JP2016195588A - シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能を有するスフィンゴビウム属細菌、該細菌を含む微生物製剤、及びこれらを用いたシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法 - Google Patents

Abstract

【課題】シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能を有する微生物、微生物製剤及びこれらを用いたシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法を提供すること。【解決手段】本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ細菌は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群より選ばれる１つの塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する。（ａ）配列番号１に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が３塩基以下の塩基配列（ｂ）配列番号９に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２２塩基以下の塩基配列（ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２塩基以下の塩基配列【選択図】なし

Description

本発明は、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能を有するスフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌、該細菌を含む微生物製剤、及びこれらを用いたシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法に関する。

化学や鉄鋼といった重化学工業等における排水は、有機物を除去し、ヒト及び環境生物に対する影響を十分に低下させた状態で自然環境中に排出することが望まれている。

排水に含まれる有機物は工場等によって様々であるが、例えば、シクロプロパンカルボン酸誘導体等の有機物が含まれることがある。

有機物を除去するための排水処理方法としては、燃焼処理又は化合物分解性微生物を利用した生物学的処理方法等が用いられている。例えば、特許文献１には、有機物を含む排水を６００℃以上に加熱したチャンバー内に噴霧して含有有機物を熱分解・燃焼する排水の処理方法が記載されている。

特開２００４−７３９３８号公報

排水の燃焼処理は、有機物を除去するという観点からは有用な手段である。しかしながら、近年、地球環境に対する意識が社会全体で高まってきており、より環境に与える影響の少ない生物学的処理方法が注目されてきている。

本発明は、上記事情に鑑み、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能を有する微生物、微生物製剤及びこれらを用いたシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、シクロプロパンカルボン酸誘導体を含む培地で活性汚泥を馴養し、その活性汚泥からスクリーニングすることで、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能を有する新規のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌を取得し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、例えば、以下の［１］〜［１３］に関する。
［１］以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群より選ばれる１つの塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が３塩基以下の塩基配列
（ｂ）配列番号９に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２２塩基以下の塩基配列
（ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２塩基以下の塩基配列
［２］配列番号１に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が３塩基以下の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、スフィンゴビウム属細菌。
［３］配列番号９に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２２塩基以下の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、スフィンゴビウム属細菌。
［４］配列番号１０に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２塩基以下の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、スフィンゴビウム属細菌。
［５］配列番号１に記載の塩基配列を有する、［１］又は［２］に記載の細菌。
［６］配列番号９に記載の塩基配列を有する、［１］又は［３］に記載の細菌。
［７］配列番号１０に記載の塩基配列を有する、［１］又は［４］に記載の細菌。
［８］シクロプロパンカルボン酸誘導体が、（１Ｒ，３Ｒ）−２，２−ジメチル−３−（２−メチルプロップ−１−エン−１−イル）シクロプロパン−１−カルボン酸である、［１］〜［７］のいずれかに記載の細菌。
［９］受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０２４として寄託された、スフィンゴビウム属細菌。
［１０］受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１１として寄託された、スフィンゴビウム属細菌。
［１１］受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１２として寄託された、スフィンゴビウム属細菌。
［１２］［１］〜［１１］のいずれかに記載の細菌を含む、微生物製剤。
［１３］シクロプロパンカルボン酸誘導体に、［１］〜［１１］のいずれかに記載の細菌、又は［１２］に記載の微生物製剤を作用させることを含む、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法。

本発明によれば、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能を有するＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌、該細菌を含む微生物製剤及びこれらを用いたシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法を提供することが可能となる。

本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０２４）による化合物１分解の経時的変化を示す。 本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１１）による化合物１分解の経時的変化を示す。 本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１２）による化合物１分解の経時的変化を示す。

以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。

本明細書において、「シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能」とは、シクロプロパンカルボン酸誘導体を代謝して異なる化合物に変換する能力を指す。

（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌）
本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌は、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群より選ばれる１つの塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が３塩基以下の塩基配列
（ｂ）配列番号９に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２２塩基以下の塩基配列
（ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２塩基以下の塩基配列

本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の一実施形態としては、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が３塩基以下の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する。本実施形態のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列と比較したときの塩基の相違数が２塩基以下の塩基配列を有していてもよく、塩基の相違数が１塩基以下の塩基配列を有していてもよい。また、本実施形態のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列を有していてもよい。

配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の代表的な菌株としては、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０２４、原寄託日：２０１５年３月６日）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ、住所：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）にブダペスト条約に基づいて寄託されている菌株を挙げることができる。該菌株の菌学的性質については、後述する表１〜４に示す。

本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の別の実施形態としては、配列番号９に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２２塩基以下の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する。本実施形態のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号９に記載の塩基配列と比較したときの塩基の相違数が１０塩基以下の塩基配列を有していてもよく、塩基の相違数が５塩基以下の塩基配列を有していてもよい。また、本実施形態のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号９に記載の塩基配列を有していてもよい。

配列番号９に記載の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の代表的な菌株としては、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１１、原寄託日：２０１６年２月２４日）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ、住所：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）にブダペスト条約に基づいて寄託されている菌株を挙げることができる。該菌株の菌学的性質については、後述する表５〜８に示す。

本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の更なる実施形態としては、配列番号１０に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２塩基以下の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する。本実施形態のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号１０に記載の塩基配列と比較したときの塩基の相違数が１塩基以下の塩基配列を有していてもよい。また、本実施形態のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号１０に記載の塩基配列を有していてもよい。

配列番号１０に記載の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の代表的な菌株としては、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１２、原寄託日：２０１６年２月２４日）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ、住所：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）にブダペスト条約に基づいて寄託されている菌株を挙げることができる。該菌株の菌学的性質については、後述する表９〜１２に示す。

本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌は、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能を有している。シクロプロパンカルボン酸誘導体としては、例えば、（１Ｒ，３Ｒ）−２，２−ジメチル−３−（２−メチルプロップ−１−エン−１−イル）シクロプロパン−１−カルボン酸が挙げられる。

本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌のシクロプロパンカルボン酸誘導体分解活性は、反応条件（基質の種類及び濃度、反応液の組成、温度、ｐＨ、菌体数等）によって変化する。例えば、上述の本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の代表的菌株（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０２４）を５０ｍｇ／ｍＬの湿菌体濃度で用いることで、１００ｐｐｍのシクロプロパンカルボン酸誘導体を５日間で、ほぼ完全に分解することができる。

本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌は、対象微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析及びシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能の測定により、特定することができる。具体的には、対象微生物が、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群より選ばれる１つの塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能を有していれば、その対象微生物は、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌であると特定できる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が３塩基以下の塩基配列
（ｂ）配列番号９に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２２塩基以下の塩基配列
（ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２塩基以下の塩基配列

塩基配列解析において、対象微生物のＤＮＡから１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させる方法としては、特に制限されるものではなく、当業者が通常用いることができるユニバーサルプライマーを用いるＰＣＲ法等がある。ＰＣＲ法により得られた増幅産物を、ＤＮＡシークエンサー等に供し、塩基配列を解析することができる。

シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能を調べる方法としては、例えば、対象微生物と、シクロプロパンカルボン酸誘導体とを、適切な培地又は緩衝液中で一定時間反応させた後、培地又は緩衝液中におけるシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解を調べる方法が挙げられる。分解を調べる方法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＴＬＣ、ＮＭＲ、ＧＣ等を用いてシクロプロパンカルボン酸誘導体量の減少を検出する方法等が挙げられる。これらの塩基配列解析及びシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能の試験の結果に基づき、対象微生物が本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌であるかを判断できる。

本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌は、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能を有することから、シクロプロパンカルボン酸誘導体を多く含む排水の処理等に有用である。

（微生物製剤）
本実施形態の微生物製剤は、上記Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌を含む。

微生物製剤は、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の他に、必要に応じて、各種添加剤や担体を含むことができる。本実施形態の微生物製剤の具体例としては、細菌、添加剤及び担体を含み、細菌が、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌から実質的になる微生物製剤を挙げることができる。

担体としては、例えば、無機微粒子担体が挙げられる。無機微粒子担体としては、材質が金属及びその無機塩類又は酸化物であってもよく、炭素を含有するものであっても化学的に無機物に分類されるものであってもよく、又は有機態炭素の含有量が１％程度未満の純物質又は混合物であってもよい。無機微粒子担体としては、例えば、アルミナ（酸化アルミニウム）、ヒドロキシアパタイト（カルシウムリン酸ヒドロキシド）等の工業製品（規格外品や副産物、廃品を含む）、活性汚泥等の有機性廃棄物の焼却灰並びに火力発電又はコークス炉の燃えかすである石炭焼却灰等が挙げられる。

無機微粒子担体としては、中でも、安価であり、簡便な操作で得ることができ、また微生物の活性発現が短期間で生じるといった観点から、石炭焼却灰が好ましい。石炭焼却灰の中でも、クリンカアッシュ又はフライアッシュが好ましく、ふるい分け等を行わなくても中心粒子径が１００μｍ以下であることから、フライアッシュがより好ましい。無機微粒子担体としては、クリンカアッシュも粉砕して中心粒子径を調整することで、フライアッシュと同様に用いることができる。クリンカアッシュ又はフライアッシュの組成は、特に制限されるものではない。

無機微粒子担体の中心粒子径は、１μｍ〜１００μｍが好ましく、４μｍ〜７５μｍがより好ましく、１３μｍ〜２５μｍが更に好ましい。中心粒子径がこのような範囲の場合、対象化合物分解性微生物を含むバイオマス及び無機微粒子担体を混合した際に、両者が凝集しやすくなり、好適な量の対象化合物分解性微生物を含むバイオマスが無機微粒子担体に担持されやすくなる傾向にある。

無機微粒子担体の比重は、特に制限されないが、１．２〜３．５が好ましい。

無機微粒子担体は、培養初期の歩留まりを向上させることを目的として、必要に応じて、各種凝集剤を用いて凝集させてもよい。凝集剤としては、例えば、ノニオン性、カチオン性、アニオン性の高分子凝集剤等が挙げられる。

微生物製剤の製造方法としては、例えば、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌から実質的になる培養液又はバイオマス（活性汚泥等）と無機微粒子担体とを混合し、無機微粒子担体上に本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌を担持させ、これを培養して得られる微生物製剤を回収する方法が挙げられる。

培養方法としては、回分、半回分、流加、連続のいずれの方式を用いてもよい。培養方法としては、例えば、増殖が遅く菌体収率の低い微生物を効率的に調製するという観点から、特開平９−１８７２７２号公報に記載されるように、微生物を培養する容器（以下、反応槽という）へ供給する対象化合物の濃度を培養時間の経過に伴い、対数増加させる連続培養方式を用いてもよい。

（シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法）
本実施形態のシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法は、シクロプロパンカルボン酸誘導体に、上記Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌又は上記微生物製剤を作用させることを含む。

シクロプロパンカルボン酸誘導体に作用させる際のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌又は微生物製剤の量は、シクロプロパンカルボン酸誘導体の濃度、反応系の容積等を考慮し、適宜設定することができる。

本実施形態の分解方法における反応条件としては、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌が死滅しない又は該細菌が有するシクロプロパンカルボン酸誘導体の分解能が失われない条件であれば、特に制限されるものではない。このような条件としては、例えば、温度が２０〜３５℃であってもよく、２５〜３０℃であってもよく、ｐＨが６．５〜８．０であってもよく、７．０〜７．５であってもよい。

分解の確認方法は、特に制限されるものではなく、当業者が通常用いることができる方法により行われる。このような確認方法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＴＬＣ、ＮＭＲ、ＧＣ等を用いてシクロプロパンカルボン酸誘導体量の減少を検出する方法等が挙げられる。

実施例１．（１Ｒ，３Ｒ）−２，２−ジメチル−３−（２−メチルプロップ−１−エン−１−イル）シクロプロパン−１−カルボン酸（化合物１）の分解能を有する微生物群の探索
（方法）
化合物１を炭素源とした培地を用いて活性汚泥中に存在する微生物群を培養することにより、化合物１を分解する微生物を集積培養した。次に、集積培養された微生物群から、数菌株を単離し、単離した数菌株の化合物１分解能を評価した。

（結果）
単離した数菌株のうち、３つの菌株に化合物１分解能が認められた。

実施例２．化合物１の分解能を有するＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング及び塩基配列解析
（材料）
・ＬＢ液体培地：５００ｍＬの超純水に対し、ＬＢ Ｂｒｏｔｈ，１．１Ｇ ＰＥＲ ＴＡＢＬＥＴ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌をしたもの。
・ＬＢ寒天培地：ＬＢ Ａｇａｒ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌し、これをプラスチックシャーレに約２５ｍＬずつ分注したもの。
・クローニング用フォワードプライマー（２７ｆ：配列番号２）
・クローニング用リバースプライマー（１４９２ｒ：配列番号３）
・シークエンス解析用プライマー（Ｍ１３Ｆ：配列番号４、Ｍ１３Ｒ：配列番号５、３３９Ｆ：配列番号６、５３６Ｒ：配列番号７、９０７Ｆ：配列番号８）

（方法）
実施例１で化合物１分解能が認められた３つの菌株からＤＮＡを抽出し、クローニングの鋳型ＤＮＡとして用いた。

２５．０μＬの２×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製）、１０．０μＬのｄＮＴＰ ｍｉｘ（２ｍＭ）、１．５μＬのクローニング用フォワードプライマー及びクローニング用リバースプライマー（それぞれ１０ｐｍｏｌ／μＬ）、０．５８μＬの鋳型ＤＮＡ、１０．４μＬの滅菌水、１．０μＬのＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＦＸ、１Ｕ／μＬ、東洋紡社製）を、マイクロチューブに加え、混合した。マイクロチューブをＰＣＲ装置に供し、鋳型ＤＮＡの増幅反応を行った。反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）５０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。ＰＣＲ後の増幅産物を精製し、クローニングに用いた。

増幅産物とＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、クローニングを行った。１μＬのｐＣＲＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ、１μＬの増幅産物、１μＬのＳａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、３μＬの滅菌超純水を加えた反応液を室温で５分間混合後し、これを氷中に保存した。２μＬの上記反応液と５０μＬの大腸菌ＤＨ５α（Ｔａｋａｒａ社製）とを混合し、これを氷中に３０分間静置した。静置後、４２℃で３０秒間インキュベートし、これを氷中に保存した。この反応液にＳＯＣ培地を４５０μＬ加えた後、得られた混合物を３７℃、２００ｒｐｍ、１時間振盪培養した。ＬＢプレート（カナマイシン終濃度５０μｇ／ｍＬ）に培養液を塗布し、これを培養（３７℃、２０時間）した。

得られた大腸菌ＤＨ５αのコロニーをピックアップし、ピックアップされた大腸菌ＤＨ５αを４ｍＬのＬＢ培地（カナマイシン終濃度５０μｇ／ｍＬ）で３７℃、１６時間培養した。得られた大腸菌ＤＨ５αからプラスミド抽出装置（ＱＩＡｃｕｂｅ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出することにより、プラスミド溶液を得た。

得られたプラスミド溶液３．０μＬと、ＥｃｏＲＩを５Ｕ相当量と、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ １μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１０．０μＬとした混合液を調製した。この混合液を、３７℃にて２時間インキュベーションした。インキュベーションを行った後、ＥｃｏＲＩ処理したサンプルを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片がＥｃｏＲＩにより切り出されていることを確認した。

プラスミド溶液１５０ｎｇ相当量と、シークエンス解析用プライマー（１０μＭ）０．３２μＬと、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）８．０μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０．０μＬとした反応液を調製した。この反応液をＰＣＲ装置に供し、増幅反応を行った。反応は、（１）９６℃、１分間、（２）９６℃、１０秒間、（３）５０℃、５秒間、（４）６０℃、４分間で行い、（２）〜（４）の工程は２５サイクル繰り返し行った。得られた反応液をＤＮＡシーケンス解析に供して、化合物１の分解能を有する微生物から抽出した鋳型ＤＮＡの塩基配列を決定した。決定した塩基配列はＲＤＰ Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒを用いて属レベルで由来を決定した。

（結果）
塩基配列解析の結果、シークエンス解析に供したサンプルは、いずれもＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子であることが示唆された。このときの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号１、９及び１０に示す。このことから、配列番号１、９又は１０に記載の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌は、化合物１の分解能を持つことが示唆された。以下、配列番号１、９又は１０に記載の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌を、菌株Ａ、Ｂ又はＣと表すこともある。

実施例３．配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の同定試験
（方法）
菌株Ａについて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析、形態観察及び生理・生化学的性状試験を行った。これらの試験は、光学顕微鏡による形態観察、ＢＡＲＲＯＷらの方法（Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．）及びＡＰＩ２０ＮＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）によって行った。

（結果）
表１〜４に、形態観察及び生理・生化学的性状試験の試験結果を示す。配列番号１に記載の塩基配列は、基準株の中では、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ ＮＢＲＣ１５１０２の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対し、９９．７％と高い相同性を示した。しかし、配列番号１に記載の塩基配列と完全に一致する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は存在しなかった。

菌株Ａは、エスクリンを加水分解せず、Ｓｉｍｍｏｎ’ｓのクエン酸を利用しないが、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の相同性が最も高いＳ．ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ ＮＢＲＣ１５１０２にはこのような特徴がみられなかった。そのため、菌株Ａは、従来のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｙａｎｏｉｋｕｙａｅとは異なる、新規の株であることが示唆された。菌株ＡをＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０２４として寄託した。

実施例４．配列番号９に記載の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の同定試験
（方法）
菌株Ｂについて、上記同様に１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析、形態観察及び生理・生化学的性状試験を行った。

（結果）
表５〜８に、形態観察及び生理・生化学的性状試験の試験結果を示す。配列番号９に記載の塩基配列は、基準株の中では、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｃｚｅｃｈｅｎｓｅ ＬＬ０１Ｔの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対し、９８．４％と最も高い相同性を示した。しかし、配列番号９に記載の塩基配列と完全に一致する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は存在しなかった。

菌株Ｂは、硝酸塩を還元せず、アルギニンジヒドロラーゼやウレアーゼ等の活性を示さず、グルコース及びＬ-アラビノースを資化し、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール等を資化しなかった。また、菌株Ｂは、嫌気条件下で生育せず、デンプンを加水分解せず、スクロース、マルトース、フラクトース及びラムノースを酸化しなかった。菌株ＢとＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属の既知種との性状を比較した結果、菌株Ｂと一致する既知種は認められず、新規の株であることが示唆された。菌株ＢをＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１１として寄託した。

実施例５．配列番号１０に記載の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有するＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属細菌の同定試験
（方法）
菌株Ｃについて、上記同様に１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析、形態観察及び生理・生化学的性状試験を行った。

（結果）
表９〜１２に、形態観察及び生理・生化学的性状試験の試験結果を示す。配列番号１０に記載の塩基配列は、基準株の中では、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｘｅｎｏｐｈａｇｕｍ ＢＮ６Ｔの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対し、９９．８％と高い相同性を示した。しかし、配列番号１０に記載の塩基配列と完全に一致する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を持つ微生物は存在しなかった。

菌株Ｃは、Ｌ−アラビノースを資化し、ｄｌ−リンゴ酸を資化しないが、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の相同性が最も高いＳ.ｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｘｅｎｏｐｈａｇｕｍ ＢＮ６Ｔにはこのような特徴がみられなかった。そのため、菌株Ｃは、従来のＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｘｅｎｏｐｈａｇｕｍとは異なる、新規の株であることが示唆された。菌株ＣをＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１２として寄託した。

実施例６．Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０２４、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１１及びＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１２の化合物分解能解析
（材料）
・細菌用培地：２０ｇのグルコース、５ｇのポリペプトン、３ｇの酵母エキス、３ｇの肉エキス、２ｇの硫酸アンモニウム、１ｇのリン酸二水素カリウム、０．５ｇの硫酸マグネシウム七水和物を超純水に溶解し、ｐＨを７．０に調節した後、１０００ｍＬに調製し、高圧蒸気滅菌したもの。
・化合物１：ＡＬＤＲＩＣＨ社製

（方法）
Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０２４、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１１及びＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１２のグリセロールストックをそれぞれ４．０ｍＬの細菌用培地に植菌し、３０℃で２日間前培養した。前培養液４．０ｍＬを１００ｍＬの細菌用培地に添加し、３０℃で２日間培養した。

培養終了後、培養液を６，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を生理食塩液２０ｍＬで洗浄後、湿菌体濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。懸濁液１．０ｍＬと２００ｐｐｍの化合物１を含むリン酸緩衝液１．０ｍＬとをねじ口試験管に添加して、３０℃、２００ｒｐｍにて反応させた。

反応液２００μＬをサンプリングし、遠心分離により沈殿物を除去し、上清を回収した。回収した上清をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ １００ Ｋ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に添加し、１４，０００×gで１０分間遠心分離することにより、限外ろ過を行った。得られたろ液１００μＬを、下記の条件による液体クロマトグラフィーを用いて解析した。

ＨＰＬＣ条件
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ ＯＤＳ Ａ−２１１（４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、５μｍ、住化分析センター社製)
移動相：Ａ液０．０１％ＴＦＡ、Ｂ液アセトニトリル
溶出方法：アイソクラティック
溶出条件：Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０分、４０：６０
２０分、４０：６０
流量：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ

（結果）
図１には、湿菌体濃度５０ｍｇ／ｍＬのＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０２４を用いて、終濃度１００ｐｐｍの化合物１を分解した時の経時変化を示す。化合物１の基質残存率は、反応開始から１６時間後には１１％になり、４０時間後には４％になり、１１２時間後には０％になった。この結果、湿菌体濃度５０ｍｇ／ｍＬのＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０２４は、１００ｐｐｍの化合物１を、ほぼ５日間で完全に分解できることが示された。

図２には、湿菌体濃度５０ｍｇ／ｍＬのＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１１を用いて、終濃度１００ｐｐｍの化合物１を分解した時の経時変化を示す。化合物１の基質残存率は、反応開始から９０時間後には２０％になった。

図３には、湿菌体濃度５０ｍｇ／ｍＬのＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１２を用いて、終濃度１００ｐｐｍの化合物１を分解した時の経時変化を示す。化合物１の基質残存率は、反応開始から２４時間後には４８％になり、９０時間後には３８％になった。

Claims (13)

1. 以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群より選ばれる１つの塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属細菌。
   （ａ）配列番号１に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が３塩基以下の塩基配列
   （ｂ）配列番号９に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２２塩基以下の塩基配列
   （ｃ）配列番号１０に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２塩基以下の塩基配列
2. 配列番号１に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が３塩基以下の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、スフィンゴビウム属細菌。
3. 配列番号９に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２２塩基以下の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、スフィンゴビウム属細菌。
4. 配列番号１０に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が２塩基以下の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、シクロプロパンカルボン酸誘導体分解能を有する、スフィンゴビウム属細菌。
5. 配列番号１に記載の塩基配列を有する、請求項１又は２に記載の細菌。
6. 配列番号９に記載の塩基配列を有する、請求項１又は３に記載の細菌。
7. 配列番号１０に記載の塩基配列を有する、請求項１又は４に記載の細菌。
8. 前記シクロプロパンカルボン酸誘導体が、（１Ｒ，３Ｒ）−２，２−ジメチル−３−（２−メチルプロップ−１−エン−１−イル）シクロプロパン−１−カルボン酸である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細菌。
9. 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０２４として寄託された、スフィンゴビウム属細菌。
10. 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１１として寄託された、スフィンゴビウム属細菌。
11. 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２２１２として寄託された、スフィンゴビウム属細菌。
12. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細菌を含む、微生物製剤。
13. シクロプロパンカルボン酸誘導体に、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細菌、又は請求項１２に記載の微生物製剤を作用させることを含む、シクロプロパンカルボン酸誘導体の分解方法。
    

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