JPH09249A - 新規プロリダーゼとその製造方法 - Google Patents
新規プロリダーゼとその製造方法Info
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- JPH09249A JPH09249A JP7151510A JP15151095A JPH09249A JP H09249 A JPH09249 A JP H09249A JP 7151510 A JP7151510 A JP 7151510A JP 15151095 A JP15151095 A JP 15151095A JP H09249 A JPH09249 A JP H09249A
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- JP
- Japan
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- prolidase
- pro
- activity
- amino acid
- xanthomonas maltophilia
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 広く自然界より分離したキサントモナス・マ
ルトフィリアを培養して得られる新規プロリダーゼ及び
該酵素の製造方法。 【効果】 本発明により得られる新規プロリダーゼは従
来報告されていない、キサントモナス属細菌から効率よ
く得られ、細菌由来の既知のプロリダーゼにはないＧｌ
ｙ−Ｐｒｏの分解活性を有する。そのため、この酵素は
醤油中の残存ペプチドを分解できる等、その用途は広
い。
ルトフィリアを培養して得られる新規プロリダーゼ及び
該酵素の製造方法。 【効果】 本発明により得られる新規プロリダーゼは従
来報告されていない、キサントモナス属細菌から効率よ
く得られ、細菌由来の既知のプロリダーゼにはないＧｌ
ｙ−Ｐｒｏの分解活性を有する。そのため、この酵素は
醤油中の残存ペプチドを分解できる等、その用途は広
い。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は微生物の培養物に含まれ
る新規プロリダーゼに関する。更に詳細には、本発明は
広く自然界から分離したロイシルプロリン（Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ）の分解能力に優れているプロリダーゼを生産する
微生物であるキサントモナス・マルトフィリア 由来の
新規プロリダーゼとその製造方法に関する。
る新規プロリダーゼに関する。更に詳細には、本発明は
広く自然界から分離したロイシルプロリン（Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ）の分解能力に優れているプロリダーゼを生産する
微生物であるキサントモナス・マルトフィリア 由来の
新規プロリダーゼとその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】これまで多くのプロリダーゼが精製さ
れ、酵素学的性質が解明されてきた。例えば、ほ乳類で
は豚の腎臓、小腸、牛の小腸、及びヒトの赤血球由来の
プロリダーゼが知られており、微生物ではストレプトコ
ッカス・クレモリス由来のプロリダーゼが報告されてい
る（Ｎ．Ｃ．Ｄａｖｉｓ ａｎｄ Ｅ．Ｌ．Ｓｍｉｔ
ｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２４，２６１−２７
５（１９５６），Ｈ．Ｓｊｏｒｓｔｒｏｒｍ，Ｏ．Ｎｏ
ｒｅｎ，ａｎｄ Ｌ．Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，３２７，４５７−
４７０（１９７３），Ｈ．Ｓｊｏｒｓｔｒｏｒｍ，Ｏ．
Ｎｏｒｅｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｐｒｏｔ．
Ｒｅｓ．，１１，１５９（１９７８），Ｔ．Ｙｏｓｈｉ
ｍｏｔｏ，Ｆ．Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｅ．Ｋａｗａｎ
ｏ，ａｎｄ Ｄ．Ｔｓｕｒｕ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
９４，１８８９−１８９６（１９８３），Ｓ．Ｋａｍｉ
ｎｏｇａｗａ，Ｎ．Ａｚｕｍａ，Ｉ．Ｈｗａｎｇ，Ｙ．
Ｓｕｚｕｋｉ，ａｎｄ Ｋ．Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ａｇｒ
ｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，３０３５−３０４０
（１９８４），Ｉ．Ｍｙａｒａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．
Ａｃｔａ．，１７０，２６３−２７０（１９８７），
Ｆ．Ｅｎｄｏ，Ａ．Ｔａｎｏｕｅ，Ｔ．Ｏｇａｔａ，
Ｋ．Ｍｏｔｏｈａｒａ，ａｎｄ Ｉ．Ｍａｔｓｕｄａ，
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１７６，１４３−１
５０（１９８８），Ａ．Ｍ．Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｇ．Ｌ．
Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｆ．Ｙ．Ｍ．Ｃｈｏｙ，ａｎｄ
Ｐ．Ｈｅｃｈｔｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，６７，３４−４１（１９８９），Ｔ．Ｏｈｈ
ａｓｈｉ，Ｔ，Ｏｈｎｏ，Ｊ．Ａｒａｔａ，Ｋ．Ｓｕｇ
ａｈａｒａ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｄａｍａ，Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１８７，１−１０（１９９
０））。
れ、酵素学的性質が解明されてきた。例えば、ほ乳類で
は豚の腎臓、小腸、牛の小腸、及びヒトの赤血球由来の
プロリダーゼが知られており、微生物ではストレプトコ
ッカス・クレモリス由来のプロリダーゼが報告されてい
る（Ｎ．Ｃ．Ｄａｖｉｓ ａｎｄ Ｅ．Ｌ．Ｓｍｉｔ
ｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２２４，２６１−２７
５（１９５６），Ｈ．Ｓｊｏｒｓｔｒｏｒｍ，Ｏ．Ｎｏ
ｒｅｎ，ａｎｄ Ｌ．Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，３２７，４５７−
４７０（１９７３），Ｈ．Ｓｊｏｒｓｔｒｏｒｍ，Ｏ．
Ｎｏｒｅｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｐｒｏｔ．
Ｒｅｓ．，１１，１５９（１９７８），Ｔ．Ｙｏｓｈｉ
ｍｏｔｏ，Ｆ．Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ｅ．Ｋａｗａｎ
ｏ，ａｎｄ Ｄ．Ｔｓｕｒｕ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
９４，１８８９−１８９６（１９８３），Ｓ．Ｋａｍｉ
ｎｏｇａｗａ，Ｎ．Ａｚｕｍａ，Ｉ．Ｈｗａｎｇ，Ｙ．
Ｓｕｚｕｋｉ，ａｎｄ Ｋ．Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ａｇｒ
ｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，３０３５−３０４０
（１９８４），Ｉ．Ｍｙａｒａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．
Ａｃｔａ．，１７０，２６３−２７０（１９８７），
Ｆ．Ｅｎｄｏ，Ａ．Ｔａｎｏｕｅ，Ｔ．Ｏｇａｔａ，
Ｋ．Ｍｏｔｏｈａｒａ，ａｎｄ Ｉ．Ｍａｔｓｕｄａ，
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１７６，１４３−１
５０（１９８８），Ａ．Ｍ．Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｇ．Ｌ．
Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｆ．Ｙ．Ｍ．Ｃｈｏｙ，ａｎｄ
Ｐ．Ｈｅｃｈｔｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，６７，３４−４１（１９８９），Ｔ．Ｏｈｈ
ａｓｈｉ，Ｔ，Ｏｈｎｏ，Ｊ．Ａｒａｔａ，Ｋ．Ｓｕｇ
ａｈａｒａ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｄａｍａ，Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１８７，１−１０（１９９
０））。
【０００３】次に、分子量について述べると、豚、牛の
小腸のプロリダーゼ、及びヒトの赤血球由来のプロリダ
ーゼＩの分子量は各々１１３，０００、１１６，００
０、１１２，０００とほぼ同じであることが報告されて
いる。一方、ストレプトコッカス・クレモリス Ｈ６１
のプロリダーゼの分子量は４３，０００、ヒト赤血球由
来のプロリダーゼＩＩは１８５，０００である。
小腸のプロリダーゼ、及びヒトの赤血球由来のプロリダ
ーゼＩの分子量は各々１１３，０００、１１６，００
０、１１２，０００とほぼ同じであることが報告されて
いる。一方、ストレプトコッカス・クレモリス Ｈ６１
のプロリダーゼの分子量は４３，０００、ヒト赤血球由
来のプロリダーゼＩＩは１８５，０００である。
【０００４】また、Ｍｎ++に対する挙動について言え
ば、豚の腎臓のプロリダーゼ、及びヒト赤血球由来のプ
ロリダーゼＩはＭｎ++で顕著に活性化される。一方、牛
の小腸、ストレプトコッカス・クレモリス Ｈ６１由来
のプロリダーゼ、ヒト赤血球由来のプロリダーゼＩＩは
Ｍｎ++の存在下で、その活性は阻害されるという特徴が
報告されている。
ば、豚の腎臓のプロリダーゼ、及びヒト赤血球由来のプ
ロリダーゼＩはＭｎ++で顕著に活性化される。一方、牛
の小腸、ストレプトコッカス・クレモリス Ｈ６１由来
のプロリダーゼ、ヒト赤血球由来のプロリダーゼＩＩは
Ｍｎ++の存在下で、その活性は阻害されるという特徴が
報告されている。
【０００５】更に、豚の腎臓、牛の小腸由来のプロリダ
ーゼ、及び、ヒト赤血球由来のプロリダーゼＩはＧｌｙ
−Ｐｒｏを分解できると報告されている。しかしなが
ら、ストレプトコッカス・クレモリス Ｈ６１由来のプ
ロリダーゼではＧｌｙ−Ｐｒｏを分解することができな
い。
ーゼ、及び、ヒト赤血球由来のプロリダーゼＩはＧｌｙ
−Ｐｒｏを分解できると報告されている。しかしなが
ら、ストレプトコッカス・クレモリス Ｈ６１由来のプ
ロリダーゼではＧｌｙ−Ｐｒｏを分解することができな
い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】一般に、プロリン、ハ
イドロキシプロリンやグリシンを含む低分子ペプチド
（特にジペプチド、トリペプチド）は通常のエキソペプ
チダーゼではほとんど加水分解されない。例えば、醤油
製造の際に生産される麹菌の酸性カルボキシペプチダー
ゼは基質がトリペプチドになると分解しにくくなり、ジ
ペプチドになると更に分解しにくくなる。特にカルボキ
シル末端がプロリンのペプチドを分解しにくいために、
これらのペプチドは醤油中に残存しやすい。更に、（麹
菌が産生する）ロイシンアミノペプチダーゼはアミノ末
端がグリシンのペプチドを分解しにくいため、これらの
ペプチドも醤油中に残存しやすく、醤油の呈味性を低下
させる一因ともなっている（醤研，１１，６７（１９８
５））。
イドロキシプロリンやグリシンを含む低分子ペプチド
（特にジペプチド、トリペプチド）は通常のエキソペプ
チダーゼではほとんど加水分解されない。例えば、醤油
製造の際に生産される麹菌の酸性カルボキシペプチダー
ゼは基質がトリペプチドになると分解しにくくなり、ジ
ペプチドになると更に分解しにくくなる。特にカルボキ
シル末端がプロリンのペプチドを分解しにくいために、
これらのペプチドは醤油中に残存しやすい。更に、（麹
菌が産生する）ロイシンアミノペプチダーゼはアミノ末
端がグリシンのペプチドを分解しにくいため、これらの
ペプチドも醤油中に残存しやすく、醤油の呈味性を低下
させる一因ともなっている（醤研，１１，６７（１９８
５））。
【０００７】従って、酵素の大量調製が比較的容易な細
菌からＧｌｙ−Ｐｒｏ等の難分解性ペプチドを分解でき
るプロリダーゼを得ることが強く待ち望まれている。し
かしながら、豚の腎臓、牛の小腸由来のプロリダーゼ、
及び、ヒト赤血球由来のプロリダーゼＩはＧｌｙ−Ｐｒ
ｏを分解できるものの、その大量調製は困難であるとい
う難点を有する。一方、ストレプトコッカス・クレモリ
ス Ｈ６１由来のプロリダーゼは大量調製が比較的容易
なものの、Ｇｌｙ−Ｐｒｏを分解することができないと
いう欠点を持っている。これ故、本発明の目的は醤油中
に存在するＧｌｙ−Ｐｒｏを分解することができるプロ
リダーゼを大量に提供することである。
菌からＧｌｙ−Ｐｒｏ等の難分解性ペプチドを分解でき
るプロリダーゼを得ることが強く待ち望まれている。し
かしながら、豚の腎臓、牛の小腸由来のプロリダーゼ、
及び、ヒト赤血球由来のプロリダーゼＩはＧｌｙ−Ｐｒ
ｏを分解できるものの、その大量調製は困難であるとい
う難点を有する。一方、ストレプトコッカス・クレモリ
ス Ｈ６１由来のプロリダーゼは大量調製が比較的容易
なものの、Ｇｌｙ−Ｐｒｏを分解することができないと
いう欠点を持っている。これ故、本発明の目的は醤油中
に存在するＧｌｙ−Ｐｒｏを分解することができるプロ
リダーゼを大量に提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らはＬｅｕ−Ｐ
ｒｏを効率よく分解する微生物を広く自然界よりスクリ
ーニングしたところ、土壌より分離した細菌の一菌株
に、本菌が従来の細菌（ストレプトコッカス・クレモリ
ス）由来のプロリダーゼと比較して、Ｇｌｙ−Ｐｒｏを
分解することのできるプロリダーゼの活性を有している
ことを見出し、その酵素的諸性質を明らかにすると共
に、製造方法を確立して、本発明を完成するに至らしめ
た。
ｒｏを効率よく分解する微生物を広く自然界よりスクリ
ーニングしたところ、土壌より分離した細菌の一菌株
に、本菌が従来の細菌（ストレプトコッカス・クレモリ
ス）由来のプロリダーゼと比較して、Ｇｌｙ−Ｐｒｏを
分解することのできるプロリダーゼの活性を有している
ことを見出し、その酵素的諸性質を明らかにすると共
に、製造方法を確立して、本発明を完成するに至らしめ
た。
【０００９】即ち、本発明はスクリーニングによって得
られたキサントモナス・マルトフィリアに由来し、下記
の性質を有するプロリダーゼである。 １）作用 ｐＨ６．０〜８．５の間においてカルボキシル基側にプ
ロリンを持つジペプチドに特異的に働き、ペプチド結合
を加水分解してアミノ酸を遊離せしめる。 ２）基質特異性 Ｍｎ++存在下で、Ｌ−Ｘ−Ｐｒｏに対して加水分解能を
示す。尚、Ｘは任意のアミノ酸を表す。 ３）至適ｐＨ 基質としてＬ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを用い、かつバッファー
として２０ｍＭトリス−塩酸バッファーを用いた時の至
適ｐＨは約７〜８である。 ４）安定なｐＨ範囲 ｐＨ６．０〜８．５の範囲で安定である。 ５）作用至適温度 基質としてＬ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを用いた時の至適温度は
約３０〜４０℃である。 ６）阻害剤 ＰＣＭＢ，Ｚ−Ｌ−Ｐｒｏ，O−Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏ
ｌｉｎｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ
及びＰｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ｔｈｉｏｐｒｏｌｉｎ
ｅで活性が阻害される。また、Ｃｕ++、Ｚｎ++、及びＨ
ｇ++で活性が阻害される。 ７）活性化剤 Ｍｎ++，Ｆｅ+++により活性化される。 ８）分子量 ゲル濾過法で測定すると約９０、０００〜１１０、００
０である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で測定すると約４８、０００〜５５、０００である。こ
のことから、本酵素はダイマーであるといえる。また、
本発明のプロリダーゼを生産するキサントモナス・マル
トフィリアは工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４９８６
である。
られたキサントモナス・マルトフィリアに由来し、下記
の性質を有するプロリダーゼである。 １）作用 ｐＨ６．０〜８．５の間においてカルボキシル基側にプ
ロリンを持つジペプチドに特異的に働き、ペプチド結合
を加水分解してアミノ酸を遊離せしめる。 ２）基質特異性 Ｍｎ++存在下で、Ｌ−Ｘ−Ｐｒｏに対して加水分解能を
示す。尚、Ｘは任意のアミノ酸を表す。 ３）至適ｐＨ 基質としてＬ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを用い、かつバッファー
として２０ｍＭトリス−塩酸バッファーを用いた時の至
適ｐＨは約７〜８である。 ４）安定なｐＨ範囲 ｐＨ６．０〜８．５の範囲で安定である。 ５）作用至適温度 基質としてＬ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを用いた時の至適温度は
約３０〜４０℃である。 ６）阻害剤 ＰＣＭＢ，Ｚ−Ｌ−Ｐｒｏ，O−Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏ
ｌｉｎｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ
及びＰｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ｔｈｉｏｐｒｏｌｉｎ
ｅで活性が阻害される。また、Ｃｕ++、Ｚｎ++、及びＨ
ｇ++で活性が阻害される。 ７）活性化剤 Ｍｎ++，Ｆｅ+++により活性化される。 ８）分子量 ゲル濾過法で測定すると約９０、０００〜１１０、００
０である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で測定すると約４８、０００〜５５、０００である。こ
のことから、本酵素はダイマーであるといえる。また、
本発明のプロリダーゼを生産するキサントモナス・マル
トフィリアは工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託
されており、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４９８６
である。
【００１０】本発明のもう一つ態様は、キサントモナス
・マルトフィリアを培養して、培地中に目的とするプロ
リダーゼを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とするキサントモナス・マルトフィリア由来のプロリ
ダーゼの製造方法である。以下、本発明を詳細に説明す
る。
・マルトフィリアを培養して、培地中に目的とするプロ
リダーゼを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とするキサントモナス・マルトフィリア由来のプロリ
ダーゼの製造方法である。以下、本発明を詳細に説明す
る。
【００１１】本発明者らは普通ブイヨン培地（極東製薬
工業（株）製）に終濃度２％になるように寒天を加えて
調製したプレートを用いて、種々の微生物から高プロリ
ダーゼ活性菌株を自然界より取得した。その結果、キサ
ントモナス・マルトフィリア（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９８
６）が目的とするプロリダーゼを生成、蓄積しているこ
とを発見した。
工業（株）製）に終濃度２％になるように寒天を加えて
調製したプレートを用いて、種々の微生物から高プロリ
ダーゼ活性菌株を自然界より取得した。その結果、キサ
ントモナス・マルトフィリア（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９８
６）が目的とするプロリダーゼを生成、蓄積しているこ
とを発見した。
【００１２】尚、プロリダーゼ活性はＹａｒｏｎらの変
法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ．，３２，６５８−６６３（１９６８））により
測定した。キサントモナス・マルトフィリア （ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４９８６）の培養に用いられる栄養培地は、
炭素源、窒素源、無機塩類、補助因子などからなる通常
の培地であり、炭素源としてはグルコース、マルトー
ス、フラクトース、シュクロース、乳糖、澱粉などが単
独又は組み合わせて用いられる。窒素源としてはペプト
ン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、カゼイン、不溶性
コラーゲン、大豆蛋白などが、無機塩類としては塩化ナ
トリウム、硫酸マグネシウム七水和物、リン酸水素二ナ
トリウム、リン酸二水素カリウムなどが、また補助因子
としては肉エキス、コーンスティープリカーなどが使用
される。これらの成分のうち、肉エキス１．０％、ポリ
ペプトン１．０％、塩化ナトリウム０．５％（ｐＨ７．
５）が好適である。
法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ．，３２，６５８−６６３（１９６８））により
測定した。キサントモナス・マルトフィリア （ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４９８６）の培養に用いられる栄養培地は、
炭素源、窒素源、無機塩類、補助因子などからなる通常
の培地であり、炭素源としてはグルコース、マルトー
ス、フラクトース、シュクロース、乳糖、澱粉などが単
独又は組み合わせて用いられる。窒素源としてはペプト
ン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、カゼイン、不溶性
コラーゲン、大豆蛋白などが、無機塩類としては塩化ナ
トリウム、硫酸マグネシウム七水和物、リン酸水素二ナ
トリウム、リン酸二水素カリウムなどが、また補助因子
としては肉エキス、コーンスティープリカーなどが使用
される。これらの成分のうち、肉エキス１．０％、ポリ
ペプトン１．０％、塩化ナトリウム０．５％（ｐＨ７．
５）が好適である。
【００１３】 本発明のプロリダーゼを生産するための
微生物の培養条件は、通常の好気的培養条件でよく、ｐ
Ｈ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、温
度２０℃〜４０℃、好ましくは２７℃〜３３℃、培養時
間１２〜６０時間、好ましくは２４〜４８時間が適当で
ある。また、本発明のプロリダーゼは、培養物をそのま
まプロリダーゼ源として用いることができるが、本発明
の方法により分離採取する事により、酵素の比活性は著
しく増大し、安定性も高くなる。
微生物の培養条件は、通常の好気的培養条件でよく、ｐ
Ｈ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５、温
度２０℃〜４０℃、好ましくは２７℃〜３３℃、培養時
間１２〜６０時間、好ましくは２４〜４８時間が適当で
ある。また、本発明のプロリダーゼは、培養物をそのま
まプロリダーゼ源として用いることができるが、本発明
の方法により分離採取する事により、酵素の比活性は著
しく増大し、安定性も高くなる。
【００１４】 尚、本発明のプロリダーゼは、上記した
方法により製造されるものに限定されず、発現ベクター
に接続された該酵素の遺伝子が導入された大腸菌、枯草
菌、酵母などによる組換えＤＮＡ法によって生産するこ
とも可能である。いずれの方法で生産された酵素も同程
度の効果を期待することができる。また、酵素の精製法
も限定されず、通常行われてイオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過等の手法を適宜組み合わせて行えばよ
い。
方法により製造されるものに限定されず、発現ベクター
に接続された該酵素の遺伝子が導入された大腸菌、枯草
菌、酵母などによる組換えＤＮＡ法によって生産するこ
とも可能である。いずれの方法で生産された酵素も同程
度の効果を期待することができる。また、酵素の精製法
も限定されず、通常行われてイオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過等の手法を適宜組み合わせて行えばよ
い。
【００１５】
【実施例】以下、実施例により本発明のキサントモナス
・マルトフィリア （ＦＥＲＭＰー１４９８６）の分
離、該細菌由来のプロリダーゼの製造方法、及び性質に
ついて示す。
・マルトフィリア （ＦＥＲＭＰー１４９８６）の分
離、該細菌由来のプロリダーゼの製造方法、及び性質に
ついて示す。
【００１６】実施例１：キサントモナス・マルトフィリ
ア （Xanthomonas maltophilia AJ 13127,ＦＥＲＭ Ｐ
ー１４９８６）の分離 常法に従い、普通ブイヨン培地（極東製薬工業株製）に
終濃度２％になるように寒天を加えて調製したプレート
（ｐＨ７．０）上に、土壌を滅菌水にて懸濁した懸濁液
を塗り広げ、３０℃においてコロニーを約５００個形成
させた。これらのコロニーを９６穴プレートに接種培養
し、プロリダーゼ活性の測定を行った。その結果、プロ
リダーゼ活性を示す１株、ＫＳ−３株を得た。本菌は工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
尚、寄託番号はＦＥＲＭ Ｐー１４９８６である。
ア （Xanthomonas maltophilia AJ 13127,ＦＥＲＭ Ｐ
ー１４９８６）の分離 常法に従い、普通ブイヨン培地（極東製薬工業株製）に
終濃度２％になるように寒天を加えて調製したプレート
（ｐＨ７．０）上に、土壌を滅菌水にて懸濁した懸濁液
を塗り広げ、３０℃においてコロニーを約５００個形成
させた。これらのコロニーを９６穴プレートに接種培養
し、プロリダーゼ活性の測定を行った。その結果、プロ
リダーゼ活性を示す１株、ＫＳ−３株を得た。本菌は工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
尚、寄託番号はＦＥＲＭ Ｐー１４９８６である。
【００１７】本菌の菌学的性質を以下に示す。 （ａ）形態的性質 (1)細胞の大きさ及び形：０．４〜０．５×１．０〜
１．５μｍのかん菌（多形性はなし。） (2)グラム染色性：グラム陰性 (3)運動性の有無：３０〜３７℃で運動性有り。 (4)鞭毛の特徴：極鞭毛、複数（１〜３本）。
１．５μｍのかん菌（多形性はなし。） (2)グラム染色性：グラム陰性 (3)運動性の有無：３０〜３７℃で運動性有り。 (4)鞭毛の特徴：極鞭毛、複数（１〜３本）。
【００１８】（ｂ）栄養培地上での生育状態 (1)Ｎｕｔｒｉｅｎｔ寒天平板培地：生育は中等度。コ
ロニー形態は円形、平滑、光沢あり。菌体を生理食塩水
（０．９％）に懸濁の際には、均一に分散しにくい菌体
性状を示した。 (2)Ｎｕｔｒｉｅｎｔ液体培地：中等度の生育。試験管
の液面上縁に菌の凝集帯（幅〜１ｍｍ）を形成した。液
は均一に濁り、粘質性の沈澱が生じた（３０℃、２日間
培養）。 (3)ＭｃＣｏｎｋｅｙ寒天平板：中等度の生育（３０、
３７℃）。コロニー形態は円形、平滑、光沢あり。色調
は半透明淡黄色であるが、周縁は橙色を呈す。尚、対照
菌のうちキサントモナス・マルトフィリア ＡＴＣＣ１
３６３７は生育せず。 (4)Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ寒天平板：３０℃で中等度
の生育。コロニー形態は円形、平滑、光沢あり。色調は
淡黄褐色、集落の周縁部は半透明。尚、対照菌のキサン
トモナス・マルトフィリア ＡＪ２０８２，２２２０，
２５５４はすべて、本菌とコロニー外観がきわめてよく
似ていた。培地中に塩化ナトリウムを３％添加ではこれ
らの菌は生育したが、１０％添加では生育は阻害された
（３０℃）。
ロニー形態は円形、平滑、光沢あり。菌体を生理食塩水
（０．９％）に懸濁の際には、均一に分散しにくい菌体
性状を示した。 (2)Ｎｕｔｒｉｅｎｔ液体培地：中等度の生育。試験管
の液面上縁に菌の凝集帯（幅〜１ｍｍ）を形成した。液
は均一に濁り、粘質性の沈澱が生じた（３０℃、２日間
培養）。 (3)ＭｃＣｏｎｋｅｙ寒天平板：中等度の生育（３０、
３７℃）。コロニー形態は円形、平滑、光沢あり。色調
は半透明淡黄色であるが、周縁は橙色を呈す。尚、対照
菌のうちキサントモナス・マルトフィリア ＡＴＣＣ１
３６３７は生育せず。 (4)Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ寒天平板：３０℃で中等度
の生育。コロニー形態は円形、平滑、光沢あり。色調は
淡黄褐色、集落の周縁部は半透明。尚、対照菌のキサン
トモナス・マルトフィリア ＡＪ２０８２，２２２０，
２５５４はすべて、本菌とコロニー外観がきわめてよく
似ていた。培地中に塩化ナトリウムを３％添加ではこれ
らの菌は生育したが、１０％添加では生育は阻害された
（３０℃）。
【００１９】（ｃ）保存性状 (1)Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ寒天斜面培地：８℃にて、
１カ月間保存可能であった。しかし、６カ月以上経過し
た保存スラントでは菌は死滅していた。 (2)真空凍結乾燥法：１５℃にて、１８年間保存可能で
あった。 (3)−８０℃保存法：Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ液体培地
中（８％ＤＭＳＯ添加）に凍結状態にて、１カ月間の保
存が可能であった。
１カ月間保存可能であった。しかし、６カ月以上経過し
た保存スラントでは菌は死滅していた。 (2)真空凍結乾燥法：１５℃にて、１８年間保存可能で
あった。 (3)−８０℃保存法：Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ液体培地
中（８％ＤＭＳＯ添加）に凍結状態にて、１カ月間の保
存が可能であった。
【００２０】（ｄ）生理学的性質 (1)好気性菌である。従って嫌気的生育無し。 (2)生育温度：３０、３７℃で生育（＋）、４１℃で生
育（−）。 (3)オキシダーゼ：陽性（＋）。 (4)硝酸塩の利用性：陰性（−）。本菌はＫＮＯ3をＮ源
として利用しない。 (5)ウレアーゼ：陰性（−）。 (6)デカルボキシラーゼ：リジンデカルボキシラーゼ
（＋）、アルギニンデカルボキシラーゼ（−）、オルニ
チンデカルボキシラーゼ（−）。 (7)プロテアーゼ：カゼイン加水分解（＋）、ゼラチン
加水分解（＋）。 (8)リパーゼ活性：陽性（＋）。ツゥイーン８０に対す
る加水分解活性が認められた。 (9)糖からの酸生成（３０℃）：糖加アンモニウム培地
で以下の結果を得た。グルコース（−）、セロビオース
（−）、マルトース（＋）、フラクトース（−）、アラ
ビノース（−）、グリセロール（−）、ラクトース
（−）、トレハロース（−）、キシロース（−）。 (10)糖の資化性（３０℃）：糖加アンモニウム培地、及
び最少培地で以下の結果を得た。グルコース（＋）、セ
ロビオース（＋）、マルトース（＋）、ラクトース
（＋）、トレハロース（＋） (11)澱粉の分解性：陰性（−） (12)ＯＮＰＧテスト：陽性（＋）（３０℃の場合）、陰
性（−）（３７℃の場合） (13)クエン酸の利用性：陰性（−）（Ｓｉｍｍｏｎ’ｓ
ｃｉｔｒａｔｅ培地） (14)メチオニン要求性：寒天平板、液体培地のいずれに
ついてもＬ−Ｍｅｔ要求性を認めた。対照としたキサン
トモナス・マルトフィリア （ＡＪ２０８２，２２２
０，２５５４）は、いずれもＬ−Ｍｅｔ要求性を有して
いた（液体培養）。 (15)インドールの生成：陰性（−）（３０、３７℃）
育（−）。 (3)オキシダーゼ：陽性（＋）。 (4)硝酸塩の利用性：陰性（−）。本菌はＫＮＯ3をＮ源
として利用しない。 (5)ウレアーゼ：陰性（−）。 (6)デカルボキシラーゼ：リジンデカルボキシラーゼ
（＋）、アルギニンデカルボキシラーゼ（−）、オルニ
チンデカルボキシラーゼ（−）。 (7)プロテアーゼ：カゼイン加水分解（＋）、ゼラチン
加水分解（＋）。 (8)リパーゼ活性：陽性（＋）。ツゥイーン８０に対す
る加水分解活性が認められた。 (9)糖からの酸生成（３０℃）：糖加アンモニウム培地
で以下の結果を得た。グルコース（−）、セロビオース
（−）、マルトース（＋）、フラクトース（−）、アラ
ビノース（−）、グリセロール（−）、ラクトース
（−）、トレハロース（−）、キシロース（−）。 (10)糖の資化性（３０℃）：糖加アンモニウム培地、及
び最少培地で以下の結果を得た。グルコース（＋）、セ
ロビオース（＋）、マルトース（＋）、ラクトース
（＋）、トレハロース（＋） (11)澱粉の分解性：陰性（−） (12)ＯＮＰＧテスト：陽性（＋）（３０℃の場合）、陰
性（−）（３７℃の場合） (13)クエン酸の利用性：陰性（−）（Ｓｉｍｍｏｎ’ｓ
ｃｉｔｒａｔｅ培地） (14)メチオニン要求性：寒天平板、液体培地のいずれに
ついてもＬ−Ｍｅｔ要求性を認めた。対照としたキサン
トモナス・マルトフィリア （ＡＪ２０８２，２２２
０，２５５４）は、いずれもＬ−Ｍｅｔ要求性を有して
いた（液体培養）。 (15)インドールの生成：陰性（−）（３０、３７℃）
【００２１】（ｅ）黄色色素の産生：菌体中の黄色色素
の存在を確認した。この色素は、キサントモナジンで報
告された波長４２５〜４７５ｎｍの２つの吸収極大がな
かった。 （ｆ）キノンタイプ：ユビキノン（＋）、メナキノン
（−）。 （ｇ）菌体脂肪酸組成の分析：分岐鎖脂肪酸を検出。特
徴的な脂肪酸として、ｉｓｏ−及びａｎｔｅｉｓｏ−型
のＣ15:0脂肪酸を含んでいた。
の存在を確認した。この色素は、キサントモナジンで報
告された波長４２５〜４７５ｎｍの２つの吸収極大がな
かった。 （ｆ）キノンタイプ：ユビキノン（＋）、メナキノン
（−）。 （ｇ）菌体脂肪酸組成の分析：分岐鎖脂肪酸を検出。特
徴的な脂肪酸として、ｉｓｏ−及びａｎｔｅｉｓｏ−型
のＣ15:0脂肪酸を含んでいた。
【００２２】 以上の菌学的性質をＢｅｒｇｅｙ’ｓ
ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８４）及、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７３）、及びＩｄ
ｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａ
ｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ２９（１９９２）の
分類基準により検索すると、本菌はキサントモナス・マ
ルトフィリア と同定された。
ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８４）及、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７３）、及びＩｄ
ｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａ
ｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ２９（１９９２）の
分類基準により検索すると、本菌はキサントモナス・マ
ルトフィリア と同定された。
【００２３】実施例２：キサントモナス・マルトフィリ
ア 由来プロリダーゼの製造法及び性質 肉エキス１．０％、ポリペプトン１．０％、塩化ナトリ
ウム０．５％を含む培地（ｐＨ７．５）５ｍｌに上記キ
サントモナス・マルトフィリア ＦＥＲＭ Ｐー１４９
８６を接種し、３０℃で２４時間前培養を行ったものを
種菌として生産培地に植菌し（１％）、３０℃で２４時
間培養した。その後、得られた培養液１２Ｌを８，００
０ｒｐｍで２０分間、遠心分離することによりプロリダ
ーゼを含む菌体を得た。
ア 由来プロリダーゼの製造法及び性質 肉エキス１．０％、ポリペプトン１．０％、塩化ナトリ
ウム０．５％を含む培地（ｐＨ７．５）５ｍｌに上記キ
サントモナス・マルトフィリア ＦＥＲＭ Ｐー１４９
８６を接種し、３０℃で２４時間前培養を行ったものを
種菌として生産培地に植菌し（１％）、３０℃で２４時
間培養した。その後、得られた培養液１２Ｌを８，００
０ｒｐｍで２０分間、遠心分離することによりプロリダ
ーゼを含む菌体を得た。
【００２４】本菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ８．０）６００ｍｌに懸濁し、Ｄｙｎｏ−
Ｍｉｌｌによりガラスビーズとともに破砕した。本菌体
破砕液を遠心分離し、粗酵素液を得た。破砕前のウェッ
ト菌体１ｇあたり９．０ｍｇの硫酸プロタミンを粗酵素
液に添加し、核酸を沈降させ、氷冷下で１５分間静置し
た後、遠心分離により沈澱物を除去した。次に、硫酸ア
ンモニウムを４０％飽和になるように遠心上清に添加
し、氷冷下で１時間放置後、遠心分離し沈澱物を得た。
この沈澱物に少量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッフ
ァー（ｐＨ８．０）を添加し、沈澱物を溶解した。
ファー（ｐＨ８．０）６００ｍｌに懸濁し、Ｄｙｎｏ−
Ｍｉｌｌによりガラスビーズとともに破砕した。本菌体
破砕液を遠心分離し、粗酵素液を得た。破砕前のウェッ
ト菌体１ｇあたり９．０ｍｇの硫酸プロタミンを粗酵素
液に添加し、核酸を沈降させ、氷冷下で１５分間静置し
た後、遠心分離により沈澱物を除去した。次に、硫酸ア
ンモニウムを４０％飽和になるように遠心上清に添加
し、氷冷下で１時間放置後、遠心分離し沈澱物を得た。
この沈澱物に少量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッフ
ァー（ｐＨ８．０）を添加し、沈澱物を溶解した。
【００２５】その後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラ
ムで脱塩し、あらかじめ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ８．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌにアプライ、０〜０．３Ｍ ＮａＣｌ
で段階的に溶出した。プロリダーゼ活性画分に３０％飽
和になるように硫酸アンモニウムを添加した。本溶液を
３０％飽和硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したＴｏｙ
ｏｐｅａｒｌ ＨＷ６５Ｃカラムにアプライした。吸着
したプロリダーゼは硫酸アンモニウム濃度を徐々に減少
させることにより溶出した。詳細には、グラジエントユ
ニットの一方に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー
（ｐＨ８．０）中で１０％、他方に３０％飽和の硫酸ア
ンモニウムを含む。
ムで脱塩し、あらかじめ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ８．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌにアプライ、０〜０．３Ｍ ＮａＣｌ
で段階的に溶出した。プロリダーゼ活性画分に３０％飽
和になるように硫酸アンモニウムを添加した。本溶液を
３０％飽和硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したＴｏｙ
ｏｐｅａｒｌ ＨＷ６５Ｃカラムにアプライした。吸着
したプロリダーゼは硫酸アンモニウム濃度を徐々に減少
させることにより溶出した。詳細には、グラジエントユ
ニットの一方に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー
（ｐＨ８．０）中で１０％、他方に３０％飽和の硫酸ア
ンモニウムを含む。
【００２６】更に、得られた活性画分を限外濾過により
濃縮した。濃縮液を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡
化されたＨｉｌｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐ
ｇ（ＦＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に
アプライし、プロリダーゼ活性画分を分取した。得られ
た画分を濃縮し、Ｈｉｔｒａｐ Ｑ（ＦＰＬＣ ｓｙｓ
ｔｅｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライし、０．１５
〜０．２Ｍ ＮａＣｌで段階的に溶出した。
濃縮した。濃縮液を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡
化されたＨｉｌｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐ
ｇ（ＦＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に
アプライし、プロリダーゼ活性画分を分取した。得られ
た画分を濃縮し、Ｈｉｔｒａｐ Ｑ（ＦＰＬＣ ｓｙｓ
ｔｅｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライし、０．１５
〜０．２Ｍ ＮａＣｌで段階的に溶出した。
【００２７】得られた活性画分を濃縮し、２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で透析後、再
度Ｈｉｔｒａｐ Ｑにアプライした。吸着されたプロリ
ダーゼは０．１５〜０．２ＭのＮａＣｌで溶出し、精製
プロリダーゼを得た。次に、得られた精製プロリダーゼ
を用いて本酵素の諸性質について検討を行った。
ｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で透析後、再
度Ｈｉｔｒａｐ Ｑにアプライした。吸着されたプロリ
ダーゼは０．１５〜０．２ＭのＮａＣｌで溶出し、精製
プロリダーゼを得た。次に、得られた精製プロリダーゼ
を用いて本酵素の諸性質について検討を行った。
【００２８】本発明の新規プロリダーゼの性状は次の如
くである。 （１）作用 ｐＨ６．０〜８．５の間においてカルボキシル基側にプ
ロリンを持つジペプチドに特異的に働き、ペプチド結合
を加水分解してアミノ酸を遊離せしめる。 （２）基質特異性 低分子合成基質を用いた場合の基質特異性を下記の表１
に示す。用いた基質はすべて４ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ，
Ａｌａ−Ｐｒｏ，Ｖａｌ−Ｐｒｏ等である。尚、本酵素
は後述する通りＭｎ++により活性化されるため、基質特
異性の検討は、Ｍｎ++添加系、無添加系にて実施した。
下記の表１から分かるように、本酵素はＭｎ++存在下
で、Ｌ−Ｘ−Ｐｒｏに対して加水分解能を示す。尚、Ｘ
は任意のアミノ酸を表す。
くである。 （１）作用 ｐＨ６．０〜８．５の間においてカルボキシル基側にプ
ロリンを持つジペプチドに特異的に働き、ペプチド結合
を加水分解してアミノ酸を遊離せしめる。 （２）基質特異性 低分子合成基質を用いた場合の基質特異性を下記の表１
に示す。用いた基質はすべて４ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ，
Ａｌａ−Ｐｒｏ，Ｖａｌ−Ｐｒｏ等である。尚、本酵素
は後述する通りＭｎ++により活性化されるため、基質特
異性の検討は、Ｍｎ++添加系、無添加系にて実施した。
下記の表１から分かるように、本酵素はＭｎ++存在下
で、Ｌ−Ｘ−Ｐｒｏに対して加水分解能を示す。尚、Ｘ
は任意のアミノ酸を表す。
【００２９】
【表１】
【００３０】３）至適ｐＨ 本酵素の基質としてＬ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを用い、かつバ
ッファーとして２０ｍＭトリス−塩酸バッファーを用い
た時の至適ｐＨは約７〜８である。 ４）ｐＨ安定性 本酵素はｐＨ６．０〜８．５の範囲で安定である。 ５）作用至適温度 本酵素の基質としてＬ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを用いた時の至
適温度は約３０〜４０℃である。 ６）温度安定性 ｐＨ７．５で各温度に６０分間保温した後、Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏを基質に用いて残存活性を測定したところ、５０％
の残存活性を有する温度範囲は約３５〜４５℃であっ
た。 ７）金属イオンの影響 本酵素の基質としてＬ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを用いた場合の
金属イオンの影響を下記の表２に示した。用いた金属は
すべて１ｍＭのＭｇＣｌ2，ＣａＣｌ2，ＭｎＣｌ2等で
ある。
ッファーとして２０ｍＭトリス−塩酸バッファーを用い
た時の至適ｐＨは約７〜８である。 ４）ｐＨ安定性 本酵素はｐＨ６．０〜８．５の範囲で安定である。 ５）作用至適温度 本酵素の基質としてＬ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを用いた時の至
適温度は約３０〜４０℃である。 ６）温度安定性 ｐＨ７．５で各温度に６０分間保温した後、Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏを基質に用いて残存活性を測定したところ、５０％
の残存活性を有する温度範囲は約３５〜４５℃であっ
た。 ７）金属イオンの影響 本酵素の基質としてＬ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを用いた場合の
金属イオンの影響を下記の表２に示した。用いた金属は
すべて１ｍＭのＭｇＣｌ2，ＣａＣｌ2，ＭｎＣｌ2等で
ある。
【００３１】
【表２】
【００３２】本酵素はＣｕ++，Ｚｎ++，Ｈｇ++でほぼ完
全に阻害され、Ｍｎ++，Ｆｅ+++により活性化される。
全に阻害され、Ｍｎ++，Ｆｅ+++により活性化される。
【００３３】８）阻害剤 本酵素を各プロテアーゼ阻害剤存在下において、Ｌｅｕ
−Ｐｒｏを基質に用いて相対活性を測定した。その結果
を下記の表３に示した。
−Ｐｒｏを基質に用いて相対活性を測定した。その結果
を下記の表３に示した。
【００３４】
【表３】
【００３５】本酵素はＰＣＭＢ，Ｚ−Ｌ−Ｐｒｏｌｉｎ
ｅ，o−Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ，Ｐｈｅｎｙｌ
ａｃｅｔｙｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔ
ｙｌ−ｔｈｉｏｐｒｏｌｉｎｅにより完全に活性が阻害
され、２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌで若干阻害
される。
ｅ，o−Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ，Ｐｈｅｎｙｌ
ａｃｅｔｙｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔ
ｙｌ−ｔｈｉｏｐｒｏｌｉｎｅにより完全に活性が阻害
され、２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌで若干阻害
される。
【００３６】９）分子量 本酵素の分子量はゲル濾過法で測定すると約９０、００
〜１１０、０００であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法で測定すると約４８、０００〜５５、０
００であった。 このことから、本酵素はダイマーであ
ることが分かった。 １０）力価測定法 前述のＬｅｕ−Ｐｒｏを基質とし、酵素作用によって遊
離するアミノ酸のアミノ基を酸ニンヒドリン法を用いて
測定を行った。すなわち、酵素溶液１０μｌ、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）４４０μ
lに、５ｍＭＬｅｕ−Ｐｒｏ５０μｌを加え、３７℃で
１５分間反応させ、氷酢酸５００μｌを加えて酵素反応
を停止させ、さらにニンヒドリン試薬を加え、１００℃
で１０分間煮沸、冷却後、５１５ｎｍの吸収を測定す
る。
〜１１０、０００であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法で測定すると約４８、０００〜５５、０
００であった。 このことから、本酵素はダイマーであ
ることが分かった。 １０）力価測定法 前述のＬｅｕ−Ｐｒｏを基質とし、酵素作用によって遊
離するアミノ酸のアミノ基を酸ニンヒドリン法を用いて
測定を行った。すなわち、酵素溶液１０μｌ、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）４４０μ
lに、５ｍＭＬｅｕ−Ｐｒｏ５０μｌを加え、３７℃で
１５分間反応させ、氷酢酸５００μｌを加えて酵素反応
を停止させ、さらにニンヒドリン試薬を加え、１００℃
で１０分間煮沸、冷却後、５１５ｎｍの吸収を測定す
る。
【００３７】
【発明の効果】本発明により得られる新規プロリダーゼ
は従来報告されていない、キサントモナス属細菌から効
率よく得られ、細菌由来の既知のプロリダーゼにはない
Ｇｌｙ−Ｐｒｏの分解活性を有する。そのため、この酵
素は醤油中の残存ペプチドを分解できる等、その用途は
極めて広いものと考えられる。
は従来報告されていない、キサントモナス属細菌から効
率よく得られ、細菌由来の既知のプロリダーゼにはない
Ｇｌｙ−Ｐｒｏの分解活性を有する。そのため、この酵
素は醤油中の残存ペプチドを分解できる等、その用途は
極めて広いものと考えられる。
Claims (2)
- 【請求項１】 キサントモナス・マルトフィリア由来の
下記の性質を有するプロリダーゼ。 １）作用 ｐＨ６．０〜８．５の間においてカルボキシル基側にプ
ロリンを持つジペプチドに特異的に働き、ペプチド結合
を加水分解してアミノ酸を遊離せしめる。 ２）基質特異性 Ｍｎ++存在下で、Ｌ−Ｘ−Ｐｒｏに対して加水分解能を
示す。尚、Ｘは任意のアミノ酸を表す。 ３）至適ｐＨ 基質としてＬ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを用い、かつバッファー
として２０ｍＭトリス−塩酸バッファーを用いた時の至
適ｐＨは約７〜８である。 ４）安定ｐＨ範囲 ｐＨ６．０〜８．５の範囲で安定である。 ５）作用至適温度 基質としてＬ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏを用いた時の至適温度は
約３０〜４０℃である。 ６）阻害剤 ＰＣＭＢ，Ｚ−Ｌ−Ｐｒｏ，O−Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏ
ｌｉｎｅ、Ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ
及びＰｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ−ｔｈｉｏｐｒｏｌｉｎ
ｅで活性が阻害される。また、Ｃｕ++、Ｚｎ++ 及びＨ
ｇ++で活性が阻害される。 ７）活性化剤 Ｍｎ++，Ｆｅ+++により活性化される。 ８）分子量 ゲル濾過法で測定すると約９０、０００〜１１０、００
０である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で測定すると約４８、０００〜５５、０００である。 - 【請求項２】 キサントモナス・マルトフィリアを培養
して、培地中に目的とするプロリダーゼを生成、蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とするキサントモナス
・マルトフィリア由来のプロリダーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7151510A JPH09249A (ja) | 1995-06-19 | 1995-06-19 | 新規プロリダーゼとその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7151510A JPH09249A (ja) | 1995-06-19 | 1995-06-19 | 新規プロリダーゼとその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09249A true JPH09249A (ja) | 1997-01-07 |
Family
ID=15520094
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7151510A Pending JPH09249A (ja) | 1995-06-19 | 1995-06-19 | 新規プロリダーゼとその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09249A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999002705A1 (en) * | 1997-07-05 | 1999-01-21 | Societe Des Produits Nestle S.A. | CLONING OF THE PROLYL-DIPEPTIDYL-PEPTIDASE FROM $i(ASPERGILLUS ORYZAE) |
| CN103163269A (zh) * | 2013-03-21 | 2013-06-19 | 佛山市海天调味食品股份有限公司 | 一种酿造酱油和配制酱油的鉴别方法 |
| CN114732121B (zh) * | 2022-03-23 | 2023-07-18 | 江苏大学 | 利用脯氨酸内切蛋白酶减少酱油二次沉淀及提高其总氮和氨基酸含量的方法 |
-
1995
- 1995-06-19 JP JP7151510A patent/JPH09249A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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