JP2838005B2 - 新規なγ−ポリグルタミン酸分解酵素 - Google Patents
新規なγ−ポリグルタミン酸分解酵素Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はミロセシウム属に属する
不完全菌により生産される新規なγ−ポリグルタミン酸
分解酵素およびその製造法に関する。
不完全菌により生産される新規なγ−ポリグルタミン酸
分解酵素およびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】α結合
のポリグルタミン酸は、従来人工皮革の材料等として利
用されてきている。γ−ポリグルタミン酸は納豆粘質物
の成分として古くから知られている。近年、これを新し
い素材として見直し、培養法によって大量に生産する試
みが各所においてなされている。本発明者らも、バチル
ス属に属する細菌を用い、γ−ポリグルタミン酸を安価
に、大量に生産する方法を発明している（特開平１−１
７４３９７）。
のポリグルタミン酸は、従来人工皮革の材料等として利
用されてきている。γ−ポリグルタミン酸は納豆粘質物
の成分として古くから知られている。近年、これを新し
い素材として見直し、培養法によって大量に生産する試
みが各所においてなされている。本発明者らも、バチル
ス属に属する細菌を用い、γ−ポリグルタミン酸を安価
に、大量に生産する方法を発明している（特開平１−１
７４３９７）。
【０００３】バチルス属に属する細菌を用い生産される
γ−ポリグルタミン酸は分子量１００万以上であり、粘
性付加剤としては有効であるが、その他の用途にはその
高粘性がかえって障害となっている。γ−ポリグルタミ
ン酸の低分子化酵素に関しては、ミクロモノスポラ・メ
ラノスポレマＩＦＯ１２５１５の生産するポリグルタミ
ン酸ヒドロラーゼ（Ｔ．Ｍｕｒｏら．Ａｇｒ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５４（４），１０６５（１９９０））
やγ−グルタミルトランスペプチダーゼがあるが、前者
はα−ポリグルタミン酸を基質とし、後者はγ−ポリグ
ルタミン酸を基質とする。
γ−ポリグルタミン酸は分子量１００万以上であり、粘
性付加剤としては有効であるが、その他の用途にはその
高粘性がかえって障害となっている。γ−ポリグルタミ
ン酸の低分子化酵素に関しては、ミクロモノスポラ・メ
ラノスポレマＩＦＯ１２５１５の生産するポリグルタミ
ン酸ヒドロラーゼ（Ｔ．Ｍｕｒｏら．Ａｇｒ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，５４（４），１０６５（１９９０））
やγ−グルタミルトランスペプチダーゼがあるが、前者
はα−ポリグルタミン酸を基質とし、後者はγ−ポリグ
ルタミン酸を基質とする。
【０００４】いずれも末端のグルタミン酸を順次切断
し、グルタミン酸として遊離するエキソ型の酵素であ
り、γ−ポリグルタミン酸を内部から切断する酵素につ
いては未だ報告されていない。従ってγ−ポリグルタミ
ン酸を内部より切断し、γ−ポリグルタミン酸を低分子
化する酵素の開発が望まれていた。
し、グルタミン酸として遊離するエキソ型の酵素であ
り、γ−ポリグルタミン酸を内部から切断する酵素につ
いては未だ報告されていない。従ってγ−ポリグルタミ
ン酸を内部より切断し、γ−ポリグルタミン酸を低分子
化する酵素の開発が望まれていた。
【０００５】又、培養法によって得られるγ−ポリグル
タミン酸はＬ−グルタミン酸を主構成とするホモペプチ
ドすなわちＬ−ポリグルタミン酸と、Ｄ−グルタミン酸
を主構成成分とするＤ−ポリグルタミン酸との混合物で
あろうと予想されている（村尾沢夫：高分子１６巻１８
８号 １２０４〜１２１２頁）。
タミン酸はＬ−グルタミン酸を主構成とするホモペプチ
ドすなわちＬ−ポリグルタミン酸と、Ｄ−グルタミン酸
を主構成成分とするＤ−ポリグルタミン酸との混合物で
あろうと予想されている（村尾沢夫：高分子１６巻１８
８号 １２０４〜１２１２頁）。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる課
題を解決するために、γ−ポリグルタミン酸分解酵素生
産能を有する微生物を広く自然界より探索した。その結
果、新たに土壌より分離された菌（ＴＭ−４２２２株）
が、γ−ポリグルタミン酸分解酵素を培養液中に生産す
ることを見いだした。又該酵素を利用することにより、
γ−Ｌ−オリゴグルタミン酸、γ−Ｄ−ポリグルタミン
酸が効率よく得られることを見いだし、本発明を完成し
た。
題を解決するために、γ−ポリグルタミン酸分解酵素生
産能を有する微生物を広く自然界より探索した。その結
果、新たに土壌より分離された菌（ＴＭ−４２２２株）
が、γ−ポリグルタミン酸分解酵素を培養液中に生産す
ることを見いだした。又該酵素を利用することにより、
γ−Ｌ−オリゴグルタミン酸、γ−Ｄ−ポリグルタミン
酸が効率よく得られることを見いだし、本発明を完成し
た。
【０００７】本発明において用いられる菌株であるＴＭ
−４２２２株の菌学的性状は以下の通りである。 （生育の特徴）２５℃、２週間の培養で、ポテト・デキ
ストロース寒天培地上で、３５〜４０ｍｍ、オートミー
ル寒天培地上で５０〜６０ｍｍ、麦芽エキス寒天培地上
で２５〜３０ｍｍ、ツァペックドックス寒天培地上で３
５〜４０ｍｍの大きさのコロニーとなった。どの培地の
培養においても、白色のビロード〜羊毛状の基底菌糸上
にオリーブ色の分生子を粘塊上に形成した。麦芽エキス
寒天培地、ツァペックドックス寒天培地上では、部分的
に白色、綿毛状の気菌糸におおわれることがある。裏面
は、どの培地においても淡黄色であった。３７℃では生
育しなかった。
−４２２２株の菌学的性状は以下の通りである。 （生育の特徴）２５℃、２週間の培養で、ポテト・デキ
ストロース寒天培地上で、３５〜４０ｍｍ、オートミー
ル寒天培地上で５０〜６０ｍｍ、麦芽エキス寒天培地上
で２５〜３０ｍｍ、ツァペックドックス寒天培地上で３
５〜４０ｍｍの大きさのコロニーとなった。どの培地の
培養においても、白色のビロード〜羊毛状の基底菌糸上
にオリーブ色の分生子を粘塊上に形成した。麦芽エキス
寒天培地、ツァペックドックス寒天培地上では、部分的
に白色、綿毛状の気菌糸におおわれることがある。裏面
は、どの培地においても淡黄色であった。３７℃では生
育しなかった。
【０００８】（形態の特徴）菌糸は、無色、滑面で隔壁
がある。分生子は、フィアロ型分生子で形は円筒形〜楕
円形である。大きさは、６〜７×２〜３μｍであった。
フィアライドは、２〜５本が輪生し、円柱形で先端に向
かい幾分細まる。無色で大きさは、１０〜１５×２〜
２．５μｍであった。
がある。分生子は、フィアロ型分生子で形は円筒形〜楕
円形である。大きさは、６〜７×２〜３μｍであった。
フィアライドは、２〜５本が輪生し、円柱形で先端に向
かい幾分細まる。無色で大きさは、１０〜１５×２〜
２．５μｍであった。
【０００９】以上の菌学的性状に従い、菌学図鑑（１９
７８，講談社サイエンティフィック）により検索したと
ころ、ＴＭ−４２２２株は、不完全糸状菌網ミロセシウ
ム属（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｓｐ．）に属する一株
と同定した。本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所
にＦＥＲＭ ＢＰ−４１６１として寄託されている。次
に本菌株より生産されるγ−ポリグルタミン分解酵素の
酵素学的および理化学的性質について記述する。
７８，講談社サイエンティフィック）により検索したと
ころ、ＴＭ−４２２２株は、不完全糸状菌網ミロセシウ
ム属（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｓｐ．）に属する一株
と同定した。本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所
にＦＥＲＭ ＢＰ−４１６１として寄託されている。次
に本菌株より生産されるγ−ポリグルタミン分解酵素の
酵素学的および理化学的性質について記述する。
【００１０】１．作用：γ−ポリ−Ｌ−グルタミン酸に
作用し、エンド型に特異的に加水分解し、γ結合のオリ
ゴ−Ｌ−グルタミン酸（２〜４個のγ−グルタミン酸が
結合したもの）を遊離する。 ２．基質特異性：γ結合のポリ−Ｌ−グルタミン酸を分
解し、オリゴ−Ｌ−グルタミン酸を遊離するが、α結合
のポリグルタミン酸には作用しない。又、γ結合のグル
タミルグルタミン酸、グルタチオンやγ−グルタミルト
ランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）の合成基質であるγ
−グルタミルナフチルアミドを全く分解しない。従って
エンド型である。
作用し、エンド型に特異的に加水分解し、γ結合のオリ
ゴ−Ｌ−グルタミン酸（２〜４個のγ−グルタミン酸が
結合したもの）を遊離する。 ２．基質特異性：γ結合のポリ−Ｌ−グルタミン酸を分
解し、オリゴ−Ｌ−グルタミン酸を遊離するが、α結合
のポリグルタミン酸には作用しない。又、γ結合のグル
タミルグルタミン酸、グルタチオンやγ−グルタミルト
ランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）の合成基質であるγ
−グルタミルナフチルアミドを全く分解しない。従って
エンド型である。
【００１１】３．至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨはｐＨ５．０であり、安定ｐＨ範囲は４．０〜
６．０ ４．反応至適温度および安定温度範囲 反応の至適温度は３７℃であり、ｐＨ５．０、１時間処
理した時、４０℃まで安定である。 ５．分子量 ゲル濾過法により測定した分子量は約６８，０００であ
る。
６．０ ４．反応至適温度および安定温度範囲 反応の至適温度は３７℃であり、ｐＨ５．０、１時間処
理した時、４０℃まで安定である。 ５．分子量 ゲル濾過法により測定した分子量は約６８，０００であ
る。
【００１２】６．γ−ポリグルタミン酸ヒドロラーゼの
活性測定 （１）粘度法 ２％γ−ポリグルタミン酸（ｐＨ５．
０）４ｍｌ、０．４Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）２ｍｌ
及び酵素液２ｍｌよりなる反応液をオストワルド粘度計
に注入し、３７℃で３０分間反応させた。本条件下でγ
−ポリグルタミン酸に由来する粘度を１分間に１秒低下
させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。なお、本条件で、
０．０５Ｕ〜０．３３Ｕの範囲で酵素量と粘度低下との
間に比例関係がみられた。
活性測定 （１）粘度法 ２％γ−ポリグルタミン酸（ｐＨ５．
０）４ｍｌ、０．４Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）２ｍｌ
及び酵素液２ｍｌよりなる反応液をオストワルド粘度計
に注入し、３７℃で３０分間反応させた。本条件下でγ
−ポリグルタミン酸に由来する粘度を１分間に１秒低下
させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。なお、本条件で、
０．０５Ｕ〜０．３３Ｕの範囲で酵素量と粘度低下との
間に比例関係がみられた。
【００１３】（２）ニンヒドリン法 上記と同組成
（ただし全容を１ｍｌとしたもの）の反応液を同じく３
７℃で３０分間反応させ、ニンヒドリン発色用メチルセ
ロソルブ溶液１．２ｍｌの添加によって反応を停止し
た。ついで、ニンヒドリン法により遊離アミノ基量の測
定を行った。本条件下で、１分間に１μモルのＬ−グル
タミン酸相当の遊離アミノ基を生成する酵素量を１Ｕと
した。なお、この条件下で、０．００４Ｕ〜０．０３３
Ｕの範囲で活性測定が可能であった。
（ただし全容を１ｍｌとしたもの）の反応液を同じく３
７℃で３０分間反応させ、ニンヒドリン発色用メチルセ
ロソルブ溶液１．２ｍｌの添加によって反応を停止し
た。ついで、ニンヒドリン法により遊離アミノ基量の測
定を行った。本条件下で、１分間に１μモルのＬ−グル
タミン酸相当の遊離アミノ基を生成する酵素量を１Ｕと
した。なお、この条件下で、０．００４Ｕ〜０．０３３
Ｕの範囲で活性測定が可能であった。
【００１４】現在あるγ−ポリグルタミン酸はＤ−体の
ポリマーとＬ−体のポリマーの混合物なので、この酵素
を作用させることによりＬ−体のポリマーは分解され、
Ｌ−グルタミン酸のオリゴマー（２〜３個のＬ−Ｇｌｕ
がγ結合したもの）が得られる。又、Ｄ−体のポリマー
は分解されずに残る。
ポリマーとＬ−体のポリマーの混合物なので、この酵素
を作用させることによりＬ−体のポリマーは分解され、
Ｌ−グルタミン酸のオリゴマー（２〜３個のＬ−Ｇｌｕ
がγ結合したもの）が得られる。又、Ｄ−体のポリマー
は分解されずに残る。
【００１５】利用法としては、 （１）Ｄ−グルタミン酸のポリマーは、γ−ポリグルタ
ミン酸とは異なる粘性特性をもつので、食品用途、新素
材用途として期待できる。 （２）Ｄ−ポリマーを化学分解すると、Ｄ−グルタミン
酸が得られる。Ｄ−グルタミン酸は、Ｌ−グルタミン酸
に比べ非常に高価であり、試薬として利用できる。 （３）分解されたＬ−Ｇｌｕオリゴマーは哺乳類の脳内
に存在することが知られており、中枢神経系に対する生
理作用を有することが期待できる。
ミン酸とは異なる粘性特性をもつので、食品用途、新素
材用途として期待できる。 （２）Ｄ−ポリマーを化学分解すると、Ｄ−グルタミン
酸が得られる。Ｄ−グルタミン酸は、Ｌ−グルタミン酸
に比べ非常に高価であり、試薬として利用できる。 （３）分解されたＬ−Ｇｌｕオリゴマーは哺乳類の脳内
に存在することが知られており、中枢神経系に対する生
理作用を有することが期待できる。
【００１６】
実施例１ （１）０．５％ イーストエキスを含むＣｚａｐｅｋ−
Ｄｏｘ改変培地（ただし、γ−ポリグルタミン酸を含ま
ない）を用い、ジャーファメンターにてミロテシウムｓ
ｐ．ＴＭ−４２２２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１６１）２
５℃、７日間培養した。なお、培養にあたって、炭素源
としてグリセロール、ポテトスターチ、デキストリンの
効果、また窒素源としてポリペプトン、カゼイン、カザ
ミノ酸を用いても同様の効果が得られた。また、γ−ポ
リグルタミン酸による酵素の誘導生成も見られた。
Ｄｏｘ改変培地（ただし、γ−ポリグルタミン酸を含ま
ない）を用い、ジャーファメンターにてミロテシウムｓ
ｐ．ＴＭ−４２２２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１６１）２
５℃、７日間培養した。なお、培養にあたって、炭素源
としてグリセロール、ポテトスターチ、デキストリンの
効果、また窒素源としてポリペプトン、カゼイン、カザ
ミノ酸を用いても同様の効果が得られた。また、γ−ポ
リグルタミン酸による酵素の誘導生成も見られた。
【００１７】（２）培養濾液（２Ｌ）のｐＨを酢酸にて
４．０とし、これをあらかじめ０．０５Ｍ酢酸緩衝液、
ｐＨ４．０にて平衡化したＢｉｏ−Ｒｅｘ７０（バイオ
ラド社製）のカラム（４．４×１８ｃｍ）に負荷した。
カラムを同緩衝液で十分洗浄したのち、０．０５Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ４．０）４００ｍｌ及び１．０Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ６．０）４００ｍｌよりなる濃度勾配によって
溶出し、さらに後者のみによる溶出をおこなった。
４．０とし、これをあらかじめ０．０５Ｍ酢酸緩衝液、
ｐＨ４．０にて平衡化したＢｉｏ−Ｒｅｘ７０（バイオ
ラド社製）のカラム（４．４×１８ｃｍ）に負荷した。
カラムを同緩衝液で十分洗浄したのち、０．０５Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ４．０）４００ｍｌ及び１．０Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ６．０）４００ｍｌよりなる濃度勾配によって
溶出し、さらに後者のみによる溶出をおこなった。
【００１８】溶出液は１０ｍｌずつのフラクションにと
った。なお、これ以降のクロマトグラフィー操作におけ
る蛋白質の溶出パターンは２８０ｎｍにおける吸収にも
とずいて測定し、γ−ポリグルタミン酸ヒドロラーゼの
溶出パターンはニンヒドリン法による活性測定法に基づ
いて求めた。γ−ポリグルタミン酸ヒドロラーゼ活性は
濃度勾配が終了して以降、１．０Ｍの緩衝液にきりかえ
た後の画分、すなわち、フラクションＮｏ．１２５〜１
６０に回収された。
った。なお、これ以降のクロマトグラフィー操作におけ
る蛋白質の溶出パターンは２８０ｎｍにおける吸収にも
とずいて測定し、γ−ポリグルタミン酸ヒドロラーゼの
溶出パターンはニンヒドリン法による活性測定法に基づ
いて求めた。γ−ポリグルタミン酸ヒドロラーゼ活性は
濃度勾配が終了して以降、１．０Ｍの緩衝液にきりかえ
た後の画分、すなわち、フラクションＮｏ．１２５〜１
６０に回収された。
【００１９】（３）活性画分を集め０．０５Ｍ酢酸緩衝
液、ｐＨ５．０に対し透析したのち、同緩衝液で緩衝化
したＡＦ−ブルートヨパール（東ソー製）のカラム
（２．２×５．０ｃｍ）に負荷した。同緩衝液でカラム
を洗浄し、非吸着成分を除去したのち０．２Ｍの食塩を
含む同緩衝液にて酵素を溶出した。
液、ｐＨ５．０に対し透析したのち、同緩衝液で緩衝化
したＡＦ−ブルートヨパール（東ソー製）のカラム
（２．２×５．０ｃｍ）に負荷した。同緩衝液でカラム
を洗浄し、非吸着成分を除去したのち０．２Ｍの食塩を
含む同緩衝液にて酵素を溶出した。
【００２０】（４）γ−ポリグルタミン酸セファロース
４Ｂカラムによるアフィニティークロマトグラフィー 以下の方法によってカラムを調整した。ＥＡＨ−セファ
ロース４Ｂ（シグマ社製）５ｍｌをガラスフィルター上
で、沈降ゲル１ｍｌに対して８０ｍｌの０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ溶液で洗浄する。Ｌ−グルタミン酸換算で０．５ｍ
モルのγ−ポリグルタミン酸を１０ｍｌの蒸留水に溶解
し、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整する。５０ｍｇ
の１−エチル−３−（３−ジエチルアミノプロピル）カ
ルボジイミドを５ｍｌの蒸留水に溶解し、ｐＨを１Ｎ
ＮａＯＨにて４．５とする。洗浄したゲル５ｍｌ、リガ
ンド溶液１０ｍｌ及びカルボジイミド溶液５ｍｌを混合
し、室温で一夜軽く振とうし、カップリングさせた。
４Ｂカラムによるアフィニティークロマトグラフィー 以下の方法によってカラムを調整した。ＥＡＨ−セファ
ロース４Ｂ（シグマ社製）５ｍｌをガラスフィルター上
で、沈降ゲル１ｍｌに対して８０ｍｌの０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ溶液で洗浄する。Ｌ−グルタミン酸換算で０．５ｍ
モルのγ−ポリグルタミン酸を１０ｍｌの蒸留水に溶解
し、１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ４．５に調整する。５０ｍｇ
の１−エチル−３−（３−ジエチルアミノプロピル）カ
ルボジイミドを５ｍｌの蒸留水に溶解し、ｐＨを１Ｎ
ＮａＯＨにて４．５とする。洗浄したゲル５ｍｌ、リガ
ンド溶液１０ｍｌ及びカルボジイミド溶液５ｍｌを混合
し、室温で一夜軽く振とうし、カップリングさせた。
【００２１】実施例１（３）により得られた活性画分を
０．０５Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０に対して透析したの
ち、γ−ポリグルタミン酸セファロース４Ｂのカラム
（１．８×５．０ｃｍ）に負荷した。カラムを同緩衝液
で洗浄後、同緩衝液１００ｍｌ及び０．０５Ｍ酢酸緩衝
液、ｐＨ６．０、１００ｍｌによってつくるｐＨ勾配に
よって酵素を溶出し、さらに後者の緩衝液のみによって
カラムを洗浄した。
０．０５Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０に対して透析したの
ち、γ−ポリグルタミン酸セファロース４Ｂのカラム
（１．８×５．０ｃｍ）に負荷した。カラムを同緩衝液
で洗浄後、同緩衝液１００ｍｌ及び０．０５Ｍ酢酸緩衝
液、ｐＨ６．０、１００ｍｌによってつくるｐＨ勾配に
よって酵素を溶出し、さらに後者の緩衝液のみによって
カラムを洗浄した。
【００２２】この操作で大部分の蛋白質成分は素通り画
分に得られ、活性画分は、ｐＨ勾配の終点以後にシング
ルピークとして得られた。活性画分の前半には不純蛋白
が認められたので、２８０ｎｍの吸収がほとんど認めら
れない後半部すなわちフラクションＮｏ８６〜９０まで
を集めた。
分に得られ、活性画分は、ｐＨ勾配の終点以後にシング
ルピークとして得られた。活性画分の前半には不純蛋白
が認められたので、２８０ｎｍの吸収がほとんど認めら
れない後半部すなわちフラクションＮｏ８６〜９０まで
を集めた。
【００２３】（５）活性画分を限外濾過によって濃縮
し、これをあらかじめ１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０
ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０で平衡化したセファクリル
Ｓ−３００（ファルマシア社製）のカラム（３．９×６
４．５ｃｍ）に通した。１０ｍｌずつのフラクションを
回収したところ、酵素活性はフラクションＮｏ４６〜５
０に得られた。なお、精製標品の比活性はニンヒドリン
法によっては３６２Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎと測定さ
れた。
し、これをあらかじめ１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０
ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０で平衡化したセファクリル
Ｓ−３００（ファルマシア社製）のカラム（３．９×６
４．５ｃｍ）に通した。１０ｍｌずつのフラクションを
回収したところ、酵素活性はフラクションＮｏ４６〜５
０に得られた。なお、精製標品の比活性はニンヒドリン
法によっては３６２Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎと測定さ
れた。
【００２４】実施例２ （１）１．０％のγ−ポリグルタミン酸（分子量１２４
万）を含む１００ｍＭ酢酸緩衝液１００ｍｌ（ｐＨ４．
５）に、γ−ポリグルタミン酸ヒドロラーゼ粗酵素粉末
０．５ｇを加え、３０℃の恒温水槽で１８時間インキュ
ベートし分解反応を行った。反応終了後、１０％トリク
ロル酢酸溶液１ｍｌを加え、生じた沈殿を吸引濾過で除
去後、分画分子量１０，０００の膜で限外濾過を行い、
Ｄ−体のポリマー画分と、Ｌ−体の低分子画分に分け
た。
万）を含む１００ｍＭ酢酸緩衝液１００ｍｌ（ｐＨ４．
５）に、γ−ポリグルタミン酸ヒドロラーゼ粗酵素粉末
０．５ｇを加え、３０℃の恒温水槽で１８時間インキュ
ベートし分解反応を行った。反応終了後、１０％トリク
ロル酢酸溶液１ｍｌを加え、生じた沈殿を吸引濾過で除
去後、分画分子量１０，０００の膜で限外濾過を行い、
Ｄ−体のポリマー画分と、Ｌ−体の低分子画分に分け
た。
【００２５】（２）Ｄ−体のポリマー画分は、上記の限
外濾過で十分に水洗し、低分子部分を除去した後に凍結
乾燥し、約２００ｍｇの白色粉末を得た。 （３）Ｌ−体低分子画分は、ダイヤイオンＵＢＫ−５２
０Ｇ（Ｈ+）カラム（２．５×２５ｃｍ）に負荷し、カ
ラムを脱イオン水で十分に洗浄した後に、０．１Ｎ Ｈ
Ｃｌにて溶出した。溶出液は水を加えながら減圧濃縮を
行い、ＨＣｌを除去し、約３００ｍｇの白色粉末を得
た。
外濾過で十分に水洗し、低分子部分を除去した後に凍結
乾燥し、約２００ｍｇの白色粉末を得た。 （３）Ｌ−体低分子画分は、ダイヤイオンＵＢＫ−５２
０Ｇ（Ｈ+）カラム（２．５×２５ｃｍ）に負荷し、カ
ラムを脱イオン水で十分に洗浄した後に、０．１Ｎ Ｈ
Ｃｌにて溶出した。溶出液は水を加えながら減圧濃縮を
行い、ＨＣｌを除去し、約３００ｍｇの白色粉末を得
た。
【００２６】（４）実施例２（２）で得た白色粉末はＧ
ＰＣ分析の結果、ピーク分子量約２０万であつた。ま
た、塩酸による加水分解により生じた遊離アミノ酸は光
学分割液体クロマトグラフィーの結果、Ｄ−グルタミン
酸であった。 （５）実施例２（４）で得た粉末はアミノ酸分析及び塩
酸による加水分解の光学分割液体クロマトグラフィーの
結果、Ｌ−グルタミン酸の２〜４量体の混合物であっ
た。
ＰＣ分析の結果、ピーク分子量約２０万であつた。ま
た、塩酸による加水分解により生じた遊離アミノ酸は光
学分割液体クロマトグラフィーの結果、Ｄ−グルタミン
酸であった。 （５）実施例２（４）で得た粉末はアミノ酸分析及び塩
酸による加水分解の光学分割液体クロマトグラフィーの
結果、Ｌ−グルタミン酸の２〜４量体の混合物であっ
た。
【００２７】
【発明の効果】本願発明にかかわるγ−ポリグルタミン
酸ヒドロラーゼはγ−ポリグルタミン酸よりグルタミン
酸を全く生成することなく、その粘度を急激に低下させ
ることができ、オリゴ−Ｌ−グルタミン酸やポリ−Ｌ−
グルタミン酸を生成する。この性質によりγ−ポリグル
タミン酸の新しい用途が開発されることが期待される。
酸ヒドロラーゼはγ−ポリグルタミン酸よりグルタミン
酸を全く生成することなく、その粘度を急激に低下させ
ることができ、オリゴ−Ｌ−グルタミン酸やポリ−Ｌ−
グルタミン酸を生成する。この性質によりγ−ポリグル
タミン酸の新しい用途が開発されることが期待される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平７−179891（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−174397（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】次の理化学的性状を示す新規なγ−ポリグ
ルタミン酸分解酵素。 １．作用：γ−ポリ−Ｌ−グルタミン酸に作用し、エン
ド型に特異的に加水分解し、γ結合のオリゴ−Ｌ−グル
タミン酸を遊離する。 ２．基質特異性：γ結合のポリ−Ｌ−グルタミン酸を分
解し、オリゴ−Ｌ−グルタミン酸を遊離するが、α結合
のポリグルタミン酸には作用しない。又、γ結合のグル
タミルグルタミン酸、グルタチオンやγ−グルタミルト
ランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）の合成基質であるγ
−グルタミルナフチルアミドを全く分解しない。 ３．至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨはｐＨ５．０であり、安定ｐＨ範囲は４．０〜
６．０ ４．反応至適温度および安定温度範囲 反応の至適温度は３７℃であり、ｐＨ５．０、１時間処
理した時、４０℃まで安定である。 ５．分子量 ゲル濾過法により測定した分子量は約６８，０００であ
る。 - 【請求項２】ミロセシウム属に属する微生物を培養し、
培養物より請求項１記載の酵素を採取することを特徴と
するγ−ポリグルタミン酸分解酵素の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/025,344 US5356805A (en) | 1992-03-03 | 1993-03-03 | Gamma-polyglutamate hydrolase |
| ES93103397T ES2135423T3 (es) | 1992-03-03 | 1993-03-03 | Gamma-poliglutamato-hidrolasa y procedimiento de produccion de esta. |
| EP93103397A EP0559175B1 (en) | 1992-03-03 | 1993-03-03 | gamma-Polyglutamate hydrolase and process for producing same |
| DE69325602T DE69325602T2 (de) | 1992-03-03 | 1993-03-03 | Gamma-Polyglutaminsäure-Hydrolase und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4551792 | 1992-03-03 | ||
| JP4-45517 | 1992-03-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05304958A JPH05304958A (ja) | 1993-11-19 |
| JP2838005B2 true JP2838005B2 (ja) | 1998-12-16 |
Family
ID=12721610
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5009665A Expired - Fee Related JP2838005B2 (ja) | 1992-03-03 | 1993-01-25 | 新規なγ−ポリグルタミン酸分解酵素 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2838005B2 (ja) |
| KR (1) | KR100262381B1 (ja) |
-
1993
- 1993-01-25 JP JP5009665A patent/JP2838005B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-03-03 KR KR1019930003115A patent/KR100262381B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05304958A (ja) | 1993-11-19 |
| KR100262381B1 (ko) | 2000-08-01 |
| KR930019824A (ko) | 1993-10-19 |
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