JP3107639B2 - アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼおよびその製造方法 - Google Patents
アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼおよびその製造方法Info
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- JP3107639B2 JP3107639B2 JP04077577A JP7757792A JP3107639B2 JP 3107639 B2 JP3107639 B2 JP 3107639B2 JP 04077577 A JP04077577 A JP 04077577A JP 7757792 A JP7757792 A JP 7757792A JP 3107639 B2 JP3107639 B2 JP 3107639B2
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアセチルアミノメチルシ
クロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼに
関するものである。
クロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼに
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】アセチルアミノメチルシクロヘキサンカ
ルボン酸エステルアミドヒドロラーゼは、アセチルアミ
ノメチルシクロヘキサンカルボン酸（カルボキシエチ
ル）フェニルエステル（以下Ａｃ−ＣＣＰエステルと略
称する）を加水分解して、アミノメチルシクロヘキサン
カルボン酸（カルボキシエチル）フェニルエステル（以
下ＣＣＰエステルと略称する）を生成する酵素である。
ルボン酸エステルアミドヒドロラーゼは、アセチルアミ
ノメチルシクロヘキサンカルボン酸（カルボキシエチ
ル）フェニルエステル（以下Ａｃ−ＣＣＰエステルと略
称する）を加水分解して、アミノメチルシクロヘキサン
カルボン酸（カルボキシエチル）フェニルエステル（以
下ＣＣＰエステルと略称する）を生成する酵素である。
【０００３】従来、Ａｃ−ＣＣＰエステルに作用するア
ミド ヒドロラーゼに関する知見はほとんどなく、工業
的に利用できる技術が確立されていない。またＡｃ−Ｃ
ＣＰエステルからＣＣＰエステルを有機化学的に得よう
とする際には、Ａｃ−ＣＣＰエステルのエステル部分が
加水分解され、分離精製が煩雑である上、収率が低いと
いう問題点があった。
ミド ヒドロラーゼに関する知見はほとんどなく、工業
的に利用できる技術が確立されていない。またＡｃ−Ｃ
ＣＰエステルからＣＣＰエステルを有機化学的に得よう
とする際には、Ａｃ−ＣＣＰエステルのエステル部分が
加水分解され、分離精製が煩雑である上、収率が低いと
いう問題点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする問題点】上記の背景から、Ａ
ｃ−ＣＣＰエステルに作用しＣＣＰエステルを生成する
酵素、 アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン
酸エステルアミドヒドロラーゼを見い出すことが望まれ
ていた。
ｃ−ＣＣＰエステルに作用しＣＣＰエステルを生成する
酵素、 アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン
酸エステルアミドヒドロラーゼを見い出すことが望まれ
ていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる従
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、Ａｃ−ＣＣＰ
エステルに作用しＣＣＰエステルを生成する酵素、アセ
チルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルア
ミドヒドロラーゼを微生物中に見出し、かつまたアルカ
リゲネス属、シュードモナス属、フザリウム属またはキ
ャディダ属に属する微生物がアセチルアミノメチルシク
ロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼを多
く産生することを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、Ａｃ−ＣＣＰ
エステルに作用しＣＣＰエステルを生成する酵素、アセ
チルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルア
ミドヒドロラーゼを微生物中に見出し、かつまたアルカ
リゲネス属、シュードモナス属、フザリウム属またはキ
ャディダ属に属する微生物がアセチルアミノメチルシク
ロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼを多
く産生することを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００６】即ち、本発明は以下の理化学的性質を有す
るアセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エス
テルアミドヒドロラーゼを提供するものであり、他の発
明は、アルカリゲネス属、シュードモナス属、フザリウ
ム属またはキャンディダ属に属し、アセチルアミノメチ
ルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラー
ゼ生産能を有する微生物を培養し、培養物からアセチル
アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミド
ヒドロラーゼを採取することを特徴とする、該理化学的
性質を有するアセチルアミノメチルシクロヘキサンカル
ボン酸エステルアミドヒドロラーゼの製造方法である。
るアセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エス
テルアミドヒドロラーゼを提供するものであり、他の発
明は、アルカリゲネス属、シュードモナス属、フザリウ
ム属またはキャンディダ属に属し、アセチルアミノメチ
ルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラー
ゼ生産能を有する微生物を培養し、培養物からアセチル
アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミド
ヒドロラーゼを採取することを特徴とする、該理化学的
性質を有するアセチルアミノメチルシクロヘキサンカル
ボン酸エステルアミドヒドロラーゼの製造方法である。
【０００７】本発明のアセチルアミノメチルシクロヘキ
サンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼは、以下の
理化学的性質を有する。
サンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼは、以下の
理化学的性質を有する。
【０００８】（１）作用 Ａｃ−ＣＣＰエステルに作用して、アミド結合を加水分
解し、ＣＣＰエステルを生成する。
解し、ＣＣＰエステルを生成する。
【０００９】（２）基質特異性：トランス−４−アセチ
ルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸−４’−
（２”−カルボキシエチル）フェニルエステル（以下Ａ
ｃ−ＡＭＣＣＰエステルと略称する）、アセチルプトレ
ッシン等に作用する。
ルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸−４’−
（２”−カルボキシエチル）フェニルエステル（以下Ａ
ｃ−ＡＭＣＣＰエステルと略称する）、アセチルプトレ
ッシン等に作用する。
【００１０】（３）至適ｐＨ： ｐＨ ８．５〜１０．０ （４）ｐＨ安定性：３０℃で１時間保存した時、ｐＨ
６．０〜１０．０において９０％以上の残存活性を有す
る。（５）分子量：１１５，０００±５，０００（ゲル濾過
法で測定）
６．０〜１０．０において９０％以上の残存活性を有す
る。（５）分子量：１１５，０００±５，０００（ゲル濾過
法で測定）
【００１１】また、本発明のアセチルアミノメチルシク
ロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼが有
するその他の理化学的性質は以下の通りである。
ロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼが有
するその他の理化学的性質は以下の通りである。
【００１２】１．至適温度：ｐＨ ９．５、３０分間の
反応において、５５〜６０℃である。
反応において、５５〜６０℃である。
【００１３】２．温度安定性：ｐＨ ９．５、１時間の
処理条件下において、４０℃までの温度で９０％以上の
残存活性を有する。
処理条件下において、４０℃までの温度で９０％以上の
残存活性を有する。
【００１４】本発明におけるアセチルアミノメチルシク
ロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼの酵
素活性測定方法及び酵素活性の表示方法は以下の通りで
ある。
ロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼの酵
素活性測定方法及び酵素活性の表示方法は以下の通りで
ある。
【００１５】（活性測定法）１０ｍＭのＡｃ−ＡＭＣＣ
Ｐエステルを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５０μＬとアセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボ
ン酸エステルアミドヒドロラーゼを含有する被検体５０
μＬを混合し、３７℃で１時間反応させた後、１０％ト
リクロロ酢酸５０μＬ加え０℃下で１５分間放置し、次
いで１Ｍリン酸水素二ナトリウム５０μＬ、水２００μ
Ｌを加える。この溶液に下記試薬（ａ）および（ｂ）を
それぞれ３００μＬずつ加えて混合し、１００℃で１５
分間反応させ、冷却した後さらに試薬（ｃ）を１ｍＬ加
えて混合し、５７０ｎｍの吸光度を測定する。予めトラ
ンス−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸−
４’−（２”−カルボキシエチル）フェニルエステル
（以下ＡＭＣＣＰエステルと略称する）を用いて作成し
た検量線より、生成したＡＭＣＣＰエステルを定量し、
酵素活性を算出する。
Ｐエステルを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５０μＬとアセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボ
ン酸エステルアミドヒドロラーゼを含有する被検体５０
μＬを混合し、３７℃で１時間反応させた後、１０％ト
リクロロ酢酸５０μＬ加え０℃下で１５分間放置し、次
いで１Ｍリン酸水素二ナトリウム５０μＬ、水２００μ
Ｌを加える。この溶液に下記試薬（ａ）および（ｂ）を
それぞれ３００μＬずつ加えて混合し、１００℃で１５
分間反応させ、冷却した後さらに試薬（ｃ）を１ｍＬ加
えて混合し、５７０ｎｍの吸光度を測定する。予めトラ
ンス−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸−
４’−（２”−カルボキシエチル）フェニルエステル
（以下ＡＭＣＣＰエステルと略称する）を用いて作成し
た検量線より、生成したＡＭＣＣＰエステルを定量し、
酵素活性を算出する。
【００１６】（試薬） （ａ） １０ｍＭシアン化カリウムおよび４Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．１）の１：５０混合液 （ｂ） ３％ニンヒドリンのメトキシエタノール溶液 （ｃ） ５０％２−プロパノール水溶液 酵素活性値は１分間当り１μｍｏｌｅのＡＭＣＣＰエス
テルを生成させる酵素量を１ユニット（μｍｏｌｅ／ｍ
ｉｎ）として表示する。
液（ｐＨ５．１）の１：５０混合液 （ｂ） ３％ニンヒドリンのメトキシエタノール溶液 （ｃ） ５０％２−プロパノール水溶液 酵素活性値は１分間当り１μｍｏｌｅのＡＭＣＣＰエス
テルを生成させる酵素量を１ユニット（μｍｏｌｅ／ｍ
ｉｎ）として表示する。
【００１７】本発明で使用するＡｃ−ＣＣＰエステルま
たはその塩は、一般式（Ｉ）で示される化合物である。
たはその塩は、一般式（Ｉ）で示される化合物である。
【００１８】
【化１】
【００１９】（式中Ｍは水素原子、アンモニウム基また
は金属原子である） 上記一般式（Ｉ）中Ｍで示される金属原子は、Ａｃ−Ｃ
ＣＰエステルの塩を形成する金属原子が特に限定されず
選びうるが、特にナトリウム、カリウム等のアルカリ金
属の原子が好適である。
は金属原子である） 上記一般式（Ｉ）中Ｍで示される金属原子は、Ａｃ−Ｃ
ＣＰエステルの塩を形成する金属原子が特に限定されず
選びうるが、特にナトリウム、カリウム等のアルカリ金
属の原子が好適である。
【００２０】本発明のアセチルアミノメチルシクロヘキ
サンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼは、該アセ
チルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルア
ミドヒドロラーゼの生産能のある微生物の培養物から採
取することができる。 その微生物としては、アルカリ
ゲネス属、シュードモナス属、フザリウム属またはキャ
ンディダ属に属し、アセチルアミノメチルシクロヘキサ
ンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼの生産能を有
するものであれば既存の菌株、自然界から新たに分離さ
れた菌株、およびこれらの変異株のいずれでも使用する
ことができる。さらに、これらのアルカリゲネス属、シ
ュードモナス属、フザリウム属またはキャンディダ属に
属し、アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸
エステルアミドヒドロラーゼの生産能を有する微生物か
らアセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エス
テルアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を単離し、
その遺伝子を同属あるいは他の属に属する微生物内にて
発現させるように導入して得られるアセチルアミノメチ
ルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラー
ゼ生産菌も使用することができる。
サンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼは、該アセ
チルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルア
ミドヒドロラーゼの生産能のある微生物の培養物から採
取することができる。 その微生物としては、アルカリ
ゲネス属、シュードモナス属、フザリウム属またはキャ
ンディダ属に属し、アセチルアミノメチルシクロヘキサ
ンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼの生産能を有
するものであれば既存の菌株、自然界から新たに分離さ
れた菌株、およびこれらの変異株のいずれでも使用する
ことができる。さらに、これらのアルカリゲネス属、シ
ュードモナス属、フザリウム属またはキャンディダ属に
属し、アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸
エステルアミドヒドロラーゼの生産能を有する微生物か
らアセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エス
テルアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を単離し、
その遺伝子を同属あるいは他の属に属する微生物内にて
発現させるように導入して得られるアセチルアミノメチ
ルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラー
ゼ生産菌も使用することができる。
【００２１】本発明のアセチルアミノメチルシクロヘキ
サンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼの製造方法
は、アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エ
ステルアミドヒドロラーゼの生産能のあるアルカリゲネ
ス属、シュードモナス属、フザリウム属またはキャンデ
ィダ属に属する微生物の培養物からアセチルアミノメチ
ルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラー
ゼを採取する方法であるが、アルカリゲネス属、シュー
ドモナス属、フザリウム属またはキャンディダ属に属す
る微生物の菌株としては、例えばアルカリゲネス・フェ
カリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓＩ
ＦＯ １４４７９）、シュードモナス・ソラナシアルム
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ
ＩＦＯ ３５０９）、フザリウム・オキシスポラム
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＩＦＯ ７
１９０）、キャンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ
ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ ＩＦＯ０４５４ ）等
が挙げられる。
サンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼの製造方法
は、アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エ
ステルアミドヒドロラーゼの生産能のあるアルカリゲネ
ス属、シュードモナス属、フザリウム属またはキャンデ
ィダ属に属する微生物の培養物からアセチルアミノメチ
ルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラー
ゼを採取する方法であるが、アルカリゲネス属、シュー
ドモナス属、フザリウム属またはキャンディダ属に属す
る微生物の菌株としては、例えばアルカリゲネス・フェ
カリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓＩ
ＦＯ １４４７９）、シュードモナス・ソラナシアルム
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ
ＩＦＯ ３５０９）、フザリウム・オキシスポラム
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＩＦＯ ７
１９０）、キャンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ
ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ ＩＦＯ０４５４ ）等
が挙げられる。
【００２２】上記の各微生物を培養するにあたって使用
する培地としては公知のものが使用される。例えばグル
コース、糖蜜、可溶性でんぷん等の炭素源、肉エキス、
酵母エキス、ポリペプトン等の窒素源、およびリン酸第
一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化ナトリウム、硫
酸マグネシウム等の無機塩類を含有するものであれば特
に限定されないが、これらの成分の他にＡｃ−ＣＣＰエ
ステルやアセチルプトレッシン等のアセトアミド化合物
を含有させることが該酵素の生産性を高める上において
有利である。
する培地としては公知のものが使用される。例えばグル
コース、糖蜜、可溶性でんぷん等の炭素源、肉エキス、
酵母エキス、ポリペプトン等の窒素源、およびリン酸第
一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化ナトリウム、硫
酸マグネシウム等の無機塩類を含有するものであれば特
に限定されないが、これらの成分の他にＡｃ−ＣＣＰエ
ステルやアセチルプトレッシン等のアセトアミド化合物
を含有させることが該酵素の生産性を高める上において
有利である。
【００２３】本発明のアセチルアミノメチルシクロヘキ
サンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼを生産する
生産菌を培養する際の培養条件としては、通気攪拌条件
下で培養温度が１５〜４０℃の範囲、好ましくは２０〜
３５℃の範囲で培養する方法が好適である。培養時のｐ
Ｈ条件は、ｐＨ５．０〜９．０の範囲で、好ましくはｐ
Ｈ６．０〜８．０の範囲が適当である。培養時間は、特
に限定されないが酵素の生産性等の経済性を考慮すると
増殖の後期に達する時間から休止状態に入ってから１０
〜３０時間以内の範囲が適当である。
サンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼを生産する
生産菌を培養する際の培養条件としては、通気攪拌条件
下で培養温度が１５〜４０℃の範囲、好ましくは２０〜
３５℃の範囲で培養する方法が好適である。培養時のｐ
Ｈ条件は、ｐＨ５．０〜９．０の範囲で、好ましくはｐ
Ｈ６．０〜８．０の範囲が適当である。培養時間は、特
に限定されないが酵素の生産性等の経済性を考慮すると
増殖の後期に達する時間から休止状態に入ってから１０
〜３０時間以内の範囲が適当である。
【００２４】培養によって得られた培養物から培養液と
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法や濾過等の方法が使用できるが、遠心分離法
が好適である。
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法や濾過等の方法が使用できるが、遠心分離法
が好適である。
【００２５】本発明のアセチルアミノメチルシクロヘキ
サンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼの分離精製
は、次のようにして行うことができる。
サンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼの分離精製
は、次のようにして行うことができる。
【００２６】菌体内に蓄積された該酵素を菌体から抽出
する方法としては、従来から行われている超音波による
菌体破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させるダ
イノミル細胞破砕機による菌体破砕、またはリゾチーム
等の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破壊等
の方法が挙げられる。これらの中から適当な方法を選択
して菌体から酵素の抽出を行うことにより、酵素を採取
することができる。
する方法としては、従来から行われている超音波による
菌体破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させるダ
イノミル細胞破砕機による菌体破砕、またはリゾチーム
等の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破壊等
の方法が挙げられる。これらの中から適当な方法を選択
して菌体から酵素の抽出を行うことにより、酵素を採取
することができる。
【００２７】これらの方法で抽出された粗酵素液からア
セチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステル
アミドヒドロラーゼをさらに精製する必要がある場合に
は、通常実施されている一般的な酵素の精製手段である
硫酸アンモニウム沈澱法、イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー法、ゲル濾過法、ヒドロキシアパタイトカラム
クロマトグラフィー法、アフィニティーカラムクロマト
グラフィー法、調製用電気泳動法等の方法を適宜組み合
わせるか、あるいは繰り返すことによって精製を行うこ
とができる。
セチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステル
アミドヒドロラーゼをさらに精製する必要がある場合に
は、通常実施されている一般的な酵素の精製手段である
硫酸アンモニウム沈澱法、イオン交換カラムクロマトグ
ラフィー法、ゲル濾過法、ヒドロキシアパタイトカラム
クロマトグラフィー法、アフィニティーカラムクロマト
グラフィー法、調製用電気泳動法等の方法を適宜組み合
わせるか、あるいは繰り返すことによって精製を行うこ
とができる。
【００２８】
【効果】本発明のアセチルアミノメチルシクロヘキサン
カルボン酸エステルアミドヒドロラーゼは、Ａｃ−ＣＣ
Ｐエステルに作用して、ＣＣＰエステルを生成する。従
って本発明のアセチルアミノメチルシクロヘキサンカル
ボン酸エステルアミドヒドロラーゼを用いることによ
り、胃炎、胃潰瘍治療剤および抗プラスミン剤としてす
ぐれた作用を有するトランス−４−アミノメチルシクロ
ヘキサンカルボン酸−４′−（２″−カルボキシエチ
ル）フェニルエステルおよびその塩の製造を、トランス
−４−アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸
−４′−（２″−カルボキシエチル）フェニルエステル
またはその塩を原料として、生化学的方法により温和な
条件で行うことができる。
カルボン酸エステルアミドヒドロラーゼは、Ａｃ−ＣＣ
Ｐエステルに作用して、ＣＣＰエステルを生成する。従
って本発明のアセチルアミノメチルシクロヘキサンカル
ボン酸エステルアミドヒドロラーゼを用いることによ
り、胃炎、胃潰瘍治療剤および抗プラスミン剤としてす
ぐれた作用を有するトランス−４−アミノメチルシクロ
ヘキサンカルボン酸−４′−（２″−カルボキシエチ
ル）フェニルエステルおよびその塩の製造を、トランス
−４−アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸
−４′−（２″−カルボキシエチル）フェニルエステル
またはその塩を原料として、生化学的方法により温和な
条件で行うことができる。
【００２９】本発明のアセチルアミノメチルシクロヘキ
サンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼは、アセチ
ルポリアミンに作用してポリアミンを生成するため、ア
セチルポリアミンの遊離化および定量に利用できる。
サンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼは、アセチ
ルポリアミンに作用してポリアミンを生成するため、ア
セチルポリアミンの遊離化および定量に利用できる。
【００３０】また本発明は、アルカリゲネス属、シュー
ドモナス属、フザリウム属またはキャンディダ属に属
し、アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エ
ステルアミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物を培養
し、その培養物からアセチルアミノメチルシクロヘキサ
ンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼを採取するこ
とを特徴とするアセチルアミノメチルシクロヘキサンカ
ルボン酸エステルアミドヒドロラーゼの製造方法であ
る。本発明により、Ａｃ−ＣＣＰエステルに作用するア
ミドヒドロラーゼを工業的に製造できる技術を提供す
る。
ドモナス属、フザリウム属またはキャンディダ属に属
し、アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エ
ステルアミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物を培養
し、その培養物からアセチルアミノメチルシクロヘキサ
ンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼを採取するこ
とを特徴とするアセチルアミノメチルシクロヘキサンカ
ルボン酸エステルアミドヒドロラーゼの製造方法であ
る。本発明により、Ａｃ−ＣＣＰエステルに作用するア
ミドヒドロラーゼを工業的に製造できる技術を提供す
る。
【００３１】以下、実施例により本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。
【００３２】
実施例１ ０．５％ポリペプトン、０．０１％酵母エキス、０．３
％ジアセチルプトレッシン、０．１％食塩、０．０５％
リン酸第一カリウム、０．１５％リン酸第二カリウム、
０．０２％消泡剤から成る培地（ｐＨ７．０）０．５
Ｌを２Ｌの三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間オ
ートクレーブした後、２８℃以下でこの培地にシュード
モナス・ソラナシアルム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓ
ｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＩＦＯ ３５０９）を植菌し
た。２８℃で４８時間振とう培養を行った後この培養液
を、予め上記と同様の組成を有する培地２０Ｌを仕込み
減菌しておいたジャー・ファーメンターに加えて本培養
を行った。培養条件は２８℃、攪拌回転数１００ｒｐ
ｍ、通気２０Ｌ／ｍｉｎで、４８時間培養の後、培養液
を遠心分離にかけて菌体を採取した。得られた菌体の８
０ｇ（湿菌体重量）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）８００ｍＬに懸濁し、その懸濁液を超音波破砕機に
より菌体破砕を行った。その破砕液を遠心分離機を使用
して遠心分離し、上清液を得た。この上清液中のアセチ
ルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミ
ドヒドロラーゼの総活性は３２０ユニット、比活性は
０．０２８ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
％ジアセチルプトレッシン、０．１％食塩、０．０５％
リン酸第一カリウム、０．１５％リン酸第二カリウム、
０．０２％消泡剤から成る培地（ｐＨ７．０）０．５
Ｌを２Ｌの三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間オ
ートクレーブした後、２８℃以下でこの培地にシュード
モナス・ソラナシアルム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓ
ｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＩＦＯ ３５０９）を植菌し
た。２８℃で４８時間振とう培養を行った後この培養液
を、予め上記と同様の組成を有する培地２０Ｌを仕込み
減菌しておいたジャー・ファーメンターに加えて本培養
を行った。培養条件は２８℃、攪拌回転数１００ｒｐ
ｍ、通気２０Ｌ／ｍｉｎで、４８時間培養の後、培養液
を遠心分離にかけて菌体を採取した。得られた菌体の８
０ｇ（湿菌体重量）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）８００ｍＬに懸濁し、その懸濁液を超音波破砕機に
より菌体破砕を行った。その破砕液を遠心分離機を使用
して遠心分離し、上清液を得た。この上清液中のアセチ
ルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミ
ドヒドロラーゼの総活性は３２０ユニット、比活性は
０．０２８ユニット／ｍｇ−タンパクであった。
【００３３】この上清液を、予め１０ｍＭのリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で平衡化した１．２Ｌのジエチルアミ
ノエチルーセルロース（以下ＤＥＡＥ−セルロースと略
記する）のカラムに通し酵素を吸着させた。カラムを同
様のリン酸緩衝液で洗浄した後、食塩の直線濃度勾配に
よりアセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エ
ステルアミドヒドロラーゼを溶出させた。 この溶出液
を、１．８ＬのセファクリルＳ−３００（ファルマシア
社製）を充填したカラムに通し、ゲル濾過を行い活性画
分を集めた。
液（ｐＨ７．５）で平衡化した１．２Ｌのジエチルアミ
ノエチルーセルロース（以下ＤＥＡＥ−セルロースと略
記する）のカラムに通し酵素を吸着させた。カラムを同
様のリン酸緩衝液で洗浄した後、食塩の直線濃度勾配に
よりアセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エ
ステルアミドヒドロラーゼを溶出させた。 この溶出液
を、１．８ＬのセファクリルＳ−３００（ファルマシア
社製）を充填したカラムに通し、ゲル濾過を行い活性画
分を集めた。
【００３４】この溶出液を、再度５０ｍＬのＤＥＡＥ−
セルロースのカラムに通し吸着させ、食塩の直線濃度勾
配により、アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボ
ン酸エステルアミドヒドロラーゼを溶出させた。 この
溶出液を、２１．５ｍｍｘ６００ｍｍのＴＳＫ−２５０
（高速液体クロマトグラフィー以下（ＨＰＬＣと略記す
る）用、東ソー社製）のカラムを通してゲル濾過を行
い、活性画分を集めた。さらに７．５ｍｍｘ１００ｍｍ
のトーネン フルオロアパタイト（ＨＰＬＣ用、東燃社
製）カラムを通して活性画分を集め、透析により脱塩し
限外濾過により濃縮した。この様ににして得られた酵素
の総活性は、１７．２ユニット、比活性は１９．９ユニ
ット／ｍｇ−タンパクで、得られた酵素の純度をドデシ
ル硫酸ナトリウム存在下、および非存在下でのポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって調べた結果、両者共に
一本のバンドのみが観察され、純粋なアセチルアミノメ
チルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラ
ーゼであることが確認された。
セルロースのカラムに通し吸着させ、食塩の直線濃度勾
配により、アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボ
ン酸エステルアミドヒドロラーゼを溶出させた。 この
溶出液を、２１．５ｍｍｘ６００ｍｍのＴＳＫ−２５０
（高速液体クロマトグラフィー以下（ＨＰＬＣと略記す
る）用、東ソー社製）のカラムを通してゲル濾過を行
い、活性画分を集めた。さらに７．５ｍｍｘ１００ｍｍ
のトーネン フルオロアパタイト（ＨＰＬＣ用、東燃社
製）カラムを通して活性画分を集め、透析により脱塩し
限外濾過により濃縮した。この様ににして得られた酵素
の総活性は、１７．２ユニット、比活性は１９．９ユニ
ット／ｍｇ−タンパクで、得られた酵素の純度をドデシ
ル硫酸ナトリウム存在下、および非存在下でのポリアク
リルアミドゲル電気泳動によって調べた結果、両者共に
一本のバンドのみが観察され、純粋なアセチルアミノメ
チルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラ
ーゼであることが確認された。
【００３５】次に、こうして得られた精製酵素を１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）により適当に希釈して調
整した酵素標品を用いて本酵素の、基質特異性、至適ｐ
Ｈ、ｐＨ安定性、至適温度および温度安定性を調べた。
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）により適当に希釈して調
整した酵素標品を用いて本酵素の、基質特異性、至適ｐ
Ｈ、ｐＨ安定性、至適温度および温度安定性を調べた。
【００３６】（基質特異性）酵素標品５μＬを含んだ
０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
５）０．１ｍＬ（基質が、アセチルグリシン、アセチル
−Ｌ−グルタミン酸、Ｎα−アセチル−Ｌ−リジン、Ｎ
ε−アセチル−Ｌ−リジンの場合は０．１Ｍ炭酸緩衝液
を使用）と表１に示した各基質の１０ｍＭ水溶液０．１
ｍＬを混合し、３０゜Ｃで３０分間反応させた。２０％
トリクロロ酢酸０．１ｍＬを添加して反応を停止させた
後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム０．２ｍＬ、水０．３
ｍＬを加えて中和した。この溶液中の生成物をＨＰＬＣ
により定量し、酵素活性を算出した。これらの基質に対
する作用の強さを、それぞれＡｃ−ＡＭＣＣＰエステル
に対する作用を１００％とした相対活性値として表１に
示す。
０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
５）０．１ｍＬ（基質が、アセチルグリシン、アセチル
−Ｌ−グルタミン酸、Ｎα−アセチル−Ｌ−リジン、Ｎ
ε−アセチル−Ｌ−リジンの場合は０．１Ｍ炭酸緩衝液
を使用）と表１に示した各基質の１０ｍＭ水溶液０．１
ｍＬを混合し、３０゜Ｃで３０分間反応させた。２０％
トリクロロ酢酸０．１ｍＬを添加して反応を停止させた
後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム０．２ｍＬ、水０．３
ｍＬを加えて中和した。この溶液中の生成物をＨＰＬＣ
により定量し、酵素活性を算出した。これらの基質に対
する作用の強さを、それぞれＡｃ−ＡＭＣＣＰエステル
に対する作用を１００％とした相対活性値として表１に
示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】（至適pH）１０ｍＭＡｃ−ＡＭＣＣＰエス
テル溶液０．１ｍＬ、酵素標品０．０５ｍＬおよび０．
２Ｍの各種緩衝液（ｐＨ５．５、６．０、６．６：クエ
ン酸緩衝液、ｐＨ６．１、７．１、８．０：リン酸緩衝
液、ｐＨ７．６、８．２、８．７、９．２：トリス塩緩
衝液、ｐＨ８．４、８．８、９．３、９．７、１０．
５、１２．２、１２．９：グリシン−水酸化ナトリウム
緩衝液）０．０５ｍＬを混合し、３０℃で３０分間反応
させた。２０％トリクロロ酢酸０．１ｍＬを添加して反
応を停止させた後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム０．２
ｍＬ、水０．３ｍＬを加えて中和した。この溶液中の生
成ＡＭＣＣＰエステルをＨＰＬＣにより定量し、酵素活
性を算出した。以上の操作の後、最高の酵素活性値を１
００％とした相対活性を算出し、表２に示した。表２よ
り、本酵素の至適ｐＨは８．５〜１０．０の範囲にある
ことがわかる。
テル溶液０．１ｍＬ、酵素標品０．０５ｍＬおよび０．
２Ｍの各種緩衝液（ｐＨ５．５、６．０、６．６：クエ
ン酸緩衝液、ｐＨ６．１、７．１、８．０：リン酸緩衝
液、ｐＨ７．６、８．２、８．７、９．２：トリス塩緩
衝液、ｐＨ８．４、８．８、９．３、９．７、１０．
５、１２．２、１２．９：グリシン−水酸化ナトリウム
緩衝液）０．０５ｍＬを混合し、３０℃で３０分間反応
させた。２０％トリクロロ酢酸０．１ｍＬを添加して反
応を停止させた後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム０．２
ｍＬ、水０．３ｍＬを加えて中和した。この溶液中の生
成ＡＭＣＣＰエステルをＨＰＬＣにより定量し、酵素活
性を算出した。以上の操作の後、最高の酵素活性値を１
００％とした相対活性を算出し、表２に示した。表２よ
り、本酵素の至適ｐＨは８．５〜１０．０の範囲にある
ことがわかる。
【００３９】
【表２】
【００４０】（pH 安定性）０．１Ｍの各種緩衝液（ｐ
Ｈ４．５、５．０、５．５、６．０、６．６：クエン酸
緩衝液、ｐＨ６．１、６．６、７．１、８．０：リン酸
緩衝液、ｐＨ７．６、８．２、８．７、９．２：トリイ
塩緩衝液、ｐＨ８．４、８．８、９．３、９．９、１
０．５、１２．２、１２．９：グリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液）０．１ｍＬと酵素標品０．１ｍＬを混合
し、３０℃で１時間放置した後、各溶液０．０５ｍＬと
０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
５）０．４５ｍＬを混合した。この酵素溶液０．１ｍＬ
とＡｃ−ＡＭＣＣＰエステル溶液０．１ｍＬを混合し
て、３０℃で３０分間反応させた。２０％トリクロロ酢
酸０．１ｍＬを添加して反応を停止させた後、１Ｍリン
酸水素二ナトリウム０．２ｍＬ、水０．３ｍＬを加えて
中和した。この溶液中の生成ＡＭＣＣＰエステルをＨＰ
ＬＣにより定量し、酵素活性を算出した。以上の操作の
後、最高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出
し、表３に示した。。表３より、本酵素はｐＨ５．５〜
１０．２の範囲において９０％以上の残存活性を有して
いる。
Ｈ４．５、５．０、５．５、６．０、６．６：クエン酸
緩衝液、ｐＨ６．１、６．６、７．１、８．０：リン酸
緩衝液、ｐＨ７．６、８．２、８．７、９．２：トリイ
塩緩衝液、ｐＨ８．４、８．８、９．３、９．９、１
０．５、１２．２、１２．９：グリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液）０．１ｍＬと酵素標品０．１ｍＬを混合
し、３０℃で１時間放置した後、各溶液０．０５ｍＬと
０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
５）０．４５ｍＬを混合した。この酵素溶液０．１ｍＬ
とＡｃ−ＡＭＣＣＰエステル溶液０．１ｍＬを混合し
て、３０℃で３０分間反応させた。２０％トリクロロ酢
酸０．１ｍＬを添加して反応を停止させた後、１Ｍリン
酸水素二ナトリウム０．２ｍＬ、水０．３ｍＬを加えて
中和した。この溶液中の生成ＡＭＣＣＰエステルをＨＰ
ＬＣにより定量し、酵素活性を算出した。以上の操作の
後、最高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出
し、表３に示した。。表３より、本酵素はｐＨ５．５〜
１０．２の範囲において９０％以上の残存活性を有して
いる。
【００４１】
【表３】
【００４２】（至適温度）１０ｍＭＡｃ−ＡＭＣＣＰエ
ステル溶液０．１ｍＬ、酵素標品０．０５ｍＬおよび
０．２ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９．５）０．０５ｍＬを混合し、２１、３０、３７、４
０、４３、４７、５０、５５、６０、６５、７０、７
５、８０、８５゜Ｃの各温度で３０分間反応させた。各
反応溶液に２０％トリクロロ酢酸０．１ｍＬを添加して
反応を停止させた後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム０．
２ｍＬ、水０．３ｍＬを加えて中和した。この溶液中の
生成ＡＭＣＣＰエステルをＨＰＬＣにより定量し、酵素
活性を算出した。以上の操作の後、最高の酵素活性値を
１００％とした相対活性を算出し、表４に示す。表４よ
り、本酵素の至適温度は５５〜６０℃ の範囲にあるこ
とがわかる。
ステル溶液０．１ｍＬ、酵素標品０．０５ｍＬおよび
０．２ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９．５）０．０５ｍＬを混合し、２１、３０、３７、４
０、４３、４７、５０、５５、６０、６５、７０、７
５、８０、８５゜Ｃの各温度で３０分間反応させた。各
反応溶液に２０％トリクロロ酢酸０．１ｍＬを添加して
反応を停止させた後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム０．
２ｍＬ、水０．３ｍＬを加えて中和した。この溶液中の
生成ＡＭＣＣＰエステルをＨＰＬＣにより定量し、酵素
活性を算出した。以上の操作の後、最高の酵素活性値を
１００％とした相対活性を算出し、表４に示す。表４よ
り、本酵素の至適温度は５５〜６０℃ の範囲にあるこ
とがわかる。
【００４３】
【表４】
【００４４】（温度安定性）酵素標品０．１ｍＬと０．
１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）
０．１ｍＬを混合して、４、３０、３７、５０、５５、
６０、６５、７０、７７℃の各温度で１時間放置した。
この酵素溶液を０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．５）で１０倍に希釈した希釈液０．１ｍ
Ｌと１０ｍＭＡｃ−ＡＭＣＣＰエステル溶液０．１ｍＬ
を混合し、３０゜Ｃで３０分間反応させた。各反応溶液
に２０％トリクロロ酢酸０．１ｍＬを添加して反応を停
止させた後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム０．２ｍＬ、
水０．３ｍＬを加えて中和した。この溶液中の生成ＡＭ
ＣＣＰエステルをＨＰＬＣにより定量し、酵素活性を算
出した。以上の操作の後、最高の酵素活性値を１００％
とした相対活性を算出し、表５に示した。表５より、本
酵素は４０℃までの温度において９０％以上の残存活性
を有している。
１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）
０．１ｍＬを混合して、４、３０、３７、５０、５５、
６０、６５、７０、７７℃の各温度で１時間放置した。
この酵素溶液を０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．５）で１０倍に希釈した希釈液０．１ｍ
Ｌと１０ｍＭＡｃ−ＡＭＣＣＰエステル溶液０．１ｍＬ
を混合し、３０゜Ｃで３０分間反応させた。各反応溶液
に２０％トリクロロ酢酸０．１ｍＬを添加して反応を停
止させた後、１Ｍリン酸水素二ナトリウム０．２ｍＬ、
水０．３ｍＬを加えて中和した。この溶液中の生成ＡＭ
ＣＣＰエステルをＨＰＬＣにより定量し、酵素活性を算
出した。以上の操作の後、最高の酵素活性値を１００％
とした相対活性を算出し、表５に示した。表５より、本
酵素は４０℃までの温度において９０％以上の残存活性
を有している。
【００４５】
【表５】
【００４６】実施例２〜４ ０．５％ポリペプトン、０．０２％酵母エキス、０．１
％食塩、０．４％ジアセチルプトレッシン、０．０５％
リン酸第一カリウム、０．１５％リン酸第二カリウムか
ら成る培地（ｐＨ７．０）各１０ｍＬを大型試験管に分
注し、１２０゜Ｃで１５分間オートクレーブしたもの
に、表６に示す各種微生物を斜面培養から、一白金耳接
種した。２８℃で４８〜９６時間振とう培養を行った
後、各培養液をを遠心分離機にかけて菌体を採取した。
得られた菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５
ｍＬに懸濁し、その懸濁液を超音波破砕機にかけて菌体
破砕を行った。その破砕液を遠心分離機により遠心分離
し、粗酵素抽出液を得た。各粗酵素抽出液０．１２５ｍ
Ｌに、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．１２５
ｍＬおよび１０ｍＭＡｃ−ＡＭＣＣＰエステル水溶液
０．２５ｍＬを加えて３０℃で３時間反応させた。５０
％トリクロロ酢酸０．０５ｍＬを添加して反応を停止さ
せた後、０．５Ｍ酢酸ナトリウム０．５ｍＬ、水０．４
５ｍＬを加えて中和させた。この溶液中の生成ＡＭＣＣ
Ｐエステルを高速液体クロマトグラフィーにより定量し
た結果を表６に示した。表中の生成ＡＭＣＣＰエステル
は、３０℃、３時間の反応で、０．１２５ｍＬの粗酵素
抽出液の作用により生成したＡＭＣＣＰエステル量であ
り、培地１ｍＬ当りの活性とは、粗酵素抽出液の酵素活
性を元の培養液１ｍＬ当りに換算したものである。
％食塩、０．４％ジアセチルプトレッシン、０．０５％
リン酸第一カリウム、０．１５％リン酸第二カリウムか
ら成る培地（ｐＨ７．０）各１０ｍＬを大型試験管に分
注し、１２０゜Ｃで１５分間オートクレーブしたもの
に、表６に示す各種微生物を斜面培養から、一白金耳接
種した。２８℃で４８〜９６時間振とう培養を行った
後、各培養液をを遠心分離機にかけて菌体を採取した。
得られた菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５
ｍＬに懸濁し、その懸濁液を超音波破砕機にかけて菌体
破砕を行った。その破砕液を遠心分離機により遠心分離
し、粗酵素抽出液を得た。各粗酵素抽出液０．１２５ｍ
Ｌに、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．１２５
ｍＬおよび１０ｍＭＡｃ−ＡＭＣＣＰエステル水溶液
０．２５ｍＬを加えて３０℃で３時間反応させた。５０
％トリクロロ酢酸０．０５ｍＬを添加して反応を停止さ
せた後、０．５Ｍ酢酸ナトリウム０．５ｍＬ、水０．４
５ｍＬを加えて中和させた。この溶液中の生成ＡＭＣＣ
Ｐエステルを高速液体クロマトグラフィーにより定量し
た結果を表６に示した。表中の生成ＡＭＣＣＰエステル
は、３０℃、３時間の反応で、０．１２５ｍＬの粗酵素
抽出液の作用により生成したＡＭＣＣＰエステル量であ
り、培地１ｍＬ当りの活性とは、粗酵素抽出液の酵素活
性を元の培養液１ｍＬ当りに換算したものである。
【００４７】
【表６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:77 1:72） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/80 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するアセチルア
ミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒ
ドロラーゼ （１）作用：アセチルアミノメチルシクロヘキサンカル
ボン酸（カルボキシエチル）フェニルエステルを加水分
解して、アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸（カル
ボキシエチル）フェニルエステルを生成する。 （２）基質特異性：トランス−４−アセチルアミノメチ
ルシクロヘキサンカルボン酸−４’−（２”−カルボキ
シエチル）フェニルエステル、アセチルプトレッシン等
に作用する。 （３）至適ｐＨ： ｐＨ ８．５〜１０．０ （４）ｐＨ安定性：３０℃で１時間保存した時、ｐＨ
６．０〜１０．０において９０％以上の残存活性を有す
る。（５）分子量：１１５，０００±５，０００（ゲル濾過
法で測定） - 【請求項２】 アルカリゲネス属、シュードモナス属、
フザリウム属またはキャンディダ属に属し、アセチルア
ミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒ
ドロラーゼ生産能を有する微生物を培養し、培養物から
アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステ
ルアミドヒドロラーゼを採取することを特徴とする、請
求項１に記載のアセチルアミノメチルシクロヘキサンカ
ルボン酸エステルアミドヒドロラーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04077577A JP3107639B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04077577A JP3107639B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼおよびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05276944A JPH05276944A (ja) | 1993-10-26 |
| JP3107639B2 true JP3107639B2 (ja) | 2000-11-13 |
Family
ID=13637853
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04077577A Expired - Fee Related JP3107639B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-03-31 | アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3107639B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6396566B2 (en) | 1997-12-26 | 2002-05-28 | Canon Kabushiki Kaisha | Stage system for exposure apparatus and device manufacturing method in which a stage supporting member and a countermass supporting member provide vibration isolation |
-
1992
- 1992-03-31 JP JP04077577A patent/JP3107639B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6396566B2 (en) | 1997-12-26 | 2002-05-28 | Canon Kabushiki Kaisha | Stage system for exposure apparatus and device manufacturing method in which a stage supporting member and a countermass supporting member provide vibration isolation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05276944A (ja) | 1993-10-26 |
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