JPH09263653A - 嫌気性細菌を用いた微生物産生性脂肪族ポリエステルの分解方法 - Google Patents
嫌気性細菌を用いた微生物産生性脂肪族ポリエステルの分解方法Info
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- JPH09263653A JPH09263653A JP9758496A JP9758496A JPH09263653A JP H09263653 A JPH09263653 A JP H09263653A JP 9758496 A JP9758496 A JP 9758496A JP 9758496 A JP9758496 A JP 9758496A JP H09263653 A JPH09263653 A JP H09263653A
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- C08J11/04—Recovery or working-up of waste materials of polymers
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- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2367/00—Characterised by the use of polyesters obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain; Derivatives of such polymers
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 嫌気性細菌及び／又はその嫌気性細菌から単
離した分解酵素を用いて微生物産生性脂肪族ポリエステ
ルを嫌気条件下で完全に分解する方法を提供する。 【解決手段】 微生物産生性脂肪族ポリエステルを、嫌
気条件下で、クロストリジウム属の嫌気性細菌及び／又
はその培養物から分離した分解酵素を用いて分解する方
法。微生物産生性脂肪族ポリエステルを、クロストリジ
ウム属の嫌気性細菌の培養物から分離した分解酵素を用
いて分解する方法。
離した分解酵素を用いて微生物産生性脂肪族ポリエステ
ルを嫌気条件下で完全に分解する方法を提供する。 【解決手段】 微生物産生性脂肪族ポリエステルを、嫌
気条件下で、クロストリジウム属の嫌気性細菌及び／又
はその培養物から分離した分解酵素を用いて分解する方
法。微生物産生性脂肪族ポリエステルを、クロストリジ
ウム属の嫌気性細菌の培養物から分離した分解酵素を用
いて分解する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物産生性脂肪
族ポリエステルを嫌気条件下で、嫌気性細菌及び／又は
嫌気性細菌の培養物から分離した分解酵素を用いて分解
する方法に関するものである。
族ポリエステルを嫌気条件下で、嫌気性細菌及び／又は
嫌気性細菌の培養物から分離した分解酵素を用いて分解
する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】最近、環境問題に関連して微生物による
プラスチック廃棄物の処理技術が注目されている。使用
中は通常のプラスチックと同じ機能を保ちながら、使用
後は土中や水中に存在する微生物により自然に環境下で
分解され、最終的には水と二酸化炭素にまで分解される
生分解性プラスチックが種々開発されている。具体的に
は、ポリ乳酸、ポリ３ーヒドロキシブチレート、ポリ３
ーヒドロキシバリレート等のポリヒドロキシアルカノエ
ート、ポリカプロラクトン、ポリエチレンアジペートな
どが挙げられる。一般的にポリヒドロキシアルカノエー
トは、微生物によって産生される脂肪属ポリエステルで
ある。前記のような脂肪族ポリエステルを好気条件下で
分解する微生物は、シュードモナス属をはじめ多くの微
生物が知られている。例えばＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，９０，１４５５−１４６６（１９６５）記載の微
生物である。また、嫌気条件下で脂肪族ポリエステルを
分解する微生物はイリオバクター属〔Ａｒｃｈ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．，１５４，２５３−２５９（１９９
０）〕がただ一種知られているのみである。しかしなが
ら、この微生物は脂肪族ポリエステルを完全に分解でき
ない。また、嫌気条件下で脂肪族ポリエステルを分解す
る嫌気性細菌由来の分解酵素は得られていない。
プラスチック廃棄物の処理技術が注目されている。使用
中は通常のプラスチックと同じ機能を保ちながら、使用
後は土中や水中に存在する微生物により自然に環境下で
分解され、最終的には水と二酸化炭素にまで分解される
生分解性プラスチックが種々開発されている。具体的に
は、ポリ乳酸、ポリ３ーヒドロキシブチレート、ポリ３
ーヒドロキシバリレート等のポリヒドロキシアルカノエ
ート、ポリカプロラクトン、ポリエチレンアジペートな
どが挙げられる。一般的にポリヒドロキシアルカノエー
トは、微生物によって産生される脂肪属ポリエステルで
ある。前記のような脂肪族ポリエステルを好気条件下で
分解する微生物は、シュードモナス属をはじめ多くの微
生物が知られている。例えばＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．，９０，１４５５−１４６６（１９６５）記載の微
生物である。また、嫌気条件下で脂肪族ポリエステルを
分解する微生物はイリオバクター属〔Ａｒｃｈ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．，１５４，２５３−２５９（１９９
０）〕がただ一種知られているのみである。しかしなが
ら、この微生物は脂肪族ポリエステルを完全に分解でき
ない。また、嫌気条件下で脂肪族ポリエステルを分解す
る嫌気性細菌由来の分解酵素は得られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、嫌気性細菌
及び／又はその嫌気性細菌から単離した分解酵素を用い
て微生物産生性脂肪族ポリエステルを嫌気条件下で完全
に分解する方法を提供することをその課題とする。
及び／又はその嫌気性細菌から単離した分解酵素を用い
て微生物産生性脂肪族ポリエステルを嫌気条件下で完全
に分解する方法を提供することをその課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成す
るに至った。即ち、本発明によれば、微生物産生性脂肪
族ポリエステルを、嫌気条件下で、クロストリジウム属
の嫌気性細菌及び／又はその培養物から分離した分解酵
素を用いて分解する方法が提供される。また、本発明に
よれば、微生物産生性脂肪族ポリエステルを、クロスト
リジウム属の嫌気性細菌の培養物から分離した分解酵素
を用いて分解する方法が提供される。
解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成す
るに至った。即ち、本発明によれば、微生物産生性脂肪
族ポリエステルを、嫌気条件下で、クロストリジウム属
の嫌気性細菌及び／又はその培養物から分離した分解酵
素を用いて分解する方法が提供される。また、本発明に
よれば、微生物産生性脂肪族ポリエステルを、クロスト
リジウム属の嫌気性細菌の培養物から分離した分解酵素
を用いて分解する方法が提供される。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明で用いる被処理原料は、微
生物産生性脂肪族ポリエステルであり、ポリ３−ヒドロ
キシブチレート（以下、ＰＨＢと略記する）の他、ポリ
乳酸、ポリ３−ヒドロキシバリレート及びそれらの共重
合体が包含される。ポリカプロラクトンやポリエチレン
アジペートは本発明の方法では分解されない。
生物産生性脂肪族ポリエステルであり、ポリ３−ヒドロ
キシブチレート（以下、ＰＨＢと略記する）の他、ポリ
乳酸、ポリ３−ヒドロキシバリレート及びそれらの共重
合体が包含される。ポリカプロラクトンやポリエチレン
アジペートは本発明の方法では分解されない。
【０００６】本発明で用いる微生物はクロストリジウム
属嫌気性細菌であり、本発明者らが土壌より分離した嫌
気条件下で微生物産生性脂肪族ポリエステルを完全に分
解する嫌気性細菌は、ＢＴ９３と命名され、微生物受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５２８９として寄託されている。
属嫌気性細菌であり、本発明者らが土壌より分離した嫌
気条件下で微生物産生性脂肪族ポリエステルを完全に分
解する嫌気性細菌は、ＢＴ９３と命名され、微生物受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５２８９として寄託されている。
【０００７】本菌の培養に使用する基礎培地において
は、その窒素源として、例えば、硫酸ナトリウム、塩
安、硫安、尿素、燐酸第一アンモニウム、炭酸アンモニ
ウム等が利用され、その他無機塩類として、燐酸第一カ
リウム、燐酸第二カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナ
トリウム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄、モリブテン酸
ナトリウム、タングステン酸ナトリウム、塩化第一鉄お
よび硫酸マンガンなど通常利用される培養源が利用でき
る。また、微量栄養源として、酵母エキス、トリプチケ
ース等の天然物が利用できる。この基礎培地に主炭素源
として、微生物産生性脂肪族ポリエステルを０．１〜
２．０重量％の濃度で加え、ｐＨ５．０〜９．０、好ま
しくは、ｐＨ６．５〜８．０に調製した特定培地を用い
て、温度２５〜４０℃で嫌気的に９日〜６０日間、本細
菌を培養すると、微生物産生性脂肪族ポリエステルは強
力に分解され、微生物産生性脂肪族ポリエステル分解酵
素が菌体外に分泌生産される。特定培地中での微生物産
生性脂肪族ポリエステルは、出来るだけ分散している状
態の方が望ましいと考えられるが、綿状、フィルム状で
あっても良い。また、培養を嫌気的に行うため、硫化ナ
トリウム、L-システイン、L-アスコルビン酸等の還元剤
を培地に添加し、培養の気相に酸素を含まない窒素、二
酸化炭素、水素、またはそれらの混合ガスを用いる。
は、その窒素源として、例えば、硫酸ナトリウム、塩
安、硫安、尿素、燐酸第一アンモニウム、炭酸アンモニ
ウム等が利用され、その他無機塩類として、燐酸第一カ
リウム、燐酸第二カリウム、塩化マグネシウム、塩化ナ
トリウム、塩化カルシウム、硫酸第一鉄、モリブテン酸
ナトリウム、タングステン酸ナトリウム、塩化第一鉄お
よび硫酸マンガンなど通常利用される培養源が利用でき
る。また、微量栄養源として、酵母エキス、トリプチケ
ース等の天然物が利用できる。この基礎培地に主炭素源
として、微生物産生性脂肪族ポリエステルを０．１〜
２．０重量％の濃度で加え、ｐＨ５．０〜９．０、好ま
しくは、ｐＨ６．５〜８．０に調製した特定培地を用い
て、温度２５〜４０℃で嫌気的に９日〜６０日間、本細
菌を培養すると、微生物産生性脂肪族ポリエステルは強
力に分解され、微生物産生性脂肪族ポリエステル分解酵
素が菌体外に分泌生産される。特定培地中での微生物産
生性脂肪族ポリエステルは、出来るだけ分散している状
態の方が望ましいと考えられるが、綿状、フィルム状で
あっても良い。また、培養を嫌気的に行うため、硫化ナ
トリウム、L-システイン、L-アスコルビン酸等の還元剤
を培地に添加し、培養の気相に酸素を含まない窒素、二
酸化炭素、水素、またはそれらの混合ガスを用いる。
【０００８】一方、前記の基礎培地中に炭素源として、
微生物産生性脂肪族ポリエステルの代わりに、グルコー
スなどの一般の炭素源を含む培地で培養後、微生物産生
性脂肪族ポリエステルと接触させても、微生物産生性脂
肪族ポリエステルを分解し、微生物産生性脂肪族ポリエ
ステル分解酵素を菌体外に分泌生産することができる。
この理由として、微生物産生性脂肪族ポリエステルと菌
体が接触することによって、誘導的に微生物産生性脂肪
族ポリエステル分解酵素が生産されることが考えられ
る。
微生物産生性脂肪族ポリエステルの代わりに、グルコー
スなどの一般の炭素源を含む培地で培養後、微生物産生
性脂肪族ポリエステルと接触させても、微生物産生性脂
肪族ポリエステルを分解し、微生物産生性脂肪族ポリエ
ステル分解酵素を菌体外に分泌生産することができる。
この理由として、微生物産生性脂肪族ポリエステルと菌
体が接触することによって、誘導的に微生物産生性脂肪
族ポリエステル分解酵素が生産されることが考えられ
る。
【０００９】本発明の酵素の製造方法には、一般に使用
される分離精製法を用いることができる。例えば培養ろ
液を硫安等の塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウ
ムなどの金属凝集法、プロタミンやエチレンイミンポリ
マーなどの凝集法、さらにはイオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲルクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ーなどにより精製することができる。本酵素の至適ｐＨ
は７．５〜９．０付近である。本酵素を用いるときに
は、嫌気条件下のみでなく、好気条件下でも微生物産生
性脂肪族ポリエステルを完全分解できる。
される分離精製法を用いることができる。例えば培養ろ
液を硫安等の塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウ
ムなどの金属凝集法、プロタミンやエチレンイミンポリ
マーなどの凝集法、さらにはイオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲルクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ーなどにより精製することができる。本酵素の至適ｐＨ
は７．５〜９．０付近である。本酵素を用いるときに
は、嫌気条件下のみでなく、好気条件下でも微生物産生
性脂肪族ポリエステルを完全分解できる。
【００１０】このように本発明は微生物産生性脂肪族ポ
リエステルを嫌気的に分解することを可能としたもので
あって、微生物産生性脂肪族ポリエステルの分解処理に
利用でき、本発明を工業的に実施する場合、経済的利用
価値は大きいものと考えられる。
リエステルを嫌気的に分解することを可能としたもので
あって、微生物産生性脂肪族ポリエステルの分解処理に
利用でき、本発明を工業的に実施する場合、経済的利用
価値は大きいものと考えられる。
【００１１】
【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるも
のではない。なお、以下に示す％は重量％を示す。
明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるも
のではない。なお、以下に示す％は重量％を示す。
【００１２】実施例１ 本発明者らは、茨城県つくば市周辺の土壌、および廃水
路底に沈積した汚泥を採取し、後に述べる操作を経て、
微生物産生性脂肪族ポリエステルを分解する嫌気性細菌
を獲得した。培養は、硫酸ナトリウム０．３％、酵母エ
キス０．０５％、トリプチケース０．０５％、ＫＨ2Ｐ
Ｏ4 ０．０５％、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2 Ｏ ０．０３％、
ＮａＣｌ ０．０４％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．００
５％、ＦｅＣｌ2 ・４Ｈ2Ｏ０．００１％、Ｎａ2ＭｏＯ
4・２Ｈ2Ｏ ０．００００３％，Ｎａ2ＷＯ4・２Ｈ2Ｏ
０．００００３％、ＭｎＳＯ4 ０．００００３％、
レサズリン（還元指示薬）０．０００１％をそれぞれ含
有するように調製した基礎培地に、ＰＨＢが０．２％の
割合になるように加えて、ｐＨを７．２に調製した特定
培地を用いた。培養に用いたＰＨＢは、ＩＣＩ社製ＰＨ
Ｂを脂肪酸抽出装置（ソックスレー）を用い、クロロホ
ルムに溶解し、ヘキサンで再沈殿を２回繰り返して綿状
になったものを使用した。ＰＨＢの分子量は、約１４０
００であった。
路底に沈積した汚泥を採取し、後に述べる操作を経て、
微生物産生性脂肪族ポリエステルを分解する嫌気性細菌
を獲得した。培養は、硫酸ナトリウム０．３％、酵母エ
キス０．０５％、トリプチケース０．０５％、ＫＨ2Ｐ
Ｏ4 ０．０５％、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2 Ｏ ０．０３％、
ＮａＣｌ ０．０４％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．００
５％、ＦｅＣｌ2 ・４Ｈ2Ｏ０．００１％、Ｎａ2ＭｏＯ
4・２Ｈ2Ｏ ０．００００３％，Ｎａ2ＷＯ4・２Ｈ2Ｏ
０．００００３％、ＭｎＳＯ4 ０．００００３％、
レサズリン（還元指示薬）０．０００１％をそれぞれ含
有するように調製した基礎培地に、ＰＨＢが０．２％の
割合になるように加えて、ｐＨを７．２に調製した特定
培地を用いた。培養に用いたＰＨＢは、ＩＣＩ社製ＰＨ
Ｂを脂肪酸抽出装置（ソックスレー）を用い、クロロホ
ルムに溶解し、ヘキサンで再沈殿を２回繰り返して綿状
になったものを使用した。ＰＨＢの分子量は、約１４０
００であった。
【００１３】この特定培地９ｍｌを３０ｍｌ容ブチルゴ
ム栓付きネジ口試験管に移し、ガス噴射法により試験管
中の気相を混合ガス（Ｎ2：ＣＯ2＝８０：２０）にて置
換し、１２１℃、１５分間オートクレーブ殺菌を行っ
た。その後、室温にまで冷却し、３．５％ＮａＨＣＯ
3 １ｍｌ、５％Ｌ−システイン０．１ｍｌ、５％硫化
ナトリウム０．１ｍｌを培地に加えて、ろ過、滅菌を行
い、特定培地を調製した。ロールチューブ作成において
は、基礎培地に寒天を１．５％添加して使用した。
ム栓付きネジ口試験管に移し、ガス噴射法により試験管
中の気相を混合ガス（Ｎ2：ＣＯ2＝８０：２０）にて置
換し、１２１℃、１５分間オートクレーブ殺菌を行っ
た。その後、室温にまで冷却し、３．５％ＮａＨＣＯ
3 １ｍｌ、５％Ｌ−システイン０．１ｍｌ、５％硫化
ナトリウム０．１ｍｌを培地に加えて、ろ過、滅菌を行
い、特定培地を調製した。ロールチューブ作成において
は、基礎培地に寒天を１．５％添加して使用した。
【００１４】採取した土壌および汚泥は、一定量を秤量
したのち、硫化ナトリウム、Ｌ−システィンにより還元
した滅菌還元水を速やかに加え、窒素ガス気相下で振と
うにより嫌気性菌を分離した。菌体の分離液を適当に希
釈したのち、上記特定培地に接種して、３０℃で３０日
間培養し、綿状のＰＨＢが粉状になったＰＨＢ分解集積
菌を、更に３０日周期で３回以上植え継ぎしたのち、サ
ンプルとした。
したのち、硫化ナトリウム、Ｌ−システィンにより還元
した滅菌還元水を速やかに加え、窒素ガス気相下で振と
うにより嫌気性菌を分離した。菌体の分離液を適当に希
釈したのち、上記特定培地に接種して、３０℃で３０日
間培養し、綿状のＰＨＢが粉状になったＰＨＢ分解集積
菌を、更に３０日周期で３回以上植え継ぎしたのち、サ
ンプルとした。
【００１５】ＰＨＢを分解した集積菌を、上記ロールチ
ューブに接種し、３０℃で３０日間培養し、透明域を形
成したコロニーを微生物産生性脂肪族ポリエステルの分
解菌株とし、湾曲したガラスキャピラリーによりコロニ
ーを釣りあげることで単離した。ＰＨＢを唯一炭素源と
した集積培養系より、ＰＨＢ分解嫌気性菌を１５株分離
獲得した。また、その中でＰＨＢ分解酵素を菌体外に分
泌するもの２株を得た。
ューブに接種し、３０℃で３０日間培養し、透明域を形
成したコロニーを微生物産生性脂肪族ポリエステルの分
解菌株とし、湾曲したガラスキャピラリーによりコロニ
ーを釣りあげることで単離した。ＰＨＢを唯一炭素源と
した集積培養系より、ＰＨＢ分解嫌気性菌を１５株分離
獲得した。また、その中でＰＨＢ分解酵素を菌体外に分
泌するもの２株を得た。
【００１６】実施例２ 実施例１で獲得した、ＰＨＢ分解酵素を菌体外に分泌す
る２株の中の１株（ＢＴ９３）を同定した。その菌学的
性質は次の通りである。
る２株の中の１株（ＢＴ９３）を同定した。その菌学的
性質は次の通りである。
【００１７】１．顕微鏡的形態 細胞の形および大きさ 直桿状 １．２〜１．８μｍ×３．８〜５．０μｍ 単細胞あるいは双細胞になる 運動性・・・・・・・・有り 胞子の有無・・・・有り グラム染色・・・・陽性
【００１８】２．生理的性質 （１）資化できる炭素化合物 ブドウ糖、グリセロール、マルトース、マンノース、サ
リシン （２）資化できない炭素化合物 ラムノース、白糖、キシロース、ソルビトール、アラビ
ノース、乳糖、マンニトール、トレハロース、セルビオ
ース、ラフィノース （３）インドールの生成……………有り （４）カタラーゼ……………………無し （５）エスクリン反応………………有り （６）硝酸塩の還元…………………無し （７）ゼラチン液化…………………有り （８）レシチナーゼ反応……………有り （９）リパーゼ反応…………………無し （１０）プロテアーゼ反応…………有り この菌株ＢＴ９３は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆ
ｅｒｍｅｎｔａｎｓ近縁種と同定された。
リシン （２）資化できない炭素化合物 ラムノース、白糖、キシロース、ソルビトール、アラビ
ノース、乳糖、マンニトール、トレハロース、セルビオ
ース、ラフィノース （３）インドールの生成……………有り （４）カタラーゼ……………………無し （５）エスクリン反応………………有り （６）硝酸塩の還元…………………無し （７）ゼラチン液化…………………有り （８）レシチナーゼ反応……………有り （９）リパーゼ反応…………………無し （１０）プロテアーゼ反応…………有り この菌株ＢＴ９３は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆ
ｅｒｍｅｎｔａｎｓ近縁種と同定された。
【００１９】実施例３ ＰＨＢ分解酵素を分泌するＢＴ９３株を、実施例１の特
定培地に接種し、２日間前培養したのち、植え継ぎ培養
を２３日間行い、酵素精製のサンプルとした。酵素精製
は、菌体および沈殿物を取り除くため、培養物を高速遠
心機によって１００００ｒｐｍ．にて、３０分間遠心分
離したのち、上澄み液を孔径が０．２２μｍのフィルタ
ー（ミリポア社製）でろ過した。この溶液に１０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）と、０．３Ｍの硫安を加
え、Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（東ソー株式会社
製）を充填したカラムに通して、酵素を吸着させた。そ
の後、０．３〜０Ｍの濃度勾配を持つ硫安水溶液をカラ
ムに通して、酵素を溶出した。酵素活性を測定しなが
ら、酵素濃度の高い溶出液を分取した。
定培地に接種し、２日間前培養したのち、植え継ぎ培養
を２３日間行い、酵素精製のサンプルとした。酵素精製
は、菌体および沈殿物を取り除くため、培養物を高速遠
心機によって１００００ｒｐｍ．にて、３０分間遠心分
離したのち、上澄み液を孔径が０．２２μｍのフィルタ
ー（ミリポア社製）でろ過した。この溶液に１０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）と、０．３Ｍの硫安を加
え、Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（東ソー株式会社
製）を充填したカラムに通して、酵素を吸着させた。そ
の後、０．３〜０Ｍの濃度勾配を持つ硫安水溶液をカラ
ムに通して、酵素を溶出した。酵素活性を測定しなが
ら、酵素濃度の高い溶出液を分取した。
【００２０】酵素活性の測定は以下のようにして行っ
た。ＰＨＢ０．６ｇをジクロロメタン５０ｍｌに完全に
溶解し、これを超音波破砕機を作動させながら５００ｍ
ｌの水中に加え、水を沸騰させて、溶媒を完全に蒸発さ
せた。この溶液を用いて０．１％ＰＨＢ水分散液を調製
した。０．１％ＰＨＢ水分散液溶液４．８５ｍｌに１Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）０．０５ｍｌを混合
し、３０℃で予備加温し、酵素液０．１ｍｌを添加し、
ゆるやかに混和した後、３０℃で反応させた。一定時間
反応後、塩酸を０．０５ｍｌ添加し反応を停止させ、孔
径が０．２２μｍのミリポアフィルターでろ過して、未
分解物を取り除き、取り除いた液の２１０ｎｍの吸光度
を求めた。分解酵素の活性の表示は、上記条件下で１分
間あたり吸光度が１減少する酵素量を１単位（Ｕ）とし
た。
た。ＰＨＢ０．６ｇをジクロロメタン５０ｍｌに完全に
溶解し、これを超音波破砕機を作動させながら５００ｍ
ｌの水中に加え、水を沸騰させて、溶媒を完全に蒸発さ
せた。この溶液を用いて０．１％ＰＨＢ水分散液を調製
した。０．１％ＰＨＢ水分散液溶液４．８５ｍｌに１Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８.５）０．０５ｍｌを混合
し、３０℃で予備加温し、酵素液０．１ｍｌを添加し、
ゆるやかに混和した後、３０℃で反応させた。一定時間
反応後、塩酸を０．０５ｍｌ添加し反応を停止させ、孔
径が０．２２μｍのミリポアフィルターでろ過して、未
分解物を取り除き、取り除いた液の２１０ｎｍの吸光度
を求めた。分解酵素の活性の表示は、上記条件下で１分
間あたり吸光度が１減少する酵素量を１単位（Ｕ）とし
た。
【００２１】酵素の基質特異性を検討するため、ポリカ
プロラクトン、ポリエチレンアジペート、ポリプロピレ
ンの０．１％水分散液を作製した。この水分散液を用い
て、上記酵素活性の測定法と同様の方法でポリカプロラ
クトン、ポリエチレンアジペート、ポリプロピレンの分
解性を検討した。反応液中のポリマー濃度は、反応液を
孔径が０．２２μｍのミリポアフィルターでろ過し、ろ
紙を減圧乾燥し、ろ紙重量の増加量を測定して求めた。
酵素反応前後のポリマー濃度の測定から、分解性を調べ
た。
プロラクトン、ポリエチレンアジペート、ポリプロピレ
ンの０．１％水分散液を作製した。この水分散液を用い
て、上記酵素活性の測定法と同様の方法でポリカプロラ
クトン、ポリエチレンアジペート、ポリプロピレンの分
解性を検討した。反応液中のポリマー濃度は、反応液を
孔径が０．２２μｍのミリポアフィルターでろ過し、ろ
紙を減圧乾燥し、ろ紙重量の増加量を測定して求めた。
酵素反応前後のポリマー濃度の測定から、分解性を調べ
た。
【００２２】該酵素は、ＰＨＢホモポリマーを分解した
が、リパーゼで分解されるポリカプロラクトンおよびポ
リエチレンアジペートを分解しなかった。培養液の酵素
活性は、ＰＨＢホモポリマーを基質として用いた場合、
反応時間とともに減少したが、ポリカプロラクトンおよ
びポリエチレンアジペートを基質として用いた場合、減
少しなかった。次に、ＰＨＢを酵素分解した後の、最終
産物をゲルクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で調べた。Ｇ
ＰＣの測定条件は、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、室温、移動相
は０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２
Ｍ塩化ナトリウムの混合溶液、カラムはＴＯＳＯＨ Ｔ
ＳＫ−ＧＥＬ Ｇ２５００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社
製）を用いて、紫外線吸収法（２１０ｎｍ）で検出し
た。ＧＰＣによる測定結果、分解酵素を用いたＰＨＢの
分解の最終産物は、モノマーとダイマーであることがわ
かった。
が、リパーゼで分解されるポリカプロラクトンおよびポ
リエチレンアジペートを分解しなかった。培養液の酵素
活性は、ＰＨＢホモポリマーを基質として用いた場合、
反応時間とともに減少したが、ポリカプロラクトンおよ
びポリエチレンアジペートを基質として用いた場合、減
少しなかった。次に、ＰＨＢを酵素分解した後の、最終
産物をゲルクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で調べた。Ｇ
ＰＣの測定条件は、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、室温、移動相
は０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２
Ｍ塩化ナトリウムの混合溶液、カラムはＴＯＳＯＨ Ｔ
ＳＫ−ＧＥＬ Ｇ２５００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社
製）を用いて、紫外線吸収法（２１０ｎｍ）で検出し
た。ＧＰＣによる測定結果、分解酵素を用いたＰＨＢの
分解の最終産物は、モノマーとダイマーであることがわ
かった。
【００２３】実施例４ 実施例３と同様に、ＰＨＢ分解酵素を分泌するＢＴ９３
株を、０．２％ＰＨＢを含む特定培地に接種し、２日間
前培養したのち、２％植菌で、植え継ぎ培養を２３日間
行なった。培養に用いたＰＨＢは、実施例１と同様に、
綿状になったものを使用した。未分解のＰＨＢは、培養
物をろ紙（東洋濾紙Ｎｏ．２）でろ過し、ろ紙上の残留
物の乾燥重量から求めた。菌体量は、孔径０．２２μｍ
のミリポアフィルターでろ過し、ろ紙上の残留物の乾燥
重量から求めた。２３日間の培養期間中のＰＨＢの分解
率、ＰＨＢ分解酵素の酵素活性および菌体量の変化を図
１に示した。図１において、黒丸はＰＨＢの分解率を示
し、白丸はＰＨＢ分解酵素の酵素活性を示し、三角は菌
体量を示し、四角はｐＨを示す。培養開始後、５日目頃
から酵素活性が増加し始め、それに伴って、ＰＨＢが分
解し始め、約２０日で完全に分解した。途中菌体はあま
り増加せず、分解酵素のみが増加した。
株を、０．２％ＰＨＢを含む特定培地に接種し、２日間
前培養したのち、２％植菌で、植え継ぎ培養を２３日間
行なった。培養に用いたＰＨＢは、実施例１と同様に、
綿状になったものを使用した。未分解のＰＨＢは、培養
物をろ紙（東洋濾紙Ｎｏ．２）でろ過し、ろ紙上の残留
物の乾燥重量から求めた。菌体量は、孔径０．２２μｍ
のミリポアフィルターでろ過し、ろ紙上の残留物の乾燥
重量から求めた。２３日間の培養期間中のＰＨＢの分解
率、ＰＨＢ分解酵素の酵素活性および菌体量の変化を図
１に示した。図１において、黒丸はＰＨＢの分解率を示
し、白丸はＰＨＢ分解酵素の酵素活性を示し、三角は菌
体量を示し、四角はｐＨを示す。培養開始後、５日目頃
から酵素活性が増加し始め、それに伴って、ＰＨＢが分
解し始め、約２０日で完全に分解した。途中菌体はあま
り増加せず、分解酵素のみが増加した。
【００２４】実施例５ クロロホルムにＰＨＢを３％になるように溶解し、その
溶液を平らなガラス面上に流延し、室温で２４時間放置
しクロロホルムを蒸発させる方法で、厚さ４７μｍのＰ
ＨＢキャストフィルムを作製した。このフィルムを１×
２ｃｍにカットし、実施例３と同様に特定培地に加えて
ＰＨＢ分解菌による分解性の検討を行った。約２０日間
培養して、フィルムの表面を走査型電子顕微鏡で観察し
た結果、フィルムの表面から分解されることがわかっ
た。
溶液を平らなガラス面上に流延し、室温で２４時間放置
しクロロホルムを蒸発させる方法で、厚さ４７μｍのＰ
ＨＢキャストフィルムを作製した。このフィルムを１×
２ｃｍにカットし、実施例３と同様に特定培地に加えて
ＰＨＢ分解菌による分解性の検討を行った。約２０日間
培養して、フィルムの表面を走査型電子顕微鏡で観察し
た結果、フィルムの表面から分解されることがわかっ
た。
【００２５】
【発明の効果】本発明の嫌気性細菌による微生物産生性
脂肪族ポリエステルの分解方法は、生分解性プラスチッ
クの廃棄処理方法において、省スペース、省エネルギー
等の優れた特性を有する産業上極めて利用価値の高い技
術である。
脂肪族ポリエステルの分解方法は、生分解性プラスチッ
クの廃棄処理方法において、省スペース、省エネルギー
等の優れた特性を有する産業上極めて利用価値の高い技
術である。
【図１】ＰＨＢ分解酵素の分解率と菌体量の変化を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 常盤 豊 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 柴谷 滋郎 東京都港区西新橋２−８−11 第７東洋海 事ビル８階 財団法人地球環境産業技術研 究機構 ＣＯ２固定化等プロジェクト室内
Claims (2)
- 【請求項１】 微生物産生性脂肪族ポリエステルを、嫌
気条件下で、クロストリジウム属の嫌気性細菌及び／又
はその培養物から分離した分解酵素を用いて分解する方
法。 - 【請求項２】 微生物産生性脂肪族ポリエステルを、ク
ロストリジウム属の嫌気性細菌の培養物から分離した分
解酵素を用いて分解する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9758496A JP2889953B2 (ja) | 1996-03-27 | 1996-03-27 | 嫌気性細菌を用いた微生物産生性脂肪族ポリエステルの分解方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9758496A JP2889953B2 (ja) | 1996-03-27 | 1996-03-27 | 嫌気性細菌を用いた微生物産生性脂肪族ポリエステルの分解方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09263653A true JPH09263653A (ja) | 1997-10-07 |
| JP2889953B2 JP2889953B2 (ja) | 1999-05-10 |
Family
ID=14196295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9758496A Expired - Lifetime JP2889953B2 (ja) | 1996-03-27 | 1996-03-27 | 嫌気性細菌を用いた微生物産生性脂肪族ポリエステルの分解方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2889953B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004339420A (ja) * | 2003-05-19 | 2004-12-02 | Kanebo Ltd | 生分解性樹脂からなる成形体と植物の混合物の分解方法 |
| EP2876157A1 (en) * | 2013-11-26 | 2015-05-27 | Basf Se | Degradation of polyesters under anaerobic conditions |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05344897A (ja) * | 1992-06-12 | 1993-12-27 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 酵素を用いた脂肪族ポリエステルの分解法及び表面処理方法 |
| JPH0751088A (ja) * | 1993-08-17 | 1995-02-28 | Ebara Res Co Ltd | 石油系プラスチックの水素生産を伴なう生物学的分解方法 |
| JPH07132272A (ja) * | 1993-10-19 | 1995-05-23 | Agency Of Ind Science & Technol | 嫌気性細菌による脂肪族ポリエステルの分解方法 |
| JPH07165977A (ja) * | 1993-12-10 | 1995-06-27 | Unitika Ltd | ポリ脂肪酸エステルの分解方法 |
-
1996
- 1996-03-27 JP JP9758496A patent/JP2889953B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05344897A (ja) * | 1992-06-12 | 1993-12-27 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 酵素を用いた脂肪族ポリエステルの分解法及び表面処理方法 |
| JPH0751088A (ja) * | 1993-08-17 | 1995-02-28 | Ebara Res Co Ltd | 石油系プラスチックの水素生産を伴なう生物学的分解方法 |
| JPH07132272A (ja) * | 1993-10-19 | 1995-05-23 | Agency Of Ind Science & Technol | 嫌気性細菌による脂肪族ポリエステルの分解方法 |
| JPH07165977A (ja) * | 1993-12-10 | 1995-06-27 | Unitika Ltd | ポリ脂肪酸エステルの分解方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004339420A (ja) * | 2003-05-19 | 2004-12-02 | Kanebo Ltd | 生分解性樹脂からなる成形体と植物の混合物の分解方法 |
| JP4631252B2 (ja) * | 2003-05-19 | 2011-02-16 | 東レ株式会社 | ポリ乳酸系樹脂からなる成形体と植物の混合物の分解方法 |
| EP2876157A1 (en) * | 2013-11-26 | 2015-05-27 | Basf Se | Degradation of polyesters under anaerobic conditions |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2889953B2 (ja) | 1999-05-10 |
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