JPS6339589A - アルギン酸のアルカリ土類金属塩を分解する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアルギン酸またはその塩をアルギン酸リアーゼ
の作用によや分解する方法、特に上記方法においてアル
カリ土類金属キレート能物質および／または界面活性剤
の存在下に行なうアルギン酸またはその塩類の分解の改
良方法に関する。

〔従来の技術〕

アルギン酸リアーゼは、アルギン酸およびその塩に作用
してそれらを分解し、低分子化させる酵素である。

アルギン酸およびその塩は多くの用途に使用されている
。例えば経糸剤、食品加工、塗料、歯科印象材等にその
用途が開かれている。そ１−てこれらの用途においては
アルギン酸および／またはその塩は使用後これを除去す
る必要があることがある。

例えば歯科印象材のアルギン酸カルシウムゲルは使用後
、トレイ等からこれらを除去しなければならない。かか
る場合従来はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ　）な
どのキレート能物質を主成分とする溶解液を用い、化学
的にアルギン酸および／またはその塩を可溶化させてい
る。しかしながらＥＤＴＡは金属を腐蝕する作用があり
、基材を損傷することがあるので好ましくない。

またクエン酸またはリン酸の如き酸あるいはそれらの塩
を用いてアルギン酸および／またはその塩のゲル除去を
する方法もあるが、これらはその溶解作用が弱いため効
率的でない。

また繊維工業において経糸剤または糊剤としてアルギン
酸およびその塩を使用した時、後に染色その他の処理を
するに当っては、上記アルギン酸および／またはその塩
を予め除去する必要がある。しかもそれを除去する際、
普通に使用される方法である加温抽出は時間がかかり非
能率的である。

上述した化学的方法に代るものとしてアルギンＷＪＩ’
）アーゼを使用した列としてはアルギン酸を分解するア
ルギン酸リアーゼの力価測定方法が知られている（例え
ばメソツズ・イン書エンジモロジー第８巻第６４１頁〜
第６４４頁、１９６６年、参照）。

アルギン酸リアーゼは上述した化学的方法と異なり、７
ルギン酸および／またはその塩にのみ作用して、これを
分解し、低分子化して除去を容易にすると共に、アルギ
ン酸および／またはその塩が適用された他の材料を損う
ことがないので非常に有利である。

かかるアルギン酸リアーゼを生産する微生物としてはシ
ュウトモナス属（ジャーナル・オプ・バイオケミストリ
ー、第６６巻第５０３頁〜第５１２頁、１９６９年）、
エーロモナス属（科学と工業、第４３巻第２１３頁〜第
２１８頁、１９６９年）、クレブシェラ属（カルボハイ
ドレイド・リサーチ、第５９巻、第１６３頁〜第１７１
頁、１９７７年）、およびバシラス属（アプライド・エ
ンド・エンピロメンタル・マイクロバイオロジイ、第４
７巻第７０４頁〜第７０９頁）等の微生物が知られてい
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

アルギンＦｔ　’）アーゼは上述した化学的方法に比し
てアルギン酸および／またはその塩を分解するのに有利
なのであるが、その分解能力、特に分解速度において未
だ充分とはいえず、分解速度の向上が望まれているのが
現状である。

従って本発明の目的はアルギン酸リアーゼ裔こよるアル
ギン酸および／またはその塩類の分解速度を向上させる
改良法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明はアルギン酸またはその塩類をアルギン酸リアー
ゼの作用により分解するに当り、アルカリ金属キレート
能物質および／または界面活性剤の存在下に行なうアル
ギン酸またはその塩を分解する方法にある。

本発明方法で使用するアルギン酸リアーゼはその起源は
特に限定されるものではなく、前述しり公知の例えばシ
ュードモナス属、エーロモナス属、クレブシェラ属およ
びバシラス属等の微生物を公知の方法で培養することに
よって得られるアルギン酸リアーゼを使用できる。

また本発明者によって新たに見出されたキサントモナス
属（Ｘａｎｉｈｏｍｏｎａｓ　）に属するアルギン酸リ
アーゼ生産菌を培養し、この培養物より採取したアルギ
ン酸リアーゼも使用でき、これはその生産量が大ですぐ
れているので好ましい。

このキサントモナス属の微生物からのアルギン酸リアー
ゼを製造する方法は本願と同日付にて出願した特許出願
に記載されている。よって同特許出願明細書の記載はこ
こに引用して組入れるものとする。

上記キサントモナス属に属する微生物はアルギン酸リア
ーゼを培養物中に著量生産することができるので有利で
ある。これについて以下に更に説明する。

かかる菌株としては、午サントモナス属に属するアルギ
ン酸リアーゼ生産能を有する菌株であればいかなる菌株
でもよく、またそれらの変異株でもよい。そしてキサン
トモナス属に属し、アルギン酸リアーゼ生産能を有する
菌株の具体例としては、例えば午サントモナス・エスピ
ーＮ　−２６（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｓｐ　Ｎ　−
２６）を挙げることができる。本菌株は京都府福知山市
内の畑地の土壌より分離された。本菌株の菌学的性質は
次のとおりである。

ａ、形態的性質 顕微鏡的観察（肉汁液体培地で３０℃で培養）（１）細
胞の形および大きさ：通常細胞の大きさは４〜ｓμｍｘ
　ｏ、　６〜０．７Ｊｔｍ０（２）細胞の多形性の有無
：なし、単独である。

（３）運動性の有無：有、極は毛を有する。

（４）胞子の有無：なし。

（５）ダラム染色性：陰性。

ｂ、各培地における生育状悪 （１）肉汁寒天平板培養： ３０℃４８時間の培養で、直径２〜５朋の凸円形コロニ
ーを形成する。表面は滑らかでやや黄色。

（２）肉汁寒天斜面培養： ３０℃の培養で糸状、周縁は滑らかで光沢があり、生育
は普通。

（３）肉汁液体培養： ３０℃の培養で２４時間で生育し、生育は普通。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養： ３０℃の培養で２４時間で生育し、生育は普通。液化は
漏斗状。

（５）リドマスミルク培養： ３０℃の培養で凝固せず、色調は青紫色で変化なし。

Ｃ１生理学的性質 （１）硝酸塩の還元：陰性 （２）脱窒反応；陰性 （３）ＭＲテスト＝陽性 （４）ＶＰテスト：陰性 （５）インドールの生成：陰性 （６）硫化水素の生成：陽性 （７）澱粉の加水分解：陽性 （８）栄養要求性：メチオニン （９）クエン酸の利用：陽性 （１０）無機窒素源の利用：陽性 （１１）ウレアーゼ：陰性 （１のオキシダーゼ：Ｆ３性 Ｃ３）カタラーゼ；陽性 （１→生育ｐＨ：５〜１０ αの生育温度：１５〜４０℃ ｏｇｙａ素に対する態度：好気的 Ｃ７）Ｏ−Ｆテスト二酸化的 （１８）糖類からのガスの生成：陽性 （１９）糖類からの酸の生成； 陽性；ラクトース、レプロース、ラクトース、グルコー
ス、セロビオース、フラクト ース、シュクロース、サリシン 陰性；ソルビトール、キシロース、アラビノース、アン
トール、ガラクトース、ラ ムノース、ラフィノース、イノシトー ル 以上の諸性質を「バーシーズ・マニュアル・オブ・デタ
ミネイテイプ・バクテリオロジイ」第８版（１９７４年
）より検索するとキサントモナス・キャンペストリスと
類似していることが分かったが、糖類からの酸の生成な
どにおいて異なっているのでキサントモナス属の新種と
判断しキサントモナス拳エスピーＮ−２６と命名した。

なお本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微生物
受託番号微工研菌寄第８８００号として寄託されている
。

本菌株は微生物の培養に通常用いられる栄養物たとえば
肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、コーン
スチーブリカー、カザミノ酸などにアルギン酸およびア
ルギン酸の塩を０．０１〜２％、好ましくは０．１％〜
１％を加えた培地で２０℃〜４０℃、好ましくは２７℃
〜３６℃の好気的条件で良好に増殖し、培養５〜４０時
間でアルギン酸リアーゼを生産する。

本発明の菌によって生産されたアルギン酸リアーゼは菌
体内に存在するので菌体からのアルギン酸リアーゼの抽
出はビーズや超音波を用いた細胞破砕、有機溶媒抽出な
どが使用できるが好ましくは以下の方法で行なう。アル
ギン酸リアーゼを生産し菌体内に蓄積した菌体を遠心等
によって集め緩衝液に分散させた液、あるいは菌体を含
んだ培養液に、界面活性剤たとえばトリトンＸ−１００
を０．０１％〜５％、好ましくは０．０５％〜２％を加
える。この時リゾチームをｏ、ｏｏｉ〜１ｏｍｇ／ｍｌ
、好ましくは０．０１〜１１１１ｉ’　／　ｍｌ加える
と抽出効果が良くなる。処理後、添加量や菌体濃度によ
っても異なるが、１分〜５時間放置したのち凝集剤によ
る凝集、遠心などにより菌体残さを除去すると粗酵素液
を得ることができる。本発明で使用される上記アルギン
酸リアーゼは上記の粗酊素液に限定するものではなく粗
酵塁液の処理物たとえば有（戊溶媒沈５１１塩析、クロ
マトグラフィーなどの公知の方法で’Ｆｉ７製した６７
：素液および、それらの乾燥物、固定化物さらには細胞
懸濁１１′１でもよい。

次に上記のキサントモナスやエスピーＮ−２６より得ら
れるアルギン酸リアーゼの酵素化学的および理化学的性
質は次のとおりである。

（１）作用ニアルギン酸を基質として反応させた時、ア
ルギン酸リアーゼの反応生成物である二重結合を二由来
する２３５ｎｍの特異吸収の増加が確認された。

（２）基質特異性： （３）至適ｐ）Ｉおよび安定ｐＨ範囲：ｐｉ（６，１付
近に至適ｐＨを示す（第１図参照）ｐＨ５，５〜６．５
）こて安定（第２図参照）（４）至、適温度および熱安
定性： 至適温度は５０℃付近である（第３図３１卯）熱安定性
は４０°Ｃ付近まで安定（第４図参照） （５）阻害、活性化 （６）安定化（４５℃、３０分処理） （７）分子景ニゲル濾過法により約７００００（８）酵
素活性測定法ニアルギン酸との反応によって生成した二
重結合由来の２３５ｎｍの吸光度を測定することにより
アルギン酸リアーゼの酵素活性を測定することができる
。

１）反応液の組成 酵素液　　　　　　　０．３プ ２）反応条件 ３７℃にて反応させ２３５ｎｍの吸光度変化を経時的に
測定する。

３）酵素活性 アルギン酸リアーゼ１単位はｐＨ６，３，３７℃の条件
で１分間に基質１ｍｌの２３５ｎｍの吸光度を１上昇さ
せる酵素量とする。

本発明で使用するアルカリ土類金属キレート能物質とは
、アルカリ土類金属をキレート化しうる物質を称し、例
えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ　）およびその
塩、クエン酸およびその塩、リン酸およびその塩等アル
カリ土類金属に対してキレート能を有する物質であれば
よい。

また本発明で使用しつる界面活性剤はアルギン酸リアー
ゼに対し非阻害的であり、不安定化しないものであれば
よく、例えば非イオン界面活性剤（例えばポリオキシエ
チレンアルキルエーテル、アルキルフェノール系、ポリ
オキシエチレンモノラウレート等のエステル系のもの）
、アニオン界面活性剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム
、ドデシルベンゼンスルホ゛ン酸ナトリウム、アル中ル
ナフタレンヌルホン酸ナトリウム等）、カチオン界面活
性剤（サニゾール、ラウリルベタイン、ラウリルジメチ
ルアミノキサイド等）を使用できる。

本発明を実施するに当って使用するアルギン酸リアーゼ
の量は、通常０．０５〜１０単位／ｄ１好ましくは約１
単位／　ｍｌにて実施するのが反応性および経済性の面
から好ましい。また本発明アルカリ土類金属キレート能
物質は種々のものを使用出来るが、アルギン酸リアーゼ
との特に有利な併用効果を持たせるためには、クエン酸
塩が好ましく、そのクエン酸塩の濃度は、分解すべきア
ルギン酸金屈塩ユ（モル濃度）に対して等モル以上のク
エン酸塩濃度を、好ましくは１．６倍以上のモル濃度使
用するのが好ましい。

界面活性剤の使用濃度としては０．０２〜０．１％（ｗ
／ｖ）、好ましくは０．０５〜０．１％（、ｗ／ｖ　）
がよい。

本発明方法を実施する場合、ｐＨは使用するアルギン酸
リアーゼの至適ｐＨを使用する。例えば前述したキサン
トモナス属の微生物より採取したアルギン酸リアーゼの
場合、ｐＨ５，５〜７．０、好ましくは５．８〜６．５
に調整すれば良い、ただし、分解すべきアルギン酸およ
び／またはその塩と共に金属が存在もしくは含まれてい
るものに対して作用させるときには、その腐蝕を避ける
ため、ＨＣＡ’等の使用は避けるべきである。

本発明方法を実施するに当って、公知の酵素安定剤、例
えばソルビトール、グリセリン、ポリエチレングリコー
ル等の多価アルコール、ゼラチン、牛血清アルブミン等
の蛋白質、乳糖、澱粉、デキス）　ＩＪン等の糖類を併
用してもよい。

またＭ９”　＋　Ｍｎ＋“等の金属イオンを安定化剤と
して添加してもよい。

〔作用〕

本発明により、理論的には不明であるがアルギン酸リア
ーゼと共に、アルカリ土類金属および／または界面活性
剤を使用すると、従来のアルギン酸リアーゼ単独使用の
場合に比して、アルギン酸およびその塩の分解反応速度
が大となり、更に他の共存する材料を腐蝕等により損う
ことがない。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例　１ ２％（Ｗ／Ｖ　）アルギン酸ナトリウム水溶液に綿布（
５ｃＩＩＬ×５ｃｌＩＬ）を浸漬、脱水、乾燥して糊づ
けした。この布の糊抜反応を、５０℃にて下表１に示す
組成物を三角フラスコ（２００Ｍ容）にｉｏｏｍｊ投入
し、これに上記面を入れて振盪（１１０回／分）条件下
、実施した。除去出来たか否かの判定は、上記の処理布
を表１に示す各時間後とり出し、濾紙にて脱水後、４０
℃、ｌＱｍＪの水中に１夜放置後の１９０ｎｍの吸光度
が０．０２以下の時除去が行なえたとして、糊抜に要し
た時間を求めた。

表　　　１ 鶏例　２ 歯科用印象剤ブロック（２，５Ｘ　２．５　Ｘ　２．５
の１９．５ｇ）を、ｐＨ６，３に調整したアルカリ土類
金属キレート能物質および／または界面活性剤を含むア
ルギン酸リアーゼ水溶液にて３０℃、２０時間、静置反
応させた。溶は残ったブロックの重さを天秤にて測定し
、下記式により溶解した印象剤ブロックの割合（溶解重
層）にてその効果を判定した。ただし、ｐＨ調整はＮａ
ＨｔＰＯａ水溶液にて実施した。その結果を表２に示す
。

上記表２のデータから、アルギン酸リアーゼを、アルカ
リ土類金、ｑキレート能物質および／または界面活性剤
と併用することによりアルギン酸およびその塩類の溶解
率がすぐれていることが判る。

〔発明の効果〕

アルギン酸またはその塩類を分解する時、アルギン酸リ
アーゼとアルカリ土類余病キレート能物質および／また
は界面活性剤を併用することにより、従来の分解剤に比
較して器材の腐蝕をおこさないばかりでなく、アルギン
酸またはその塩類を分解する時、分解力の大幅な増強、
効率化が可能になった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法で得られたアルギン酸リアーゼの
各ｐＨにおける活性を表わすグラフであり、第２図は各
ｐ）Ｉにおける３０℃、１時間処理によるｐＨ安定性を
表わすグラフであり、第３図は各温度における活性を表
わすグラフであり、第４図は各温度における１０分間処
理による熱安定性を示すグラフである。 同　　　　　　安　　　達　　　　　　　智１−７．］
１゜１゜ 第１図 ５．５　６．０　６５　７．Ｏ Ｈ 第２図 第３図 第４図 １五ＥＬ　ｒ−ノ 手続補正書（自発） ｉ君ｆ１１６１年９月１２日 ２、発明の名称 アルギン酸またはその塩類を分解する方法３、補正をす
る者 事件との関係　　特許出願人 Ｎへ槍旭、 フリガナ 覧＼名称　ナガセ生化学工業株式会社 ４、代理人 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）明細書第５頁第１行〜第２行［アルカリ金？ｊＥ
　Ｊを「アルカリ土類金属」と訂正する。 （２）同第１４真下より第４行「また本発明」を「また
本発明において」と訂正する。 （３）同第２０頁第８行「本発明の方法で得られた」を
「キサントモナス・エスピーＮ−２６よす得られた」と
訂正する。 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、アルギン酸またはその塩類をアルギン酸リアーゼの
   作用により分解するに当り、アルカリ土類金属キレート
   能物質および／または界面活性剤の存在下に行なうこと
   を特徴とするアルギン酸またはその塩類を分解する方法
   。