KR100262381B1 - 감마-폴리글루타메이트 가수분해 효소(감마-polyglutamatehydrolase) 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

미로세슘속(genus Myrothecium)에 속하는 미생물에 의해 생산된 효소가 세포내작용으로 γ-폴리글루타민산을 가수분해시켜 2~4개의 글루타민산 잔류물로 구성되는 올리고 글루타민산을 제조한다.

Description

γ-폴리글루타메이트 가수분해효소(γ-polyglutamate hydrolase) 및 그 제조방법

이 발명은 불완전군류(Fungi Imperfecti)의 미로세슘(Myrothecium)속에 속하는 미생물에 의해 생산된 새로운 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소와 그 효소의 제조방법에 관한 것이다.

γ-폴리글루타민산은 인조가죽등의 재료에 사용되었으며 γ-폴리글루타민산은 삶은 콩을 발효시킨 일본식품인, 낫토(natto)(納豆)의 점조성재 구성성분으로 공지되었다.

최근에는 대규모의 배양에 의해 새로운 재료로서 γ-폴리글루타민산은 경제적인 생산방법을 시도하였다.

이 발명의 발명자들은 바실루스속(genus Bacillus)에 속하는 균(일본국 공개특허공보 일특개 평 1-174398 참조)을 사용하여 대규모로 γ-폴리글루타민산을 경제적으로 제조하는 방법을 개발하였다.

이 바실루스속에 속하는 균을 배양하여 생산한 γ-폴리글루타민산은 분자량이 1,000,000이상이다.

이것은 점도-첨가재로서 유용하나 점도가 너무 높기 때문에 다른 용도로서 적용할 수 없다.

미크로모노스포라 멜라노스포리아(Micromonospora melanosporea)IFO 12515(T. Muro등, Agr, Biol. Chem, 54(4), 1065, 1990)에 의해 생산된 폴리글루타메이트 가수분해효소와 γ-글루타밀 트랜스펩티다아제(γ-glutamyltranspeptidas e)는 γ-글루타민산의 분자량을 감소하는 효소로서 공지되었다.

그 전자효소(former enzyme)의 기질은 α-폴리글루타민산이며, 후자 효소의 기질은 γ-폴리글루타민산이다.

두 효소는 그 폴리글루타민산 사슬(chain)말단에서 연속적으로 글루타민산을 분리 및 유리시킴으로써 세포외 작용효소(exo-acting enzyme)로서 작용한다.

현재까지, γ-폴리글루타민산은 가수분해시키는 세포내작용효소(endo-acting enzyme)는 공지된 바 없다.

따라서, 이 발명은 세포내작용(endo action)으로 γ-폴리글루타민산을 가수분해시킴으로써 그 γ-폴리글루타민산의 분자량을 감소시킬 수 있는 효소를 개발하는데 있다.

발효에 의해 생산된 γ-폴리글루타민산은 L-글루타민산, 즉 폴리-L-글루타민산으로 구성된 효모펩티드와, D-글루타민산, 즉 폴리-D-글루타민산으로 구성된 효모펩티드의 혼합물이라는 연구보고가 있다(S. Murao, Kohbunshi, 16(188), 1204-1212, 1969).

위와 같은 문제를 극복하기 위하여, 이 발명의 발명자들은 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소를 생산할 수 있는 여러 가지의 자연발생원(natural sources)에서 미생물의 선별에 관한 집중적인 연구를 행하였다.

그 결과, 이 발명의 발명자들은 토양시료(soil sample)에서 분리시킨 미생물균주(TM-4222주)가 배지에서 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소(γ-polyglutamate hydrolase)를 제조할 수 있다는 것을 확인하였다.

또, γ-올리고-L-글루타민산과 γ-폴리-D-글루타민산은 이 효소를 사용하여 효율있게 제조할 수 있다는 것을 확인하였다.

따라서, 이 발명의 목적은 세포내작용으로 γ-폴리-L-글루타민산을 특별히 가수분해시키는 새로운 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소를 생산하는데 있다.

이 발명의 또 다른 목적은 미로세슘속(genus myrothecium)에 속하는 미생물을 배양하여 그 효소를 그 얻어진 배양물에서 회수하는 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

이발명에서 사용되는 균쥬 TM-4222의 균학적 특성은 다음과 같다.

[생육특성]

2주간 25℃에서 배양할 때 그 균주는 감자-덱스트로오스 한천배지에서 직경 25~40mm, 오우트밀 한천배에서 직경 50~60mm, 맥아엑스 한천배지(malt extract agar medium)에서 직경 25~30mm, 또는 차펙-닥스(czapeck-Dox)한천배지에서 직경 35~40mm를 가진 콜로니(colony)를 생성한다.

위 배지에서 각각의 경우, 점조성있는 일군의 올리브색분생자(conidia)는 벨벳형상(velvet ) 또는 양모형상의 흰색기질 균사에서 생성된다.

맥아엑스와 차펙-닥스한천배지의 경우 그 생성된 콜로니는 흰색의 솜털형상의 기생균사(fluffy aerial mycelia)로 일부 싸여 있다.

그 콜로니의 배면은 그 배지의 모든 경우 담황색이다.

이 균주는 37℃에서 생육되지 않는다.

[형태학적 특성]

이 균사는 비염색질(무색)이며, 표면이 부드럽고 격벽(septa)를 가진다.

그분생자(conidium)는 하나의 피알로포자(phialospore)형이며, 각 피알로포자는 원통형상 내지 타원형상이고 크기가 6~7×2~3㎛이다.

2~5개의 피알리드(phialides)는 윤생형상(verticillate form)으로 생육되고 각 피알리드는 주상형상(columnar in shape)으로, 그 선단쪽 방향으로 약간 엷게 형성되어 있으며, 무색(비염색질)이고 크기가 10~15×2~2.5㎛이다.

균학도감(일본국 코단사과학 1978)에서 이들의 균학특성을 참조하여 보면 균주 TM-4222는 불완전균주(Fungi Imperfecti)강(class)의 미로세슘속 (myrotheciumsp.)에 속하는 균주로서 확인되었다.

이 균주는 일본국 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본국 이바라키겐 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-3)에 부다페스트조약에 따라 수탁번호 FERM BP-4161로서 기탁하였다.

이 균주에 의해 생산된 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소의 효소학적 특성과 생리화학적 특성을 아래에 설명한다.

1. 작용

이 효소는 세포내작용으로 γ-폴리-L-글루타민산을 특히 가수분해시켜 2~4개의 글루타민산 잔유물로 구성되는 γ-올리고-L-글루타민산을 유리시킨다.

2. 기질특이성

이 효소는 γ-폴리-L-글루타민산의 γ-결합을 가수분해시켜 올리고-L-글루타민산을 유리시키나, α-폴리글루타민산의 α-결합에 작용하지 않는다.

또, 글루타밀 글루타민산, 글루타티욘 및 γ-글루타밀 트랜스텝디다아제(γ-GTP)의 합성기질인 γ-글루타밀 나프틸아미드의 γ-결합을 가수분해하지 않는다.

3. 최적 PH와 안정성 있는 범위

이 효소는 최적 PH 5.0, 안정성 있는 PH범위 4.0~6.0을 가진다.

4. 최적 반응온도 및 안정성 있는 온도범위

최적반응 온도는 37℃이고, 1시간동안 PH 5.0에서 처리할 때 40℃이내에서 안정성이 있다.

5. 분자량

겔여과에 의해 측정한 분자량은 약 68,000이다.

6.γ-폴리글루타메이트 가수분해효소의 활성측정

(1)점도방법

2% γ-폴리글루타민산용액(PH 5.0) 4㎖와, 0.4M 아세테이트버퍼(PH 5.0) 2㎖와, 효소용액 2㎖로 조성된 반응혼합액을 오스트발트 점도계(Ostwald Viscometer)에 넣고 30분간 37℃에서 배양하였다.

그 활성의 단위(U)는 이들의 반응상태에서 1분에 대해서 1초의 비로 γ-폴리글루타민산의 점도를 감소시키는 효소의 양으로 정의하였다.

이 예에서 효소의 양은 이 반응상태하에서 0.05U~0.33U의 범위내에서의 점도감소에 비례하였다.

(2)닌히드린 반응방법

위에서 설명한 바와 같이 동일한 조성물을 가진 반응혼합액 1㎖를 30분간 37℃에서 배양하고 닌히드린 발생현상용의 메틸셀로솔브(β-히드록시에틸메틸에테르)용액 1.2㎖를 첨가시켜 반응을 정지시킨 다음 닌히드린 반응에 의해 유리아미노기의 양을 측정하였다.

그 활성 단위는 이와 같은 반응상태에서 1분에 대하여 1㎛mol L-글루타민산의 당량의 유리아미노기를 생성하는 효소의 양으로 정의한다.

이 예에서, 그 효소활성은 0.004U~0.033U의 범위내에서 측정할 수 있다.

합성 또는 자연배지는 탄소원, 질소원, 무기질물질을 포함하는 영양소와 기타영양소를 포함하면 이 발명에서 사용할 수 있다.

탄소원으로, 글루코오스, 수크로오스, 글리세롤, 키실로스, 프럭토오스, 말토오스, 당밀(molasses), 전분가수분해 생성물등이 유용하며, 질소원으로 니트레이트 및 암모늄염 등의 무기질물질과 펩톤, 폴리펩톤, 효모엑스(yeast extract), 콘스티프리큐어(옥수수침지액)(corn steep liquor) 및 카제인가수분해 생성물 등의 유기질물질이 유용하다.

무기질물질의 예로는 포타슘포스페이트, 마그네슘 설페이트, 망간, 철 등이 있다.

그 미생물의 배양은 호기성 상태에서 온도 20~40℃, 바람직하게는 25~30℃로 진탕 또는 호기교반(aerobic agitation)을 하면서 행한다.

그 배지는 소듐히드록시드, 포타슘히드록시드, 염산, 황산 등을 사용하여 PH 5~9, 바람직하게는 PH 6~8로 조절한다.

그 생성물 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소는 5~8일 배양에서 주로 세포밖 배양물에 축적된다.

이 발명의 효소를 D-형 폴리머와 L-형 폴리머의 혼합물인 시판용 γ-폴리글루타민산과 반응하도록 할 때 그 L-형 폴리머는 γ-결합으로 연결된 2~4개의 L-글루타민산 잔유물로 구성되는 L-글루타민산 올리고머로 분해된다.

반면에, 그 D-형 폴리머는 가수분해를 하지 아니하여 그대로 있게 된다.

그 효소반응은 온도 35~39℃에서 PH4~PH6의 수용액중에 이 발명의 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소와 γ-폴리글루타민산이 반응을 하도록 함으로써 실시할 수 있다.

그 기질로서 γ-폴리글루타민산은 그 효소를 기준으로 하여 과잉의 양을 사용한다.

그 반응생성물, γ-폴리-D-글루타민산과 γ-올리고-L-글루타민산을 회수시켜 암모늄설페이트의 침전, 투석(dialysis), DEAE-세파덱스(Spehdex)등을 사용하는 컬럼크로마토그라피, 친화성(affinity) 크로마토 그라피 등의 공지방법에 의해 그 반응 혼합물에 정제한다.

이와 같이 이 발명의 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소는 유리글루타민산을 유리시킴이 없이 신속하게 γ-폴리글루타민산의 점도를 감소시킬 수 있으며, γ-올리고-D-글루타민산과 γ-폴리-D-글루타민산을 제조할 수 있다.

이 발명의 효소는 다음 제조에 유용하다:

(1) γ-폴리글루타민산과 점도특성이 다르며 식품과 새로운 물질에 적용시킬 수 있는 D-글루타민산 폴리머,

(2) L-글루타민산과 비교하여 고가이고 시약으로 사용될 수 있는, D-형 폴리머의 화학적 가수분해에 의해 얻어진 D-글루타민산,

(3) 포유류 뇌에서 발견되고 그 중추신경계에 생리적 작용을 하는 L-글루타민산 올리고머.

이 발명을 더 설명하기 위하여 다음 실시예를 예시하나 이 발명의 범위를 한정시킨 것은 아니다.

[실시예 1]

(1) 미로세슘균주(Myrothecium sp.), TM-4222(FERM BP-4161)를, 0.5% 효모추출물(yeast extract)을 첨가시키나 γ-폴리글루타민산이 함유되지 아니한 변경시킨 차펙-닥스배지(Czapeck-Dox medium)(3.0% 수크로오스, 0.2% NaNO₃, 0.1% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O, 0.001% FeSO₄·7H₂O, PH 6.0)에 접종시켜 세포밀도(cell density) 20~50g/ℓ(건조기준)을 얻었으며, 자 발효장치(jar fermentor)에 의해 7일간 25℃에서 배양하여 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소를 제조하도록 하였다.

그 탄소원으로 글리세롤, 감자전분 또는 덱스트린을 사용하거나 그 질소원으로 폴리텝톤, 카제인 또는 아미노산을 사용할 때 동일한 생산성이 측정되었다.

또, γ-폴리글루타민산 0.5%를 그 배지에 첨가할 때 얻어진 효소활성은 γ-폴리글루타민산을 첨가하지 아니한 경우 그 효소활성의 1.5~2배 높았다.

(2) 위 (1)공정에서 얻어진 배양여액 2ℓ를 아세트산으로 조절하여 PH 4.0으로 하고, 미리 0.05M 아세테이트버퍼(PH 4.0)로 균형시킨 바이오-렉스 70(Bio-Rex70)(Bio-Red Laboratories, Inc. 사제품)으로 채운컬럼(Colulmn)4.4×18cm)에 가하였다.

그 컬럼을 동일한 버퍼로 충분히 세척시킨 다음 그 흡착시킨 효소는 0.05M 아세테이트버퍼(PH 4.0) 400㎖와 1.0M 아세테이트버퍼(PH 6.0) 400㎖를 사용하여 밀도경사용출(density gradient elution)에 의해 용출시킨 다음 후자버퍼를 사용하여 더 용출시켰다.

그 용출액(eluate)을 10㎖분액으로 회수하였다.

단백질의 용출패턴(Pattern)은 그 흡광도(absorbance)를 280nm에서 측정하여 제조하였으며 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소의 용출패턴은 닌히드린 반응법(이 검출법은 다음에 실시한 크로마토그라피공정에 적용하였다)에 의해 측정하였다.

그 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소활성은 그 밀도경사용출을 완료시킨 후 1.0M 아세테이트버퍼를 사용하여 용출시킨 분액 No. 125~160에서 확인되었다.

(3) 위 공정(2)에서 회수한 활성분액을 합쳐 0.05M 아세테이트버퍼(PH 5.0)로 투석시킨 다음 그 동일한 버퍼로 미리 평형을 시킨 AF-블루토요펄(blue Toyopearl)(Tosoh corp.)로 충전시킨 컬럼(2.2×5.0cm)에 가하였다.

그 컬럼을 동일한 버퍼로 세척시켜 비 흡착성분을 제거시킨 다음 0.2M 소듐클로리드를 더 첨가시켜 동일한 버퍼로 그 흡착효소를 용출시켰다.

(4) 친화성크로마토그라피는 γ-폴리글루타민산-결합세파로오스(coupled Sepharose)4B로 채운컬럼을 사용하여 실시한다.

그 γ-폴리글루타민산-결합세파로오스 4B는 다음 방법으로 제조하였다.

EAH-세파로오스 4B(Sigma Chemical Co.사제품) 5㎖를 글라스필터에 넣고 그 침강겔(sedimentation gel) 1㎖당 0.5M 소듐클로리드 80㎖로 세척하였다.

별도로, L-글루타민산 0.5mmol당량의 γ-폴리글루타민산을 증류수 10㎖에 용해시켜, 얻어진 용액을 1N소듐히드록시드를 사용하여 PH 4.5로 조절하였다.

1-에틸-3(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드 50mg을 더 증류수 5㎖에 용해시켜 그 얻어진 용액을, 1N소듐히드록시드를 사용하여 PH 4.5로 조절하였다.

이와 같이 하여 세척한 겔 5㎖, γ-폴리글루타민산(리간드:ligand) 용액 10m와 카르보디이미드용액 5㎖를 혼합하여 실온에서 하루밤동안 진탕시켜 커플링반응 (coupling reaction)을 시켰다.

위 (3)공정에서 얻어진 활성분액을 0.05M 아세테이트버퍼(PH 4.0)로 투석시킨 다음, 위에서 제조한 바와 같이 γ-폴리글루타민산-결합세파로오스 4B로 채운 컬럼(1.8×5.0cm)에 처리하였다.

동일한 버퍼로 그 컬럼을 세척시킨 다음, 그 흡착요소를, 동일한 버퍼 100㎖와 0.05M 아세테이프버퍼(PH 6.0) 100㎖를 사용하여 PH경사에 의해 용출시킨 다음 후자버퍼로 더 세척하였다.

대부분의 단백질성분은 완전통과처리한 분액에서 확인되었고 활성분액은 그 PH경사를 완료시킨 다음 단일 피크(simple peak)로서 얻었다.

분액 NO. 86~90을 합하였다.

첫 번째 반부분액에서는 단백질 불순물이 확인되었고 그 다음번째 반부분액에서는 280nm에서의 흡광도가 별로 검출되지 않았다.

(5) 이와 같이 하여 합친 활성분액을 한외여과(ultrafiltration)에 의해 농축시킨 다음, 150mM 소듐클로리드를 포함하는 50mM 아세테이트버퍼(PH 5.0)로 미리 평행시킨 세파크릴(Sephacryl) S-300(Pharmacia)으로 채운컬럼(3.9×64.5cm)에 통과시켰다.

그 용출액을 10㎖분액으로 회수시켰을 때 그 효소활성은 분액 No.46~50에서 확인되었다.

이와 같이 하여 정제한 효소의 고유활성은 닌히드린 반응방법에 의해 362U/mg단백질임이 확인되었다.

[실시예 2]

(1) 실시예 1에서와 같은 방법으로 하여 얻어진 배양상증액을 한외여과에 의해 탈염하고 냉동건조시켜 거친 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소를 얻었다.

이와 같이 하여 얻어진 효소분말 0.5g을, 바실루스섭틸리스(Bacillus subtills) F-2-01을 사용하여 특허문헌 JP-A-174397에 기재되어 있는 방법에 의해 제조한 γ-폴리글루타민산(분자량 1,240,000) 1.0%를 함유하는 100mM 아세테이트버퍼 (PH 4.5)100㎖에 첨가시켰다.

그 혼합물을 18시간 30℃에서 유지시킨 수욕조(water bath)에서 접종시켜 가수분해반응을 하였다.

그 반응이 완료된 다음, 10% 트리클로로아세트산용액 1㎖를 그 얻어진 반응 혼합물에 첨가시켰다.

이와 같이 하여 생성된 침전물은 흡인여과에 의해 제거하였다.

그 다음, 이와 같이 하여 얻어진 여액은 분자량 컷오프(Cut off) 10,000을 가진 막을 사용하여 한외여과하고 그 반응생성물을 D-형 폴리머함유분액과 L-형 폴리머의 저분자량 가수분해생성물을 함유한 또 다른 분액으로 분리하였다.

(2) D-형 폴리머분액을, 그 한외여과막을 사용하여 물로 충분히 세척시켜 저분자량의 불순물을 제거시킨 다음, 냉동건조하여 흰색분말액 200mg을 얻었다.

(3) 그 L-형의 저분자량분액을, 디아이온(DiaIon)UBX-520G(H⁺)(미쓰비시가세이(주)제품)로 채운컬럼(2.5×25cm)에 가하였다.

그 컬럼을 탈이온수(deionized water)로 충분히 세척시킨 다음, 그 흡착생성물을 0.1N염산으로 용출시켰다.

물을 첨가시키면서 감압하에 그 용출액을 농축시켜 염산을 제거하였다.

이와 같이 하여 흰색분말 약 300mg을 얻었다.

(4) 위 공정(2)에서 얻어진 D-형 폴리머분말을 GPC분석을 하여 피크분자량 약 200,000을 확인하였다.

또, 그 분말을 염산으로 가수분해시켜 얻어진 가수분해생성물을 광분해액 크로마토그라피에 의해 분석하였다.

그 결과 그 가수분해생성물은 D-글루타민산을 나타내었다.

(5) 위 공정(3)에서 얻어진 L-형 폴리머분말은 아미노산분석을 하여 염산으로 가수분해시킨 다음 광분해액 크로마토그라피로 분석하여 그 분말이 L-글루타민산의 디머(dimer)내지 테트라머(tetramer)의 혼합물임을 확인하였다.

Claims (6)

1. 다음의 이화학적 성상을 가지며, 미로세슘속(genus Myrothecium)에 속하는 미생물을 배양하여 그 배양물에서 채취하고, 그 미생물은 FERM BP-4161의 특성을 가진 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소.

   (1) 작용 : γ-폴리글루타민산을 엔도형 작용(endo action)으로 가수분해시켜 γ-올리고글루타민산을 유리한다.

   (2) 기질특이성 : γ-폴리글루타민산을 가수분해하며, 올리고글루타민산을 유리하나 α-폴리글루타민산에 작용하지 않으며, γ-글루타밀 글루타민산, 글루타티온 및 γ-글루타밀 트랜스펩티타아제(γ-GTP)의 합성기질인 γ-글루타밀 나프틸 아미드를 가수분해하지 않는다.

   (3) 가장 적합한 PH 및 안정성 있는 PH의 범위

   최적 PH는 5.0이고, 안정성 있는 PH의 범위는 4.0~6.0이다.

   (4) 가장 적합한 반응온도 및 안정성 있는 온도범위

   가장 적합한 반응온도는 37℃이고, PH 5.0에서 1시간 40℃까지 안정하다.

   (5) 분자량

   겔여과법에 의해 측정한 분자량은 약 68,000이다.
2. 미로세슘속(genus Myrothecium)에 속하는 미생물을 배양하여 그 얻어진 배양물에서 제1항의 효소를 채취함을 특징으로 하는 γ-폴리글루타메이트 가수분해 효소의 제조방법.
3. 제2항에 있어서, 그 미생물은 FERM BP-4161의 특성을 가짐을 특징으로 하는 γ-폴리글루타 메이트 가수분해효소의 제조방법.
4. 미로세슘속(genus Myrothecium)에 속하는 FERM BP-4161의 미생물.
5. γ-폴리-D-글루타민산의 제조방법에 있어서, γ-폴리-L-글루타민산과 γ-폴리-D-글루타민산으로 구성하는 γ-폴리글루타민산을 제1항의 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소와 작용시켜, 그 반응 혼합액에서 γ-폴리-D-글루타민산을 회수함을 특징으로 하는 γ-폴리-D-글루타민산의 제조방법.
6. γ-올리고-L-글루타민산의 제조방법에 있어서, γ-폴리-L-글루타민과 γ-폴리-D-글루타민산으로 구성되는 γ-폴리글루타민산을 제1항의 γ-폴리글루타메이트 가수분해효소와 작용시켜, 그 반응 혼합액에서 γ-올리고-L-글루타민산을 회수함을 특징으로 하는 γ-올리고-L-글루타민산의 제조방법.