JPH02234672A - ポリガラクトサミン分解酵素e―1及びその製造法 - Google Patents
ポリガラクトサミン分解酵素e―1及びその製造法Info
- Publication number
- JPH02234672A JPH02234672A JP5301489A JP5301489A JPH02234672A JP H02234672 A JPH02234672 A JP H02234672A JP 5301489 A JP5301489 A JP 5301489A JP 5301489 A JP5301489 A JP 5301489A JP H02234672 A JPH02234672 A JP H02234672A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polygalactosamine
- enzyme
- range
- stable
- degrading enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 title 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 title 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 6
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 abstract description 10
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 abstract description 10
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 abstract description 7
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 abstract description 6
- HXOLFXRMWWHLMH-UHFFFAOYSA-L disodium boric acid carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].OB(O)O.[O-]C([O-])=O HXOLFXRMWWHLMH-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M p-chloromercuribenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([Hg]Cl)C=C1 YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- 229920001543 Laminarin Polymers 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241001236817 Paecilomyces <Clavicipitaceae> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 1
- DRUQKRWRXOUEGS-NGERZBJRSA-N Samin Chemical compound C1=C2OCOC2=CC([C@H]2OC[C@H]3[C@@H]2CO[C@@H]3O)=C1 DRUQKRWRXOUEGS-NGERZBJRSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- WGYFACNYUJGZQO-UHFFFAOYSA-N aminomethanetriol Chemical compound NC(O)(O)O WGYFACNYUJGZQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-VPNXCSTESA-N laminarin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)OC1O[C@@H]1[C@@H](O)C(O[C@H]2[C@@H]([C@@H](CO)OC(O)[C@@H]2O)O)O[C@H](CO)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-VPNXCSTESA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000002932 luster Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 235000019600 saltiness Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規なポリガラクトサミン分解酵素(ポリガ
ラクトサミニダーゼ)ト1に関するものである。
ラクトサミニダーゼ)ト1に関するものである。
更に詳細には、本発明は、ポリガラクトサミンを加水分
解してオリゴガラクトサミンを生成する新規なポリガラ
クトサミン分解酵素E−1及びその製造法に関するもの
である。
解してオリゴガラクトサミンを生成する新規なポリガラ
クトサミン分解酵素E−1及びその製造法に関するもの
である。
一般に、微生物の生産するポリガラクトサミン(ボリC
L−1.4ガラクトサミノガラククン)としては、PF
IOI (特公昭56 − 12639)及びPF10
2 (特願昭61134799)が認知されている程度
である。
L−1.4ガラクトサミノガラククン)としては、PF
IOI (特公昭56 − 12639)及びPF10
2 (特願昭61134799)が認知されている程度
である。
近年、微生物、植物あるいは動物の生産する多糖あるい
はそれらのオリゴ糖が種々の生理活性を有することが知
られるようになり、多糖又はそれらのオリゴ糖に関心が
高まっている。
はそれらのオリゴ糖が種々の生理活性を有することが知
られるようになり、多糖又はそれらのオリゴ糖に関心が
高まっている。
また、ポリガラクトサミンの類似多糖として知られるポ
リグルコサミン(キトサン)においてもキチン、キ1へ
サン及びそのオリゴ糖が抗腫瘍活性を有する事が発見さ
れている。さらにポリガラクトサミン自身においても同
様な生理活性の在ることが見出され(石谷幸喜他日本生
化学会講演要旨集pl7] , 1985)、そのオリ
ゴ糖の生理活性にも関心が高まっている。生理活性以外
の用途にもポリガラクトサミン、オリゴガラクトサミン
が有用になる可能性があり、特に、オリゴマーは用途分
野や作用面でポリマーにない特性を発揮するものと期待
され、注目されている。 ポリガラクトサミンを酸又は
アルカリによって加水分解することによりオリゴ糖を得
ることは可能であるが、オリゴマーの収率は非常に悪い
。例えば塩酸によってポリガラクトサミンを加水分解す
る時、ランダムな分解の結果、得られるオリゴ糖の量は
モノーガラクトサミン、ジーガラクトサミン、トリーガ
ラクトサミン、テトラーガラクトサミン,ペンターガラ
クトサミンの順であり、重合度が大きい程その収量は激
減するということになる。 そこで、ポリガラクトサミ
ンを分解して、重合度が比較的大きな種々の重合度のオ
リゴ糖を得ることのできるポリガラクトサミン分解酵素
が必要とされるのである。
リグルコサミン(キトサン)においてもキチン、キ1へ
サン及びそのオリゴ糖が抗腫瘍活性を有する事が発見さ
れている。さらにポリガラクトサミン自身においても同
様な生理活性の在ることが見出され(石谷幸喜他日本生
化学会講演要旨集pl7] , 1985)、そのオリ
ゴ糖の生理活性にも関心が高まっている。生理活性以外
の用途にもポリガラクトサミン、オリゴガラクトサミン
が有用になる可能性があり、特に、オリゴマーは用途分
野や作用面でポリマーにない特性を発揮するものと期待
され、注目されている。 ポリガラクトサミンを酸又は
アルカリによって加水分解することによりオリゴ糖を得
ることは可能であるが、オリゴマーの収率は非常に悪い
。例えば塩酸によってポリガラクトサミンを加水分解す
る時、ランダムな分解の結果、得られるオリゴ糖の量は
モノーガラクトサミン、ジーガラクトサミン、トリーガ
ラクトサミン、テトラーガラクトサミン,ペンターガラ
クトサミンの順であり、重合度が大きい程その収量は激
減するということになる。 そこで、ポリガラクトサミ
ンを分解して、重合度が比較的大きな種々の重合度のオ
リゴ糖を得ることのできるポリガラクトサミン分解酵素
が必要とされるのである。
すでにシュードモナス属に属する細菌の生産するポリガ
ラクトサミン分解酵素(特願昭61−308579、同
61−308580)が結知されている。
ラクトサミン分解酵素(特願昭61−308579、同
61−308580)が結知されている。
本発明は上記記載のポリガラクトサミン分解酵素に比べ
て、ポリガラクトサミンを分解してオリゴ糖を得るのに
、より利用価値の高い理化学的性質をもつポリガラクト
サミン分解酵素を提供することにある。
て、ポリガラクトサミンを分解してオリゴ糖を得るのに
、より利用価値の高い理化学的性質をもつポリガラクト
サミン分解酵素を提供することにある。
本発明者らは、広範な微生物についてポリガラクトサミ
ン分解菌を検索した結果、バチルス属に属する細菌が、
新規なポリガラクトサミン分解酵素E−1を生産し従来
の酵素と異なる性質を有することを見出し、本発明を完
成した。
ン分解菌を検索した結果、バチルス属に属する細菌が、
新規なポリガラクトサミン分解酵素E−1を生産し従来
の酵素と異なる性質を有することを見出し、本発明を完
成した。
本発明は、新規なポリガラクトサミン分解酵素E−1で
あり、また本発明は、バチルス属に属し、ポリガラクト
サミン分解酵素E−1生産能を有する菌株を培養し培養
物よりポリガラクトサミン分解酵素E−1を採取するこ
とを特徴とするポリガラクトサミン分解酵素E−1の製
造法である。
あり、また本発明は、バチルス属に属し、ポリガラクト
サミン分解酵素E−1生産能を有する菌株を培養し培養
物よりポリガラクトサミン分解酵素E−1を採取するこ
とを特徴とするポリガラクトサミン分解酵素E−1の製
造法である。
本酵素の理化学的性質は、下記のとうりである。
(1)作用及び基質特異性
本酵素は、重合度n=4(テトラーガラクトサミン)以
上のオリゴ糖及びポリガラクトサミン(α−1,4ポリ
ガラクトサミン)に作用し、オリゴガラクトサミンを生
成する。
上のオリゴ糖及びポリガラクトサミン(α−1,4ポリ
ガラクトサミン)に作用し、オリゴガラクトサミンを生
成する。
その他の多糖類、澱粉(α−1,4グルカン)、グリコ
ーゲン(α−1,4グルカン)、デキストラン(α−1
,6グルカン)、ラミナラン(β−1,3グルカン)、
カルボキシルセルロース(β−1.4グルカン)、キト
サン(β−1.4 グノレコサミノグルカン)、エチレ
ングリコールキチン(β−1.4N−アセチルグルコサ
ミノグルカン)、Pseudomonas solan
acearumのポリトアセチルガラクトサミノガラク
タン(ポリβ−1 . 3N−アセチルガラクトサミノ
ガラクタン) (Y.Akiyama., et.a
l., Agric. Biol. Chem., 5
0(3), 747.1986)などには全く作用しな
い。
ーゲン(α−1,4グルカン)、デキストラン(α−1
,6グルカン)、ラミナラン(β−1,3グルカン)、
カルボキシルセルロース(β−1.4グルカン)、キト
サン(β−1.4 グノレコサミノグルカン)、エチレ
ングリコールキチン(β−1.4N−アセチルグルコサ
ミノグルカン)、Pseudomonas solan
acearumのポリトアセチルガラクトサミノガラク
タン(ポリβ−1 . 3N−アセチルガラクトサミノ
ガラクタン) (Y.Akiyama., et.a
l., Agric. Biol. Chem., 5
0(3), 747.1986)などには全く作用しな
い。
また、重合度n=3(トリーガラクトサミン)以下のα
−1,4ガラクトサミノオリゴ糖にも作用しない。
−1,4ガラクトサミノオリゴ糖にも作用しない。
(2)至適pH及び安定pH範囲
Mcllvaine氏緩衝液を用いた場合,至適pHは
、7.5である。(第1図)また、安定p}I範囲は、
p}12.5−8.0:Mcllvaine氏緩衝液、
pH8.0 〜11.0:Atkins&Pantin
氏炭酸ソーダ・硼酸混合液を用い、第2図に示すように
pH5.5〜10.0である。この測定は、37℃で1
時間放置した後の酵素残存活性を相対値で示した。
、7.5である。(第1図)また、安定p}I範囲は、
p}12.5−8.0:Mcllvaine氏緩衝液、
pH8.0 〜11.0:Atkins&Pantin
氏炭酸ソーダ・硼酸混合液を用い、第2図に示すように
pH5.5〜10.0である。この測定は、37℃で1
時間放置した後の酵素残存活性を相対値で示した。
(3)酵素活性の測定法
酵素活性は、基質として、0.1モル酢酸緩衝液(pH
6)にPaecilomyces I −1菌の生産す
るPFIOI又はPF102(その主構成糖は,α−1
,4ガラクトサミノガラクタン)を0.2%溶解した溶
液0.5mMに酵素溶液0.5ml1を加え37℃、1
0分間反応させ、生じる還元力をSomogyi−Ne
lson法で測定した。なお酵素単位は、1分間当りに
1μモルのガラクトサミンに相当する還元力を増加させ
る活性を1単位とした。
6)にPaecilomyces I −1菌の生産す
るPFIOI又はPF102(その主構成糖は,α−1
,4ガラクトサミノガラクタン)を0.2%溶解した溶
液0.5mMに酵素溶液0.5ml1を加え37℃、1
0分間反応させ、生じる還元力をSomogyi−Ne
lson法で測定した。なお酵素単位は、1分間当りに
1μモルのガラクトサミンに相当する還元力を増加させ
る活性を1単位とした。
(4)作用適温及び温度安定性の範囲
20〜90℃の範囲で測定した結果を第3図に示した。
この酵素の至適温度は60℃であり、それ以上で急激に
低下する。
低下する。
つぎに温度安定性についてみたものが第4図である。p
H6.0の条件で各温度で0〜60分間保った時の残存
活性を示した。60℃、1時間で85%の活性が残存し
ている。
H6.0の条件で各温度で0〜60分間保った時の残存
活性を示した。60℃、1時間で85%の活性が残存し
ている。
(5)金属イオン等の影響
各種金属イオン及び阻害剤1 mM(PCMBのみO.
lmMを含む溶液中に37℃、1時間放置後,残存酵素
活性を測定し、相対値で示した。(表−1)表−1.金
属イオン等の影響 阻害物 残存活性(%) 無添加 1.00 KCI 106 CaC]21.10 BaC1294 CoC12105 CdC]281 FeC128 ZnC]251 Pb(CH3COO)295 (Nl{.).SO. 98 trj.s 3) 102 ?害物 NaC] LiC03 MnSQ, Nice2 FeCl3 HgC1■ N84CI CUS04 SDS 1) EDTA 2) PCMB 4) NFIS 5) 14 MIA
6) 961)ドデシル硫酸ナ1〜リウム 2)エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム3)トリス(
ヒドロキシル)アミノメタン4)パラクロル安息香酸第
二水銀 5)N−プロモコハク酸イミト 6)モノヨード酢酸 以上の結果から、このポリガラクトサミン分解酵素は、
Fe++、Fe+++、CIJ++、Hg++及びNB
Sによって強力に阻害されZ n ” ”、N1++、
SDSによっても阻害される。
lmMを含む溶液中に37℃、1時間放置後,残存酵素
活性を測定し、相対値で示した。(表−1)表−1.金
属イオン等の影響 阻害物 残存活性(%) 無添加 1.00 KCI 106 CaC]21.10 BaC1294 CoC12105 CdC]281 FeC128 ZnC]251 Pb(CH3COO)295 (Nl{.).SO. 98 trj.s 3) 102 ?害物 NaC] LiC03 MnSQ, Nice2 FeCl3 HgC1■ N84CI CUS04 SDS 1) EDTA 2) PCMB 4) NFIS 5) 14 MIA
6) 961)ドデシル硫酸ナ1〜リウム 2)エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム3)トリス(
ヒドロキシル)アミノメタン4)パラクロル安息香酸第
二水銀 5)N−プロモコハク酸イミト 6)モノヨード酢酸 以上の結果から、このポリガラクトサミン分解酵素は、
Fe++、Fe+++、CIJ++、Hg++及びNB
Sによって強力に阻害されZ n ” ”、N1++、
SDSによっても阻害される。
(6)酵素の精製法
本酵素の単離、精製は常法に従って行うことができる。
例えば硫酸アンモニウムによる分画沈澱、Cトセファデ
ックスC−50カラムクロマトグラフィー(第5図)、
セファデソクスG100カラムクロマトグラフィー(第
6図)、フェニルーセファロースCL−4Bカラムクロ
マトグラフイー(第7図)などの精製手段又はこれらの
組合せにより精製される。
ックスC−50カラムクロマトグラフィー(第5図)、
セファデソクスG100カラムクロマトグラフィー(第
6図)、フェニルーセファロースCL−4Bカラムクロ
マトグラフイー(第7図)などの精製手段又はこれらの
組合せにより精製される。
(7)分子量
本酵素の分子量はポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より測定すると、60,000と計算される。
より測定すると、60,000と計算される。
結果は第8図に示した。
(8)ポリアクリルアミドゲル電気泳動精製酵素を常法
に従って10%のポリアクリルアミドゲル(pl+8.
8)電気泳動にかけた。結果は第9図に示すとうり単一
のバンドが認められた。
に従って10%のポリアクリルアミドゲル(pl+8.
8)電気泳動にかけた。結果は第9図に示すとうり単一
のバンドが認められた。
(9)等重点
常法によりシュークロース密度勾配の等電点電気泳動を
行った。結果は第10図に示すように、この酵素の等電
点はρI=9.5である。
行った。結果は第10図に示すように、この酵素の等電
点はρI=9.5である。
本酵素は、その作用及び基質特異性において従来全く知
られていない新規酵素である。
られていない新規酵素である。
次に本発明による新規ポリガラクトサミン分解酵素ト1
の製造法について説明する。
の製造法について説明する。
本発明における使用菌は、バチルス属に属し,ポリガラ
クトサミン分解酵素E−1 を生産する菌であればいか
なる菌株でもよいが、本発明者らが土壌より分離したバ
チルスsp.E−1が有利に使用される。
クトサミン分解酵素E−1 を生産する菌であればいか
なる菌株でもよいが、本発明者らが土壌より分離したバ
チルスsp.E−1が有利に使用される。
バチルスsp.E−1の菌学的性質は下記のとうりであ
る。
る。
(a)形態
(1)細胞の大きさ:0.6−0.8 X 1.5〜2
.0 μmの桿菌 (2)運動性二周鞭毛を有し、運動性有り(3)胞子の
有無:有り、楕円形 (4)ダラム染色性:陰性 (b)生育状態 (1)肉汁寒天平板培養:30℃、24〜96時間で無
色のコロニー、表面平滑で、にぶい光沢がある。
.0 μmの桿菌 (2)運動性二周鞭毛を有し、運動性有り(3)胞子の
有無:有り、楕円形 (4)ダラム染色性:陰性 (b)生育状態 (1)肉汁寒天平板培養:30℃、24〜96時間で無
色のコロニー、表面平滑で、にぶい光沢がある。
(2)肉汁寒天斜面培養:30℃、24〜96時間でよ
く生育する。
く生育する。
(3)肉汁液体培養:30℃,24〜96時間で、時間
とともに全体的に濁ってくる。表面に膜を形成しない。
とともに全体的に濁ってくる。表面に膜を形成しない。
(c)生理的性質
(1)硝酸塩の還元:陽性
(2) vpテスl弓陰性
(3)イントールの生成:陰性
(4)硫化水素の生成:陰性
(5)澱粉の加水分解:陽性
(6)色素の生成:なし
(7)ウレアーゼ:陽性
(8)オキシダーゼ:陽性
(9)カタラーゼ:陽性
(10)生育の範囲:生育pH4−II、至適温度25
−35℃ (11)酸素に対する態度:好気性 (12)酎塩性:5%食塩;陰性 (13)糖類から酸及びガスの生成 酸の生成 ガスの生成 (1)D−グルコース 士 (2)L−アラビノース + (3)D−キシロース + (4)D−マンニトール + 本菌の形態学的、生理学的諸性質で特徴的なことは、ダ
ラム陰性の桿菌で運動性があり、胞子を形成すること、
それに好気性菌であることから、バチルス属に属するも
のと認められた。そこで本菌をBacillus属の新
菌株バチルスsp . E−1と命名し、通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第1058
1号(FERM P−10581)として寄託さわてい
る。
−35℃ (11)酸素に対する態度:好気性 (12)酎塩性:5%食塩;陰性 (13)糖類から酸及びガスの生成 酸の生成 ガスの生成 (1)D−グルコース 士 (2)L−アラビノース + (3)D−キシロース + (4)D−マンニトール + 本菌の形態学的、生理学的諸性質で特徴的なことは、ダ
ラム陰性の桿菌で運動性があり、胞子を形成すること、
それに好気性菌であることから、バチルス属に属するも
のと認められた。そこで本菌をBacillus属の新
菌株バチルスsp . E−1と命名し、通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第1058
1号(FERM P−10581)として寄託さわてい
る。
ポリガラクトサミン分解酵素E−1生産菌の培養培地と
しては、炭素源、窒素源,無機物、その他の栄養素を程
よく含有する培地ならば,合成培地あるいは天然培地の
いずれでも使用可能である。
しては、炭素源、窒素源,無機物、その他の栄養素を程
よく含有する培地ならば,合成培地あるいは天然培地の
いずれでも使用可能である。
該培養培地の好適な例としては、ポリガラクトサミン0
.5%、グルコース0.2%、ペプトン0.1%、酵母
エキス0.1%、KH2PO40.1%、K7HP0,
0.1%、MgSO,・7820 0.01%pH8
.0の例が挙げられる。培養温度は20〜40℃、好ま
しくは、25〜35゜Cの範囲、培養開始pHは、6〜
10好ましくは8付近で35〜72時間振盪又は深部攪
拌培養すれば、培養液中にポリガラクトサミン分解酵素
E−1が得られる。そして,ポリガラクトサミン分解酵
素E−]は、必要に応じて単離精製される。例えば、培
養濾液を硫酸アンモニウムによる分画沈澱法によって粗
酵素を分離し、これを透析し、CトセファデックスC−
50?オン交換クロマトグラフィー、セファデックスG
−100ケル濾過、フェニルーセファロースCL−4B
疎水クロマトグラフイー等の処理により、精製されたポ
リガラクトサミン分解酵素E−1が得られる。
.5%、グルコース0.2%、ペプトン0.1%、酵母
エキス0.1%、KH2PO40.1%、K7HP0,
0.1%、MgSO,・7820 0.01%pH8
.0の例が挙げられる。培養温度は20〜40℃、好ま
しくは、25〜35゜Cの範囲、培養開始pHは、6〜
10好ましくは8付近で35〜72時間振盪又は深部攪
拌培養すれば、培養液中にポリガラクトサミン分解酵素
E−1が得られる。そして,ポリガラクトサミン分解酵
素E−]は、必要に応じて単離精製される。例えば、培
養濾液を硫酸アンモニウムによる分画沈澱法によって粗
酵素を分離し、これを透析し、CトセファデックスC−
50?オン交換クロマトグラフィー、セファデックスG
−100ケル濾過、フェニルーセファロースCL−4B
疎水クロマトグラフイー等の処理により、精製されたポ
リガラクトサミン分解酵素E−1が得られる。
本発明の新規ポリガラクI〜サミン分解酵素E−1を用
いるとオリゴガラクトサミンをより効果的に得る事がで
きる。
いるとオリゴガラクトサミンをより効果的に得る事がで
きる。
次に本発明の実施例を示す。
実施例1
バチルスsp.E−1, FERM P−10581
を500mfl三角フラスコ中でペプトン1.0%、酵
母エキス1.0%の組成を有する種培地100mI2に
植菌し、30℃で24時間培養した9 得られた種培養液を30氾ジャーファーメンターの中で
、ポリガラクトサミン(PF102) 0.5%、グル
コース0.2%、ペプトン0.1%、酵母エキス0.1
%、KN2PO4(1.1%、K.I{P0, 0.1
%、MgSO4・711■O O.01%の酵素生産培
地1512に植菌し、30℃で72時間通気(15 Q
/分)攪拌(150rpm)で培養した。
を500mfl三角フラスコ中でペプトン1.0%、酵
母エキス1.0%の組成を有する種培地100mI2に
植菌し、30℃で24時間培養した9 得られた種培養液を30氾ジャーファーメンターの中で
、ポリガラクトサミン(PF102) 0.5%、グル
コース0.2%、ペプトン0.1%、酵母エキス0.1
%、KN2PO4(1.1%、K.I{P0, 0.1
%、MgSO4・711■O O.01%の酵素生産培
地1512に植菌し、30℃で72時間通気(15 Q
/分)攪拌(150rpm)で培養した。
得られた培養液を遠心分離(10,OOOrpm) シ
て、菌体を除き、得られた培養濾液に硫酸アンモニウム
を0.9飽和になる様に加え、蛋白質を沈澱させ、更に
遠心分離(10,OOOrpm) Lて蛋白質を集め、
0.01Mリン酸緩衝液(pH7.0)で透析し脱塩し
た。
て、菌体を除き、得られた培養濾液に硫酸アンモニウム
を0.9飽和になる様に加え、蛋白質を沈澱させ、更に
遠心分離(10,OOOrpm) Lて蛋白質を集め、
0.01Mリン酸緩衝液(pH7.0)で透析し脱塩し
た。
得られた透析内液を0.01Mリン酸緩衝液(pH7.
0)で平衡化したCトセファデックスC−50カラムに
かけ、酵素蛋白質を吸着させ、0〜0.5モル食塩の濃
度勾配を有する同緩衝液を用いて溶出させた。溶出した
活性画分を集め、同緩衝液で平衡化したセファデックス
G−100カラムにかける。次いで活性画分の食塩濃度
を4モルにまで高め、同様な溶液で平衡化したフェニル
ーセフ7ロースCL−4Bカラムに吸着させ、食塩の逆
濃度勾配を持つ0.OIMリン酸緩衝液で溶出させた。
0)で平衡化したCトセファデックスC−50カラムに
かけ、酵素蛋白質を吸着させ、0〜0.5モル食塩の濃
度勾配を有する同緩衝液を用いて溶出させた。溶出した
活性画分を集め、同緩衝液で平衡化したセファデックス
G−100カラムにかける。次いで活性画分の食塩濃度
を4モルにまで高め、同様な溶液で平衡化したフェニル
ーセフ7ロースCL−4Bカラムに吸着させ、食塩の逆
濃度勾配を持つ0.OIMリン酸緩衝液で溶出させた。
活性画分を集め透析し脱塩後凍結乾燥し、精製酵素蛋白
質70mgを得た。
質70mgを得た。
第1図は、本酵素についての至適pHを、第2図は安定
ρHを、第3図には作用適温を,第4図は、温度安定性
を、第5図にはCM−セファデックスC〜50カラムク
ロマ1−グラフィーのパターンを、第6図は、セファデ
ックスG】00のゲル濾過パターンを、第7図には、フ
ェニルーセファロースCL−4Bカラムクロマ1〜クラ
フィーのパターンを、第8図は、ポリアクリルアミ1〜
ゲル電気泳動法により分子量を測定した結果を、第9図
はポリアクリルアミトゲル電気泳動の結果を、更に第1
0図には等電点′市気泳動の結果を、それぞれ示す図で
ある。 代理人 弁理士 戸 田 親 男
ρHを、第3図には作用適温を,第4図は、温度安定性
を、第5図にはCM−セファデックスC〜50カラムク
ロマ1−グラフィーのパターンを、第6図は、セファデ
ックスG】00のゲル濾過パターンを、第7図には、フ
ェニルーセファロースCL−4Bカラムクロマ1〜クラ
フィーのパターンを、第8図は、ポリアクリルアミ1〜
ゲル電気泳動法により分子量を測定した結果を、第9図
はポリアクリルアミトゲル電気泳動の結果を、更に第1
0図には等電点′市気泳動の結果を、それぞれ示す図で
ある。 代理人 弁理士 戸 田 親 男
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、下記の化学的性質を有するポリガラクトサミン分解
酵素E−1。 (1)作用及び基質特異性 ポリガラクトサミン(ポリα−1,4ガラクトサミノガ
ラクタン)に作用して、オリゴガラクトサミンを生成す
る。ポリヘキソース、又はキチン、キトサンに対しては
、全く作用しない。 (2)至適pH及び安定pH範囲 Mcllvaine氏緩衝液及び、Atkins&Pa
ntin氏炭酸ソーダ・硼酸混合液を用いた場合、至適
pHは、7.5であり、安定pH範囲は5.5〜10.
0である。 2、バチルス属に属するポリガラクトサミン分解酵素E
−1生産菌を培養し、培養物より、ポリガラクトサミン
分解酵素E−1を採取することを特徴とするポリガラク
トサミン分解酵素E−1の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5301489A JPH02234672A (ja) | 1989-03-07 | 1989-03-07 | ポリガラクトサミン分解酵素e―1及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5301489A JPH02234672A (ja) | 1989-03-07 | 1989-03-07 | ポリガラクトサミン分解酵素e―1及びその製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02234672A true JPH02234672A (ja) | 1990-09-17 |
Family
ID=12931049
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5301489A Pending JPH02234672A (ja) | 1989-03-07 | 1989-03-07 | ポリガラクトサミン分解酵素e―1及びその製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02234672A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012147989A1 (en) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid belonging to the glutamate family, using a coryneform bacterium |
-
1989
- 1989-03-07 JP JP5301489A patent/JPH02234672A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012147989A1 (en) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | Ajinomoto Co.,Inc. | A method for producing an l-amino acid belonging to the glutamate family, using a coryneform bacterium |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4052262A (en) | Preparation of an alkaline protease | |
US5362645A (en) | Heparinase-producing microorganism belonging to the genus bacillus | |
US5405759A (en) | Heparitinase, process for producing the same and bacteria producing the same | |
JPH02234672A (ja) | ポリガラクトサミン分解酵素e―1及びその製造法 | |
JPH03247296A (ja) | 低分子量コンドロイチン硫酸の製造方法 | |
JP3055041B2 (ja) | α−1,2−マンノシダーゼ、その製造方法およびその生産菌 | |
JPH05236958A (ja) | 新規イソアミラーゼ及びその製造法 | |
JP2676453B2 (ja) | アルカリイソアミラーゼ及びそれを生産する微生物並びに該アルカリイソアミラーゼの製造方法 | |
JP2707093B2 (ja) | 新規微生物 | |
JP3603396B2 (ja) | εーポリーLーリシン分解酵素およびそれを用いた低重合度εーポリーLーリシンの製造法 | |
JPS63164884A (ja) | ポリガラクトサミン分解酵素 | |
JP3516104B2 (ja) | ムタナーゼ産生微生物及びムタナーゼ | |
JPH02190185A (ja) | ポリガラクトサミン分解酵素a−4及びその製造法 | |
JP3820617B2 (ja) | ε−ポリ−L−リシン分解酵素とそれを用いた低重合度ε−ポリ−L−リシンの製造法 | |
JP3027449B2 (ja) | 新規シクロマルトデキストリナーゼ、その製造法及び該酵素を生産する微生物 | |
JP2894292B2 (ja) | ガラクタナーゼs−2及びこれを産生するバチルスエスピーs−2 | |
JPH01228465A (ja) | 新規なβ−アガラーゼ及びその製造法 | |
JPS62201571A (ja) | 新規キトサナ−ゼ生産菌 | |
JPH0236232B2 (ja) | Horigarakutosaminbunkaikosonoseizoho | |
JP3272416B2 (ja) | 新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法 | |
JP2838005B2 (ja) | 新規なγ−ポリグルタミン酸分解酵素 | |
JPH099962A (ja) | アルギン酸分解酵素とその製造法ならびにアルギン酸分解法 | |
JPH0761264B2 (ja) | 新規なシクロマルトデキストリナーゼ及びその製造方法 | |
JPS6339589A (ja) | アルギン酸のアルカリ土類金属塩を分解する方法 | |
JPH0632611B2 (ja) | γ―サイクロデキストリン合成酵素及びその製造法 |