JPH034789A - 新規な好塩性プロテアーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な好塩性プロテアーゼ及びその製造法に
関する。

〔従来の技術〕

プロテアーゼは、これまで数多く知られている。

例えば、醤油醸造に古来から使われている麹菌は、多量
のアルカリ性、並びに中性プロテアーゼを菌体外に分泌
し、該酵素により１８％という高濃度の食塩存在下で大
豆蛋白質が加水分解される。ところで、無塩下でよりも
高濃度の食塩存在下でより高い活性を発現する好塩性の
プロテアーゼとしては、高度好塩菌／・ロバクテリウム
・・・ロビウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈａｌ
ｏｂｉｕｍ）の菌体外セリンプロテアーゼが知られてい
る。〔ジャーナル・オプ・バクテリウムジ−（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉ−ＯｌＯｇｙ）、第１５
５蓚、第８２６〜８３０頁、１９８３年〕 〔発明が解決しようとする課題〕 しかしながら、ハロバクテリウム・ハロビウムのプロテ
アーゼは、極めて不安定であり、例えば、１．８％食塩
存在下に１０日間４℃で保存する間に完全に失活する。

このため実用に供するには極めて不利である。

〔課題を解決するための手段〕

そこで本発明者１等は、かかる現状に鑑み、高濃度食塩
存在下で強い活性を示し、かつ安定なプロテアーゼを生
産する微生物を鋭意検索した結果、供試した高度好塩菌
５０株の内１菌株が目的の酵素を生産することを見い出
し、かかる知見に基づし・て本発明を完成した。

（１）すなわち本発明は、下記の理化学的性質を有する
新規な好塩性プロテアーゼ。

■作用 蛋白質及びペプチドのペプチド結合を加水分解する。

■　基質特異性 蛋白質及びペプチド中に存在するフェニルアラニン及び
チロシンのカルボキシル基側のペプチド結合を好んで分
解する。

■　至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 蛋白質分解活性の至適ｐＨは、１０，７であり、安定ｐ
Ｈ１ｊ囲は、６〜１１．５である。

■　作用適温の範囲 ２０〜９０″Ｃである。

■　好適食塩濃度 １〜３２％（飽和）食塩の範囲内にある。

■　ｐＨ１温度等による失活の条件 ｐＨ４又は１２．３０’Ｃ，３０分でほぼ完全に失活す
る。温度による失活は、酵素液中の食塩濃度により異な
る。例えば、５％食塩を含有する酵素液では、６０℃９
３０分で１００％失活するのに対し、２５％食塩含有酵
素液では７０℃１５分で５％、７０℃１３０分では１５
％の失活があるに過ぎない。

■　阻害、活性化及び安定化 第２表に示す通りである。

■分子量 ゲル濾過クロマトグラフィー用カラムＴ　Ｓ　Ｋｇｅｌ
　Ｇ３０００ＳＷＸＬを用いたゲル濾過−ＨＰＬＣによ
り求めた本酵素の分子量は、４４、　ＯＯＯであり、５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で求めた分子量
は、４６．　ＯＯＯである。

テアリ、また、本発明は、ハロバクテリウム属に属し、
好塩性プロテアーゼを生産する微生物を培地に培養し、
培養物より該酵素を採取することを特徴とする新規な好
塩性プロテアーゼの製造法である。

以下、本発明の詳細な説明する。

先ず、本発明で使用される精製好塩性プロテアーゼの理
化学的性質を述べる。

（１）作用 本酵素は、蛋白質及びペプチドのペプチド結合を加水分
解し、ペプチド又はアミノ酸を生成遊離させる。

（２）基質特異性 第１表に、本酵素による合成ペプチドの分解の度合いを
示す。ペプチド中に存在するフェニルアラニン及びチロ
シンのカルボキシル基側のペプチド結合を好んで分解す
るが、ジペプチドには作用しない。

第 表 （その１） 第　　　　１　　　　表　　（その２）Ｓｕｅ　　： ＢｏＣ： Ｚ　　　： Ｂｚ　　： ＭＣＡ　　： ｐＮＡ　： サクシエル ターシャリーフ′チルオキシカルボニルカルボベンゾキ
シ ベンゾイル ４−メチル−クマリル−７−アミト パラニトｐアニリド （３）力価の測定法 方法−１ １％アゾカゼイン（シグマケミカルカンパニ製）の２５
％食塩−１０ｍＭ）リス（Ｔｒｉｓ）−塩酸緩衝液（ｐ
　Ｈ７，６）　１．　Ｏａｔ及び１０ｍＭ１−リス−塩
酸緩衝液（１）　Ｈ７，６）　０．９　ｍｌを混合し、
温度３７゛Ｃで５分間加温し、０．１　ｍｌの酵素液を
加えて正確に５分間反応させたのち、３ＩＩＩｌの５％
トリクロロ酢酸（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ　ａｃｅｔｉｃ　
ａｃｉｄ）を加えて反応を停止させると同時に未分解の
アゾカゼインを沈殿させる。２．０００　ｒ、ｐ、ｍ、
で５分間の遠心分離処理により沈殿を除去し、更に、濾
過で清澄にしたのち、濾過液の４１０ｎｍにおける吸光
度を測定す・る。

方法−２ １％カゼイン（ハマルステン氏法、メルク社製）の２５
％食塩−１０ｍＭ　ト！Ｉスー塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，
６）　１．　ＯＩＩ！を及び１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝
液（ｐ　Ｈ７，６）　０．９　ｒｎｌを混合したものに
、酵素液０．１　ｍｌを加え２て３０℃で５分間反応さ
せたのち、３　ｍｌの５％トリクロロ酢酸を添加し、遠
心、濾過により濾過液を得る。濾過液１ゴを採取し、０
．４Ｍ炭酸ソーダ５ゴと、１　ｍｌの５倍希釈フエ／−
ル試薬を加え、温度２５℃にて１時間発色させたのち、
６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。上記反応条件で
、１分間あたり１μｇのチロシンに相当する発色を与え
る酵素量を１単位と定義する。

（４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 第１図に示されるように、安定ｐＨ範囲は３０’Ｃ，３
０分の処理では５−１１、であり、７０　’Ｃ。

３０分では６−７である。またｐ　Ｈ７，６〜９．１を
トリス−塩酸緩衝液、ｐ　Ｈ８，２〜１１．７をグリン
ン苛性ソーダ緩衝液にて測定した際の蛋白質分解活性の
至適ｐＨは１０．７である（第２図）。

（５）作用適温の範囲及び至適温度 加熱による失活は、酵素液中の食塩濃度により異なる。

例えば第３図に示すように、５％食塩を含有する酵素液
は５０℃，５分で１５％、６０”Ｃ，３０分で１００％
失活するのに対し、２５％食塩含有酵素液は７０’Ｃ，
５分で５％、８０℃９５分で２２％、７０”Ｃ，３０分
でも１５％の失活があるンこ過ぎなし・。また、１８％
食塩存在下、４”Ｃ，１０日間で全く失活せず、更に、
２５％食塩存在下で５℃に保存すれば数カ月間安定であ
る。

至適温度は、２０〜９０℃の範囲内にある。至適温度は
、反応液中の食塩濃度により大きく異なる。例えば第４
図に示すように、１．３％食塩存在下では４０〜５０℃
，１３８％食塩では７０℃１２５％食塩存在下では８０
℃で最大活性を示す。

（６）好適食塩ａ７Ｆ １〜３２％（飽和）食塩の範囲内にある。至適食塩濃度
は、基質の種類と、反応の温度：こまり大きく異なる。

例えば、第５ａ図に示すようンこ、アノカゼインを基質
とじ３０℃で反応させると、１〜５％が至適食塩濃度で
あるが、７０℃では１０〜１５％食塩含有時に最大活性
を示す。一方、第１表に示さハる好ましい合成基質の内
、２つの基質の加水分解に及ぼす塩濃度の影響は第５１
）図に示されている。何れの合成基質１・こ対１〜でも
２５ノ！いし３０％という高濃度の食塩存在下で最大活
性を示す。

（７）阻害、活性化及び安定化 各種金属イオン、金属キレート剤、その他通常酵素の阻
害剤と考えられてし・る薬剤を最終濃度が第２表に示す
ようになるように反応液に加えた時の本酵素活性に及ぼ
す影響をまとめて示す。なお、第２表中の相対活性は、
薬剤無添加時の活性に対する薬剤添加時の活性比を示す
ものである。

フェニルメタンスルフォニルフルオライドで完全に、キ
モスタチンでほぼ完全に阻害されることより本発明プロ
テアーゼはセリン酵素であると考えられる。また、Ｆｅ
””、　Ｃｏ””、　Ｎｉ””、　Ｃｕ２”、　Ｚｎ”
及びＣ３，ｎ　２“でかなり阻害される。

第 表　（その１） 第 ２ 表　（その２） ＤＡＦ　　　　　：ダン／ルフルオライドｐＡ−ＰＭＳ
Ｆ：パラアミチノフェニルメタンスルフオニルフルオラ
イド ＰＭＳＦ　　　　：フエニルメタンスルフオニルフルオ
ライド （８）精製方法 粗酵素液を、２０％硫安−１８％食塩、ｐ　Ｈ６，８で
平衡化したブチルトヨパール（東ソー社製）のカラムに
かけ、本酵素を吸着させる。次に３０％食塩−１０ｍＭ
　トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，６で洗浄し、非吸着蛋
白質を除去する。次？こ３０〜０％までの食塩濃度減少
勾配により本酵素を溶出させる。

二つの活性区分の内、主要な区分を集め濃縮後、２０％
硫安−２５％食塩−１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液、ｐ　
Ｈ７，６に対し透析し、同緩衝液で平衡化してあるフェ
ニルセファロースＣＬ　−４Ｂのカラムに吸着させる。

再び、３０〜０％まての食塩濃度減少勾配により本酵素
を溶出させる。二つの活性区分の内、先に溶出される区
分を集め、ダイアフロー膜ＰＭＩＯ（ブレース・ジャパ
ン社製）で濃縮後、１６％ポリアクリルアミドゲルを使
った調製電気泳動により不純物と分け、精製酵素標品を
得る。

（９〉分子量 ０．１Ｍ硫酸ソーダ、０．１Ｍリン酸カリウム、００５
％ソジウムアジド、ｐＨ６，５で平衡化したゲル濾過ク
ロマトグラフィー用カラムＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ
ＸＬ（０，７８Ｘ３０ｃｍ、東ソー社製）を用いてゲル
濾過−ＨＰＬＣを行なった。５種類の分子量既知の蛋白
質を分子量マーカーとして求めた本酵素の分子量は４４
．　ＯＯＯである。

方５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳ｉ　（４〜２
０％濃度勾配ゲル）で求めた分子量は４６、　ＯＯＯで
ある。

（１０）　Ｎ−末端のアミノ酸配列 精製酵素標品のＮ−末端から３５個のアミノ酸配列は以
下に示すとおりである。

Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｎ−Ｄ−Ｐ−Ｑ−Ｙ−Ｇ−Ｑ−Ｑ−Ｙ−Ａ
−Ｐ−Ｑ−Ｑ−Ｖ−Ｎ−？−Ｅ　−Ａ−Ａ−Ｗ−Ｄ−Ｖ
−Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｄ−Ｐ　−Ｇ−Ｖ−Ｔ−Ｉ−Ｓ− 以上本発明酵素の性質を既知のプロテアーゼのそれらと
比較してみると、極めて好塩性に富むことから、既述の
ハロバクテリウム・／・ロビウムのプロテアーゼに似て
いるが、至適ｐＨが７．２、至適温度が３７℃と、本酵
素とは犬ぎく異なり、また、その安定性の点でも著しし
・差異がある。

一方、シュウトモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属
に属する海洋細菌Ａ−１４の生産するプロテアーゼも好
塩性であるとされているが（Ｄ、　ｖ、　Ｑｕａ等；カ
ナデアン・ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー（
Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ）　、第２７巻、第５０５〜５１０頁、
１９８１年〕、分子量が１２０，０００と、本酵素に比
し、極めて犬であり、至適ｐＨが８、また、ｌ　ｍＭの
ＥＤＴＡで完全阻害を受けること、なおかつセリン酵素
ではないことが記載されている。以上の考察より、本酵
素は公知の何れのプロテアーゼとも異なっており、新規
な酵素と認められる。

次に本酵素を製造するための具体的手段につり・て以下
に述べる。

先ず、本酵素は、如何なる起源のものでも良いが、例え
ば、微生物起源、特にハロバクテリウム属に属し上記し
たプロテアーゼを生産する能力を有する菌株を用いるの
が本酵素を製造するうえで特に有利である。

そして、ハロバクテリウム属に属する菌株の具体例とし
ては、ハロバクテリウム１７２Ｐ１が挙げられ、この菌
の変種もしくは変異株も用いることが出来る。また、本
発明のプロテアーゼは微生物の遺伝子操作等によっても
得ることができる。

上記シたハロバクテリウム１７２Ｐ１は、本発明者等が
海岸の砂から分離した高度好塩菌であり、その菌学的性
質を下記に示す。

（ａ）形態 １　細胞の形及び大きさ：０，５〜０．７　Ｘ　１．　
Ｏ〜３０ミクｐンのかん菌。

２　細胞の多形成：認められない。

３　運動性：有り。

４　胞子の有無：形成しない。

５　グラム染色性：陰性。

（ｂ）各培地における生育状態 １　肉汁寒天平板培養＝３７℃，５〜６日培養て直径０
，５〜１．０朋の円形コロニー。盛り上がり金縁。僅か
にクリーム色を帯び透明感をもつ。

２　肉汁寒天斜面培養：生育は貧弱で半透明の粘性のあ
る薄クリーム色のコロニ ３　肉汁液体培養：試験管底部になるほどよく生育し、
沈査有り。

４　肉汁ゼラチン穿刺培養：液化させる。

（ｃ）生理学的性質 １　硝酸塩の還元：陽性。

２　脱窒反応：陰性。

３　　ＭＲテスト：陰性。

４　　ＶＰテスト：陰性。

５　インドールの生成：陽性。

６　硫化水素の生成：陰性。

７　澱粉の加水分解：陰性。

８　ウレアーゼ：陰性。

９　オキシダーゼ；陰性。

１０　　カタラーゼ：陽性。

１１　　クエン酸の利用：陰性。

１２　　硫安の利用：陰性。

１３　　色素の生成：陰性。

１４　　酸素に対する態度：好気性。

１５　　糖類からの酸及びガスの生成；グルコース、ア
ラビノース、キシロース、マルトース、澱粉の何れから
も酸、ガスの生成は認められない。

１６　　生育の範囲：ｐ’Ｈ６，４〜８．Ｏ１温度２０
〜５０℃１食塩濃度１５〜３０％。

１７　　低張塩溶液での溶菌：培養液を遠心して得られ
る菌体ベレットを、蒸留水に懸濁すると、菌体は瞬時に
溶菌する。

１８　　胆汁酸による溶菌：菌体ペレットを、２５％食
塩−０，０１％コール酸溶液に懸濁すると瞬時に溶菌す
る。

１９　　膜脂質の特徴二極性膜脂質は、グリセリンの２
，３位の水酸基に炭素数２０のファイタニル基カ結合、
又は３位にファイタニル基、２位に炭素数２５のセスタ
テルパニル基がエーテル結合したものを骨格とする。ま
たこれまでに知られて（・ない構造を持つ糖脂質が存在
する。

上述のプロテアーゼ生産能を有する菌株の分類学的性質
を「パージエイズ・マニュアル・オブ・システマチック
・バクテリウムジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ）　Ｊ　＼第１巻（１９８４年）の分類と対比する
と、本菌は、・・ロバクテリウム属に属するものと判定
さ汎る。

上記「パージエイズ・マニーアル」では、高度好塩菌は
、かん菌の・・ロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅ−
ｒｉｕｍ）　、球菌のハｌ：ｌ　：１２　ッカス（Ｈａ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ）の２属の入が記載されているが「マ
ニュアル」の刊行後、好アルカリ性の高度好塩菌ナトロ
ノバクテリウム（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
とナトロノ’ｌ）　ツカス（Ｎａｔｒｏｎｏｃｏｃｃｕ
ｓ）の２属が新たに提唱され、認知されて（・る。更に
、「マニュアル」のハロバクテリウム属を更に３つの属
、・・ロバクテリウム、ハｄアーキュラ（Ｈａｌｏａｒ
ｃｕｌａ）及びハロフェラソクス（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ
）に分けるという提唱が１９８６年になされ、これも認
められている［Ｍ。

ＴＯｒｒｅｂｌａｎＣａ　５　：ンステマチノク・アン
ド・アプライド・マイクロバイオロジー（Ｓｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃ　ａｎｄＡｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ）　、第８巻、第８９〜９９頁、１９８６年〕。

以上の既知の高度好塩菌は、何れも赤色菌体色素を有す
る点で共通しているが、本分離菌１７２Ｐ１は、色素を
有しない点て既知の高度好塩菌とは大きく異なる。

しかし、上記６つの属の諸性質と比較検討した結果、本
菌１７２Ｐ１は・・ロバクテリウム属に属するものと判
定した。しかし、既知の種し・ずれとモ一致せず、・・
ロバクテリウム１７２Ｐ１と命名した。

なお、・・ロバクテリウム１７２Ｐ１は、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第１０７４−７号（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−４０７４７）として寄託され℃し・る。

次に、本酵素を生産する能力を有する菌を用し・るプロ
テアーゼの製造について述べる。

本酵素を生産する能力を有する菌株を培養するのに用い
られる培地としては、！・ロバクテリウム属に属する微
生物の培養に用いられる培地が挙げられる。培地の窒素
源としては利用可能な窒素化合物であれば如何なるもの
でもよ、＜、例えば、酵母エキス、ヘフトン、肉エキス
、コーンスチープリカー、アミノ酸、大豆、小麦ふすま
の浸出液等の一種以上の窒素源が用し・られる。上記窒
素源に、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、カルシ
ウム、リン酸等の適当な無機塩類を適宜添加し、必要に
応じて菌の生育に必要な炭素源、例えば、糖類、各種の
有機物、ビタミン等を添加したものが培地として好適で
ある。

菌の培養は、固体培養で行なっても良いが、通常液体培
養法を採用するのが好ましく、振盪培養、撹拌培養、通
気培養等により好気的に菌の培養を行なうのがよし・。

工業的には、液体培地を用い、通気撹拌深部培養するの
が好ましい。培養温度は２５〜５０℃１好ましくは４０
℃付近である。

培養時のｐＨは６〜７が最適である。培養時間は、培養
方法により異なるが、２４〜９６時間である。

かくして得られた培養物からの本酵素の精製は、−船釣
な方法を用いることができる。

濾過法、遠心分離法等の適当な方法により培養液から菌
体を除去して得られる清澄液を、限外濾過膜、例えば、
旭化成ウルトラフィルトレージョンモジュールにより濃
縮し、これをこのまま、又は、凍結乾燥法、アルコール
沈殿法、アセトン沈殿法を適宜選択して実施することに
より粗酵素粉末を得ることができる。

一ト記粗酵素液もしくは粗酵素粉末より更に精製酵素標
品を得るには、例えば、セファデックス、トヨパール、
もしくはバイオゲル等を用Ｌ・るゲル濾過法、イオン交
換体を用いる吸着溶出法、高濃度硫安又は塩存在下での
吸着を利用した疎水クロマトグラフィー　ハイドロキン
パタイトを用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル
を用いる電気泳動法、アフイニテイクロマトグラフイー
法等を適宜に選択し、組み合わせて実施することにより
、精製された本酵素の標品な得ることができる。

〔発明の効果〕

以上より明らかな如く、本酵素は、高濃度食塩存在下で
強い活性を示し、かつ熱安定性に極めて優れたアルカリ
プロテアーゼであるため、魚醤油、醤油、味噌等の飲食
品、医薬、洗剤等広範に用いることができ、本発明は、
産業上極めて有用である。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。

実施例１ 臭化ナトリウム０．４８．９　、塩化カリウム３．６ｙ
、重炭酸ソーダＯ，ｌ　２　、ｐ　、塩化力ルノウム０
、８７．７、硫酸マグネシウム３５．７．７、塩化マグ
ネシウム２５，７、食塩１４０．７及び酵母エキス４ｙ
を、蒸留水に溶解し、ｐ　Ｈ６，５に調整したのち、１
１にした培地を、２０ｍ１ずつ１５０ｍ１容の振盪フラ
スコに分注し、１２０’Ｃで１５分間殺菌し、ハロバク
テリウム１７２Ｐ１　（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０７４７）を
接種して、３７℃で２４時間静置培養後、４８時間、８
０　ｒ、ｐ、ｍ、で回転振盪培養した。

培養終了後、培養液を８．　ＯＯＯｒ、ｐ、ｍ、で３０
分間遠心分離して菌体を除去して得られた上澄を酵素液
として、プロテアーゼ活性を測定したところ、２．　Ｏ
単位／　＋＋＋／であった。

実施例２ 塩化カリウム４ｙ１硫酸マグネシウム２０ｙ１リン酸二
カリウム０．３ｇ、グルタミン酸ソーダ２０、Ｓ７、蔗
糖１ｏｙ及び食塩１８０ｙを、蒸留水に溶解し、ｐ　Ｈ
６，２に調整し、１７！にした培地を２７！スつ３１容
ガラス製ミニジヤーに入れ１２０℃て１５分間殺菌処理
を行なった。これに・・ロバクテリウム１７２Ｐ１　（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０７４７）の前培養液２０ｍ／を接
種し、ファーメンタ−にて、４０℃，２１１分の通気、
１５０ｒ、ｐ、ｍ、の撹拌で２４時間培養、次し・で、
撹拌を２５０　ｒ、ｐ、ｍ、に上げ、更に、４８時間培
養を続けた。

培養終了後８．　ＯＯＯｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分
離して得られた上澄の酵素活性は２．５単位／　ｍｅで
あった。

実施例３ 実施例１に記載したのと同一組成の培地２０１を、３０
１容ステンレス製ジヤーに入ハ常法により殺菌処理した
のち、ハロバクテリウム１７２Ｐ１　（ＦＥＲＭ　　Ｐ
−１０７４７）の前培養１１を接種し、ファーメンタ−
にて、４０℃ｌ２Ｏβ／分の通気、無撹拌で７２時間培
養した。

培養終了後の上澄１８１を、限外濾過（ＵＦ）モジュー
ル５ＥＰ１０１３　（旭化成社製）で３１まで濃縮した
。これに硫安を１５０ｇ／ｌの割合で加えて溶解し、生
じた沈殿を濾別し、濾液を２０％硫安−１８％食塩、ｐ
　Ｈ６，８で平衡化したブチルトヨパール６５０Ｃ（東
ソー社製）のカラム（４，２Ｘ１７α）にかける。同波
で洗浄し、３０％食塩−１０ｍ）４）リス−塩酸緩衝液
ｐＨ７，６で更に洗浄したのち、３０〜０％食塩の減少
濃度勾配でプロテアーゼを溶出、主活性区分６１０ｍ１
を得た。

これに飽和になるように食塩を加えて上記モジー−ルで
濃縮、２０％硫安−２５％食塩、１０ｍＭ　ト！Ｉスー
塩酸緩衝液ｐ　Ｈ７，６に対し透析し、同緩衝液に対し
平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラム（４
，ＯＸ　２９　ｃｍ　）にかけ、再び、３０〜０％食塩
の濃度勾配で溶出した。

先に溶出してきた活性区分５００ゴを集め、飽和まで食
塩を添加し、グイアフロ膜ＰＭ１０で５０ｍ１まで濃縮
した。この濃縮酵素液１．５　ｍｌずつ１６％ポリアク
リルアミドゲル（１１Ｘ１６Ｘ３朋）を使った調製用電
気泳動にかけた。泳動条件は９５ｍＡ、５℃１３時間で
あった。

ゲルを取り出し、２５％食塩−１０ｍＭ）！Ｉスス−酸
緩衝液に溶かした６０μｇ　／　ｍｔのＳｕｃ−Ａ−Ａ
−Ｐ−Ｆ−ＭＣＡ溶液にひたし、５分間反応させたのち
、３８０ｎｍの光を照射すると活性区分は蛍光を持った
バンドとして検出された。

このバンドを切り出し、３０％食塩−１００ｍＭトリス
−塩酸緩衝液、ｐ　Ｈ７，６で酵素蛋白質を抽出した。

最後にミリボア膜（０，４５μｍ）で濾過し、精製され
た本発明プロテアーゼ５ｍｑを得た。

本酵素標品は、２５％以上の食塩を添加しておくことに
より、５℃で数カ月以上全く失活することなく保存可能
であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明プロテアーゼの各温度におけるｐＨ安定
性を示す図であり、第２図は本発明プロテアーゼの至適
ｐＨを示す図であり、第３図は本発明プロテアーゼの熱
安定性を示す図であり、第４図は本発明プロテアーゼの
作用温度を示す図てあり、第５ａ図は本発明プロテアー
ゼのアゾカゼインを基質としたときの作用食塩濃度を示
す図であり、また、第５ｂ図は本発明プロテアーゼの合
成ペプチドを基質としたときの作用食塩濃度を示す図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の理化学的性質を有する新規な好塩性プロテ
   アーゼ。 （１）作用 蛋白質及びペプチドのペプチド結合を加水分解する。 （２）基質特異性 蛋白質及びペプチド中に存在するフェニルアラニン及び
   チロシンのカルボキシル基側のペプチド結合を好んで分
   解する。 （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 蛋白質分解活性の至適ｐＨは、１０．７であり、安定ｐ
   Ｈ範囲は、６〜１１．５である。（４）作用適温の範囲 ２０〜９０℃である。 （５）好適食塩濃度 １〜３２％（飽和）食塩の範囲内にある。 （６）ｐＨ、温度等による失活の条件 ｐＨ４又は１２、３０℃、３０分でほぼ完全に失活する
   。温度による失活は、酵素液中の食塩濃度により異なる
   。例えば、５％食塩を含有する酵素液では、６０℃、３
   ０分で１００％失活するのに対し、２５％食塩含有酵素
   液では７０℃、５分で５％、７０℃、３０分では１５％
   の失活があるに過ぎない。 （７）阻害、活性化及び安定化 第２表に示す通りである。 （８）分子量 ゲル濾過クロマトグラフィー用カラムＴＳＫｇｅｌＧ３
   ０００ＳＷＸＬを用いたゲル濾過−ＨＰＬＣにより求め
   た本酵素の分子量は、 ４４，０００であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
   電気泳動で求めた分子量は、４６，０００である。 （２）ハロバクテリウム属に属し、好塩性プロテアーゼ
   を生産する微生物を培地に培養し、培養物より該酵素を
   採取することを特徴とする新規な好塩性プロテアーゼの
   製造法。