JPH04311389A - 新規なチオールプロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なチオールプロテア
ーゼに関する。更に詳しくは、Ｌ−アスパラギン酸（Ａ
ｓｐ）とＬ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）間のペプチド
結合を特異的に加水分解して切断し、また前記加水分解
反応の逆反応により、Ｎ端保護Ｌ−アスパラギン酸とＬ
−フェニルアラニン低級アルキルエステル間のペプチド
結合を形成する反応を行なうことができ、Ｎ端保護アス
パルテームの製造に用いられるチオールプロテアーゼに
関する。

【０００２】

【従来技術】Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニ
ン間のペプチド結合を加水分解する酵素については、既
に多くの報告があり、また、この反応の逆反応を利用し
たアスパルテーム前駆体の製造方法が公知となっている
。例えば、金属プロテアーゼであるサーモリシンによる
Ｎ−アセチル−アスパルテームの製造方法（特開昭　６
２−０７４２９６号）、セリンプロテアーゼであるスタ
フィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）細
菌の生産する酵素による、４級ブトキシカルボニル−ア
スパルテームの製造方法（特開昭　６０−０４１４９９
号）あるいはチオールプロテアーゼであるパパインによ
るＮ端保護アスパルテームの製造方法（特公表１−５０
１９９５）等が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかるに、アスパルテ
ーム前駆体合成に用いられているプロテアーゼは、基質
特異性が比較的ブロードであり、基質特異性の選択性の
高い酵素は知られていなかった。公知のプロテアーゼは
基質特異性が低いため、逆合成反応の際、高純度の基質
を用いる必要があり、工業的なアスパルテームの生産上
好ましいものではなかった。すなわち、基質特異性が非
常に高く、Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニン
低級アルキルエステル間のペプチド結合反応に極めて特
異的に作用するプロテアーゼの出現が要望されている。

【０００４】従来、プロテアーゼの検索には、一般的に
基質としてカゼイン等のタンパク質が用いられてきた。 公知のプロテアーゼも殆どが、カゼイン等を基質として
検索され、その結果得られたプロテアーゼは複数の種類
のペプチド結合を切断する酵素であった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、以上の状
況に鑑み、基質としてＺ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ（Ｚ
−アスパルテーム：Ｚはカルボキシベンゾイル基を表わ
す。）を採用して、プロテアーゼの検索を鋭意行なった
。その結果、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏ
ｃａｒｄｉａ）属の一菌株がＬ−アスパラギン酸とＬ−
フェニルアラニン間のペプチド結合を特異的に加水分解
し、カゼインを実質的に殆ど加水分解しない新規なチオ
ールプロテアーゼを生産することを見出し、本発明を完
成した。

【０００６】すなわち、本発明は、基質特異性の極めて
高い、新規なチオールプロテアーゼおよび該酵素を用い
るＮ端保護アスパルテームの製造方法に関するものであ
る。

【０００７】以下に本発明を具体的に説明する。本発明
においてはペプチド結合の内、Ｌ−アスパラギン酸とＬ
−フェニルアラニンのペプチド結合を選択特異的に加水
分解する酵素を生産する菌であれば、如何なる菌株も使
用可能であるが、好ましい菌としてシュードノカルディ
ア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属のＤＡＴ−１株
が挙げられる。

【０００８】次に本発明において好適に用いられるシュ
ードノカルディア属菌株の新規なチオールプロテアーゼ
生産菌の菌学的性質を以下に示す。

【０００９】形態：良く伸長した基底菌糸より出芽・増
殖し、気中菌糸を形成する。菌糸は成熟と共にジグザグ
に断裂し、幅　０．８μｍ、長さ　３．０〜７．０　μ
ｍ程の粗面で桿状の、分生子に似た多くの白色細胞を形
成する。細胞の表面はやや高低はあるが、円筒状の形態
を示し、鞭毛は認められない。

【００１０】生育：酵母エキス・麦芽エキス寒天培地（
ＩＳＰ−Ｎｏ．２）での生育は中程度で、薄く気菌糸を
着生する。コロニー表面の色は白色であり、メラノイド
色素および可溶性色素の生成はない。

【００１１】トリプトン・酵母エキス寒天培地（ＩＳＰ
−Ｎｏ．１）での生育は少なく、基底菌糸のみにて生育
し、気中菌糸の形成は認められない。生育コロニーの色
は培地の色と同様であり、メラノイド色素および可溶性
色素の生成はない。

【００１２】生育の温度範囲は約２０〜３８℃であり、
最適生育温度は２８℃〜３０℃である。

【００１３】各種炭素源の利用性：プリードハム・ゴッ
トリーブ培地を用いた各種糖類の資化性は以下のとおり
である（＋：利用する、−：利用しない）。（１）　Ｌ
−アラビノース　　　　− （２）　Ｄ−キシロース　　　　　　−（３）　Ｄ−グ
ルコース　　　　　　＋（４）　Ｄ−フラクトース　　
　　＋ （５）　シュークロース　　　　　　＋（６）　イノシ
トール　　　　　　　　＋（７）　Ｌ−ラムノース　　
　　　　＋（８）　ラフィノース　　　　　　　　−（
９）　Ｄ−マンニトール　　　　＋

【００１４】細胞壁成分の性状：（１）　ジアミノピメ
リン酸（ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｒｉｃ　ａｃｉｄ　）
型ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸を含む。（２）　糖の
含有成分Ｌ−アラビノースおよびガラクトースを含む。 （３）　ノカルディオ・ミコール酸（ｎｏｃａｒｄｉｏ
ｍｙｃｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）ノカルディオ・ミコール酸
は認められない。

【００１５】以上の菌学的性状から、本菌はシュードノ
カルディア属（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）の菌で
あることが明白であり、バージェイズ・マニュアル・オ
ブ・システィマチック・バクテリオロジー第２巻（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔ
ｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２　）１９
８６年を参考に種を検索したが、本菌と同一の性状を示
す菌種は認められなかった。

【００１６】本発明者らは、本菌をシュードノカルディ
ア・エスピー　ＤＡＴ−１（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄ
ｉａ　ｓｐ．　ＤＡＴ−１）として、工業技術院微生物
工業研究所に微工研菌寄第１１９３４　号（ＦＥＲＭ　
　Ｐ−１１９３４　）の番号で寄託している。

【００１７】なお、シュードノカルディア属菌よりチオ
ールプロテアーゼが生産されることは、本発明者等によ
り初めて見出されたことである。

【００１８】本発明のチオールプロテアーゼをシュード
ノカルディア属菌により生産するためには、通常グルコ
ース、スクロース等を炭素源とし、これに肉エキス、ペ
プトンのような窒素源および少量の金属塩を含む液体培
地を用い、２５℃〜３５℃で、４〜１０日間好気的に培
養する。培養後、ろ過または遠心分離して菌体を除き、
上澄液を粗酵素液として用いることができる。粗酵素液
はそのまま使用しても良いが、例えば硫安塩析法やアセ
トン沈澱法などの公知の方法により酵素粉末を得ること
ができる。更に、各種クロマトグラフィーによって精製
を行い、プロテアーゼ活性純度の高い酵素標品を調製す
ることもできる。

【００１９】このようにして精製された本発明のＬ−ア
スパラギン酸とＬ−フェニルアラニン間のペプチド結合
を特異的に加水分解するチオールプロテアーゼの酵素学
的性質は以下のとおりである。

【００２０】（１）　作用：Ｌ−アスパラギン酸（Ａｓ
ｐ）とＬ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）間のペプチド結
合の加水分解反応を触媒する。すなわち、Ｚ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ−ＯＭｅ（Ｚはカルボキシベンゾイル基を表わし
、Ｍｅはメチル基を表わす。）を基質とした時、Ｎ端保
護アスパラギン酸とＰｈｅ−ＯＭｅ間のペプチド結合を
加水分解する。この時、Ｌ−アスパラギン酸のアミノ基
の保護基はＺ基のみならず、ベンゾイル基、ベンジル基
等でもよく、効率よくペプチド結合の加水分解を触媒す
る。

【００２１】本酵素は、カゼインを基質とした時に、殆
ど分解力を示さなかった。微生物起源のチオールプロテ
アーゼであるクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ　）細菌の生産するクロストリパイン、あるいはス
トレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　）
細菌の生産するプロテアーゼは、何れもカゼインに対す
る分解力を示し、本発明の酵素とは異なっていた。また
、Ｎ端保護アスパルテーム合成酵素として知られている
、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌により生産され
るサーモリシンは金属プロテアーゼであり、スタフィロ
コッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）細菌によ
り生産されるＶ８プロテアーゼはセリンプロテアーゼで
あり、これ等の酵素もカゼインに対し分解力を示した。 本酵素を酸化インシュリンＢ鎖に作用させたところ、４
カ所を切断した。

【００２２】以上の知見より、本酵素はこれまで全く知
られていない、シュードノカルディア属菌により生産さ
れる新規なプロテアーゼであると認められる。

【００２３】また、本酵素はアミノ基が保護されたＬ−
アスパラギン酸とＬ−フェニルアラニン低級メチルエス
テル（特にメチルエステル）間のペプチド結合の合成を
触媒し、Ｎ端保護アスパルテームの合成反応を行なうこ
とから、Ｎ端保護アスペルテームの製造に用いることが
できる。

【００２４】（２）　作用ｐＨおよび至適ｐＨ範囲：Ｚ
−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅを基質とし、クエン酸緩衡液
（ｐＨ３〜７）、トリス−塩酸緩衡液（ｐＨ７〜９）、
リン酸緩衡液（ｐＨ６〜９）および硼酸−水酸化ナトリ
ウム緩衡液（ｐＨ９〜１１）中で１０分間反応した時、
図１に示すように作用ｐＨ範囲はｐＨ６〜１０であり、
至適ｐＨが８付近である。

【００２５】（３）　安定ｐＨ範囲：Ｚ−Ａｓｐ−Ｐｈ
ｅ−ＯＭｅを基質とし、クエン酸緩衡液（ｐＨ２〜６）
、リン酸緩衡液（ｐＨ５〜８）、トリス−塩酸緩衡液（
ｐＨ７〜９）、および硼酸−水酸化ナトリウム緩衡液（
ｐＨ９〜１３）中に３０℃、２０時間放置した時の安定
ｐＨ範囲は、図２に示すようにｐＨ４〜１２である。

【００２６】（４）　作用温度範囲および至適作用温度
：本酵素の作用温度範囲はＺ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ
を基質とし、ｐＨ８で１０分間作用させた時、図３に示
すように３０〜７０℃であり、至適作用温度が６０℃付
近にある。

【００２７】（５）　熱安定性：本酵素をｐＨ　８．０
で３０分間放置した時の残存活性を図４に示した。これ
より、本酵素は６０℃までは安定であり、８０℃では殆
ど失活することがわかる。

【００２８】（６）　阻害剤の影響：金属イオンの影響
は最終金属イオン濃度１ｍＭ存在下、ｐＨ８で３７℃１
０分間反応させ、活性を測定して調べた。阻害剤の影響
は、最終阻害剤濃度１ｍＭ存在下、３７℃１時間保持後
、ｐＨ８で３７℃１０分間反応させ、酵素の残存活性を
測定し、調べた。その結果、酵素活性は硫酸銅で５０％
、塩化水銀で約８０％が阻害され、パラ−クロロマ−キ
ュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）で８５％阻害された。本酵
素はセリン酵素の阻害剤、フェニルメタンスルフォニル
・フルオリド（ＰＭＳＦ）で阻害されず、金属酵素の阻
害剤であるエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴ
Ａ）でも阻害されなかったが、チオール酵素の阻害剤Ｐ
ＣＭＢで阻害されることから、本酵素はチオールプロテ
アーゼであることが判明した。

【００２９】（７）　等電点：精製された本酵素の等電
点（ｐＩ）は、等電点電気泳動法によれば約４．５　で
ある。

【００３０】（８）　分子量：本酵素の精製標品のゲル
ろ過カラムクロマトグラフィー（カラム：Ｓｈｉｍ−ｐ
ａｃｋＤｉｏｌ−１５０、溶離液：０．１　Ｍ　ＫＣｌ
を含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ　７．６）に
よる分子量は　５００，０００ダルトンである。

【００３１】（９）　精製法：本酵素は、培養液を遠心
して菌体を除き、上澄液を得、硫安沈澱にて活性画分を
回収し、透析後、ＤＥＡＥ−セルロースカラムによるイ
オン交換クロマトグラフィー、セファデックス（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ）Ｇ−１００カラムによるゲルろ過クロマト
グラフィー、あるいはディスクゲル電気泳動法によりタ
ンパク的に単一となるまで分離・精製できる。

【００３２】（１０）活性測定法：酵素溶液１５０μｌ
、０．１　Ｍトリス−塩酸緩衡液（ｐＨ８）１５０μｌ
を３７℃で１０分間保持後、１０ｍＭのＺ−Ａｓｐ−Ｐ
ｈｅ−ＯＭｅを１５０μｌ加え、３７℃で１０分間反応
させ、この溶液から２００μｌを取り、ニンヒドリン発
色法にて５７０ｎｍの吸光度を測定し、ブランクとの差
より酵素量に相当する活性を求めた。ブランクとしては
酵素液を１００℃、５分間処理したものを用いた。酵素
量１ユニットは、本条件で１０分間に１μｍｏｌ　のＰ
ｈｅ−ＯＭｅを遊離する酵素量と定義した。

【００３３】

【発明の効果】以上のとおり、本明細書に開示したシュ
ードノカルディア属菌のチオールプロテアーゼは新規酵
素であり、ペプチド結合の内、Ｌ−アスパラギン酸とＬ
−フェニルアラニン間の結合を選択特異的に切断する。 また、本酵素は従来知られているプロテアーゼとは異な
り、カゼインを殆ど加水分解しない特異な酵素というこ
とができる。従って、本酵素は新規なプロテアーゼとし
ての応用は勿論であるが、加水分解の逆反応を利用した
、Ｎ端保護アスパルテームの新規な合成法を提供するも
のである。

【００３４】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれ等の実施例により何ら限定される
ものではない。なお、下記の説明中の％は特に断らない
限り、重量を基準としている。

【００３５】実施例１　　　　酵母エキス　０．４％、
麦芽エキス１％およびグルコース　０．４％を含む種母
培地（ｐＨ　７．３）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フ
ラスコに入れ、常法により殺菌後シュードノカルディア
・エスピー　ＤＡＴ−１を接種し、３０℃にて２日間振
盪培養した。次に、麦芽エキス１％、ポリペプトン１％
、食塩　０．５％、およびグルコース１％を含む生産培
地（ｐＨ　７．２）１Ｌを２Ｌ容ミニジャーファーメン
ターに入れ、常法により殺菌後、上記培養液５０ｍｌを
接種し、通気量　０．２ｖｖｍ　、撹拌６００ｒｐｍに
て、３０℃で６日間培養した。培養液を１０，０００ｒ
ｐｍ　３分間の遠心分離にて菌体を除去し、粗酵素液と
して上澄液　１，０００ｍｌを得た。本培養上澄液の酵
素活性は２９６単位／ｍｌであり、その全活性は　２９
６，０００単位であった。

【００３６】実施例２　　　　実施例１で得た粗酵素液
　１，０００ｍｌに硫安を添加し、９０％飽和硫安濃度
で塩析し、その後透析した液をＤＥＡＥ−セルロースカ
ラムクロマログラフィーに供し、０〜１Ｍの食塩溶液の
リニアグラジエンドで溶出したところ、０．４　Ｍの食
塩濃度で活性画分が溶出した。得られた活性画分を再度
９０％飽和硫安で塩析し、透析後セファデックスＧ−１
００カラムにてゲルろ過を行ない、凍結乾燥して２ｍｇ
の精製酵素を得た。 精製酵素はディスクゲル電気泳動的に単一であり、活性
収率は粗酵素液に対して１２％であった。また、精製酵
素凍結乾燥品１ｍｇ当りの酵素活性は１７，７６０単位
であった。

【００３７】実施例３　　　　実施例２で得られた精製
酵素１５０μｌ（５０単位）をＺ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｏ
Ｍｅ１０ｍＭを含む　０．１Ｍトリス−塩酸緩衡液（ｐ
Ｈ８）１５０μｌに添加し、３７℃で１０分間反応し、
反応液をメルク社製シリカゲル薄層板（Ａｒｔ　５７１
５）に１０μｌスポットし、ブタノール：酢酸：水（４
：１：２）にて展開し、ＵＶランプおよびニンヒドリン
発色にて酵素反応産物を調べたところ、残存基質以外に
はＺ−ＡｓｐおよびＰｈｅ−ＯＭｅのみのスポットが検
出され、本酵素がＡｓｐ−Ｐｈｅ間のペプチド結合を加
水分解することが確認された。

【図面の簡単な説明】

【図１】シュードノカルディア・エスピー　ＤＡＴ−１
の生産するチオールプロテアーゼの作用ｐＨおよび作用
ｐＨ範囲を示すグラフである。

【図２】シュードノカルディア・エスピー　ＤＡＴ−１
の生産するチオールプロテアーゼの安定ｐＨ範囲を示す
グラフである。

【図３】シュードノカルディア・エスピー　ＤＡＴ−１
の生産するチオールプロテアーゼの作用温度および至適
作用温度を示すグラフである。

【図４】シュードノカルディア・エスピー　ＤＡＴ−１
の生産するチオールプロテアーゼの熱安定性を示すグラ
フである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　下記の性質を有するチオールプロテア
   ーゼ。■作用：Ｌ−アスパラギン酸とＬ−フェニルアラ
   ニン間のペプチド結合の加水分解を触媒する。また、ア
   ミノ基が保護されたＬ−アスパラギン酸とＬ−フェニル
   アラニン低級アルキルエステル間のペプチド結合の分解
   および合成を触媒する。■至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲
   ：Ｎ−カルボキシベンゾイル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−
   フェニルアラニンメチルエステルを基質とした時、至適
   ｐＨが８付近にあり、安定ｐＨ範囲は４〜１２である。 ■作用温度：Ｎ−カルボキシベンゾイル−Ｌ−アスパル
   チル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを基質とし
   た時、作用温度範囲が３０〜７０℃であり、至適作用温
   度が６０℃付近にある。■熱安定性：ｐＨ　８．０で３
   ０分間放置した時、６０℃まで安定で、８０℃では殆ど
   失活する。■阻害剤の影響：塩化水銀およびパラ−クロ
   ロマーキュリー安息香酸にて阻害される。■等電点：等
   電点電気泳動法による本酵素の等電点は　４．５である
   。■分子量：カラムを用いたゲルろ過法による分子量は
   ５００，０００　ダルトンである。
2. 【請求項２】　　シュードノカルディア属（Ｐｓｅｕｄ
   ｏｎｏｃａｒｄｉａ）に属する微生物の培養物より得ら
   れる酵素である請求項１に記載のチオールプロテアーゼ
   。