった標的細菌含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）を用いた。

（結果）
結果を表１５に示す。また、表１４に記載の評価対象の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号７）との相同性検索を行い、算出された同一性割合を表１５に示す。表１５に記載の細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を、配列番号９～１８として示す。これらは独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）オンラインカタログ<https://www.nite.go.jp/nbrc/catalogue/NBRCDispSearchServlet?lang=jp>又は国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースカタログ<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/>に収載されている配列である。

Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９及びＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓａｌｇｉｆａｅｃｉｓＮＢＲＣ１０８７６５ｔはＡ判定であったが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌はＢ判定又はＣ判定であった。従って、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９及びＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓａｌｇｉｆａｅｃｉｓＮＢＲＣ１０８７６５ｔはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌よりも標的微生物（標的死細菌）分解能が優れていた。

Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓａｌｇｉｆａｅｃｉｓＮＢＲＣ１０８７６５ｔの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列との同一性は、９２．８％であった。一方、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌又はＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列との同一性は、９０％未満であった。このことから、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の同一性が、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９と９０％以上である細菌は、標的微生物分解能が優れていると考えられた。ＴｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓａｌｇｉｆａｅｃｉｓＮＢＲＣ１０８７６５ｔはＮＢＲＣから入手可能であり、その１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪデータベースにＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＪＸ１１０７１０として収載されている。

［参考実験９．Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉとを含む混合溶液の標的微生物分解能評価]
（材料）
標的細菌含有無機培地として、参考実験４で用いたＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌を標的細菌として含む標的細菌（死菌）含有無機培地を準備した。また、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５αとを含む溶液を準備した。

（方法）
まず、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９を２５℃で２４時間、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５αを３７℃で２４時間培養した。

培養後、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９培養液（ＯＤ６６０＝０．２に調製）とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５α培養液（ＯＤ６６０＝０．２に調製）とを表１６に示す比率で混合した混合溶液を準備した。調製した微生物製剤５０μＬと標的細菌含有無機培地５．０ｍＬとを試験管に添加して、２５℃、２００ｒｐｍにて反応させ、２日後に混合液の濁度（ＯＤ６６０）を簡易濁度計（簡易ＯＤモニター、ｍｉｎｉｐｈｏｔｏ５１８Ｒ、ＴＡＩＴＥＣ社製）で測定した。陰性対照の濁度（ＯＤ６６０）に対する、微生物製剤を添加した標的細菌含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）の割合を標的微生物の残存率として算出し、以下の基準で標的微生物分解能を評価した。
Ａ：０％以上５０％未満
Ｂ：５０％以上７０％未満
Ｃ：７０％以上
なお、陰性対照は混合溶液無添加の標的細菌含有無機培地の濁度（ＯＤ６６０）を用いた。

（結果）
結果を表１６に示す。Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉとを含む溶液は、良好な標的微生物分解能を示した。

［参考実験１０．Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９培養物の標的微生物分解能評価]
（材料）
標的細菌（生菌）含有リン酸緩衝液として６６ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２４）１０ｍＬ、及びＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌乾燥菌体（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）１０ｍｇを混合した溶液を用いた。

（方法）
まず、Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９をＲ２Ａ培地で一定時間、培養した。

培養後、培養液を遠心分離して、菌体を除いた培養上清を回収した。９６穴プレートに回収した培養上清１００μＬと標的細菌含有リン酸緩衝液１００μＬとを添加して、マイクロプレートリーダー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ社製）を用いてＡＢＳ４５０ｎｍを経時的に測定した。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌分解能（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）を算出し、以下の基準で標的微生物分解能を評価した。
Ｓ：２００（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）以上
Ａ：１００（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）以上２００（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）未満
Ｂ：２０（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）以上１００（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）未満
Ｃ：２０（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）未満
なお、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌分解能（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）は以下の式を用いて算出した。
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌分解能（ＵＮＩＴＳ／ｍＬ）
＝｛ΔＡＢＳ４５０ｎｍ／分（培養上清を添加した標的細菌含有リン酸緩衝液）－ΔＡＢＳ４５０ｎｍ／分（培養上清無添加の標的細菌含有リン酸緩衝液）｝／（０．００１×０．１）

（結果）
結果を表１７に示す。Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ＮＩＴＥＢＰ－０２７７９を一定時間培養した培養上清は、標的微生物分解能を有していることがわかった。

Claims

配列番号１に記載の塩基配列と９７％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、下記ａ）～ｄ）の少なくとも１つの性質を有し、標的微生物分解能を有する細菌であって、前記標的微生物が、下記１）～５）の少なくとも１つの微生物である、細菌；
ａ）グルコース発酵性を有さない、
ｂ）マンニトール発酵性を有さない、
ｃ）クエン酸利用性を有する、
ｄ）硝酸塩の還元能を有さない、
１）ミクロコッカス・リゾディクティクス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）、
２）サッカロミセスセレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、
３）エスケリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、
４）ブレビバチルスパラブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、
５）グルコノバクターオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ）。
配列番号１に記載の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１に記載の細菌。
配列番号１における第４２３番目の塩基がアデニンであること、第４４１番目の塩基がシトシンであること、第１２３６番目の塩基がグアニンであることの少なくとも１つを満たす、請求項２に記載の細菌。
前記標的微生物は、少なくともミクロコッカス・リゾディクティクスの死細菌である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細菌。
配列番号１に記載の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、
配列番号１における第４２３番目の塩基がアデニンであること、第４４１番目の塩基がシトシンであること、第１２３６番目の塩基がグアニンであることの少なくとも１つを満たす細菌。
受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０３０２０として寄託された細菌。
細菌（ａ１）またはその培養物を含む、汚泥分解用微生物製剤。
細菌（ａ１）：配列番号１に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するブレビバチルスパラブレビス。
前記細菌（ａ１）は、前記細菌（ａ１）の培養上清５０μＬをミクロコッカス・リゾディクティクスの死細菌含有溶液５．０ｍＬに添加して２５℃で反応させたときに、添加後の濁度（ＯＤ６６０）が添加前の濁度（ＯＤ６６０）の８０％以下となる細菌である、請求項７に記載の汚泥分解用微生物製剤。
微生物（ａ２）をさらに含み、前記細菌（ａ１）及び前記微生物（ａ２）の総数に対する前記細菌（ａ１）数は０．１％以上１００％未満である、請求項７又は８に記載の汚泥分解用微生物製剤。
微生物（ａ２）：細菌（ａ１）と異なる微生物。
前記微生物（ａ２）は、配列番号７に記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ標的微生物分解能を有する細菌、標的微生物分解能を有するバチルス属細菌、及び標的微生物分解能を有するパエニバチルス属細菌からなる群より選ばれる少なくとも１種を含み、
前記微生物（ａ２）の標的微生物は、下記１）～７）の少なくとも１つの微生物である、請求項９に記載の汚泥分解用微生物製剤；
１）ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、
２）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、
３）スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、
４）ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、
５）パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、
６）エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、
７）アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌。
請求項１～６のいずれか１項に記載の細菌又は請求項７～１０のいずれか１項に記載の汚泥分解用微生物製剤を汚泥に作用させる工程を含む、汚泥分解方法。
請求項１～６のいずれか１項に記載の細菌又は請求項７～１０のいずれか１項に記載の汚泥分解用微生物製剤を用いた、汚泥分解装置。