WO2001016302A1 - Nouvelle enzyme thermostable digerant le collagene, nouveau micro-organisme produisant l'enzyme et methode de production de l'enzyme - Google Patents

Description

明 糸田 新規な 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 、 前記酵素 を産生す る 新規 な微生物 お よ び前記酵素 の製造方法

技術分野

こ の発明 は 、 新規な微生物起源の耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 、 前記新規な微生物 お よ び前記微生物 に よ る 前記酵素 の製造方法、 具体的 に は 、 バ チル ス （ B a c i 1 1 u s ) 属 に属す る 新規な微 生物起源の コ ラ ー ゲ ン に対 し て 最 も 高 い反応性 （基質特異性） を 有す る 新親 な耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 、 前記新規な微生物 お よ び前記微生物 に よ る 前記酵素 の製造方法 に 関す る 。 背景技術

従来か ら コ ラ ー ゲ ン分解酵素ゃゼ ラ チ ン分解酵素 は 工業的 に利 用 さ れて き た。 例 え ば、 こ れ ら の酵素 を用 い た コ ラ ー ゲ ンの加水 分解物 は、 シ ヮ 取 リ な ど の美容整形用 の材料 と し て有用 であ る し ま た保湿性、 免疫賦活作用 等 の 興味深い生理活性 も 見 い だ さ れて ぉ リ 、 実際 に 、 コ ラ一ゲ ン を低分子化 し たべ プチ ド が 医療や化粧 品 分野 に お い て 多量 に用 い ら れて い る 。 ま た 、 写真用 乳剤 な ど に はゼ ラ チ ン が用 い ら れて お リ 、 レ ン 卜 ゲ ン用 や写真の フ イ ノレ ム の リ サイ ク ル に はゼ ラ チ ン分解酵素 が用 い ら れて い る 。 コ ラ ー ゲ ン の 変性産物 で あ る ゼ ラ チ ン を 分解で き る プ ロ テ ア 一ゼ は多数知 ら れて い る が 、 こ れ ら の プ ロ テ ア一ゼ に よ る コ ラ ー ゲ ン の 分解は 困 難で ぁ リ 、 コ ラ ー ゲ の加水分解 に は 「 コ ラ ゲナーゼ」 と 呼ばれ る 特異的 な金属 プ ロ テ ア 一ゼ群 が用 い ら れて い る 。

ま た近年、 有機廃棄物 の有効利用 の た め に 、 バイ オ コ ンパー ジ ヨ ン （生物学的変換） の技術の積極的利用 が試み ら れて い る 。 例 え ば生 ゴ ミ の堆肥化 （ コ ンポ ス ト イヒ） はそ の好例 で あ る 。 動物性 タ ンノ ク 質の 3 0 %以上 は コ ラ ー ゲ ン力 ら な っ て ぉ リ 、 一般家庭 や食堂カゝ ら 出 さ れ る 车 ゴ ミ 、 お よ び食 肉加 工業 に お い て排出 さ れ る 廃棄物 に も コ ラ ー ゲ ン が多量 に含ま れて レ、 る 。

コ ラ ー ゲ ン は そ の特殊 な高 次構造の た め に 一般 に難溶性 · 難分 解性でぁ リ 、 コ ン ポス ト イ匕に お レヽ て も 比較的分解の遅レヽ タ ンノ ク 質で あ る 。 畜産資源の 非利用 部分の多 く は難分解性で あ る の で、 多 く は焼却処分 さ れて い る の が 現状で ぁ リ 、 地球の温暖化や大気 汚染で問題 と さ れて い る 二酸化炭素や ダイ ォ キ シ ン な ど の発生の 問題 を も た ら し て レヽ る 。

こ れは物質の有効利用 と い う 点 か ら 見て も 解決すべ き 問題で あ る 。

コ ン ポ ス ト 化の過程で有機廃棄物 の 品 温 は微生物 の発酵熱に よ リ 5 0 〜 6 5 °C あ る い は それ以上 に達す る こ と が 知 ら れて い る 。 従 っ て 、 こ う し た コ ン ポス ト イ匕の条件 に 耐 え う る 耐熱性酵素ま た は好熱性微生物 が利用 で き れ ば、 コ ン ポ ス ト 化が ょ リ 有効 に進 行す る も の と 考 え ら れ る 。

現在、 工業的 目 的 に利用 さ れて い る コ ラ ゲナーゼ は主 と し て微 生物 （細菌） 由 来 の も の で ぁ リ 、 そ の一例 と し て St rept omyc es属 放線菌 の コ ラ ゲナ一ゼ を 挙げ る こ と が で き る 。 他 に も 微生物起源 の コ ラ ゲナーゼ は 多数知 ら れて ぉ リ 、 例 え ば、 Cl os t r i d i um hy s t o l yt i cum ( Bi ochemi s t ry 1984 , 23， 3077 - 3085 ) や Cy tophaga s p . (B i o s c i . Bi o t ec h. Bi oc hem. , 1993, 57 , 1894-1898 ) な ど 力 そ の例で あ る 。

工業 的 に利用 さ れて い る 酵素 の例か ら 、 酵素 が 工業的 に利用 さ れ る た め に は 、 処理速度 お よ び処理対象物 の範囲 の観点 か ら 、 一 般的 に 耐熱性 を 有 し て い な け れ ばな ら な い。

し カゝ し な が ら 、 従来 の コ ラ ゲナーゼ は例外 な く 中 温菌 由 来の も の で熱安定性に 欠 け て い る た め 、 そ の 工業的利用 性は不十分な も の で あ っ た。 こ れ ま での と こ ろ 工業的 に利用 可能 な程度 に 耐熱性 (至適 温度 が 十分高 い） の あ る コ ラ ー ゲ ン分解酵素 は見 い だ さ れ て い な レヽ。

従 っ て 、 前記問題は、 従来工業的 に有効 に機能す る 酵素が な い た め に利用 で き な かっ た コ ラ ー ゲ ン に対 し て 高 い活性を持つ酵素 を 開発す る こ と が で き れば一気 に解決す る こ と は明 ら かで あ る 。

よ っ て 、 こ の発 明 の課題 は、 耐熱性の コ ラ ー ゲ ン分解酵素 を見 レヽ 出す こ と で あ る 。 .

本発 明者等 は 、 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 生産微生物 を 自 然界 に 幅広 く 探索 し 、 仙 台 巿の 土壌か ら バ チル ス （ B a c i 1 l u s ) 属 に属す る 微生物 に 、 前記酵素 を 生産す る 有望 な好熱性細菌株 を 見い だ し 、 こ の発 明 を 完成 さ せ た。

こ の発 明 の耐熱性の コ ラ ー ゲ ン分解酵素 を製造す る の に用 い ら れ る 微生物 は 、 バ チ ル ス （ B a c i 1 1 u s ) 属 に属す る 微生物 で あ リ 、 B a c i 1 1 1 5 属細菌 1^ 丁 八 ？ ー 1 株で ぁ る 。 本菌株 は通産省工業技術院生命 工学工業技術研究所 に 、 Ba c i l l us s p. N TAP- 1 と 表示 さ れ、 平成 1 1 年 1 1 月 1 日 に原寄託 に よ リ ブ タ ぺ ス 卜 条約 に基づ く 寄託へ の移管請求 に よ リ 受託番号 F E R M B P — 6 9 2 6 と し て受託 さ れた （平成 1 1 年 8 月 2 7 日 に受託番 号 F E R M P — 1 7 5 3 5 と し て原寄託 さ れた。 ） （明細書 中 で は 単に 「 N T A P — 1 株」 と 表示す る 場合が あ る 。 ） 。

そ し て こ れ を用 いれ ば、 工業用 と し て 有用 な酵素 を得 る こ と が で き 、 ノ ィ ォ コ ンバー ジ ョ ン の触媒 と し て 有効 に利用 で き る こ と を 見 出 し た。 発 明 の 開示

こ の発 明 の 第 丄 は、 以 下 の 特性、 す な わ ち 、 （ 1 ) グ ラ ム 染色 性は陰性ま た は不定性で ぁ リ 、 （ 2 ) 胞子形成能 が ぁ リ 、 （ 3 ) 運動性が ぁ リ 、 （ 4 ) 7 0 °C で生育す る が 、 3 0 °C ま た は 8 0 °C で は生育せず、 P H 5 で は生育す る が P H 7 では生育せず、 （ 6 ) 桿菌 で ぁ リ 、 （ 7 ) カ タ ラ ーゼ 陰性で ぁ リ 、 （ 8 ) ォキ シ ダーゼ 陰性で ぁ リ 、 （ 9 ) 0 / F 試験陰性で ぁ リ 、 （ 1 0 ) ァ セ ト イ ン 産生能 を も ち 、 お よ び （ 1 1 ) ゼ ラ チ ン分解能 を も つ こ と で特徴 付 け ら れ る ノ チ ノレ ス （ B a c i 1 l u s ) 属 に属 す る 耐熱性 コ ラ 一ゲ ン分解酵素生産能 を 有す る 微生物 か ら 得 ら れ る 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 で あ る 。 こ れに よ つ て 、 7 0 °C ま で の雰囲気 に おい て コ ラ一ゲ ン類 の分解 に利用 で き る 優れた 作用 効果が も た ら さ れ る 。

好 ま し く は 、 以 下の 特性、 す な わ ち 、 （ 1 ) カ ゼイ ン 、 ゼ ラ チ ン 、 ァ ノレブ ミ ン お よ び コ ラ ー ゲ ン の な かで 、 コ ラ ー ゲ ン お よ びゼ ラ チ ン を も っ と も 効率良 く 加水分解す る 能力 を持 ち 、 （ 2 ) 反応 最適 （至適） p H 力； p H 3 . 5〜 4 . 5 で あ リ 、 （ 3 ) 反応最適 温度 （至適温度） 力 s 6 5〜 7 0 °C で あ リ 、 （ 4 ) 6 0 °C、 p H 6 . 0 で 4 時間 の熱処理後 も 、 処理前の 6 0 %以上の 活性 を保持 し て ぉ リ 、 （ 5 ) P H 3 — 6 の 間 で安定で ぁ リ 、 （ 6 ) S D S — ポ リ ァ ク リ ノレ ア ミ ド ゲル電気泳動 で の 分子量約 4 6 0 0 0 で あ る こ と を 特徴 と す る 前記耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 であ リ 、

ょ リ 好 ま し く は 、 バ チ ル ス （ B a c i 1 1 u s ) 属 に属す る 微 生物 力； B a c i 1 l u s 属細菌 N T A P — 1 株で あ る こ と を特徴 と す る 前記耐熱性 コ ラ ー ゲ ン 分解酵素 で あ る 。

こ の発 明 の 第 2 は 、 以 下 の 特性、 す な わ ち 、 （ 1 ) グ ラ ム染色 性 は陰性ま た は不定性で ぁ リ 、 （ 2 ) 胞子形成能 が ぁ リ 、 （ 3 ) 運動性が ぁ リ 、 （ 4 ) 7 0 °C で生育す る が 、 3 0 °C ま た は 8 0 °C で は生育せず、 （ 5 ) P H 5 で は生育す る が P H 7 で は生育せず、

( 6 ) 桿菌 で あ り 、 （ 7 ) カ タ ラ ーゼ陰性で ぁ リ 、 （ 8 ) ォキ シ ダーゼ陰性で ぁ リ 、 （ 9 ) O Z F 試験陰性で ぁ リ 、 （ 1 0 ) ァセ ト イ ン産生能 を も ち お よ び （ 1 1 ) ゼ ラ チ ン分解能 を も つ耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 を 産生す る 、 ノ チ ノレ ス （ B a c i 1 l u s ) 属 に属す る 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン 分解酵素生産能 を有す る 微生物 を用 い 、 以下の 特性、 すな わ ち 、 （ 1 ) カ ゼイ ン 、 ゼ ラ チ ン、 アルブ ミ ン 、 コ ラ ー ゲ ン の な かで、 コ ラ ー ゲ ン お よ びゼ ラ チ ン を も っ と も 効率良 く 加水分解す る 能力 を 持 ち 、 （ 2 ) 反応最適 （至適） p H 力； p H 3 . 5 〜 4 . 5 に あ リ 、 （ 3 ) 反応最適温度 （至適温度） が 6 5 〜 7 0 。C で あ リ 、 （ 4 ) 6 0 °C 、 p H 6 . 0 で 4 時間 の熱 処理後 も 、 処理前 の 6 0 %以上 の活性 を保持 し て ぉ リ 、 （ 5 ) p H 3 — 6 の 間 で安定で ぁ リ お よ び （ 6 ) S D S ( so d i um d o d e c y 1 s u l f a t e ： ドデ シノレ硫酸ナ ト リ ウ ム ） 一 ポ リ ア ク リ ノレ ア ミ ドゲノレ 電気泳動で の 分子量約 4 6 0 0 0 で あ る 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵 素 を培養物 中 に精製蓄積 さ せ、 こ れ を採取す る こ と を 特徹 と す る 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の製造方法 で あ る 。

好 ま し く は 、 B a c i 1 l u s 属 に属す る 微生物 力 S B a c i 1 1 u s 属細菌 N T A P — 1 株 で あ る こ と を特徴 と す る 前記耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の製造方法 で あ る 。

こ の発 明 の 第 3 は、 バ チル ス 属 （ B a c i 1 1 u s ) に属 し前 記の 耐熱性 を 有す る コ ラ 一 ゲ ン分解酵素 を 産生す る 新規な微生物 で あ リ 、 好 ま し く は 、 通産省 工業技術院生命 工学工業技術研究所 に 、 バ チノレ ス エ ス ピ ー N T A P — 1 (Ba c i l l us s p . NTAP— 1 ) と 表示 さ れ、 平成 1 1 年 1 1 月 1 日 に原寄託 に よ リ ブ タ ぺ ス ト 条 約 に基づ く 寄託への移管請求 に よ リ 受託番号 F E R M B P — 6 9 2 6 と し て 受託 さ れ た （平成 1 1 年 8 月 2 7 日 に受託番号 F E R M P — 1 7 5 3 5 と し て原寄託 さ れた。 ） こ と を 特徴 と す る 前記の微生物 で あ る 。

本発 明者等 は 、 バチルス （ B a c i 1 1 u s ) 属 に 属す る 微生 物 中 に 、 耐熱性 コ ラ 一 ゲ ン分解酵素 を産生す る 新規な微生物が あ る こ と を発 見す る こ と に よ リ 、 前記 こ の発 明 の課題 を解決 し た の で あ る 。 図 面 の簡 単 な説明

図 1 は 、 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の熱安定性 を示す図 で あ リ 図 2 は 、 前記耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の P H安定性 を示 し 、 図 3 は 、 前記熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の反応 の 温度依存性を示 し 、 ま た 図 4 は 、 前記耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の反応の P H 依存性 を示す図 で あ る 。 発 明 を実施す る た め の最 良 の 形態

本発明 を 詳細 に説明す る 。

A . こ の発 明 で、 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 を産生 さ せ る の に使 用 す る 細菌 の 菌学的特徴は前記 し た と お リ で あ る 。

更 に 、 こ の微生物は凍結法 （ ― 8 0 °C付近） で保管 で き る 。 B . 生育条件

培地名 ： G G Y 培地

培地の組成 ： グル コ ー ス 1 . 5 % 、 ゼ ラ チ ン 1 . 5 % 、 酵母ェ キ ス 0 . 0 1 % を含む培地

培地の p H ： 4 . 8

培地の殺菌条件 ： 1 2 0 °C で 2 0 分間

培地温度 ： 6 0 °C

好気性

C . 保護剤 の組成 ： 3 0 % グ リ セ ロ ール水溶液 （保護剤 の P H は 調製不要）

保護剤の P H調製不要

保護剤殺菌条件 ： 1 2 0 °C で 2 0 分間

こ の発明 の 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の 特性 を 図 に従 っ て説明す る 。

図 1 は、 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の各温度 で 1 時間熱処理後 の 残存酵素活性 を 、 3 0 °C の処理の 時の活性 を 1 0 0 % と し た と き の相対値を 示 し た も の で あ る 。

図 2 は、 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の各 p H で 1 時間 処理後 の残 存酵素活性 を 、 P H 4 . 1 で処理 し た 時の活性を 1 0 0 % と し た と き の相 対値を示 し た も の で あ る 。

図 3 は 、 熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の各温度 に お け る 活性を 、 最大 活性 を示 し た 6 0 °C に お け る 酵素活性を 1 0 0 % と し て相対活性 を示 し た も の で あ る 。

図 4 は 、 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素の各 P H に お け る 活性 を 、 最 大活性 を示 し た P H 3 . 8 に お け る 酵素活性を 1 0 0 % と して相 対活性 を示 し た も の で あ る 。

実施例

〔実施例 1 〕

土壌、 汚水、 堆肥な ど さ ま ざま な試料を 0 . 8 5 % の食塩水に て 1 0 0 〜 1 0 0 0 0 倍 に希釈 し た後、 そ の 0 . 1 m l を G G Y 寒天培地上 に塗布 し 、 7 0 °C で 2 〜 3 日 静置 し た。 培地上に生育 し た コ ロ ニ ー を 白 金耳 に て 取 リ 、 5 m 1 の G G Y液体培地 に接種 し て 7 0 °C で 2 〜 3 日 し ん と う 培養 し た。 こ の よ う に 分離 した お よ そ数百株の分離株につ き 、 培養液上清 中 の コ ラ ー ゲ ン分解酵素 活性を実施例 2 に て述べ る 方法 に よ リ 評価 し た。

コ ラ ー ゲ ン分解酵素活性の も つ と も 強かっ た一株を選抜 し、 こ れを N T A P — 1 株 と し た。

N T A P — 1 株の分類学的性質は次 の と ぉ リ で あ る 。

( 1 ) 細胞形態 桿菌（ 0 . 8 x 2 〜 3 /i m )カ卩齢培養 に ょ リ 湾 曲 し鎖状 に な る 。

( 2 ) グ ラ ム染色性 陰性ま た は不定性

( 3 ) 胞子形成能 あ リ

( 4 ) 運動性 あ リ

( 5 ) コ ロ ニ ーの 形態 と 性状 円 形 波状 低凸状 表層 な め ら か 半透明

( 6 ) 生育温度 7 0 °C で生育す る が 8 0 °C で生育 し な い。

( 7 ) カ タ ラ ーゼ 陰性

( 8 ) ォ キ シ ダ一ゼ 陰性

( 9 ) O ノ F 試験 陰性

( 1 0 ) 生化学試験

分解す る

グノレ コ ー ス 、 フ ノレ ク ト ス ソ ノレ ボ ー ス 、 D — ァ ラ ビ ノ ー ス 、 L ー ァ ラ ビ ノ ー ス 、 リ ボ ス D キ シ リ ト ー ル 、 L _ キ シ リ ト ル、 D — ッ ラ ノ ス D — リ キ ソ ー ス 、 D — タ ガ ト ー ス 、 5 — ケ ト グル コ ン 酸 分解 し な い

グ リ セ ロ ー ル 、 エ リ ス リ ト ール 、 ア ド 二 ト ー ル 、 β — メ チル 一 Ό — キ シ ロ ー ス 、 ガ ラ ク ト ー ス 、 マ ン ノ ー ス 、 ラ ム ノ ー ス 、 ズノレ シ ト 一 ノレ 、 _α — メ チノレ 一 D — マ ン ノ ー ス 、 α — メ チノレ 一 D — グノレ コ ー ス 、 Ν — ァ セ チル ダル コ サ ミ ン 、 ア ミ ダ グ リ ン 、 ア ル ブチ ン 、 エ ス ク リ ン 、 サ リ シ ン 、 セ ロ ビ オー ス 、 マ ル ト ー ス 、 乳糖、 メ リ ビオー ス 、 シ ョ 糖、 ト レ ノヽ ロ ー ス 、 ィ ヌ リ ン 、 メ レ チ ト ー ス 、 ラ フ ィ ノ ー ス 、 グ リ コ ー ゲ ン 、 キ シ リ ト ー ル 、 ゲ ン チ オ ビ オー ス 、 D — フ コ ー ス 、 L — フ コ ー ス 、 D — ァ ラ ビ ト ール 、 L ー ァ ラ ビ ト ール 、 2 — ケ ト グル コ ン 酸

酵素活性

β — ガ ラ ク ト シ ダ一ゼ 陰性

ア ル ギ ニ ン ジ ヒ ド ロ ラ 一 ゼ 陰性

リ ジ ン デ カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ 陰性 ゥ レ ア ーゼ 陰性

ト リ プ ト フ ァ ンデァ ナーゼ 陰性

ゼ ラ チナーゼ 陽性

そ の他

ク ェ ン酸の利用 な し

H 2 S の産生 な し

ィ ン ドール産生 陰性

ァ セ ト イ ン産生 陽性

硝酸塩の還元 陽性

嫌気的生育 ややみ ら れ る

p H 7 での 生育 な し

p H 5 . 1 での生育 あ リ

3 0 °C での 生育 な し

以上の分類学的性質か ら 本菌 の分類学的 な位置づ け を P. H. Sn ea t h着、 P . H. Sne a t h ら l 、 B e r ge y s Manu a l o f Sy s t ema t i c B a c t e r i o 1 o g y、 第 2卷、 p 1104- 1139 (Wi l l i ams & W i 1 k i n s社刊） に お いて検索 し た。

本菌 は芽胞 を形成す る 桿菌で、 ダ ラ ム 染色性陰性を示す点が定 型 と は異 な る も の の 、 好気的 に 生育す る こ と か ら Ba c i l l us と 考え ら れ る 。

Ba c i l l us属細菌 の な かで好熱性、 好酸性 を示す種は、 B. a c i do c a 1 d a r i u s , B . 1 i c hen i f o rm i s , B . c oa gu l a ns な と 挙 け ら れ る 力 B. 1 i c hen i f o rm i s と B. co ag u l an sは力 タ ラ ーゼ陽性が 定型性状で ぁ リ 、 ま た こ れ ら は 4 0 °C で生育 を示 し 6 5 °C で は生育 を示 さ な い と の知見 が あ る の で、 本株 は B . a c i d Q c a 1 d a r i u s に近い菌で あ る と 考 え ら れ る 。 し 力 し な 力 ら 、 ァ セ ト イ ン を 産生す る 点が 、 B. a c i doca l dar iusの 定型 と は異 な っ て い る 。

ァ セ ト イ ン を産生す る 特 ' [4は 、 ac i doc a l da r i us の変種 と 見 る の か、 別種に属す る と 見 る の か を確認で き な い た め に、 種名 を特定 す る こ と カ で き な レヽ。

〔実施例 2 〕

グル コ ー ス 1 . 5 % 、 ゼ ラ チ ン 1 . 5 % 、 酵母エ キ ス 0 . 0 1 % を含む培地 （ P H 4 . 8 ) 5 m l を試験管 に入れ、 1 2 0 で で 2 0 分間滅菌 し た。 N T A P — 1 (本発 明 の微生物の識別の た め の表示 Ba c i l l us属細菌 N T A P — 1 株の略称） の 白金耳 を接種 し 4 日 間振 と う 培養 し た。 培養液 を 8 0 0 0 r p m にて 2 0 分間遠 心分離 し 、 得 ら れた培養液上清の耐熱性 コ ラ 一 ゲ ン分解酵活性を 測定 した。 すな わ ち 、 1 M 酢酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ P H 4 . 5 ) 0 . 1 m l に酵素液 0 . 4 m l を混合 し 、 6 0 °C で 5 分間温置 し た。 つ い でそ こ に Az 0 c Q 1 1 ( ァ ゾ色素結合 コ ラ ー ゲ ン粉末 ； シ グ マ 社製） 3 m g を懸濁 し 、 6 0 °C で 1 時間攪拌す る こ と に よ リ 酵 素反応 を行 な っ た。 反応後 、 反応液 を氷冷 し静置す る こ と に よ リ 不溶性の Az oco 1 1部分 と 液体部分 （上清） を 分離 し た。

酵素反応 の進行に伴 っ て Az oco l lが 可溶化 し 、 上清 は赤色 に着 色す る の で 、 5 1 8 n m の 吸光度 を 測定す る こ と に よ リ 、 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素の活性 を 見積 も っ た。 こ の条件下で 5 1 8 n m の 吸光度 を 1 分間 に 0 . 0 0 1 增カ卩 さ せ る 酵素量を 1 ュ ニ ッ ト ( U ) と 定義 し た。 得 ら れた培養液上清の酵素活性の濃度 は 3 . 1 U / m 1 で あ っ た。

〔実施例 3 〕 実施例 2 と 同 じ培地 6 リ ッ ト ル を 1 0 リ ッ ト ル通気攪拌培養装 置 に仕込み 、 1 2 0 °C で 3 0 分間滅菌後 、 N T A P — 1 の前培養 液 2 0 0 m 1 を接種 し た。 6 0 °C 、 通気量 1 分間 あ た リ 6 リ ッ ト ル の 通気量で 4 日 間通気撹拌培養 を行 っ た。 培養液 を遠心分離す る こ と に よ リ 菌体 を 除去 し 、 上清 の耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素活 性 を 測定 し た結果、 上清 中 の酵素活性濃度 は 5 . O U Z m l であ つ た。

上で得 ら れた上清 を 出発材料 と し て 、 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵 素 の精製 · 濃縮 を以下の よ う に し て行 な っ た。

こ の上清液に硫酸ア ン モ ニ ゥ ム を加 え硫酸ア ンモ ニ ゥ ム 4 0 % 飽和 で沈殿 し た画分を集 め 、 0 . 0 1 M酢酸バ ッ フ ァ 一 （ P H 5 0 ) 5 8 5 m l に溶解 し た。 こ の溶液 に フ エ 二 ノレ 一 セ フ ァ ロ ー ス 樹脂 （アマ シ ャ ム フ ァ ノレ マ シ ア社製） を加 え 、 1 時間撹拌混合 し た後 、 混合液 を ろ過 し て樹脂 を取 リ 出 し た。 こ の樹脂 の 吸着画分 を 0 . 0 1 M酢酸バ ッ フ ァ ー （ P H 5 . 0 ) と エ チ レ ン グ リ コ ー ル 、 1 ： 1 の混合溶液で溶出 さ せ、 セ ロ フ ァ ンチ ュ ー ブ を透析膜 と し て 0 . 0 1 M リ ン酸ノ ッ フ ァ ー （ P H 7 . 0 ) で透析 した。 次いで、 予 め 0 . 0 1 M リ ン酸ノく ッ フ ァ 一 （ P H 7 . 0 ) で平 衡ィ匕 し た D E A E — セ フ ア デ ッ ク ス （ ア マ シ ャ ム フ ア ルマ シ ア社 製） の カ ラ ム に通 し 、 カ ラ ム を塩化ナ ト リ ウ ム の 直線濃度勾配 ( 0 - 1 M ) を 力 け な 力 S ら 平衡ィヒノく ッ フ ァ ー で洗浄す る こ と に よ リ 、 カ ラ ム に 吸着 し て いた酵素活性を溶出 さ せた。 溶出液 を お よ そ 9 0 本の 画分 に分け 、 各画分 中 の酵素活性を実施例 1 に記載 し た方法で測定 し た。

溶出液の 分画 中 で活性の 高 い画分 2 3 3 m 1 を集 め た。 つ いで こ の活性画分に硫酸ア ンモ ニ ゥ ム を 2 0 %飽和で力！] え 、 予め 0 . 0 1 M酢酸バ ッ フ ァ 一 （ P H 5 . 0 ) で平衡化 し た フ エ 二ル-セ フ ァ ロ ー ス カ ラ ム （ ア マ シ ャ ム フ ァ ノレマ シ ア社製） に負荷す る こ と に ょ リ 、 酵素活性を カ ラ ム に 吸着 さ せた。

次い で、 エチ レ ン グ リ コ ール の直線濃度勾配 （ 0 — 5 0 % ) を かけ な が ら カ ラ ム を平衡化ノ ッ フ ァ ーで洗浄す る こ と に よ リ 、 力 ラ ム に 吸着 し て いた酵素活性 を溶出 さ せた。 溶出液 を お よ そ 9 0 本の画分に分け 、 各画分 中 の酵素活性 を実施例 1 に記載 し た方法 で測定 し た。 溶出液の分画 中 で活性の 高 い画分 （合計量 4 8 m 1 ) を集た。

こ の溶淡 をセ ロ フ ァ ンチ ュ ー ブ を透析膜 と し て 0 . 0 1 M リ ン 酸 ノ ッ フ ァ ー （ p H 7 . 0 ) で透析 し 、 予 め 同 じノ ッ フ ァ ーで平 衡化 し た M O N O — Q カ ラ ム （ ア マ シ ャ ム フ ァ ノレマ シア社製） に 通 し 、 酵素活性 を カ ラ ム に 吸着 さ せた。

次に 、 カ ラ ム を塩化ナ ト リ ウ ム の直線濃度勾配 （ 0 — 1 M ) を か け な 力 s ら 平衡ィヒバ ッ フ ァ ー で洗浄す る こ と に よ リ 、 カ ラ ム に吸 着 し て いた酵素活性を溶出 さ せた。 溶出液の分画 中 で活性の高い 画分 1 0 . 6 m l を集 め た。 セ ン ト リ コ ン （遠心濃縮器 ： ア ミ コ ン社製 ： 該濃縮装置は、 容器の底 にセ ル ロ ー ス の誘導体でで き た 限外濾過膜が 張 っ て ぁ リ 、 容器に酵素 · 蛋 白 質の溶液 を入れ、 1 分間 に 6000回転 （ 6000 r p m ) く ら いの遠心力 を か け る と 、 溶液 中 の タ ンパ ク は膜の 上 に残 リ 、 水や低分子のイ オ ン な ど は遠心力 に よ リ 膜を通過 し て濾液 と し て 回収 さ れ る も の で あ る 。 ） で 0 . 5 m 1 に濃縮 し ゲル炉過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に よ リ 分画 して溶出液 中 の活性の 高 い画分 1 . 2 m l を集 め た。 こ の溶 出画分の培養液 力 ら の活性収率 は 1 . 4 %、 酵素活性の濃度 は 4 1 6 U / m l で あ つ 7こ 。

こ の酵素液 を Laemml i の処方 （ Laemml i , U. K . , Na t ur e, 1970 , 227 , 680 - 685 ) に よ る S D S — ポ リ ァ ク リ ノレ ア ミ ド ゲル電気泳動 で分析 し た と こ ろ 、 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の分子量は約 4 6 0 0 0 で あ る と 見積 も ら れた。

〔実施例 4 〕 （耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の基質特異性を調べ た実験）

5 m g の Az oc o l l を 0 . 0 1 M齚酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ p H 4 5 ) 0 . 4 m l に懸濁 し 、 そ こ に適宜希釈 し て酵素濃度 を調整 し た酵素液 0 . 1 m 1 を加 え、 6 0 °Cで 1 時間 、 し ん と う さ せな が ら 反応 さ せた。 反応後 、 反応液 を氷上で 2 0 分間放置 し た の ち遠 心分離 し 、 上清の 5 1 8 n m に お け る 吸光度 を求 め た。 そ の場合 酵素液 を水で置 き 換え た場合の反応液 を対照 と し た。 Az oco l lが 完全に可溶化 し た と き の 5 1 8 n m に お け る 吸光度 を 求 め る と と も に 、 い く つ かの 酵素濃度 に つ い て こ の実験 を行い 、 こ の条件下 でお よ そ 50 % の分解率 を 与 え る （約 2 . 5 m g の AZ Q C O I I を 可溶 化す る ） 酵素量 を決定 し た。

次 に 上 と 同様 に し て 、 5 m g の コ ラ ー ゲ ン 、 ゼ ラ チ ン、 カ ゼィ ン、 ま た は牛血清アルブ ミ ン （ いずれ も ナ カ ラ イ テ ス タ 社製） を 0 . 0 1 M酢酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ P H 4 . 5 ) 0 . 4 m l に懸 濁 （ ま た は溶解） し 、 さ き に決定 し た酵素濃度 の酵素液 0 . l m 1 を加 え 、 6 0 °C で 1時間 、 し ん盪 さ せ な が ら 反応 さ せた。 反応 後、 反応液 を 4 °C で 2 0 分間放置 し た の ち遠心分離 し た。 なお、 基質 を カ ゼイ ン ま た は牛血清 ア ルブ ミ ン と し た場合に は、 5 0 % ト リ ク ロ 口 酢酸 0 . 0 5 m 1 を 反応液 にカ卩 え 、 4 °C で 2 0 分間放 置 し た の ち 遠心分離 し た。 上清 の 2 8 0 n m に お け る 吸光度 を求 め た。 各蛋 白 質が完全 に 可溶化 し た と き の 2 8 0 n m に お け る 吸 光度 か ら 、 各蛋 白 質の分解率 を 求 め た。 AZ Q C Q I I の 分解速度 を 1 0 0 % と し た と き の各蛋 白 質の 相対的可溶化速度 を表 1 に示 し た 表 1

Az<>c"llの分解速度を 100%としたときの

各蛋白質の相対的可溶化速度

： Azocoll に対して 80%以上の相対活性をもつ；

土： Azocollに対して 20%以下の相対活性しかもたない；

-：反応しない）

そ の結果 を 第 1 図 に示す。 本酵素 は 6 0 °C ま で安定で あ っ た。 一方、 酵素 を さ ま ざま な P H で処理 し た と き の酵素 の安定性を調 ベた。 p H 2 . 5 〜 3 . 5 の範囲 は 1 M グ リ シ ン一塩酸バ ッ フ ァ ― 、 p H 3 . 5 〜 5 . 5 の範囲 は 1 M酢酸ノく ッ フ ァ ー 、 P H 6 . 0 〜 8 . 0 の範囲 は 1 M リ ン 酸ノ ッ フ ァ ー 、 p H 8 . 0 〜 9 . 0 の範囲 は 1 M ト リ ス 一塩酸バ ッ フ ァ ー 、 P H 9 . 0 〜 1 0 . 0 の 範囲 は 1 M ダ リ シ ン 一水酸化ナ ト リ ゥ ム バ ッ フ ァ ー を使用 し た。 こ れ ら の ノく ッ フ ァ ー 0 . 0 0 2 5 m l と l % Twe en 8 0 水溶液 0 . 0 0 2 5 m l を酵素液 0 . 0 2 m l に力 D え た後 6 0 °C に 1 時 間放置 し た。 こ の処理酵素液 に 1 M酢酸バ ッ フ ァ ー （ P H 4 . 0 ) を 0 . 0 5 m l を加 え た 後活性 を 測定 し た。 そ の結果、 本酵素 は p H 3 か ら 6 の 間 で安定で あ っ た （ 図 2 ) 。 〔実施例 7 〕 （耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の反応至適温度 と 反 応至適 P H を調べた実験）

本発明 の耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素の活性 を 3 0、 4 0、 5 0 6 0、 7 0、 8 0 °Cの各温度で求 め た。 活性測定方法は、 反応温 度 を変 え た以外は実施例 1 に記載 し た方法に よ っ た。 そ の結果、 本酵素 は 6 0 °C で も つ と も 高 い活性を示 し た （ 図 3 ) 。

次 に 、 本酵素の活性を反応系 の P H を さ ま ざ ま に変 え て （ P H 2 5〜 7 . 2 ) 測定 した。 な お P H に応 じ て 、 反応系 の緩衝液 を 0 0 1 Mの グ リ シ ン塩酸緩衝液 （ P H 2〜 4 ) 、 0 . 0 1 Mの酢酸 ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ P H 4〜 6 ) 、 ま た は 0 . 0 1 Mの リ ン酸力 リ ウ ム緩衝液 （ P H 6 〜 8 ) で置 き 換え た以外は 、 実施例 1 に記 載 し た方法 に ょ リ 酵素活性を測定 した。 そ の結果、 本酵素 は P H 3 . 7〜 3 . 9 付近で も っ と も 高 い活性を示 し た （図 4 ) 。 産業上の利用 可能性

本発明 は 、 前記新規な微生物 を使用 す る こ と に よ リ 、 前記実施 例カゝ ら 明 ら かな よ う に 、 至適温度、 お よ び至適 P H 、 お よ び コ ラ 一ゲ ン基質特異性の優れた耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 を効率良 く 得 る こ と が で き 、 従来未利用 で あ っ た畜産資源 を バイ オ リ サイ ク リ ン グ に利用す る こ と が で き 、 種々 の 資材な ど と し て 用 途の広が リ を 見せ る コ ラ ー ゲ ン の 生産 に貢献す る と こ ろ 大であ る と レ、 う 優 れた効果が も た ら さ れ る 。

Claims

言青 求 の 範 囲

1 . ( 1 ) グ ラ ム染色性は陰性ま た は不定性で ぁ リ 、 （ 2 ) 胞子 形成能が ぁ リ 、 （ 3 ) 運動性が ぁ リ 、 （ 4 ) 7 0 °Cで生育す る が 3 0 °Cま た は 8 0 °Cで は生育せず、 （ 5 ) P H 5 で は生育す る が P H 7 では生育せず、 （ 6 ) 桿菌でぁ リ 、 （ 7 ) カ タ ラ ーゼ陰性 で あ リ 、 （ 8 ) ォキ シ ダーゼ陰性でぁ リ 、 （ 9 ) 〇 F試験陰性 で あ リ 、 （ 1 0 ) ァセ ト イ ン産生能 を も ち 、 かつ （ 1 1 ) ゼ ラ チ ン分解能 を も つ耐熱性酵素 を 産性 し得 る 特性に ょ リ 特徴付 け ら れ る バチルス （ B a c i 1 1 u s ) 属 に属す る 耐熱性 コ ラ ーゲ ン分 解酵素生産能 を有す る 微生物か ら 得 ら れ る 耐熱性 コ ラ ーゲ ン分解 酵素。

2 . ( 1 ) カ ゼ イ ン 、 ゼ ラ チ ン 、 ア ル ブ ミ ン 、 コ ラ ー ゲ ン の な か で コ ラ ー ゲ ンお よ びゼ ラ チ ン を も つ と も 効率良 く 加水分解す る 能 力 を持 ち 、 （ 2 ) 至適 p H力； p H 3 . 5〜 4 . 5 に あ リ 、 （ 3 ) 反応至適温度が 6 5〜 7 0 °Cで あ リ 、 （ 4 ) 6 0 °C、 p H 6 . 0 で 4 時間 の熱処理後 も 、 処理前の 6 0 %以上 の活性を保持 し 、

( 5 ) P H 3 — 6 の 間 で安定で ぁ リ 、 （ 6 ) S D S—ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 での分子量約 4 6 0 0 0 で あ る こ と に よ つ て特徵付 け ら れ る こ と を特徴 と す る 請求項 1 に記載の 耐熱性 コ ラ 一ゲ ン分解酵素。

3 . ノ チル ス （ B a c i 1 1 u s ) 属 に属す る 微生物 が B a c i 1 1 u s 属 N T A P — 1 株で あ る こ と を 特徴 と す る 請求項 1 ま た は 2 に記載の 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素。

4 . ( 1 ) グ ラ ム 染色性 は陰性ま た は不定性で ぁ リ 、 （ 2 ) 胞子 形成能 が ぁ リ 、 （ 3 ) 運動性が ぁ リ 、 （ 4 ) 7 0 °C で生育す る が 3 0 °C ま た は 8 0 °Cで は生育せず、 （ 5 ) p H 5 では生育す る が P H 7 では生育せず、 （ 6 ) 桿菌でぁ リ 、 （ 7 ) 力 タ ラ 一ゼ陰性 であ り 、 （ 8 ) ォキ シ ダーゼ陰性で ぁ リ 、 （ 9 ) O F 試験陰性 で あ リ 、 （ 1 0 ) ァセ ト イ ン産生能 を も ち 、 かつ （ 1 1 ) ゼ ラ チ ン分解能 を も つ こ と に よ っ て 特徴付 け ら れ る B a c i 1 l u s 属 に属す る 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素生産能 を有す る 微生物 を用 い て 、 （ 1 ) カ ゼイ ン、 ゼ ラ チ ン、 アルブ ミ ン 、 コ ラ ー ゲ ン の なか で コ ラ ー ゲ ンお よ びゼ ラ チ ン を も つ と も 効率良 く 加水分解す る 能 力 を持 ち 、 （ 2 ) 反応至適 P H が P H 3 . 5 〜 4 . 5 に あ リ 、

( 3 ) 反応至適温度が 6 5 〜 7 0 °Cで あ リ 、 （ 4 ) 6 0 °C、 p H 6 . 0 で 4 時間 の熱処理後 も 、 処理前の 6 0 %以上の活性を保持 し、 （ 5 ) P H 3 — 6 の 間 で安定でぁ リ 、 （ 6 ) S D S — ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動での分子量約 4 6 0 0 0 で あ る こ と に よ つ て特徴付 け ら れ る 耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 を培養物 中 に精 製蓄積 さ せ、 こ れ を採取す る こ と を特徹 と す る 耐熱性 コ ラ ーゲ ン 分解酵素の製造方法。

5 . ノ チ ル ス （ B a c i 1 l u s ) 属 に属す る 微生物 が B a c i 1 1 u s 属 N T A P — 1 株で あ る こ と を特徴 と す る 請求項 4 に記 載の耐熱性 コ ラ ー ゲ ン分解酵素 の製造方法。

6 . バチルス 属 （ B a c i 1 l u s ) に属 し請求項 1 に記載の耐 熱性 を有す る コ ラ ー ゲ ン分解酵素 を産生す る 新規 な微生物。

7 . 通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に 、 Ba c i l l us sp. NTAP- 1 と 表示 さ れ、 平成 1 1 年 1 1 月 1 日 に原寄託 に よ リ ブ タ ぺス ト 条約 に基づ く 寄託への移管請求 に よ リ 受託番号 F E R M B P — 6 9 2 6 と して 受託 さ れた （平成 1 1 年 8 月 2 7 日 に受託 番号 F E R M P — 1 7 5 3 5 と し て原寄託 さ れた。 ） 請求項 6 に記載の微生物。