JPH05244947A - 新規ポストプロリンエンドペプチダーゼおよびその製造方法 - Google Patents
新規ポストプロリンエンドペプチダーゼおよびその製造方法Info
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- JPH05244947A JPH05244947A JP8333292A JP8333292A JPH05244947A JP H05244947 A JPH05244947 A JP H05244947A JP 8333292 A JP8333292 A JP 8333292A JP 8333292 A JP8333292 A JP 8333292A JP H05244947 A JPH05244947 A JP H05244947A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 次の性質を有するポストプロリンエンドペプ
チダーゼ及びストレプトミセス属に属する微生物を培養
による前記ペプチダーゼの製造方法：(1) Z-Ala-Ala-Pr
o-pNA ，Bz(pOH)-Gly-Ala-Pro-pNA のプロリンとパラニ
トロアニリンのアミド結合及びカゼインの水解を触媒す
る；(2) 至適ｐＨは７付近、安定ｐＨは6.0 〜8.0 ；
(3) Z-Ala-Ala-Pro-pNA を基質としたとき、作用温度範
囲は２０〜５０℃、至適作用温度４０℃付近；Z-Ala-Al
a-Pro-pNA を基質とした時、４０℃まで安定、５０℃で
失活；(5) フェニルメタンスルホニルフルオリドで１０
０％阻害、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、アンチパイン
及びロイペプシンで約５０％まで阻害；(6) 等電点は6.
2 〜7.0 ；(7) 分子量は47,000。 【効果】 ポリペプチドや蛋白の構造解析の試薬等とし
て有用である。
チダーゼ及びストレプトミセス属に属する微生物を培養
による前記ペプチダーゼの製造方法：(1) Z-Ala-Ala-Pr
o-pNA ，Bz(pOH)-Gly-Ala-Pro-pNA のプロリンとパラニ
トロアニリンのアミド結合及びカゼインの水解を触媒す
る；(2) 至適ｐＨは７付近、安定ｐＨは6.0 〜8.0 ；
(3) Z-Ala-Ala-Pro-pNA を基質としたとき、作用温度範
囲は２０〜５０℃、至適作用温度４０℃付近；Z-Ala-Al
a-Pro-pNA を基質とした時、４０℃まで安定、５０℃で
失活；(5) フェニルメタンスルホニルフルオリドで１０
０％阻害、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、アンチパイン
及びロイペプシンで約５０％まで阻害；(6) 等電点は6.
2 〜7.0 ；(7) 分子量は47,000。 【効果】 ポリペプチドや蛋白の構造解析の試薬等とし
て有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はプロリン含有ペプチドを
水解する新規なポストプロリンエンドペプチダーゼおよ
びその製造方法に関するものである。本発明のポストプ
ロリンエンドペプチダーゼは、肉類の改質や、ポリペプ
チドや蛋白の構造解析の試薬等として有用であると考え
られる。
水解する新規なポストプロリンエンドペプチダーゼおよ
びその製造方法に関するものである。本発明のポストプ
ロリンエンドペプチダーゼは、肉類の改質や、ポリペプ
チドや蛋白の構造解析の試薬等として有用であると考え
られる。
【０００２】
【従来の技術】ポリペプチドを構成するアミノ酸類の中
で、プロリンはα−イミノ酸であり、α−アミノ酸とは
異なる特異な構造を持つため、立体障害などによりエン
ド型あるいはエキソ型のペプチダーゼはプロリン周辺の
ペプチド結合に作用しにくいことが知られている。近
年、このプロリンを含む基質に特異的に作用する酵素の
研究が行なわれ、高等動物の臓器、植物、および微生物
等を起源とする、プロリンに特異的に作用するペプチダ
ーゼが多数見出されている。例えば、プロリンをアミノ
末端とするペプチドに特異的に作用するプロリンイミノ
ペプチダーゼ（特開昭58-36387号、特開平1-215288号、
特開平1-291795号、特開平3-108483号など）、アミノ末
端から２番目にプロリンが存在するときに末端アミノ酸
を除去するアミノペプチダーゼＰ（A.Yaron, D.Mylnar,
Biochem.Biophys.Res.Commun., 32, 658, (1968) ）、
プロリンを含むジペプチドに作用するプロリダーゼ（T.
Yoshimoto,et.al., J.Biochem., 94,1889(1983) ）など
が挙げられる。
で、プロリンはα−イミノ酸であり、α−アミノ酸とは
異なる特異な構造を持つため、立体障害などによりエン
ド型あるいはエキソ型のペプチダーゼはプロリン周辺の
ペプチド結合に作用しにくいことが知られている。近
年、このプロリンを含む基質に特異的に作用する酵素の
研究が行なわれ、高等動物の臓器、植物、および微生物
等を起源とする、プロリンに特異的に作用するペプチダ
ーゼが多数見出されている。例えば、プロリンをアミノ
末端とするペプチドに特異的に作用するプロリンイミノ
ペプチダーゼ（特開昭58-36387号、特開平1-215288号、
特開平1-291795号、特開平3-108483号など）、アミノ末
端から２番目にプロリンが存在するときに末端アミノ酸
を除去するアミノペプチダーゼＰ（A.Yaron, D.Mylnar,
Biochem.Biophys.Res.Commun., 32, 658, (1968) ）、
プロリンを含むジペプチドに作用するプロリダーゼ（T.
Yoshimoto,et.al., J.Biochem., 94,1889(1983) ）など
が挙げられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これらの酵素は、それ
ぞれ独自の作用および基質特異性を有するものである
が、プロリンを含有するポリペプチドの構造解析あるい
は合成上からは、さらに新規な作用特異性を有するプロ
リンエンドペプチダーゼが求められている。従って、本
発明の課題は、ポリペプチドの生産および構造解析に有
用な、微生物起源の新規なプロリン含有ペプチド結合の
水解酵素およびその製造方法を提供することにある。
ぞれ独自の作用および基質特異性を有するものである
が、プロリンを含有するポリペプチドの構造解析あるい
は合成上からは、さらに新規な作用特異性を有するプロ
リンエンドペプチダーゼが求められている。従って、本
発明の課題は、ポリペプチドの生産および構造解析に有
用な、微生物起源の新規なプロリン含有ペプチド結合の
水解酵素およびその製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは九州、阿蘇
の大観峰付近の土壌中から分離されたストレプトミセス
属（Streptomyces）に属する微生物が新規なポストプロ
リンエンドペプチダーゼを産生することを見出し、本発
明を完成した。すなわち、本発明は以下の新規ポストプ
ロリンエンドペプチダーゼおよびその製造方法を提供し
たものである。
の大観峰付近の土壌中から分離されたストレプトミセス
属（Streptomyces）に属する微生物が新規なポストプロ
リンエンドペプチダーゼを産生することを見出し、本発
明を完成した。すなわち、本発明は以下の新規ポストプ
ロリンエンドペプチダーゼおよびその製造方法を提供し
たものである。
【０００５】（Ａ）次の性質を有するポストプロリンエ
ンドペプチダーゼ (1) 作用および基質特異性 プロリンを含有する下記ペプチドのプロリンとパラ
ニトロアニリンのアミド結合、およびカゼインの加水分
解を触媒する。 Z-Ala-Ala-Pro-pNA ，Bz(pOH)-Gly-Ala-Pro-pNA 以下のペプチドを加水分解しない。 Z-Gly-Pro-pNA ， Boc-Ala-Pro-pNA ， Ala-Pro-pNA
， Pro-pNA（上記式中、Boc はｔ−ブチルオキシカル
ボニル基、Bz(pOH) はｐ−ヒドロキシベンゾイル基、、
pNA はｐ−ニトロアニリド基、Z はカルボベンゾキシ基
を表わす。） (2) 至適ｐＨおよび安定ｐＨ 至適ｐＨは７付近であり、安定ｐＨは6.0 〜8.0 であ
る。
ンドペプチダーゼ (1) 作用および基質特異性 プロリンを含有する下記ペプチドのプロリンとパラ
ニトロアニリンのアミド結合、およびカゼインの加水分
解を触媒する。 Z-Ala-Ala-Pro-pNA ，Bz(pOH)-Gly-Ala-Pro-pNA 以下のペプチドを加水分解しない。 Z-Gly-Pro-pNA ， Boc-Ala-Pro-pNA ， Ala-Pro-pNA
， Pro-pNA（上記式中、Boc はｔ−ブチルオキシカル
ボニル基、Bz(pOH) はｐ−ヒドロキシベンゾイル基、、
pNA はｐ−ニトロアニリド基、Z はカルボベンゾキシ基
を表わす。） (2) 至適ｐＨおよび安定ｐＨ 至適ｐＨは７付近であり、安定ｐＨは6.0 〜8.0 であ
る。
【０００６】(3) 作用温度 Z-Ala-Ala-Pro-pNA を基質としたとき、作用温度範囲は
２０〜５０℃で、至適作用温度は４０℃付近である。 (4) 温度安定性 Z-Ala-Ala-Pro-pNA を基質としたとき、４０℃まで安定
で、５０℃で失活する。 (5) 各種因子による影響 フェニルメタンスルホニルフルオリドで１００％阻害さ
れ、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、アンチパインおよび
ロイペプシンで約５０％まで阻害される。 (6) 等電点 イオン交換樹脂に対する吸着性から推定される等電点ｐ
Ｉは6.2 〜7.0 である。 (7) 分子量 ＳＤＳ電気泳動による分子量は47,000である。
２０〜５０℃で、至適作用温度は４０℃付近である。 (4) 温度安定性 Z-Ala-Ala-Pro-pNA を基質としたとき、４０℃まで安定
で、５０℃で失活する。 (5) 各種因子による影響 フェニルメタンスルホニルフルオリドで１００％阻害さ
れ、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、アンチパインおよび
ロイペプシンで約５０％まで阻害される。 (6) 等電点 イオン交換樹脂に対する吸着性から推定される等電点ｐ
Ｉは6.2 〜7.0 である。 (7) 分子量 ＳＤＳ電気泳動による分子量は47,000である。
【０００７】（Ｂ）ストレプトミセス属（Streptomyce
s）の属し前記（Ａ）に記載の酵素を生産する能力を有
する微生物を培養し、その培養液から前記酵素を採取す
ることを特徴とする前記（Ａ）に記載のペプチダーゼの
製造方法。以下、本発明を具体的に説明する。本発明に
おいては、プロリンを内部に含有するペプチドまたは保
護ペプチドのPro-pNA 、およびカゼインなどのポストプ
ロリンアミド結合の加水分解を触媒するペプチダーゼを
生産する微生物であれば、いかなる菌株でも使用可能で
あるが、好ましい菌株としては、ストレプトミセス（St
reptomyces）属のストレプトミセス・キサントファエウ
ス（Streptomyces xanthophaeus） ＨＡ−３６株（微
工研菌寄第１２７８７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７８
７））が挙げられる。
s）の属し前記（Ａ）に記載の酵素を生産する能力を有
する微生物を培養し、その培養液から前記酵素を採取す
ることを特徴とする前記（Ａ）に記載のペプチダーゼの
製造方法。以下、本発明を具体的に説明する。本発明に
おいては、プロリンを内部に含有するペプチドまたは保
護ペプチドのPro-pNA 、およびカゼインなどのポストプ
ロリンアミド結合の加水分解を触媒するペプチダーゼを
生産する微生物であれば、いかなる菌株でも使用可能で
あるが、好ましい菌株としては、ストレプトミセス（St
reptomyces）属のストレプトミセス・キサントファエウ
ス（Streptomyces xanthophaeus） ＨＡ−３６株（微
工研菌寄第１２７８７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７８
７））が挙げられる。
【０００８】本発明において用いられる代表的な菌株と
して、熊本県阿蘇大観峰付近の土壌より分離された放線
菌で、本発明者らがＨＡ−３６菌株と番号を付した菌株
が挙げられる。このＨＡ−３６菌株の菌学的性状は次の
とおりである。 （１）形態 良く分枝した基菌糸より直状〜曲状（straight-flexuru
s ）の気菌糸を伸長するが、培養条件により開放したラ
セン状（open loops）を示す。成熟した気菌糸の先に１
０〜５０個の楕円〜円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成
する。胞子のうは認められない。胞子の大きさは0.7 〜
1.0 ×1.0 〜1.5 ミクロン位で、胞子の表面は平滑（sm
ooth）であり、鞭毛は認められない。
して、熊本県阿蘇大観峰付近の土壌より分離された放線
菌で、本発明者らがＨＡ−３６菌株と番号を付した菌株
が挙げられる。このＨＡ−３６菌株の菌学的性状は次の
とおりである。 （１）形態 良く分枝した基菌糸より直状〜曲状（straight-flexuru
s ）の気菌糸を伸長するが、培養条件により開放したラ
セン状（open loops）を示す。成熟した気菌糸の先に１
０〜５０個の楕円〜円筒形の胞子からなる胞子鎖を形成
する。胞子のうは認められない。胞子の大きさは0.7 〜
1.0 ×1.0 〜1.5 ミクロン位で、胞子の表面は平滑（sm
ooth）であり、鞭毛は認められない。
【０００９】（２）各種培地における生育状態 培養は全て２８℃で行なった。色調の記載はコンティナ
ー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハー
モニー・マニュアル（Color Harmony Manual of Contai
ner Corporation of America）の（カッコ）内に示す符
号で表示する。 １）イースト・麦芽寒天培地 生育は中程度であるが、気菌糸・胞子は見られない。溶
解性色素は見られない。 ２）スターチ・無機塩寒天培地 生育は良好で、多くの気菌糸と胞子を着生し、コロニー
表面の色は灰色（２ｆｅ）からやや茶色がかった灰色
（３ｆｅ）である。紫色の溶解性色素を産生する 。 ３）チロシン寒天培地 生育は良好であるが、気菌糸と胞子は着生しない。培地
中に紫色の溶解性色素と共にメラノイド色素を生成す
る。
ー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハー
モニー・マニュアル（Color Harmony Manual of Contai
ner Corporation of America）の（カッコ）内に示す符
号で表示する。 １）イースト・麦芽寒天培地 生育は中程度であるが、気菌糸・胞子は見られない。溶
解性色素は見られない。 ２）スターチ・無機塩寒天培地 生育は良好で、多くの気菌糸と胞子を着生し、コロニー
表面の色は灰色（２ｆｅ）からやや茶色がかった灰色
（３ｆｅ）である。紫色の溶解性色素を産生する 。 ３）チロシン寒天培地 生育は良好であるが、気菌糸と胞子は着生しない。培地
中に紫色の溶解性色素と共にメラノイド色素を生成す
る。
【００１０】（３）各種炭素源の同化性 ブリードハム・ゴトリープ寒天培地に各種の培地を加え
生育を見た結果を下記に示す。 １）Ｌ−アラビノース − ２）Ｄ−キシロース − ３）Ｄ−グルコース ＋ ４）Ｄ−フルクトース − ５）シュークロース − ６）イノシトール − ７）Ｌ−ラムノース − ８）ラフィノース − ９）Ｄ−マンニトール − （ただし、＋は同化することを表わし、−は同化しない
ことを表わす。） （４）細胞壁成分の性状
生育を見た結果を下記に示す。 １）Ｌ−アラビノース − ２）Ｄ−キシロース − ３）Ｄ−グルコース ＋ ４）Ｄ−フルクトース − ５）シュークロース − ６）イノシトール − ７）Ｌ−ラムノース − ８）ラフィノース − ９）Ｄ−マンニトール − （ただし、＋は同化することを表わし、−は同化しない
ことを表わす。） （４）細胞壁成分の性状
【００１１】細胞を加水分解したものをセルロースの薄
層クロマトグラフィーによって分析したところ、本菌の
細胞壁成分のジアミノミメリン酸（diamino pimelic ac
id)の異性体型はＬＬ−型であり、糖成分には特徴がな
かった。以上の菌学的性質から本菌はストレプトミセス
（Streptomyces）属の菌であることは明確であり、イン
ターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック
・バイオテクノロジー １８巻，２号，１９６８（Inte
rnational Journal of Systematic Bacteriology, vol.
18, No.2, 1968）でインターナショナル・ストレプトミ
セス・プロジェクト（International Streptomyces Pro
ject）が承認したストレプトミセス（Streptomyces）属
株の記載性状と比較したところ、本菌が溶解性色素を生
成する点を除けば、ストレプトミセス・キサントファエ
ウス（Streptomyces xanthophaeus）とほぼ一致する。
本発明者らは、本菌を工業技術院微生物工業技術研究所
に、ストレプトミセス・キサントファエウス（Streptom
yces xanthophaeus）ＨＡ−３６ 微工研菌寄第１２７
８７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７８７）として寄託した。
層クロマトグラフィーによって分析したところ、本菌の
細胞壁成分のジアミノミメリン酸（diamino pimelic ac
id)の異性体型はＬＬ−型であり、糖成分には特徴がな
かった。以上の菌学的性質から本菌はストレプトミセス
（Streptomyces）属の菌であることは明確であり、イン
ターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック
・バイオテクノロジー １８巻，２号，１９６８（Inte
rnational Journal of Systematic Bacteriology, vol.
18, No.2, 1968）でインターナショナル・ストレプトミ
セス・プロジェクト（International Streptomyces Pro
ject）が承認したストレプトミセス（Streptomyces）属
株の記載性状と比較したところ、本菌が溶解性色素を生
成する点を除けば、ストレプトミセス・キサントファエ
ウス（Streptomyces xanthophaeus）とほぼ一致する。
本発明者らは、本菌を工業技術院微生物工業技術研究所
に、ストレプトミセス・キサントファエウス（Streptom
yces xanthophaeus）ＨＡ−３６ 微工研菌寄第１２７
８７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７８７）として寄託した。
【００１２】本発明の新規なペプチダーゼをストレプト
ミセス属菌株（Streptomyces sp.）により生産するた
めには、通常グルコース、デンプン、グリセリンなどを
炭素源とし、これに酵母エキス、ペプトン、肉エキスな
どの窒素源、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン
酸カリウムなどの無機物を含む液体培地を用い、ｐＨ４
〜９、温度約２０〜３５で培養する。培養時間は通常４
〜５日程度であり、目的物である本発明ペプチダーゼの
生産が最大に達したところで培養を停止する。
ミセス属菌株（Streptomyces sp.）により生産するた
めには、通常グルコース、デンプン、グリセリンなどを
炭素源とし、これに酵母エキス、ペプトン、肉エキスな
どの窒素源、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン
酸カリウムなどの無機物を含む液体培地を用い、ｐＨ４
〜９、温度約２０〜３５で培養する。培養時間は通常４
〜５日程度であり、目的物である本発明ペプチダーゼの
生産が最大に達したところで培養を停止する。
【００１３】培養終了後、培養液を遠心分離し、その上
清から本発明ペプチダーゼを採取する。本ペプチダーゼ
の採取に特に困難はなく、各種酵素の分離精製に通常採
用される方法を適宜組合わせて行なうことができる。例
えば、限外ろ過、減圧濃縮、塩析、有機溶媒沈殿、透
析、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、等電点電気泳動法、凍結乾燥法など
の方法を適宜組合わせて活性純度の高い酵素標品を得る
ことができる。次に、精製された本発明のペプチダーゼ
の酵素学的性質を、その測定法とともに示す。なお、酵
素活性の測定および蛋白質の定量は下記の方法で行なっ
た。
清から本発明ペプチダーゼを採取する。本ペプチダーゼ
の採取に特に困難はなく、各種酵素の分離精製に通常採
用される方法を適宜組合わせて行なうことができる。例
えば、限外ろ過、減圧濃縮、塩析、有機溶媒沈殿、透
析、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、等電点電気泳動法、凍結乾燥法など
の方法を適宜組合わせて活性純度の高い酵素標品を得る
ことができる。次に、精製された本発明のペプチダーゼ
の酵素学的性質を、その測定法とともに示す。なお、酵
素活性の測定および蛋白質の定量は下記の方法で行なっ
た。
【００１４】酵素活性の測定法 １ｍＭ Z-Ala-Ala-Pro-pNA を含む５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ7.0 ）の４０％メタノール溶液２００μ
ｌに、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.0）８００
μｌを加え、さらに酵素溶液２００μｌを加えて３７℃
で５分間酵素反応させた。１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ3.5
）４００μｌを加えて反応を停止させた後、Clinical
spectrophotometer 105-40 （日立株式会社製）を用い
て４１０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素活性は、
１分間に１μＭのｐＮＡを遊離させる酵素量を１単位と
定義した。蛋白質定量法 蛋白質の定量は、Ｌｏｗｒｙ法を用いて行なった。
酸緩衝液（ｐＨ7.0 ）の４０％メタノール溶液２００μ
ｌに、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.0）８００
μｌを加え、さらに酵素溶液２００μｌを加えて３７℃
で５分間酵素反応させた。１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ3.5
）４００μｌを加えて反応を停止させた後、Clinical
spectrophotometer 105-40 （日立株式会社製）を用い
て４１０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素活性は、
１分間に１μＭのｐＮＡを遊離させる酵素量を１単位と
定義した。蛋白質定量法 蛋白質の定量は、Ｌｏｗｒｙ法を用いて行なった。
【００１５】ｐＨ安定性および至適ｐＨ ｐＨ安定性は、Z-Ala-Ala-Pro-pNA を基質とし、酢酸緩
衝液（ｐＨ3.0 〜5.5）、リン緩衝液（ｐＨ5.0 〜7.0
）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ6.0 〜10.0）、グリシ
ン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ10.0〜11.0）各々５
０ｍＭ用い、３７℃で１時間酵素反応させて、前記の方
法により酵素活性を測定した。また、至適ｐＨは、酢酸
緩衝液（ｐＨ3.5 〜5.5 ）、リン緩衝液（ｐＨ5.5 〜7.
0 ）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.0 〜9.0 ）、グリシ
ン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ9.5 〜10.5）を用
い、３７℃で３０分間酵素反応させて、前記の方法によ
り酵素活性を測定し、ｐＨ7.0 における酵素活性を１０
０として各ｐＨにおける相対活性として求めた。その結
果、本発明酵素は、ｐＨ6.0 〜8.0 の範囲において安定
であり、至適ｐＨは7.0 付近であった。
衝液（ｐＨ3.0 〜5.5）、リン緩衝液（ｐＨ5.0 〜7.0
）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ6.0 〜10.0）、グリシ
ン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ10.0〜11.0）各々５
０ｍＭ用い、３７℃で１時間酵素反応させて、前記の方
法により酵素活性を測定した。また、至適ｐＨは、酢酸
緩衝液（ｐＨ3.5 〜5.5 ）、リン緩衝液（ｐＨ5.5 〜7.
0 ）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.0 〜9.0 ）、グリシ
ン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ9.5 〜10.5）を用
い、３７℃で３０分間酵素反応させて、前記の方法によ
り酵素活性を測定し、ｐＨ7.0 における酵素活性を１０
０として各ｐＨにおける相対活性として求めた。その結
果、本発明酵素は、ｐＨ6.0 〜8.0 の範囲において安定
であり、至適ｐＨは7.0 付近であった。
【００１６】作用温度 温度に対する安定性は、Z-Ala-Ala-Pro-pNA を基質と
し、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.0 ）を用い
て、０〜１００℃の範囲の各温度で３０分間酵素反応さ
せ、前記の方法により酵素活性を測定した。また、至適
温度は、同様に測定し、４０℃における酵素活性を１０
０とした場合の各温度における相対活性を求めた。その
結果、本発明酵素は、４０℃まで安定で、また５０℃で
は失活することがわかった。
し、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.0 ）を用い
て、０〜１００℃の範囲の各温度で３０分間酵素反応さ
せ、前記の方法により酵素活性を測定した。また、至適
温度は、同様に測定し、４０℃における酵素活性を１０
０とした場合の各温度における相対活性を求めた。その
結果、本発明酵素は、４０℃まで安定で、また５０℃で
は失活することがわかった。
【００１７】各種因子による阻害作用 ５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.0 ）８０μｌに酵
素液（0.74Ｕ／ｍｌ）１０μｌおよび表１に示す各種化
合物を終濃度が表１中に示す濃度になるように加えて、
３７℃で１時間インキュベートする。次いで、１ｍＭ
Z-Ala-Ala-Pro-pNA を含む基質溶液（５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液，ｐＨ7.0 ）１０００μｌを加えて、３７℃
で５分間酵素反応させる。１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ3.5 ）
を４００μｌ添加し、反応を停止させ、前記の方法に準
じて酵素活性を測定した。化合物無添加でのZ-Ala-Ala-
Pro-pNA の分解量を１００として、各種化合物添加にお
ける相対分解量を相対活性とした。その結果を表１に示
す。表１の結果からのわかるように、本発明酵素は、フ
ェニルメタンスルホニルフルオリドで活性が完全に阻害
される。また、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、アンチパ
インおよびロイペプシンで約５０％まで阻害されること
がわかった。
素液（0.74Ｕ／ｍｌ）１０μｌおよび表１に示す各種化
合物を終濃度が表１中に示す濃度になるように加えて、
３７℃で１時間インキュベートする。次いで、１ｍＭ
Z-Ala-Ala-Pro-pNA を含む基質溶液（５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液，ｐＨ7.0 ）１０００μｌを加えて、３７℃
で５分間酵素反応させる。１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ3.5 ）
を４００μｌ添加し、反応を停止させ、前記の方法に準
じて酵素活性を測定した。化合物無添加でのZ-Ala-Ala-
Pro-pNA の分解量を１００として、各種化合物添加にお
ける相対分解量を相対活性とした。その結果を表１に示
す。表１の結果からのわかるように、本発明酵素は、フ
ェニルメタンスルホニルフルオリドで活性が完全に阻害
される。また、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、アンチパ
インおよびロイペプシンで約５０％まで阻害されること
がわかった。
【００１８】
【表１】
【００１９】等電点 イオン交換樹脂に対する吸着性から推定される等電点ｐ
Ｉは6.2 〜7.0 である。 （６）分子量 ＳＤＳ電気泳動法により推定される精製ポストプロリン
エンドペプチターゼの分子量は47,000である。
Ｉは6.2 〜7.0 である。 （６）分子量 ＳＤＳ電気泳動法により推定される精製ポストプロリン
エンドペプチターゼの分子量は47,000である。
【００２０】
【実施例】次に、実施例により本発明を具体的に説明す
る。実施例１ ［酵素生産菌の培養］ペプトン５ｇ／ｌ、酵母エキス３
ｇ／ｌ、麦芽エキス３ｇ／ｌ、ブドウ糖１０ｇ／ｌ、寒
天１５ｇ／ｌを含むｐＨを7.0 に調整したスラント継代
培地（ＹＭ倍地）を調製した。前記培地を５００ｍｌ容
三角フラスコに１００ｍｌ分注し、殺菌後、ストレプト
ミセス・エスピー（Streptomyces sp. ）ＨＡ−３６
（ＦＥＲＭ−１２７８７）を一白金耳接種し、３０℃で
５日間振盪培養法により培養した。
る。実施例１ ［酵素生産菌の培養］ペプトン５ｇ／ｌ、酵母エキス３
ｇ／ｌ、麦芽エキス３ｇ／ｌ、ブドウ糖１０ｇ／ｌ、寒
天１５ｇ／ｌを含むｐＨを7.0 に調整したスラント継代
培地（ＹＭ倍地）を調製した。前記培地を５００ｍｌ容
三角フラスコに１００ｍｌ分注し、殺菌後、ストレプト
ミセス・エスピー（Streptomyces sp. ）ＨＡ−３６
（ＦＥＲＭ−１２７８７）を一白金耳接種し、３０℃で
５日間振盪培養法により培養した。
【００２１】［酵素生産菌の精製］培養液１０リットル
を遠心分離（5,000 ×ｇ，１０分間）し、培養上清を集
め以下の工程で精製した。なお、以下の操作はすべて１
０℃で行なった。 工程１：硫安分画 遠心した上清（約７リットル）に硫酸アンモニウムを飽
和濃度８０％になるよう加え、生じた沈殿を遠心分離
（10,000ｒｐｍ、３０分間）して回収し、１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ6.0 ）２００リットルに溶解させた。
を遠心分離（5,000 ×ｇ，１０分間）し、培養上清を集
め以下の工程で精製した。なお、以下の操作はすべて１
０℃で行なった。 工程１：硫安分画 遠心した上清（約７リットル）に硫酸アンモニウムを飽
和濃度８０％になるよう加え、生じた沈殿を遠心分離
（10,000ｒｐｍ、３０分間）して回収し、１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ6.0 ）２００リットルに溶解させた。
【００２２】工程２：ＣＭトヨパール６５０Ｍクロマト
グラフィー この酵素溶液を透析膜を使用して、１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ6.0 ）（以下、緩衝液Ａという。）を用いて脱
塩した。得られた酵素液を、予め緩衝液Ａで平衡化した
ＣＭトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー株式会社製）に
負荷し、緩衝液Ａでカラムを洗浄後、ＮａＣｌの直線濃
度勾配（０〜0.2 Ｍ）によって溶出させ、活性画分を回
収した。 工程３：ＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィー 工程２で得た酵素液を、透析により１０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ9.0)（以下、緩衝液Ｂという。）によっ
て緩衝液Ｂに交換した。得られた酵素液を、予め緩衝液
Ｂで平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム（和光純薬株
式会社製）に負荷し、緩衝液Ｂでカラムを洗浄した後、
ＮａＣｌの直線密度勾配（０〜0.5 Ｍ）によって溶出
し、活性画分を回収した。
グラフィー この酵素溶液を透析膜を使用して、１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ6.0 ）（以下、緩衝液Ａという。）を用いて脱
塩した。得られた酵素液を、予め緩衝液Ａで平衡化した
ＣＭトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー株式会社製）に
負荷し、緩衝液Ａでカラムを洗浄後、ＮａＣｌの直線濃
度勾配（０〜0.2 Ｍ）によって溶出させ、活性画分を回
収した。 工程３：ＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィー 工程２で得た酵素液を、透析により１０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ9.0)（以下、緩衝液Ｂという。）によっ
て緩衝液Ｂに交換した。得られた酵素液を、予め緩衝液
Ｂで平衡化したＤＥＡＥセルロースカラム（和光純薬株
式会社製）に負荷し、緩衝液Ｂでカラムを洗浄した後、
ＮａＣｌの直線密度勾配（０〜0.5 Ｍ）によって溶出
し、活性画分を回収した。
【００２３】工程４：セファデックスＧ−７５カラムク
ロマトグラフィー 工程３で得られた酵素液を透析により0.1 ＭのＮａＣｌ
を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5 ）（以
下、緩衝液Ｃという。）によって緩衝液を交換した。得
られた酵素液を、予め緩衝液Ｃで平衡化したセファデッ
クスＧ−７５カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノ
ロジー社製）に負荷し、同組成の緩衝液で溶出し、活性
画分を回収した。
ロマトグラフィー 工程３で得られた酵素液を透析により0.1 ＭのＮａＣｌ
を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5 ）（以
下、緩衝液Ｃという。）によって緩衝液を交換した。得
られた酵素液を、予め緩衝液Ｃで平衡化したセファデッ
クスＧ−７５カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノ
ロジー社製）に負荷し、同組成の緩衝液で溶出し、活性
画分を回収した。
【００２４】工程５：ブチル−トヨパール６５０カラム
クロマトグラフィー 工程５で得られた酵素溶液を、２０％の硫酸アンモニウ
ムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5)に溶解
し、得られた酵素液を予め同組成の緩衝液で平衡化した
ブチル−トヨパール６５０カラム（東ソー株式会社製）
に負荷し、同緩衝液でカラムを洗浄後、硫酸アンモニウ
ムの直線密度勾配（２０〜０％）によって溶出し、活性
画分を回収した。なお、この操作を２度行ない、２回目
に回収された活性画分を回収し、精製酵素標品とした。
表２に、精製過程における総タンパク量、総活性、比活
性、収率および精製度を示す。なお、総タンパク量は紫
外部吸収（Ａ280 ）の測定により求めた。
クロマトグラフィー 工程５で得られた酵素溶液を、２０％の硫酸アンモニウ
ムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5)に溶解
し、得られた酵素液を予め同組成の緩衝液で平衡化した
ブチル−トヨパール６５０カラム（東ソー株式会社製）
に負荷し、同緩衝液でカラムを洗浄後、硫酸アンモニウ
ムの直線密度勾配（２０〜０％）によって溶出し、活性
画分を回収した。なお、この操作を２度行ない、２回目
に回収された活性画分を回収し、精製酵素標品とした。
表２に、精製過程における総タンパク量、総活性、比活
性、収率および精製度を示す。なお、総タンパク量は紫
外部吸収（Ａ280 ）の測定により求めた。
【００２５】
【表２】
【００２６】［酵素の純度検定］上記精製によって得ら
れた精製酵素を用いて、Ｌａｅｍｍｌｉ法によりポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行なった。泳動後、蛋白質
をクマシーブルー染色によって検出したところ、単一な
バンドが得られた。
れた精製酵素を用いて、Ｌａｅｍｍｌｉ法によりポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行なった。泳動後、蛋白質
をクマシーブルー染色によって検出したところ、単一な
バンドが得られた。
【００２７】
【発明の効果】本発明によれば、ストレプトミセス属に
属する菌株（Streptomyces sp. ）により、プロリンを
含有するペプチドを、従来知られたペプチダーゼとは異
なった認識部位において切断し、肉類の改質や、ポリペ
プチドや蛋白の構造解析の試薬等として有用である新規
なポストプロリンエンドペプチダーゼおよびその製造方
法が提供される。
属する菌株（Streptomyces sp. ）により、プロリンを
含有するペプチドを、従来知られたペプチダーゼとは異
なった認識部位において切断し、肉類の改質や、ポリペ
プチドや蛋白の構造解析の試薬等として有用である新規
なポストプロリンエンドペプチダーゼおよびその製造方
法が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 新 隆志 熊本県熊本市池田４−５−２ 吉永ビル 505号 (72)発明者 村尾 澤夫 大阪府堺市堀上緑町２−８−12
Claims (2)
- 【請求項１】 次の性質を有するポストプロリンエンド
ペプチダーゼ。 (1) 作用および基質特異性 プロリンを含有する下記ペプチドのプロリンとパラ
ニトロアニリンのアミド結合、およびカゼインの加水分
解を触媒する。 Z-Ala-Ala-Pro-pNA ，Bz(pOH)-Gly-Ala-Pro-pNA 以下のペプチドを加水分解しない。 Z-Gly-Pro-pNA ， Boc-Ala-Pro-pNA ， Ala-Pro-pNA
， Pro-pNA（上記式中、Boc はｔ−ブチルオキシカル
ボニル基、Bz(pOH) はｐ−ヒドロキシベンゾイル基、、
pNA はｐ−ニトロアニリド基、Z はカルボベンゾキシ基
を表わす。） (2) 至適ｐＨおよび安定ｐＨ 至適ｐＨは７付近であり、安定ｐＨは6.0 〜8.0 であ
る。 (3) 作用温度 Z-Ala-Ala-Pro-pNA を基質としたとき、作用温度範囲は
２０〜５０℃で、至適作用温度は４０℃付近である。 (4) 温度安定性 Z-Ala-Ala-Pro-pNA を基質としたとき、４０℃まで安定
で、５０℃で失活する。 (5) 各種因子による影響 フェニルメタンスルホニルフルオリドで１００％阻害さ
れ、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、アンチパインおよび
ロイペプシンで約５０％まで阻害される。 (6) 等電点 イオン交換樹脂に対する吸着性から推定される等電点ｐ
Ｉは6.2 〜7.0 である。 (7) 分子量 ＳＤＳ電気泳動による分子量は47,000である。 - 【請求項２】 ストレプトミセス属（Streptomyces）に
属し、請求項１に記載の酵素を生産する能力を有する微
生物を培養し、その培養液の遠心上清から前記酵素を採
取することを特徴とする請求項１記載のペプチダーゼの
製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8333292A JPH05244947A (ja) | 1992-03-04 | 1992-03-04 | 新規ポストプロリンエンドペプチダーゼおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8333292A JPH05244947A (ja) | 1992-03-04 | 1992-03-04 | 新規ポストプロリンエンドペプチダーゼおよびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05244947A true JPH05244947A (ja) | 1993-09-24 |
Family
ID=13799481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8333292A Pending JPH05244947A (ja) | 1992-03-04 | 1992-03-04 | 新規ポストプロリンエンドペプチダーゼおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05244947A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001023591A1 (fr) * | 1999-09-30 | 2001-04-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Procédé de production de transglutaminase |
| JP2001136995A (ja) * | 1999-11-11 | 2001-05-22 | Calpis Co Ltd | トリペプチドの製造方法 |
| JP2010183918A (ja) * | 2010-06-01 | 2010-08-26 | Calpis Co Ltd | トリペプチドの製造方法 |
-
1992
- 1992-03-04 JP JP8333292A patent/JPH05244947A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001023591A1 (fr) * | 1999-09-30 | 2001-04-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Procédé de production de transglutaminase |
| US7723067B2 (en) | 1999-09-30 | 2010-05-25 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing transglutaminase |
| JP2001136995A (ja) * | 1999-11-11 | 2001-05-22 | Calpis Co Ltd | トリペプチドの製造方法 |
| JP2010183918A (ja) * | 2010-06-01 | 2010-08-26 | Calpis Co Ltd | トリペプチドの製造方法 |
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