JPH02190185A - ポリガラクトサミン分解酵素ａ−４及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なポリガラクトサミン分解酵素（ポリガラ
クトサミニダーゼ）Ａ−４に関するものである。

更に詳細には、本発明は、ポリガラクトサミンを加水分
解してオリゴガラクトサミンを生成する新規なポリガラ
クトサミン分解酵素Ａ−４及びその製造法に関するもの
である。

一般に、微生物の生産するポリガラクトサミン（ポリα
−１，４ガラクトサミノガラクタン）としては、ＰＦＩ
ＯＩ　（特公昭５６−１２６３９）及びＰＦ１０２　（
特願昭６ｌ−１３４７９９）が認知されている程度であ
る。

近年、微生物、植物あるいは動物の生産する多糖あるい
はそれらのオリゴ糖が種々の生理活性を有することが知
られるようになり、多糖又はそれらのオリゴ糖に関心が
高まっている。

また、ポリガラクトサミンの類似多糖として知られるポ
リグルコサミン（キトサン）においてもキチン、キトサ
ン及びそのオリゴ糖が抗腫瘍活性を有する事が発見され
ている。さらにボリガラクトサミン自身においても同様
な生理活性の在ることが見出され（石谷幸喜他日本生化
学会講演要旨集８７１．１９８６　）、そのオリゴ糖の
生理活性にも関心が高まっている。生理活性以外の用途
にもポリガラクトサミン、オリゴガラクトサミンが有用
になる可能性があり、特に、オリゴマーは用途分野や作
用面でポリマーにない特性を発揮するものと期待され、
注目されている。

ポリガラクトサミンを酸又はアルカリによって加水分解
することによりオリゴ糖を得ることは可能であるが、オ
リゴマーの収率は非常に悪い。例えば塩酸によってポリ
ガラクトサミンを加水分解する時、ランダムな分解の結
果、得られるオリゴ糖の量はモノ−ガラクトサミン、ジ
−ガラクトサミン、トリーガラクトサミン、テトラ−ガ
ラクトサミン、ペンタ−ガラクトサミンの順であり、重
合度が大きい程その収量は激減するということになる。

そこで、ポリガラクトサミンを分解して１重合度が比較
的大きな種々の重合度のオリゴ糖を得ることのできるポ
リガラクトサミン分解酵素が必要とされるのである。

本発明者らは、広範な微生物についてポリガラクトサミ
ン分解菌を検索した結果、バチルス属に属する細菌が、
新規なポリガラクトサミン分解酵素Ａ−４を生産するこ
とを見出し本発明を完成した。

本発明は新規なポリガラクトサミン分解酵素であり、ま
た１本発明は、バチルス属に属し、ポリガラクトサミン
分解酵素Ａ−４生産能を有する菌株を培養し、培養物よ
りポリガラクトサミン分解酵素Ａ−４を採取することを
特徴とする、ポリガラクトサミン分解酵素Ａ−４の製造
法である。

本酵素の理化学的性質は下記のとおりである。

（１）作用及び基質特異性 本酵素はオリゴ及びポリガラクトサミン（α−１，４ポ
リガラクトサミン）に作用しオリゴガラクトサミンを生
成する。

その他の多糖類、澱粉（α−１，４グルカン）、ラミナ
リン（β−１，３グルカン）、カルボキシメチルセルロ
ース（β−１，４グルカン）、キトサン（β−１，４ゲ
ルコサミノグルカン；脱アセチル化度各々１００％、９
０％、７９％）、グリコールキトサン、メチルセル口　
−ス（β−１，４グルカン）、グリコールキチン（β−
１，４Ｎ−アセチルゲルコサミノグルカン）、などには
全く作用しない。

（２）至適ｐｌ＋及び安定ｐＨ範囲 酢酸緩衛液を用いた場合、至適ｐＨは４．５である。（
第１図）また、安定ｐＨ範■は、ＰＨ３，０〜８．０：
ＭｃｌＬｖａｉｎｅ氏緩衝液、ｐＨ８，Ｏ”１１．０　
：　Ａｔ１ｅｉｎｓ　ａｎｄＰａｎｔｉｎ氏緩衝液、Ｐ
旧１〜１２　：　Ｒｉｎｇｅｔ氏緩衝液を用い、第２図
に示すようにｐＨ６，０〜ｌＯ，０に安定ｐＨ範囲があ
る。この測定は３７℃で３時間放置したときの残存活性
を相対値で示した。

（３）酵素活性の測定法 酵素活性は基質にＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　Ｉ−１菌
の生産するＰＦ４０１又はＰＦ１０２　（その主構成糖
はα−１，４ガラクトサミノガラクタン）を用いた。こ
の０．２５％可溶性ＰＦ１０２　（ｐｌ＋４．５）　１
ｍＭ、０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４，５）２ｎＱそれ
に酵素溶液１ｍ１２を加え３７℃、　１０分間反応させ
、生じる還元力を５ｃｈａｌａｓ法で測定した。なお酵
素単位は１分間当りに１μモルのガラクトサミンに相当
する還元力を増加させる活性を１単位とした。

（４）作用適温及び温度安定性の範囲 １０〜１００℃の範囲で測定した結果を第３図に示した
。この酵素の至適温度は６０℃であり、それ以上で急激
に低下する。

つぎに温度安定性についてみたものが第４図である。　
　ｐＨ６，０の条件で各温度で１５分間保った時の残存
活性を示した。６０℃付近までは安定で、それ以上では
急激に低下した。

（５）金属イオン等の影響 各種金属イオン及び阻害剤４Ｘ１０−ｍＭを含む溶液中
に３７℃、１０分間放置後、残存酵素活性を測定し、相
対値で示した。（表−１） 表−１，金属等の影響 阻害物 残存活性 ａＣＩ ＣＩ ａＣ１２ ＭｎＣ１□ ０Ｃ１２ ａＳ０４ ｕＣ１２ Ａ１□（ＳＯ４）３ に２ＣｒＯ４ ＮｉＣ１゜ Ｚｎ（Ｃ）ｌ、Ｃｏｏ）２・２Ｈ，０ ＣａＣ１□ ｇＳ０４ ＰｂＣ１゜ ＣｄＣ１□ ＨｇＣ１□ ＡｇＮ０゜ ＩＣ８２ＣＯＯＨ ＰＣＭＢ 以上の結果から１本酵素は、Ｈｇ＋＋、　Ａｓ４、ＰＣ
ＭＢで強く阻害されることがわかった。

（６）酵素の精製法 本酵素の単離、精製は常法に従って行うことができる。

硫酸アンモニウム（３０〜８０％）による沈澱、透析後
、ＣトセファデックスＣ−５０カラムクロマトグラフイ
ー（第５図）、更にＣトセファデックスＣ−５０カラム
クロマトグラフイー（第６図）などの精製手段よって精
製される。

（７）分子量 本酵素の分子量はポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より測定すると、６０，０００と計算される。

結果は第７図に示した。

（８）ポリアクリルアミドゲル電気泳動精製酵素を常法
に従って、１５％のポリアクリルアミドゲル（ＰＨ４、
３）電気泳動にかけた。結果は第８図に示すとうり単一
のバンドが認められた。

（９）等電点 常法により等重点ディスク電気泳動を行った。

結果は第９図に示すようにこの酵素の等電点はｐＩ＝９
．０である。

本酵素は、その作用及び基質特異性において従来全く知
られていない新規酵素である。

次に本発明による新規ポリガラクトサミン分解酵素Ａ−
４の製造法について説明する。

本発明における使用菌はバチルス属に属し、ポリガラク
トサミン分解酵素Ａ−４を生産する菌であればいかなる
菌株でもよいが、本発明者らが土壌より分離したバチル
スＳＰ、Ａ−４が有利に使用される。

バチルスｓｐ、　Ａ−４の菌学的性質は下記のとうりで
ある。

Ａ、細胞の形態 （１）細胞の形および大きさ：短桿菌、０．５〜１．０
μ、　ｘ　３．０〜５．０μｍ（肉汁および肉汁寒天斜
面培養、３７℃、２４〜７２時間の培養）（２）細胞の
多形状の有無：無し く３）運動性の有無：有り （肉汁寒天半流動高層穿刺培養） （４）胞子の有無：有り、内生胞子および裸の胞子１球
状［トーナー（Ｄｏｒｎｅｔ）の染色法およびウイッツ
（Ｗｉｔｚ）の変法］ （５）ダラム染色性：陽性 （肉汁寒天斜面培養、３７℃、１８時間、ヒュッカー（
Ｈｕｃｋｅｒ）の変法により染色）（６）抗酸性：無し Ｂ、各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養（３７℃、２４〜９６時間）コ
ロニーの大きさ二人９〜ｆｏａｍ、小６〜７ｍ１１生育
の程度：生育良好 コロニーの形：円形 コロニーの隆起：台状 コロニーの周辺の形状二金縁 コロニー表面の形状：平滑 コロニーの色：乳白色 コロニーの光沢：光沢有り コロニーの性質：粘稠、不透明 （２）肉汁寒天斜面培養（３７℃、２４〜９６時間）拡
布状に盛上った半透明、乳白色のコロニを形成する。

コロニーは凹凸円形の隆起があり、光沢が有る。生育は
良好で、時間と共に拡がってくる０色素は生産しない。

（３）肉汁液体培養（３７℃、２４〜９６時間）表面に
膜を形成しない０時間とともに全体的に濁ってくる。

底部に顆粒状の沈澱が形成される。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養（３７℃、２４〜９６時間
）穿刺線に沿って生育し、液化する６表面および内部は
最初ｆｉｌｉｆｏｒｍ、次いで漏斗状に生育し、液化す
る。液化部分は白濁する。

（５）リドマス・ミルク（３７℃、２４〜９６時間）ブ
ロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）を指示薬として用い
た。１日日から透明化がｍ祭されたが、色の変化は見ら
れなかった０時間の経過とともに、透明化が進んだが、
酸生成による液の黄変化は見られなかった。従ってペプ
トン化（ミルクが菌のプロテアーゼにより分解し透明化
する。）が起こった。

Ｃ０生理的性質 （１）硝酸塩の還元：陰性 （２）脱窒反応：陰性 （３）ＭＲテスト：陰性 （４）ＶＰテスト：陰性 （５）インドールの生成：陰性 （６）硫化水素の生成：＃１性 （７）澱粉の加水分解：陽性 （８）クエン酸の利用：コーザー、クリステンセン両培
地で利用する。

（９）無機窒素の利用：硝酸塩、アンモニアとも利用す
る。

（１０）色素の生成：なし くＩＩ）ウレアーゼ：陽性 （１２）オキシダーゼ：陽性 （１３）カタラーゼ：陽性 （１４）生育の範囲：生育ＰＨ５〜１０、至適温度３０
〜４０℃ （１５）酸素に対する態度：好気性 （１６）　Ｏ−Ｆテスト：発酵 （１７）糖類から酸及びガスの生成 酸の生成 ガスの生成 （１）　Ｌ−アラビノース （２）Ｄ−キシロース （３）Ｄ−グルコース （４）Ｄ−マンノース （５）Ｄ−フラクトース （６）Ｄ−ガラクトース （７）マルトース （８）シュークロース （９）ラクトース （１０）トレハロース （１１）　Ｄ−ソルビトール （１２）　Ｄ−マンニトール （１３）イノシトール （１４）グリセリン （１５）デンプン 十 十 ＋ 十 ＋ ＋ 本菌の形態学的、生理学的諸性質で特徴的なことは、ダ
ラム陽性の桿菌で運動性があり、胞子を形成すること、
それに好気性菌であることからバチルス属に属するもの
と認められた。Ｂ。

ｍｅｇａｔｅｒｉｕ謙と類似はしているがカタラーゼ活
性陽性、ｖ−ｐ試験陰性、デンプン分解性陽性、クエン
酸資化性陽性、亜硝酸塩の還元陰性、インドールの生成
陰性、　　ＰＨ６，８で生育すること、　３０〜４０’
Ｃで生育すること、ウレアーゼ試験陽性であること等の
違いがあること等から、本菌をＢａｃｉｌｌｕｓ属の新
菌株バチルスｓｐ、　Ａ−４と命名し、通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１０４７
３号（ＦＥＢＭ　Ｐ−１０４７３）として寄託されてい
る。

ポリガラクトサミン分解酵素Ａ−４生産菌の培養培地と
しては、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を程
よく含有する培地ならば、合成培地あるいは天然培地の
いずれでも使用可能である。

該培地の好適な例としては、ポリガラクトサミン０．５
％、酵母ｚ＊Ｘ０．５％、ＫＣＩ　Ｏ，０５％、Ｋ、　
ＨＰＯ４０，１％、Ｍｇ５Ｏ，”？１１．ＯＯ，０５％
、Ｆｅ５０．０．０１％の例が挙げられる。培養温度は
２０〜４０℃好ましくは２５〜３５℃の範囲、培養開始
ＰＨは６〜８、好ましくは７付近で２４−９６時間振盪
又は深部撹拌培養すれば、培地中にポリガラクトサミン
分解酵素が得られる。

そして、ポリガラクトサミン分解酵素は必要に応じて単
離精製される。

例えば、エタノール沈澱法によって粗酵素を分離し、こ
れを水性媒質に溶解し、　　ＣＭ−セファデックスＣ−
５０イオン交換クロマトグラフイー等の処理によって精
製されたポリガラクトサミン分解酵素Ａ−４が得られる
。

本発明の新規ポリガラクトサミン分解酵素Ａ−４を用い
るとオリゴガラクトサミンを効果的に得ることが出来る
。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ バチルスｓｐ、　Ａ−４、ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４７３を
５００ｍｆｌ三角フラスコ中でグルコース０．５％、酵
母エキス０．１％。

ペプトン０．１％、Ｋ、ＨＰＯ４０，０１％、Ｍｇ５Ｏ
，・７）１２０．０１％、にＣ１Ｏ，０１％の組成を有
する種培地１００ｍＭに植菌し、３０℃で２０時間培養
した。

得られた培養液を３００ジャーファーメンタ−の中で、
ポリガラクトサミン（Ｐｒ２Ｏ３）　０．５％、酵母エ
キス０．５％、ＫＣＩ　０．０５％、　Ｋ、ＨＰＯ４０
，１％、　Ｍｇ５Ｏ，・７１１２０．０５％、　Ｆｅ５
０４０．０１％の酵素生産培地１５Ｍに植苗し、３０℃
で７２時間通気（１５Ｑ　／分）撹拌（２００ｒｐｍ）
で培養した。

得られた培養液を遠心分離（１００００ｒρ飄）シて。

菌体を除き、遠心上澄に硫酸アンモニウムを０．８飽和
になる様に加え、蛋白質を沈澱させ、更に遠心分離（１
４０００ｒｐｍ）　して蛋白質を集め、０．０２Ｍリン
酸緩衝液（ＰＨ６，０）で透析し脱塩した。透析内液を
０．０２Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６，０）で平衡化したＣ
トセファデックスＣ−５０カラムにかけ、酵素蛋白質を
吸着させ、同緩衝液で未吸着部分を溶出させた。次いで
、０〜０，５Ｍ　ＮａＣ１で濃度勾配をつけて、吸着さ
れた酵素蛋白質を溶出させた。更に、活性画分を集め再
度、同条件でＣトセファデックスＣ−５０カラムにかけ
、吸着画分をＯ〜０．５Ｍ　　ＮａＣ１濃度勾配で溶出
させた。活性画分を集め透析し、脱塩後、凍結乾燥し、
精製酵素蛋白質（ポリガラクトサミン分解酵素Ａ−４）
２５ｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素についての至適ｐ）Ｉを、第２図は安定
ＰＨを、第３図には作用適温を、第４図は温度安定性を
、第５図にはＣトセファデツクスＣ−５０のゲル濾過パ
ターンを、第６図は更にＣＭ−セファデックスＣ−５０
のゲル濾過パターンを、第７図はポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により分子量を測定した結果を、第８図は
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を、更に第９図
は等電点ディスク電気泳動の結果を、それぞれ示す図で
ある。 第　　１ 図 代理人　弁理士　戸　１）親　男 第 図 第 図 温 度 第 図 温 度 第 図 ワラクシ１ン凱 （Ｊｉ−５ｍｌ） 吸 収（２８０ｎｍ） −（ト一 酵　素　活　ａ　　（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）　　−ｏ−第 図 ｐＨ４，３ 第 図 ０．４ α６ α８ １．０ ｆ 第 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質を有するポリガラクトサミン分
   解酵素Ａ−４。 （１）作用および基質特異性 ポリガラクトサミン（ポリα−１，ガラクトサミノガラ
   クタン）に作用してオリゴガラクトサミンを生成する、
   ポリヘキソース、キチン、キトサンに対しては全く作用
   しない。 （２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 酢酸緩衝液を用いた場合、至適ｐＨは４．５であり、安
   定ｐＨ範囲は４．５〜８．０である。 ２、バチルス属に属するポリガラクトサミン分解酵素Ａ
   −４生産菌を培養し、培養物よりポリガラクトサミン分
   解酵素Ａ−４を採取することを特徴とするポリガラクト
   サミン分解酵素Ａ−４の製造法。