KR102581363B1 - 신규 바실러스 스미시 ep184 균주 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 내염성, 내산성, 내열성 등 환경 스트레스에 대해 저항성을 가지고 있어 유기성 폐기물 처리에 적합하고 특히 음식물 쓰레기 처리 시 우수한 분해력으로 높은 감량률을 나타내는 호열성 신규 바실러스 스미시 EP184 균주 및 그의 용도를 제공한다.
Description
본 발명은 신규 바실러스 스미시 EP184 균주에 관한 것으로 더 상세하게는 환경 스트레스에 우수한 저항성을 갖는 신규 바실러스 스미시 EP184 균주 및 그의 용도에 관한 것이다.
유기성 폐기물의 한 종류인 음식물 쓰레기의 발생량은 최근 증가함에 따라 각 가정에서도 음식물 쓰레기 보관 시 발생하는 악취 때문에 어려움을 겪고 있고 음식물 쓰레기의 수거, 저장, 처리과정에서 발생하는 악취로 인하여 민원이 발생하고 환경오염도 증가하고 있어 음식물 쓰레기의 처리 방안이 시급한 실정이다. 일부 잔여 음식물 쓰레기는 사료화 및 퇴비화되지만, 이를 위해서는 많은 에너지와 시간이 소요되므로, 대부분 소각되거나 매립되는데, 수분을 많이 함유하고 있는 음식물 쓰레기를 소각하는 경우에는 많은 에너지가 소요됨은 물론 소각에 따른 이산화탄소나 다이옥신 등의 발생을 유발시켜 대기환경에 악영향을 주는 요인으로 작용하고 있고 수거 후 소각이 이루어질 때까지 방치될 때 침출수와 악취가 발생하므로 대기 및 토양 오염을 가져오게 된다. 그 동안 이를 해결하기 위하여 음식물 쓰레기의 자원화 등 많은 노력을 해왔으나 종래 음식물 쓰레기 처리 방법은 매립, 소각, 해양투기, 자원화 등이 있었으나 상술한 바와 같이 음식물 쓰레기의 직매립 금지와 해양투기 금지됨에 따라 이를 대체하기 위한 다양한 방법이 시도되었는데 매립하는 경우에는 매립지를 확보하여야 하는 문제점과 매립 후 발생하는 침출수에 의하여 토양 및 지하수 오염이 발생하는 문제점을 가지고 있으므로, 이 또한 환경오염의 한 요인이 된다. 따라서 내염성, 내산성 등 환경 스트레스에 대해 저항성 및 효소 활성이 우수하여 함수율이 높은 음식물 쓰레기를 비롯한 유기성 폐기물의 처리에 적합한 균주의 개발이 요구된다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제2077433호는 호열성 세균 바실러스 스미시 균주 DSM 4216의 대량 속성 배양방법 및 이 종균 배양물을 함유하는 유기성 폐기물 처리용 미생물에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술은 음식물 쓰레기를 비롯한 유기성 폐기물에 처리 시 시간 경과에 따른 감량률이 저조한 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 내염성, 내산성 등 환경 스트레스에 대해 저항성을 가지고 있어 유기성 폐기물 처리에 적합하고 특히 음식물 쓰레기 처리 시 우수한 분해력으로 높은 감량률을 나타내는 호열성 신규 바실러스 스미시 EP184 균주 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 기탁번호 KCTC 15314BP로 수탁된 바실러스 시미시(Bacillus smithii) EP184 균주가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 균주를 포함하는, 유기성 폐기물 처리용 미생물 제제가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 균주를 급속 동결하여 분말 형태의 동결건조체를 제조하는 단계;
상기 동결건조체에 우드 펠렛, 활성탄, 왕겨를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
상기 혼합물을 유기성 폐기물에 처리한 후 24시간 내지 48시간 동안 발효하는 단계를 포함하는, 미생물 제제를 이용한 유기성 폐기물의 처리방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 신규 바실러스 스미시 EP184 균주는 내산성, 내염성, 내열성 등 환경 스트레스 저항성 및 효소 활성이 우수하여 음식물 쓰레기 처리용 미생물 제제로 활용할 수 있고 이외에 다른 다양한 유기성 폐기물을 효율적으로 처리함에 따라 비료화를 위한 유기성 폐기물 처리 제제로도 활용가능하다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 신규 바실러스 스미시 EP184 균주의 계통을 16S rRNA 계통수(phylogenetic tree)로 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 신규 바실러스 스미시 EP184 균주의 전장 유전체를 원형 지도(circular map)으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 신규 바실러스 스미시 EP184 균주의 온도별 생장 곡선 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 신규 바실러스 스미시 EP184 균주를 포함하는 음식물 쓰레기 처리용 미생물 제제 구성을 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명의 신규 바실러스 스미시 EP184 균주의 전장 유전체를 원형 지도(circular map)으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 신규 바실러스 스미시 EP184 균주의 온도별 생장 곡선 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 신규 바실러스 스미시 EP184 균주를 포함하는 음식물 쓰레기 처리용 미생물 제제 구성을 나타내는 사진이다.
용어의 정리:
본 문서에서 사용되는 용어 "바실러스 스미시(Bacillus smithii) 균주"는 한국 전통 발효식품이나 치즈 등과 같은 발효 식품에서 흔히 발견되는 박테리아로, 토양에서 발견될 수도 있다. 그람 양성의 호열, 호산성 박테리아로 약 50~60℃이 최적 배양 조건이다. 가혹한 환경에 저항하기 위하여 포자 형태로 존재할 수도 있다. 상기 바실러스 스미시 균주는 내산성, 내염성 및 내열성 등의 스트레스에 강한 특성이 있는데 상기 내산성(acid tolerance)이란 산성 환경에 잘 견디어 내는 성질을 의미하고, 내염성(salt tolerance)은 염분에 잘 견디어 내는 성질을 의미하며, 내열성(heat tolerance)는 열에 잘 견디어 내는 성질을 의미한다. 이는 미생물 처리기의 내부 환경에서 생존하기 위한 중요한 요소이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "유기성폐기물(organic waste)"은 일반 및 산업폐기물 중에서도 주로 유기물을 주체로 하는 폐기물을 말한다. 볏짚 및 보리짚과 같은 농업 부산물, 가축분뇨, 인분뇨, 나무껍질, 산업폐수오니, 식품산업폐기물, 생활하수오니 등이 있다. 유기성폐기물을 그대로 작물생산에 이용하면 여러 가지 장해가 일어나는 경우가 있어 비료화, 퇴비화(composting), 발효 처리하여 사용한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "음식물 쓰레기(food waste)"는 소비되고 남은 음식물을 말하는 것으로 다량으로 음식물 쓰레기를 배출하는 것은 낭비이면서 동시에 처리 비용이 들기 때문에 세계 각국에서는 음식물 쓰레기를 줄이기 위해 노력하고 있고 여러 선진국에서는 음식물 쓰레기를 다른 쓰레기와 다르게 수거하여 친환경적으로 처리하거나 자원으로 활용하는 경우도 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 기탁번호 KCTC 15314BP로 수탁된 바실러스 시미시(Bacillus smithii) EP184 균주가 제공된다.
상기 균주에 있어서, 환경 스트레스에 대해 저항성을 가질 수 있고 상기 환경 스트레스는 내산성, 내염성 또는 내열성일 수 있다.
상기 균주에 있어서, 성장 온도범위가 50 내지 60℃이고 pH 2.5~3까지 내산성을 나타내며 염농도 10%에서도 생육이 가능할 수 있다. 또한 상기 균주는 알칼리 포스파타제(Alkaline phosphatase), 에스테라제(esterase), 에스테라제 리파제(esterase lipase), 산성 포스파타제(acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포하이드롤라제(Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다제(α-galactosidase) 및 α-글루코시다제(α-glucosidase)를 포함하는 군으로부터 선택되는 효소에 대한 활성을 가질 수 있다.
상기 균주에 있어서, 유기성 폐기물에 대해 분해 활성을 가질 수 있고 상기 유기성 폐기물은 음식물 쓰레기, 농업 부산물, 축산분뇨, 산업폐수오니 또는 생활하수오니일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 균주를 포함하는, 유기성 폐기물 처리용 미생물 제제가 제공된다.
상기 미생물 제제에 있어서, 우드 펠렛 35~55 중량부, 활성탄 20~40 중량부, 및 왕겨 10~20 중량부를 추가로 포함할 수 있고 더 바람직하게는 상기 균주 5~15 중량부, 우드 펠렛 35~55 중량부, 활성탄 20~40 중량부 및 왕겨 10~20 중량부를 포함할 수 있으며 보다 더 바람직하게는 상기 균주 7~15 중량부, 우드 펠렛 37~50 중량부, 활성탄 25~35 중량부, 및 왕겨 12~17 중량부를 포함할 수 있다.
상기 미생물 제제에 있어서, 상기 유기성 폐기물 처리용 미생물 제제는 분말, 액상 또는 젤 타입으로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 균주를 급속 동결하여 분말 형태의 동결건조체를 제조하는 단계;
상기 동결건조체에 우드 펠렛, 활성탄 및 왕겨를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
상기 혼합물을 유기성 폐기물에 처리한 후 24시간 내지 48시간 동안 발효하는 단계를 포함하는, 미생물 제제를 이용한 유기성 폐기물의 처리방법이 제공된다.
유기성 폐기물, 특히 음식물쓰레기의 처리는 일반적으로 유기물 및 수분의 빠른 제거 및 신속한 쓰레기 처리를 위해 고온에서 수행하는 것이 바람직하다. 그러나 미생물 제제를 포함하는 음식물쓰레기 처리 장치의 경우 통상적으로 고온에서 미생물의 증식이 불가능한 특성상, 음식물쓰레기의 처리 및 분해 공정이 가능한 온도 조건 제한의 단점이 있다. 그러나 본 발명의 호열성 바실러스 스미시 EP184 균주는 고온에서도 증식이 가능함과 동시에 우수한 음식물 쓰레기 처리 효과를 나타어 고온에서도 음식물 쓰레기의 악취를 감소시키고 감량률을 현저히 증가시키는 처리 공정을 효율적으로 수행할 수 있다. 또한, 현재 주로 사용되고 있는 중온성 미생물 음식 처리 공법은 음식물과 함께 유입되는 타 미생물의 성장에 따라 음식물 처리기 내 미생물 시스템의 교란이 발생하여 음식물 처리의 안정성이 저해되는 반면, 고온에서 생장하는 상기 균주를 이용하면 타 미생물의 성장이 저해되고, 상기 고온성 미생물만의 시스템이 안정하게 유지되어 음식물 처리에 용이하다는 장점이 있다.
본 발명자들은 환경 스트레스에 대한 저항성을 나타내고 음식물 쓰레기에 대한 분해력을 갖는 바실러스 스미시 EP184(KCTC 15314BP) 균주를 선발하였다. 그 후 급속동결 건조된 파우더 형태의 바실러스 스미시 EP184를 이용하여 환경 스트레스 저항성 분석을 분석한 결과 상기 균주는 내산성, 내염성 또는 내열성 등을 포함하는 환경 스트레스에 대해 저항성을 갖는 것으로 나타났다. 또한 상기 균주에 우드 펠렛, 활성탄 및 왕겨를 첨가하여 음식물 쓰레기 처리용 미생물 제제를 제조 후 음식물 쓰레기의 분해력을 관찰한 결과 48시간 경과 후 99% 이상의 매우 우수한 처리 감량률을 나타내었다. 따라서 바실러스 스미시 EP184 균주는 음식물 쓰레기를 비롯한 유기성 폐기물의 처리를 위한 미생물 제제 소재로 활용가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
균주 선발
본 발명자들은 한국 전통 식품인 청국장 유래 환경 스트레스 저항성을 갖는 균주를 선발하기 위해 청국장 시료를 전국 각지에서 수거하여 1X PBS에 현탁 후 단계 희석하였다. 상기 각각의 현탁액은 100 ㎕씩 NB 평판배지에 도말하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였고, 배지 상에 형성된 집락을 1차적으로 형태학적 특징에 따라 분류하였다. 1차 분류된 균주는 순수 배양하여 25% 글리세롤(glycerol)을 이용하여 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였고, 추가적인 연구를 위해 사용하였다. 후보 균주 중 형태학적 특징이 바실러스 속과 유사한 집락만을 2차 분류하여 바실러스 스미시 16S rRNA 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 바실러스 스미시로 확인된 최종 후보 균주를 바실러스 스미시(Bacillus smithii) EP184로 명명하였다.
실시예 1: 계통수 조사
본 발명자들은 상기 분리 후 선발 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석하여 계통수를 조사하였다. 구체적으로 선발 균주의 게놈(genomic) DNA를 추출하였고 범용 프라이머(universal primer) 27F 및 1492R을 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 후, 증폭된 상기 균주의 16S rRNA 염기서열을 BLAST를 이용하여 상동성 비교하였고 MEGA 6 프로그램의 neighbor-joining 방법을 이용하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다. 그 결과, 상기 바실러스 스미시 EP184 균주는 바실러스 스미시 JCM 9076과 가장 유사하였으며, 바실러스 썰모톨렌스(Bacillus thermotolerans), 바실러스 애로라투스(Bacillus aerolatus)와도 유사하였다(도 1). 또한, 상기 균주를 2023년 2월 6일자로 KCTC(Korean Collection for Type Culture, 한국생명공학연구원 생물자원센터)에 수탁번호 KCTC 15314BP로 기탁하였다. 상기 프라이머의 핵산서열 정보를 하기 표 1에 나타내었다.
프라이머 | 핵산서열(5'-->3') | 서열번호 |
27F | AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG | 2 |
1492R | GGT TAC CTT GTT ACG ACT T | 3 |
실시예 2: 생화학적 동정
본 발명자들은 API kit(bioMerieux, USA)를 사용하여 본 발명의 바실러스 스미시 EP184 균주의 생화학(Biochemical), 동화(Assimilation) 및 발효(Fermentation) 시험을 수행하였다. 구체적으로 바실러스 스미시 EP184를 현탁하여 기질이 들어있는 큐플(cupules)에 접종하여 배양하였고, 발색시약을 첨가하여 물질의 대사 유무를 색의 변화로 판정하였다. 또한, 특정 탄수화물이 유일한 탄소원으로 들어있는 cupules에 균주를 배양하여 당 이용성을 탁도 변화로 판정하였으며 당으로부터 생산된 산에 의해 변화된 pH를 측정하여 발효 여부를 판단하였다. 또한 제조사 프로토콜에 따라 3시간, 6시간, 및 24시간 마다 결과를 확인하였다. 그 결과 본 발명의 호열성 균주인 바실러스 스미시 EP184는 에리트리톨(Erythritol)을 포함한 27종의 당을 이용하는 것으로 확인되었다. 상기 API kit를 이용한 분리 균주의 생화학적 동정 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
번호 | 테스트 | 시간(hr) | 번호 | 테스트 | 시간(h) | ||||
3 | 6 | 24 | 3 | 6 | 24 | ||||
1 | Glycerol | - | - | - | 26 | Salicin | - | - | + |
2 | Erythritol | - | - | + | 27 | D-cellobiose | - | - | + |
3 | D-arabinose | - | - | - | 28 | D-maltose | - | + | + |
4 | L-arabinose | - | - | + | 29 | D-lactose | - | - | - |
5 | D-ribose | - | + | + | 30 | D-melibiose | - | - | - |
6 | D-xylose | + | 31 | D-sucrose | - | ||||
7 | L-xylose | - | - | - | 32 | D-trehalose | + | + | + |
8 | D-adonitol | - | - | - | 33 | Inulin | - | - | - |
9 | Methyl-βD-xylopyranosi | - | - | - | 34 | D-melezitose | - | - | + |
10 | D-galactose | - | + | + | 35 | D-raffinose | - | - | - |
11 | D-glucose | + | + | + | 36 | Starch | - | - | + |
12 | D-fructose | + | + | + | 37 | Glycogen | - | - | + |
13 | D-mannose | + | + | + | 38 | Xylitol | - | - | - |
14 | L-sorbose | - | - | 39 | Gentiobiose | - | - | - | |
15 | L-rhamnose | - | - | - | 40 | D-turanose | - | + | + |
16 | Dulcitol | - | - | - | 41 | D-lyxose | - | - | + |
17 | Inositol | - | - | - | 42 | D-tagatose | - | - | - |
18 | D-mannitol | - | + | + | 43 | D-fucose | - | - | - |
19 | D-sorbitol | - | - | + | 44 | L-fucose | - | - | - |
20 | Methyl-αD-mannopyran oside |
- | - | - | 45 | D-arabitol | - | - | + |
21 | Methyl-αD-glucopyrano side |
- | - | - | 46 | L-arabitol | - | - | - |
22 | N-acetyl-glucosamine | - | - | - | 47 | Potassium gluconate | - | - | + |
23 | Amygdalin | - | - | - | 48 | Potassium 2-ketogluconate |
- | - | - |
24 | Arbutin | - | - | + | 49 | Potassium 5-ketogluconate |
+ | + | + |
25 | Esculin ferric citrate | + | + | + |
실시예 3: 전장 유전체 분석
본 발명자들은 바실러스 스미시 EP184가 기존의 바실러스속 균주와의 차이점을 확인하기 위해 전장유전체 분석을 수행하였다. 구체적으로 균주는 영양 배지(NB)에서 24시간 배양한 후, NucleoSpin kit(Macherey-Nagel,Germany)를 사용하여DNA는 추출하였다. 그 후 High sensitivity range kit(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 상기 추출된 DNA의 수율을 정량하였다. 이어서, TruSeq Nano DNA LT kit(illumina, USA)를 이용하여 게놈 DNA에 대한 시퀀싱 라이브러리(sequencing library)를 제작하였고 MiSeq Illumina 시스템을 사용하여 시퀀싱을 수행하였다. 그 후 FastQC v.0.11.8을 사용하여 품질 관리를 위해 개별 시퀀스 리드를 확보하였다. 상기 Illumina 시퀀싱 데이터는 Trimmomatic v0.39를 사용하여 최적화된 설정(LEADING, 10; TRAILING, 10; SLIDINGWINDOW, 4:20; MINLEN, 200)으로 저품질 염기 및 어댑터 시퀀스를 제거하였으며, 트리밍된 시퀀스는 bowtie2 v2.3.5.1을 사용하여 phiX 게놈에 대해 정렬하고 samtools v1.9로 필터링하였다. 그 후 조립된 contig 각각은 Patric 및 RAST의 박테리아 데이터베이스를 사용하여 주석을 달았고, contig 서열에서 CDS, rRNA 및 tRNA를 식별하였다. 그 결과, 본 발명의 바실러스 스미시 EP184는 3,543,979 bp의 단일 원형 염색체와 40.57%의 구아닌-시토신 함량을 가지고 있음을 확인하였다. 단백질 코딩 유전자는 3,325개였으며, rRNA와 tRNA를 각각 33개, 98개 가지고 있었다. 상기 정보를 토대로 Minimum information about a Genome Sequence(MIGS)(하기 표 3 참조)를 작성하였으며, 이에 대한 원형 플롯(Circular plot)을 도 2에 나타내었다. 구체적으로 기존에 잘 알려진 B. smithii의 표준균주(KCTC 3618)의 단일 원형 염색체 크기는 3,368,778 bp로 EP184와 약 175,201 bp의 차이가 있으며, 단백질 코딩 유전자는 3,627개로 EP184와 302개 차이가 난다. 상기 결과는 본 발명의 바실러스 스미시 EP184가 기존의 표준균주와는 다른 신규한 균주임을 시사하는 것이다. 상기 전장 유전체 분석 결과를 하기 표 3에, 전장 유전체 내 효소 유전자를 확인한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
항목 | 세부정보 |
일반적인 특징 | |
분류 |
Domain Bacteria |
Phylum Firmicutes | |
Class Bacilli | |
Order Bacillales | |
Family Bacillaceae | |
Genus Bacillus | |
그람 균주 | 양성 |
세포 형태 | 막대 |
운동성 | 운동성 |
포자 형성 | 내배엽 형성 |
온도 범위 | 20-55°C, 50 ± 5°C에서 최적 |
염분 범위 | NaCl, 0-6% |
pH 범위 | 3-8, 및 5에서 최적 |
시퀀싱 | |
시퀀싱 방법 | Illumina MiSeq |
조립 방법 | Unicycler, version 0.4.8 |
주석 출처 | RAST 서버 |
게놈 커버리지 | 297 |
게놈 크기 | 3,543,979 |
반복실험 횟수 | 1 |
G + C 함량 | 40.57% |
단백질 암호화 유전자 | 3,325 |
rRNA | 33 |
tRNA | 98 |
tmRNA | 0 |
영역 | 길이(bp) | 유전자 | EC번호 | 생산물 |
56120-57001 | 882 | YabG | 3.4.-.- | Sporulation-specific protease YabG |
85483-87486 | 2004 | ftsH | 3.4.24.- | ATP-dependent zinc metalloprotease FtsH |
279916-281583 | 1668 | epr | 3.4.21.- | Minor extracellular protease Epr |
290541-291113 | 573 | yraA_1 | 3.2.-.- | Putative cysteine protease YraA |
428032-429495 | 1464 | ctpB | 3.4.21.102 | Carboxy-terminal processing protease CtpB |
462625-464151 | 1527 | bepA_1 | 3.4.-.- | Beta-barrel assembly-enhancing protease |
470294-469701 | 594 | clpP | 3.4.21.92 | ATP-dependent Clpprotease proteolytic subunit |
962667-963938 | 1272 | htpX | 3.4.24.- | Protease HtpX |
1100133-1101401 | 1269 | albF | 3.4.24.- | Putative zinc protease AlbF |
1260031-1257869 | 2163 | clpE | ATP-dependent Clpprotease ATP-binding subunit ClpE | |
1452740-1453282 | 543 | clpQ | 3.4.21.- | ATP-dependent protease subunit ClpQ |
1453297-1454709 | 1413 | clpY | ATP-dependent protease ATPase subunit ClpY | |
1490625-1491881 | 1257 | rasP | 3.4.24.- | Regulator of sigma-W protease RasP |
1509951-1511189 | 1239 | 3.4.24.- | putative zinc protease | |
1914325-1913453 | 837 | clpX_1 | ATP-dependent Clpprotease ATP-binding subunit ClpX | |
2044880-2043405 | 1476 | ctpA | 3.4.21.102 | Carboxy-terminal processing protease CtpA |
2129626-2128370 | 1257 | bepA_2 | 3.4.-.- | Beta-barrel assembly-enhancing protease |
2162528-2161854 | 675 | prsW | 3.4.-.- | Protease PrsW |
2332456-2331263 | 1194 | gluP | 3.4.21.105 | Rhomboid protease GluP |
2391609-2390446 | 1164 | gpr | 3.4.24.78 | Germination protease |
2562677-2560353 | 2325 | lon1 | 3.4.21.53 | Lon protease 1 |
2564685-2563024 | 1662 | lon2 | 3.4.21.53 | Lon protease 2 |
2566172-2564901 | 1272 | clpX_2 | ATP-dependent Clpprotease ATP-binding subunit ClpX | |
3096581-3097135 | 555 | yraA_ 2 |
3.4.22.- | |
3195234-3195956 | 723 | MroQ | 3.4.22.- | Membrane-embedded CAAX protease MroQ |
3514880-3513675 | 1206 | htrB | 3.4.21.107 | Serine protease Do-like HtrB |
실시예 4: 효소 활성 확인
본 발명자들은 API ZYM kit(bioMerieux, USA)를 사용하여 바실러스 스미시 EP184 균주의 효소 활성 검사를 수행하였다. 구체적으로 PBS에 현탁한 분리 균주를 cupules에 접종하여 55℃에서 4시간 동안 배양하였고, 변화된 색으로 효소 활성 여부를 판단하였다. 그 결과, 바실러스 스미시 EP184는 Alkaline phosphatase, esterase, esterase lipase, acid phosphatase, Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase, α-galactosidase, 및 α-glucosidase에 대해 활성을 나타내었다. 상기 균주의 효소 활성 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
번호 | 테스트 | 결과 | 번호 | 테스트 | 결과 |
1 | 대조군 | - | 11 | Acid phosphatase | + |
2 | Alkaline phosphatase | + | 12 | Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase | + |
3 | Esterase (C4) | + | 13 | α-galactosidase | + |
4 | Esterase Lipase (C8) | + | 14 | β-galactosidase | - |
5 | Lipase(C14) | - | 15 | β-glucuronidase | - |
6 | Leucine arylamidase | - | 16 | α-glucosidase | + |
7 | Valine arylamidase | - | 17 | β-glucosidase | - |
8 | Cystinearylamidase | - | 18 | N-acetyl-β-glucosaminidase | - |
9 | Trypsin | - | 19 | α-mannosidase | - |
10 | α-chymotrypsin | - | 20 | α-fucosidase | - |
실시예 5: 환경 스트레스 저항성 분석
5-1: 내산성
본 발명에서 수행한 내산성 분석은 pH 2~7의 조건에서 배양하였을 때의 생존율을 대조구(pH 7)와 비교하여 생균수 및 생존율로 나타내었다. 산성 조건은 1X PBS에 pH를 조절하여 인공산성액을 제조하여 사용하였다. 그 결과, 바실러스 스미시 EP184는 pH 3에서도 4.53 × 106 CFU/mL의 생존율을 나타내었으며, pH 4~7의 범위에서는 1 × 107 CFU/mL 이상을 유지하며 pH 5에서는 pH 7의 환경에서보다 높은 생존율을 보이며 Acidophile(호산성)한 결과를 나타내었다. 상기 내산성 실험 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
pH | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
생존율(%) | - | 0.51±0.04 | 35.83±17.66 | 131.76±8.05 | 84.12±18.22 | 100 |
CFU/mL | - | 4.53x106 | 3.18x108 | 1.17x109 | 8.87x108 | 8.94x108 |
5-2: 내염성
내염성 분석은 배지 상에 염분(NaCl, 1~10%)을 첨가하여 배양하였을 때의 생존율 및 생균수를 대조군(0%)과 비교하였다. 그 결과, 바실러스 스미시 EP184는 배지 내 염분이 1~4%일 때는 생존율이 70% 이상으로 나타났고, 균수에도 큰 변화가 나타나지 않으며, 염분이 10%가 되더라도 106 CFU/mL이상 생존함을 확인하였다. 상기 내염성 실험 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
염분(%) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
생존율(%) | 100 | 72.53±3.51 | 65.49±9.87 | 75.95±29.84 | 1.08±0.06 | 0.81±0.11 | 0.79±0.08 |
CFU/mL | 8.9x108 | 6.45x108 | 5.82x108 | 6.75x108 | 9.61x106 | 7.20x106 | 7.03x106 |
5-3: 온도별 성장 곡선
온도별 성장 정도를 확인하기 위하여 본 발명의 바실러스 스미시 EP184 균주를 25, 37, 55℃에서 150 rpm으로 배양하면서 24시간 동안 4시간 간격으로 흡광도(600 nm)를 측정하였다. 그 결과, 24시간 이내에서는 바실러스 스미시 EP184가 55℃의 조건에서만 생장함을 확인하였다(도 3). 이는 다른 바실러스속 균주와는 다르게 음식물 처리기기 내의 높은 온도에서도 버틸 수 있는 중요한 미생물(호열성)의 특징이라 할 수 있다.
실시예 6: 음식물 쓰레기 분해용 미생물 제제
본 발명자들은 음식물 쓰레기 분해용 미생물 제제의 제조를 위해 본 발명의 바실러스 스미시 EP184를 급속 동결건조하여 가루형태의 동결건조물을 확보하였다. 그 후, 상기 건조물에 우드 펠렛, 활성탄 및 왕겨를 첨가하여 음식물 쓰레기 처리용 미생물 제제를 제조하였다(도 4). 상기 미생물 제제의 구성성분 및 중량비를 하기 표 8에 요약하였다.
구성성분 | 중량비(%) |
바실러스 스미시 EP184 | 5~15 |
우드 펠렛 | 35~55 |
활성탄 | 20~40 |
왕겨 | 10~20 |
실시예 7: 음식물 쓰레기 분해력 시험
본 발명의 바실러스 스미시 EP184의 음식물 쓰레기 분해력 시험은 시중에 판매되는 "H"사의 A 기기와 B 기기를 이용하여 수행하였다. 구체적으로 시험은 환경부 고시 환경표지 인증기준 EL767:2022 "음식쓰레기 감량화 기기"에 준하여 시험을 진행하였으며, 시험 시작 당시 환경은 20±2℃, 38±4% R.H.로 유지하였고 시험 종료 시에도 수치는 동일하였다. 분해력 시험은 미생물 제제의 활성화 1일을 포함하여 총 3일간 진행하였으며, 시험에 사용된 음식물 쓰레기는 환경부 고시 기준표에 따라 조성비를 곡물류 16±2% , 채소류 51±5%, 과일류 14±2%, 어육류 19±2%를 사용하였다. 그 후, 제조사의 권장 음식물 투여량을 준수하여 A 기기의 경우 음식물 쓰레기 1 kg을 투입하였으며, B 기기의 경우 음식물 쓰레기 0.5 kg을 투입하였으며 24시간 및 48시간 경과 후의 중량을 초기 중량과 비교하여 백분율로 나타내었다. 그 결과, A 및 B 기기의 24시간 감량률은 각각 64%, 90%로 차이가 났지만 48시간 경과 후 처리 감량률은 모두 99% 이상으로 나타내었다. 상기 A 및 B 기기의 쓰레기 중량 변화, 발효 감량 중량, 감량률을 하기 표 9 내지 14에 요약하였다.
기간 | 항목 | 내용 | 중량(kg) | |
Day 0 |
A |
바실러스 스미시 EP 184 미생물 제제 중량 |
활성화된 미생물 제제가 포함된 음식물 처리기의 전체 중량 - 음식물 처리기 중량 | 2.68 |
B |
바실러스 스미시 EP 184 미생물 제제 + 시료 (음식물 쓰레기) |
활성화된 미생물 제제가 포함된 음식물 처리기에 시료 투입 후 중량 - 음식물 처리기 중량 | 3.68 | |
Day 1 |
C |
바실러스 스미시 EP 184 미생물 제제 + 24시간 발효 시료 |
시료 투입 24시간 후 중량 - 음식물 처리기 중량 | 3.04 |
Day 2 |
D |
바실러스 스미시 EP 184 미생물 제제 + 48시간 발효 시료 |
시료 투입 48시간 후 중량 - 음식물 처리기 중량 | 2.68 |
항목 | 중량(kg) | |
실제 투입 중량 (B-A) | 시료(음식물 쓰레기) | 1 |
24시간 발효 후 감소 중량 (B-C) | 24시간 발효 시료 | 0.64 |
48시간 발효 후 감소 중량 (B-D) | 48시간 발효 시료 | 1 |
기간 | 항목 | 내용 | 중량(kg) | |
Day 0 |
A | 바실러스 스미시 EP 184 미생물 제제 중량 |
활성화된 미생물 제제가 포함된 음식물 처리기의 전체 중량 - 음식물 처리기 중량 |
2.19 |
B | 바실러스 스미시 EP 184 미생물 제제 + 시료 (음식물 쓰레기) |
활성화된 미생물 제제가 포함된 음식물 처리기에 시료 투입 후 중량 - 음식물 처리기 중량 | 2.69 | |
Day 1 |
C | 바실러스 스미시 EP 184 미생물 제제 + 24시간 발효 시료 |
시료 투입 24시간 후 중량 - 음식물 처리기 중량 | 2.24 |
Day 2 |
D | 바실러스 스미시 EP 184 미생물 제제 + 48시간 발효 시료 |
시료 투입 48시간 후 중량 - 음식물 처리기 중량 | 2.19 |
항목 | 중량(kg) | |
실제 투입 중량 (B-A) | 시료(음식물 쓰레기) | 0.5 |
24시간 발효 후 감소 중량 (B-C) | 24시간 발효 시료 | 0.45 |
48시간 발효 후 감소 중량 (B-D) | 48시간 발효 시료 | 0.5 |
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
Claims (9)
- 기탁번호 KCTC 15314BP로 수탁된 바실러스 스미시(Bacillus smithii) EP184 균주.
- 제1항에 있어서,
환경 스트레스에 대해 저항성을 갖는, 균주. - 제2항에 있어서,
상기 환경 스트레스는 내산성, 내염성 또는 내열성인, 균주. - 제1항에 있어서,
성장 온도범위가 50 내지 60℃이고 pH 2.5~3까지 내산성을 나타내며 염농도 10%에서도 생육이 가능한, 균주. - 제1항에 있어서
유기성 폐기물에 대해 분해 활성을 갖는, 균주. - 제5항에 있어서,
상기 유기성 폐기물은 음식물 쓰레기, 농업 부산물, 축산분뇨, 산업폐수오니 또는 생활하수오니인, 균주. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 포함하는, 유기성 폐기물 처리용 미생물 제제.
- 제7항에 있어서,
우드 펠렛 35~55 중량부, 활성탄 20~40 중량부, 및 왕겨 10~20 중량부를 추가로 포함하는, 미생물 제제. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 균주를 급속 동결하여 분말 형태의 동결건조체를 제조하는 단계;
상기 동결건조체에 우드 펠렛, 활성탄 및 왕겨를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
상기 혼합물을 유기성 폐기물에 처리한 후 24시간 내지 48시간 동안 발효하는 단계를 포함하는, 미생물 제제를 이용한 유기성 폐기물의 처리방법.
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KR101715764B1 (ko) * | 2016-05-11 | 2017-03-14 | (주)오클린테크 | 유기성 폐기물 처리방법 및 이를 위한 미생물 제제 |
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