JPH02234672A - ポリガラクトサミン分解酵素ｅ―１及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なポリガラクトサミン分解酵素（ポリガ
ラクトサミニダーゼ）ト１に関するものである。

更に詳細には、本発明は、ポリガラクトサミンを加水分
解してオリゴガラクトサミンを生成する新規なポリガラ
クトサミン分解酵素Ｅ−１及びその製造法に関するもの
である。

一般に、微生物の生産するポリガラクトサミン（ボリＣ
Ｌ−１．４ガラクトサミノガラククン）としては、ＰＦ
ＩＯＩ　（特公昭５６　−　１２６３９）及びＰＦ１０
２　（特願昭６１１３４７９９）が認知されている程度
である。

近年、微生物、植物あるいは動物の生産する多糖あるい
はそれらのオリゴ糖が種々の生理活性を有することが知
られるようになり、多糖又はそれらのオリゴ糖に関心が
高まっている。

また、ポリガラクトサミンの類似多糖として知られるポ
リグルコサミン（キトサン）においてもキチン、キ１へ
サン及びそのオリゴ糖が抗腫瘍活性を有する事が発見さ
れている。さらにポリガラクトサミン自身においても同
様な生理活性の在ることが見出され（石谷幸喜他日本生
化学会講演要旨集ｐｌ７］　，　１９８５）、そのオリ
ゴ糖の生理活性にも関心が高まっている。生理活性以外
の用途にもポリガラクトサミン、オリゴガラクトサミン
が有用になる可能性があり、特に、オリゴマーは用途分
野や作用面でポリマーにない特性を発揮するものと期待
され、注目されている。　ポリガラクトサミンを酸又は
アルカリによって加水分解することによりオリゴ糖を得
ることは可能であるが、オリゴマーの収率は非常に悪い
。例えば塩酸によってポリガラクトサミンを加水分解す
る時、ランダムな分解の結果、得られるオリゴ糖の量は
モノーガラクトサミン、ジーガラクトサミン、トリーガ
ラクトサミン、テトラーガラクトサミン，ペンターガラ
クトサミンの順であり、重合度が大きい程その収量は激
減するということになる。　そこで、ポリガラクトサミ
ンを分解して、重合度が比較的大きな種々の重合度のオ
リゴ糖を得ることのできるポリガラクトサミン分解酵素
が必要とされるのである。

すでにシュードモナス属に属する細菌の生産するポリガ
ラクトサミン分解酵素（特願昭６１−３０８５７９、同
６１−３０８５８０）が結知されている。

本発明は上記記載のポリガラクトサミン分解酵素に比べ
て、ポリガラクトサミンを分解してオリゴ糖を得るのに
、より利用価値の高い理化学的性質をもつポリガラクト
サミン分解酵素を提供することにある。

本発明者らは、広範な微生物についてポリガラクトサミ
ン分解菌を検索した結果、バチルス属に属する細菌が、
新規なポリガラクトサミン分解酵素Ｅ−１を生産し従来
の酵素と異なる性質を有することを見出し、本発明を完
成した。

本発明は、新規なポリガラクトサミン分解酵素Ｅ−１で
あり、また本発明は、バチルス属に属し、ポリガラクト
サミン分解酵素Ｅ−１生産能を有する菌株を培養し培養
物よりポリガラクトサミン分解酵素Ｅ−１を採取するこ
とを特徴とするポリガラクトサミン分解酵素Ｅ−１の製
造法である。

本酵素の理化学的性質は、下記のとうりである。

（１）作用及び基質特異性 本酵素は、重合度ｎ＝４（テトラーガラクトサミン）以
上のオリゴ糖及びポリガラクトサミン（α−１，４ポリ
ガラクトサミン）に作用し、オリゴガラクトサミンを生
成する。

その他の多糖類、澱粉（α−１，４グルカン）、グリコ
ーゲン（α−１，４グルカン）、デキストラン（α−１
，６グルカン）、ラミナラン（β−１，３グルカン）、
カルボキシルセルロース（β−１．４グルカン）、キト
サン（β−１．４　グノレコサミノグルカン）、エチレ
ングリコールキチン（β−１．４Ｎ−アセチルグルコサ
ミノグルカン）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｏｌａｎ
ａｃｅａｒｕｍのポリトアセチルガラクトサミノガラク
タン（ポリβ−１　．　３Ｎ−アセチルガラクトサミノ
ガラクタン）　　（Ｙ．Ａｋｉｙａｍａ．，　ｅｔ．ａ
ｌ．，　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　５
０（３），　７４７．１９８６）などには全く作用しな
い。

また、重合度ｎ＝３（トリーガラクトサミン）以下のα
−１，４ガラクトサミノオリゴ糖にも作用しない。

（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ氏緩衝液を用いた場合，至適ｐＨは
、７．５である。（第１図）また、安定ｐ｝Ｉ範囲は、
ｐ｝１２．５−８．０：Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ氏緩衝液、
ｐＨ８．０　〜１１．０：Ａｔｋｉｎｓ＆Ｐａｎｔｉｎ
氏炭酸ソーダ・硼酸混合液を用い、第２図に示すように
ｐＨ５．５〜１０．０である。この測定は、３７℃で１
時間放置した後の酵素残存活性を相対値で示した。

（３）酵素活性の測定法 酵素活性は、基質として、０．１モル酢酸緩衝液（ｐＨ
６）にＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　Ｉ　−１菌の生産す
るＰＦＩＯＩ又はＰＦ１０２（その主構成糖は，α−１
，４ガラクトサミノガラクタン）を０．２％溶解した溶
液０．５ｍＭに酵素溶液０．５ｍｌ１を加え３７℃、１
０分間反応させ、生じる還元力をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅ
ｌｓｏｎ法で測定した。なお酵素単位は、１分間当りに
１μモルのガラクトサミンに相当する還元力を増加させ
る活性を１単位とした。

（４）作用適温及び温度安定性の範囲 ２０〜９０℃の範囲で測定した結果を第３図に示した。

この酵素の至適温度は６０℃であり、それ以上で急激に
低下する。

つぎに温度安定性についてみたものが第４図である。ｐ
Ｈ６．０の条件で各温度で０〜６０分間保った時の残存
活性を示した。６０℃、１時間で８５％の活性が残存し
ている。

（５）金属イオン等の影響 各種金属イオン及び阻害剤１　ｍＭ（ＰＣＭＢのみＯ．
ｌｍＭを含む溶液中に３７℃、１時間放置後，残存酵素
活性を測定し、相対値で示した。（表−１）表−１．金
属イオン等の影響 阻害物　　残存活性（％） 無添加　　　１．００ ＫＣＩ　　　　　１０６ ＣａＣ］２１．１０ ＢａＣ１２９４ ＣｏＣ１２１０５ ＣｄＣ］２８１ ＦｅＣ１２８ ＺｎＣ］２５１ Ｐｂ（ＣＨ３ＣＯＯ）２９５ （Ｎｌ｛．）．ＳＯ．　　　　９８ ｔｒｊ．ｓ　３）　　　　１０２ ？害物 ＮａＣ］ ＬｉＣ０３ ＭｎＳＱ， Ｎｉｃｅ２ ＦｅＣｌ３ ＨｇＣ１■ Ｎ８４ＣＩ ＣＵＳ０４ ＳＤＳ　　１） ＥＤＴＡ　２） ＰＣＭＢ　４） ＮＦＩＳ　　５）　　　　　１４　　　　　　　ＭＩＡ
　　６）　　　　　９６１）ドデシル硫酸ナ１〜リウム ２）エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム３）トリス（
ヒドロキシル）アミノメタン４）パラクロル安息香酸第
二水銀 ５）Ｎ−プロモコハク酸イミト ６）モノヨード酢酸 以上の結果から、このポリガラクトサミン分解酵素は、
Ｆｅ＋＋、Ｆｅ＋＋＋、ＣＩＪ＋＋、Ｈｇ＋＋及びＮＢ
Ｓによって強力に阻害されＺ　ｎ　”　”、Ｎ１＋＋、
ＳＤＳによっても阻害される。

（６）酵素の精製法 本酵素の単離、精製は常法に従って行うことができる。

例えば硫酸アンモニウムによる分画沈澱、Ｃトセファデ
ックスＣ−５０カラムクロマトグラフィー（第５図）、
セファデソクスＧ１００カラムクロマトグラフィー（第
６図）、フェニルーセファロースＣＬ−４Ｂカラムクロ
マトグラフイー（第７図）などの精製手段又はこれらの
組合せにより精製される。

（７）分子量 本酵素の分子量はポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より測定すると、６０，０００と計算される。

結果は第８図に示した。

（８）ポリアクリルアミドゲル電気泳動精製酵素を常法
に従って１０％のポリアクリルアミドゲル（ｐｌ＋８．
８）電気泳動にかけた。結果は第９図に示すとうり単一
のバンドが認められた。

（９）等重点 常法によりシュークロース密度勾配の等電点電気泳動を
行った。結果は第１０図に示すように、この酵素の等電
点はρＩ＝９．５である。

本酵素は、その作用及び基質特異性において従来全く知
られていない新規酵素である。

次に本発明による新規ポリガラクトサミン分解酵素ト１
の製造法について説明する。

本発明における使用菌は、バチルス属に属し，ポリガラ
クトサミン分解酵素Ｅ−１　を生産する菌であればいか
なる菌株でもよいが、本発明者らが土壌より分離したバ
チルスｓｐ．Ｅ−１が有利に使用される。

バチルスｓｐ．Ｅ−１の菌学的性質は下記のとうりであ
る。

（ａ）形態 （１）細胞の大きさ：０．６−０．８　Ｘ　１．５〜２
．０　μｍの桿菌 （２）運動性二周鞭毛を有し、運動性有り（３）胞子の
有無：有り、楕円形 （４）ダラム染色性：陰性 （ｂ）生育状態 （１）肉汁寒天平板培養：３０℃、２４〜９６時間で無
色のコロニー、表面平滑で、にぶい光沢がある。

（２）肉汁寒天斜面培養：３０℃、２４〜９６時間でよ
く生育する。

（３）肉汁液体培養：３０℃，２４〜９６時間で、時間
とともに全体的に濁ってくる。表面に膜を形成しない。

（ｃ）生理的性質 （１）硝酸塩の還元：陽性 （２）　ｖｐテスｌ弓陰性 （３）イントールの生成：陰性 （４）硫化水素の生成：陰性 （５）澱粉の加水分解：陽性 （６）色素の生成：なし （７）ウレアーゼ：陽性 （８）オキシダーゼ：陽性 （９）カタラーゼ：陽性 （１０）生育の範囲：生育ｐＨ４−ＩＩ、至適温度２５
−３５℃ （１１）酸素に対する態度：好気性 （１２）酎塩性：５％食塩；陰性 （１３）糖類から酸及びガスの生成 酸の生成　ガスの生成 （１）Ｄ−グルコース　　　士 （２）Ｌ−アラビノース　　＋ （３）Ｄ−キシロース　　　＋ （４）Ｄ−マンニトール　　＋ 本菌の形態学的、生理学的諸性質で特徴的なことは、ダ
ラム陰性の桿菌で運動性があり、胞子を形成すること、
それに好気性菌であることから、バチルス属に属するも
のと認められた。そこで本菌をＢａｃｉｌｌｕｓ属の新
菌株バチルスｓｐ　．　Ｅ−１と命名し、通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１０５８
１号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５８１）として寄託さわてい
る。

ポリガラクトサミン分解酵素Ｅ−１生産菌の培養培地と
しては、炭素源、窒素源，無機物、その他の栄養素を程
よく含有する培地ならば，合成培地あるいは天然培地の
いずれでも使用可能である。

該培養培地の好適な例としては、ポリガラクトサミン０
．５％、グルコース０．２％、ペプトン０．１％、酵母
エキス０．１％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％、Ｋ７ＨＰ０，
　０．１％、ＭｇＳＯ，・７８２０　０．０１％ｐＨ８
．０の例が挙げられる。培養温度は２０〜４０℃、好ま
しくは、２５〜３５゜Ｃの範囲、培養開始ｐＨは、６〜
１０好ましくは８付近で３５〜７２時間振盪又は深部攪
拌培養すれば、培養液中にポリガラクトサミン分解酵素
Ｅ−１が得られる。そして，ポリガラクトサミン分解酵
素Ｅ−］は、必要に応じて単離精製される。例えば、培
養濾液を硫酸アンモニウムによる分画沈澱法によって粗
酵素を分離し、これを透析し、ＣトセファデックスＣ−
５０？オン交換クロマトグラフィー、セファデックスＧ
−１００ケル濾過、フェニルーセファロースＣＬ−４Ｂ
疎水クロマトグラフイー等の処理により、精製されたポ
リガラクトサミン分解酵素Ｅ−１が得られる。

本発明の新規ポリガラクＩ〜サミン分解酵素Ｅ−１を用
いるとオリゴガラクトサミンをより効果的に得る事がで
きる。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ バチルスｓｐ．Ｅ−１，　ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５８１　
を５００ｍｆｌ三角フラスコ中でペプトン１．０％、酵
母エキス１．０％の組成を有する種培地１００ｍＩ２に
植菌し、３０℃で２４時間培養した９ 得られた種培養液を３０氾ジャーファーメンターの中で
、ポリガラクトサミン（ＰＦ１０２）　０．５％、グル
コース０．２％、ペプトン０．１％、酵母エキス０．１
％、ＫＮ２ＰＯ４（１．１％、Ｋ．Ｉ｛Ｐ０，　０．１
％、ＭｇＳＯ４・７１１■Ｏ　Ｏ．０１％の酵素生産培
地１５１２に植菌し、３０℃で７２時間通気（１５　Ｑ
　／分）攪拌（１５０ｒｐｍ）で培養した。

得られた培養液を遠心分離（１０，ＯＯＯｒｐｍ）　シ
て、菌体を除き、得られた培養濾液に硫酸アンモニウム
を０．９飽和になる様に加え、蛋白質を沈澱させ、更に
遠心分離（１０，ＯＯＯｒｐｍ）　Ｌて蛋白質を集め、
０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析し脱塩し
た。

得られた透析内液を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したＣトセファデックスＣ−５０カラムに
かけ、酵素蛋白質を吸着させ、０〜０．５モル食塩の濃
度勾配を有する同緩衝液を用いて溶出させた。溶出した
活性画分を集め、同緩衝液で平衡化したセファデックス
Ｇ−１００カラムにかける。次いで活性画分の食塩濃度
を４モルにまで高め、同様な溶液で平衡化したフェニル
ーセフ７ロースＣＬ−４Ｂカラムに吸着させ、食塩の逆
濃度勾配を持つ０．ＯＩＭリン酸緩衝液で溶出させた。

活性画分を集め透析し脱塩後凍結乾燥し、精製酵素蛋白
質７０ｍｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本酵素についての至適ｐＨを、第２図は安定
ρＨを、第３図には作用適温を，第４図は、温度安定性
を、第５図にはＣＭ−セファデックスＣ〜５０カラムク
ロマ１−グラフィーのパターンを、第６図は、セファデ
ックスＧ】００のゲル濾過パターンを、第７図には、フ
ェニルーセファロースＣＬ−４Ｂカラムクロマ１〜クラ
フィーのパターンを、第８図は、ポリアクリルアミ１〜
ゲル電気泳動法により分子量を測定した結果を、第９図
はポリアクリルアミトゲル電気泳動の結果を、更に第１
０図には等電点′市気泳動の結果を、それぞれ示す図で
ある。 代理人　弁理士　戸　田　親　男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の化学的性質を有するポリガラクトサミン分解
   酵素Ｅ−１。 （１）作用及び基質特異性 ポリガラクトサミン（ポリα−１，４ガラクトサミノガ
   ラクタン）に作用して、オリゴガラクトサミンを生成す
   る。ポリヘキソース、又はキチン、キトサンに対しては
   、全く作用しない。 （２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ氏緩衝液及び、Ａｔｋｉｎｓ＆Ｐａ
   ｎｔｉｎ氏炭酸ソーダ・硼酸混合液を用いた場合、至適
   ｐＨは、７．５であり、安定ｐＨ範囲は５．５〜１０．
   ０である。 ２、バチルス属に属するポリガラクトサミン分解酵素Ｅ
   −１生産菌を培養し、培養物より、ポリガラクトサミン
   分解酵素Ｅ−１を採取することを特徴とするポリガラク
   トサミン分解酵素Ｅ−１の製造法。