JPS61135585A - Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 - Google Patents
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPS61135585A JPS61135585A JP25632284A JP25632284A JPS61135585A JP S61135585 A JPS61135585 A JP S61135585A JP 25632284 A JP25632284 A JP 25632284A JP 25632284 A JP25632284 A JP 25632284A JP S61135585 A JPS61135585 A JP S61135585A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- acylneuraminic
- enzyme
- acid aldolase
- aldolase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法
、特にノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉｉ ）属又はスト
レプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ） ＰＡに
属し、Ｎ−アシルノイラミン酸アμドラーゼ生産能ヲ有
スる菌株によるＮ−アＶ／Ｉ／ノイフミン酸ア〃ドラー
ゼを製造する方法に関する。
、特にノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉｉ ）属又はスト
レプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ） ＰＡに
属し、Ｎ−アシルノイラミン酸アμドラーゼ生産能ヲ有
スる菌株によるＮ−アＶ／Ｉ／ノイフミン酸ア〃ドラー
ゼを製造する方法に関する。
（従来の技術）
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ（Ｎ−ａｃｙｌｎ
ｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ）は別名シア
ル酸ア〃ドフーゼとも呼ばれ、国際生化学連合酵素委員
会の酵素番号Ｅ、 Ｃ１４，１，３，３，に分類され、
系統名ではＮ−アンルノイツミン酸：ピμビン酸リアー
ゼ（Ｎ−ａｃｙｌｎｅｕｒａｍ％ｎａｔｅ ： ｐｙｒ
ｕｖａｔｅ １ｙａｓｅ ）と呼ばれている酵素である
。この酵素は下記の反応式に示されるようＫＶシアル酸
Ｎ−アシルノイラミン酸）の分解及び合成反応を触媒す
る酵素である。
ｅｕｒａｍｉｎａｔｅ ａｌｄｏｌａｓｅ）は別名シア
ル酸ア〃ドフーゼとも呼ばれ、国際生化学連合酵素委員
会の酵素番号Ｅ、 Ｃ１４，１，３，３，に分類され、
系統名ではＮ−アンルノイツミン酸：ピμビン酸リアー
ゼ（Ｎ−ａｃｙｌｎｅｕｒａｍ％ｎａｔｅ ： ｐｙｒ
ｕｖａｔｅ １ｙａｓｅ ）と呼ばれている酵素である
。この酵素は下記の反応式に示されるようＫＶシアル酸
Ｎ−アシルノイラミン酸）の分解及び合成反応を触媒す
る酵素である。
シアル酸：Ｎ−アシルマンノサミン＋ピルビン酸Ｎ−ア
シルノイラミン酸アルドラーゼは微生物界に広く見出さ
れておフ、既に工業的にも製造され、臨床検査試薬とし
てシアル酸の定量に使用されている。
シルノイラミン酸アルドラーゼは微生物界に広く見出さ
れておフ、既に工業的にも製造され、臨床検査試薬とし
てシアル酸の定量に使用されている。
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼｔ−生産する菌株
としては、今までに次の如き菌株が知られている。
としては、今までに次の如き菌株が知られている。
クロストリディウム・ベルフリンゲンスＣＣＣ１ｏ−５
ｔｒｉｄｉｕ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ） （Ｄ、Ｇ、
Ｃｏｍｂ ａｎｄ Ｓ、Ｒｏｓｅ−ｍａｎ ： Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
５ｏｃｉｅｔｙｓｌ卦４９７（１９５８）、Ｉ。
ｔｒｉｄｉｕ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ） （Ｄ、Ｇ、
Ｃｏｍｂ ａｎｄ Ｓ、Ｒｏｓｅ−ｍａｎ ： Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
５ｏｃｉｅｔｙｓｌ卦４９７（１９５８）、Ｉ。
ピプリオコＬ／う（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）
（Ｒ，Ｈｅｉｍｅｒａｎｄ Ｋ、Ｍｅｙｅｒ ： Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａ
ｄｅ−ｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ、Ｕ、５ｔ４２．７
２８（１９５６））。
（Ｒ，Ｈｅｉｍｅｒａｎｄ Ｋ、Ｍｅｙｅｒ ： Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａ
ｄｅ−ｍｙ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅ、Ｕ、５ｔ４２．７
２８（１９５６））。
ニジエリシア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ） ＋アエロバク
ター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）＋プロテウス（Ｐｒｏｔ
ｅｕｓ） （特公昭５６−５４１５３）。
ター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）＋プロテウス（Ｐｒｏｔ
ｅｕｓ） （特公昭５６−５４１５３）。
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ） ｓ Ｙイ
クロコッカスＱＩｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ） ＋すＡ／Ｖ
す（Ｓａｒｃｉｎａ） ＊バチｙｖ ス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）＋バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ＋アー
スロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）＊プレビパ
クテリヒ ウｔｈ （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ’ｆｕｍ） ＋コリネ
バクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ） （
特公昭５６−５１７５１）。
クロコッカスＱＩｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ） ＋すＡ／Ｖ
す（Ｓａｒｃｉｎａ） ＊バチｙｖ ス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）＋バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ） ＋アー
スロバフタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）＊プレビパ
クテリヒ ウｔｈ （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ’ｆｕｍ） ＋コリネ
バクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ） （
特公昭５６−５１７５１）。
（発明の解決しようとする問題点）
しかしながら６上述した公知の各種菌株から製造された
市販Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼは至適ｐＨが
酸性側にあるもの、嫌気性微生物由来であり、病原性の
危惧されるもの、高価である、などの問題がある。
市販Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼは至適ｐＨが
酸性側にあるもの、嫌気性微生物由来であり、病原性の
危惧されるもの、高価である、などの問題がある。
本発明の目的は、従って酵素の至適ｐＨが中性付近にあ
シ、好気性菌由来の酵素をより安価に製造することにあ
る。
シ、好気性菌由来の酵素をより安価に製造することにあ
る。
（問題点を解決するための手段）
本発明はノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｊａ ）属又はス
トレプトミセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）属に
属し、Ｎ−ア５／Ａ／ノイラミン酸アルドラーゼ生産能
を有する菌株を栄養培地に培養し、＃Ｉ養物中にＮ−ア
Ｖ／ｌ／ノイラミン酸アルドラーゼを生成蓄積せしめ、
培養物からＮ−アシルノイラミン酸ア〃ドヲーゼヲ採取
することを特徴とするＮ−アＶｆｉ／ノイヲミン酸アμ
ドフーゼの製造法である。
トレプトミセス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）属に
属し、Ｎ−ア５／Ａ／ノイラミン酸アルドラーゼ生産能
を有する菌株を栄養培地に培養し、＃Ｉ養物中にＮ−ア
Ｖ／ｌ／ノイラミン酸アルドラーゼを生成蓄積せしめ、
培養物からＮ−アシルノイラミン酸ア〃ドヲーゼヲ採取
することを特徴とするＮ−アＶｆｉ／ノイヲミン酸アμ
ドフーゼの製造法である。
本発明に使用する菌株はノカルディア（Ｎｏｃａｒ−ｄ
ｉａ ）属又はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ）属に属する菌株ならば何れでも良いが、特に
ノカルディア中エリスロポリス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｅ
ｒｙｔｈｒｏｐ−ｏｌｉｓ） ＩＡＭ １３９９．ノ
カルディア・エリスミポリｘ （Ｎｏｃａｒｄｌａ ｅ
ｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ） ＩＡＭ １４００＋スト
レプトミセス−フラボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
−ｃｅｓ ｆｌａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ） ＩＦＯ１３０
４０＋ ストレプトミセス・フラポファンギニ（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖ−ｏｆｕｎｇｉｎｉ）
ＩＦＯ１３３７１＊ ストレプトミセス・ｍｙｃｅｓ
ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ） ＩＦＯ１２８７０ｒ ス
トレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ａｖｅ
ｎｄｕｌａｅ） ＩＦＯ１２３４３などが好ましい。
ｉａ ）属又はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ）属に属する菌株ならば何れでも良いが、特に
ノカルディア中エリスロポリス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｅ
ｒｙｔｈｒｏｐ−ｏｌｉｓ） ＩＡＭ １３９９．ノ
カルディア・エリスミポリｘ （Ｎｏｃａｒｄｌａ ｅ
ｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ） ＩＡＭ １４００＋スト
レプトミセス−フラボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
−ｃｅｓ ｆｌａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ） ＩＦＯ１３０
４０＋ ストレプトミセス・フラポファンギニ（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖ−ｏｆｕｎｇｉｎｉ）
ＩＦＯ１３３７１＊ ストレプトミセス・ｍｙｃｅｓ
ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ） ＩＦＯ１２８７０ｒ ス
トレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ａｖｅ
ｎｄｕｌａｅ） ＩＦＯ１２３４３などが好ましい。
本発明方法上実施するに当って通常の栄養培地を使用で
きるが、好ましくはシアル酸またはその誘導体を用いて
培養するのが好ましい。培地の炭素源としてシアル酸ま
たはその誘導体、グルコース、シュークロース、フラク
トース、ｍｓ、 廃ｍ蜜、アルコ−μ類、有機酸類など
が利用でき、天然栄養源としてはペプトン、肉エキス、
酵母エキス、コーンステイープ−リカー等が利用できる
。
きるが、好ましくはシアル酸またはその誘導体を用いて
培養するのが好ましい。培地の炭素源としてシアル酸ま
たはその誘導体、グルコース、シュークロース、フラク
トース、ｍｓ、 廃ｍ蜜、アルコ−μ類、有機酸類など
が利用でき、天然栄養源としてはペプトン、肉エキス、
酵母エキス、コーンステイープ−リカー等が利用できる
。
窒素源としてはアンモニア水、ｖｔ安、硝安、塩安。
尿素等が利用でき、無機塩類としてはりン酸カリウム、
塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等が
利用で亀る。これらの栄養源はそれぞれ単独に用いるこ
ともでき、また組合せて用りることもできる。
塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等が
利用で亀る。これらの栄養源はそれぞれ単独に用いるこ
ともでき、また組合せて用りることもできる。
菌株ｔ”培養するに当っては１通常振盪培養または通気
攪拌培養で行なうことができる。一般に培養温度は２５
〜３５℃、培地ｐＨは６．５〜７．５であるのが好まし
く１通常１〜４日間培養を行なうと。
攪拌培養で行なうことができる。一般に培養温度は２５
〜３５℃、培地ｐＨは６．５〜７．５であるのが好まし
く１通常１〜４日間培養を行なうと。
菌体内にＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼが生成蓄
積する。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応じ
、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの生産量が最大
になるように設定することは当然である。
積する。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応じ
、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの生産量が最大
になるように設定することは当然である。
本発明の方法によって生成蓄積されたＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼを採取するに当っては、培養液を遠
心分離、ｐ過等の操作によシ培養液から菌体を集め、集
めた菌体をビーズ破砕、もしくは超音波破砕等の操作を
して菌体中からＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを
取シ出ス。
ミン酸アルドラーゼを採取するに当っては、培養液を遠
心分離、ｐ過等の操作によシ培養液から菌体を集め、集
めた菌体をビーズ破砕、もしくは超音波破砕等の操作を
して菌体中からＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを
取シ出ス。
かくして得られた粗酵素液からＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼを単離するに当っては通常の酵素精製に使
用される方法を使用できる。例えば、塩析、有機溶媒沈
澱、透析１等電点沈澱、イオン交換法、ゲ／Ｉ／濾過等
の方法を組合せて使用できる。例えば、粗酵素液を遠心
分離し、上清を得る。その上溝液の硫安塩析し、Ｎ−ア
シルノイラミン酸アルドラーゼ活性画分子：得る。−夜
、透析後、ＤＥＡＥ・セファロースＣＬ−４Ｂ （ファ
ルマシア社製）イオン交換体に吸着、溶出させる。活性
画分を濃縮後、セファアクリＡ／Ｓ−２００のゲル濾過
を行なうことによシ高度に精製され九Ｎ−アシルノイヲ
ミン酸アルドツーゼを単離することができる。
アルドラーゼを単離するに当っては通常の酵素精製に使
用される方法を使用できる。例えば、塩析、有機溶媒沈
澱、透析１等電点沈澱、イオン交換法、ゲ／Ｉ／濾過等
の方法を組合せて使用できる。例えば、粗酵素液を遠心
分離し、上清を得る。その上溝液の硫安塩析し、Ｎ−ア
シルノイラミン酸アルドラーゼ活性画分子：得る。−夜
、透析後、ＤＥＡＥ・セファロースＣＬ−４Ｂ （ファ
ルマシア社製）イオン交換体に吸着、溶出させる。活性
画分を濃縮後、セファアクリＡ／Ｓ−２００のゲル濾過
を行なうことによシ高度に精製され九Ｎ−アシルノイヲ
ミン酸アルドツーゼを単離することができる。
本発明方法によシ得られたＮ−アシルノイラミン酸アル
ドヲーゼの酵素化学的および理化学的性質は次のとおり
である。
ドヲーゼの酵素化学的および理化学的性質は次のとおり
である。
（１）作 用：
本発明の酵素は１七〃のＮ−アＶ〜ノイラミン酸ヲ加水
分解シて、１モルのＮ−アシルマンノサミンと１モルの
ピルビン酸を生成する。
分解シて、１モルのＮ−アシルマンノサミンと１モルの
ピルビン酸を生成する。
（２） 基質特異性：
Ｎ−アシルノイラミン酸に特異的に作用する。
（３）至適ｐＨ：
本発明の酵素の至適ｐＨは第１図の曲線で表わされる如
く、約ｐＨ６，０〜７．５に高い活ｆ！Ｅｔ−有してい
る。
く、約ｐＨ６，０〜７．５に高い活ｆ！Ｅｔ−有してい
る。
（４）至適温度：
本発明の酵素の至適温度は第２図の曲線で表わされる如
く、約４７℃付近にある。
く、約４７℃付近にある。
（５） ｐＨ安定性：
本発明の酵素を１０℃、４５時間、それぞれのｐＨで放
置した時のｐＨ安定性を第３図に示す。
置した時のｐＨ安定性を第３図に示す。
第３図よシ明らかな様に本発明の酵素はｐＨ６，０〜８
．０の間で安定である。 ゛（６）熱安定性： 本発明の酵素ｔ−ｐＨ７，０でそれぞれの温度で３０分
間処理したときの熱安定！４：金第４図に示す。第４図
から明らかな如く１本発明の酵素は３５℃まで安定であ
る。
．０の間で安定である。 ゛（６）熱安定性： 本発明の酵素ｔ−ｐＨ７，０でそれぞれの温度で３０分
間処理したときの熱安定！４：金第４図に示す。第４図
から明らかな如く１本発明の酵素は３５℃まで安定であ
る。
（７）阻害剤
ＰＣＭＢ（ｐ−クロロマーキュリベンゾエート）Ｈ？Ｃ
１２ｔ ＡＪＮＯ３，ＦｅＳＯ４など。
１２ｔ ＡＪＮＯ３，ＦｅＳＯ４など。
（８） Ｋｍ値
約ＩＸＩＯ−２Ｍ
（９）分子量：
本発明の酵素はセファアクリルＳ−２００ｔ−用いたゲ
ｌｖ濾過法で約１００．０００である。
ｌｖ濾過法で約１００．０００である。
αＱ 酵素活性測定法：
本発明の酵素活性の測定は下記条件で１分間に１マイク
ロモルのピルビン酸を生成する酵素１ｔｔ−１ｊ１位ト
Ｌ２．４ジニトロフエニルヒドラジンを用いて比色定置
する。
ロモルのピルビン酸を生成する酵素１ｔｔ−１ｊ１位ト
Ｌ２．４ジニトロフエニルヒドラジンを用いて比色定置
する。
試薬： （Ａ） ２４ｍＭ Ｎ−アシルノイラミン酸。
５０ｆｆｉＭ リン酸カリウム緩衝液
ｐＨ７，０
（Ｂ） ０．０２ ％ ２．４−ジニ） ｏ ７ エニ
ｔＶ ヒドラジン（ＤＮＰＨ） ０．９Ｎ ＨＣノ（Ｃ
） ０．４Ｎ ＮａＯＨ水溶液 （Ｄ）酵素溶液（１００７ｆｆＭリン酸カリウム緩衝液
ｐＨ７，０で０．５〜ＩＵ／肩ｌに希釈する） 手順： １、試験管に上記基質溶液（Ａ） ２５０μＩｔ−入れ
、３７℃で２〜３分子備加温する。
ｔＶ ヒドラジン（ＤＮＰＨ） ０．９Ｎ ＨＣノ（Ｃ
） ０．４Ｎ ＮａＯＨ水溶液 （Ｄ）酵素溶液（１００７ｆｆＭリン酸カリウム緩衝液
ｐＨ７，０で０．５〜ＩＵ／肩ｌに希釈する） 手順： １、試験管に上記基質溶液（Ａ） ２５０μＩｔ−入れ
、３７℃で２〜３分子備加温する。
２、上記酵素溶液ＣＤ） ５０μＩを加え１反応を關始
する。
する。
３、３７℃で正確に１５分間反応させた後、上記ＤＮＰ
Ｈ溶液（Ｂ） ？、 ２５０ ａｌ加えテ１ｌｌｉｊ応
を停止する。
Ｈ溶液（Ｂ） ？、 ２５０ ａｌ加えテ１ｌｌｉｊ応
を停止する。
４、２５℃で２０分間放置後０，４Ｎ ＮａＯＨ水溶液
（Ｃ） ｋ ２．５ ｍｌ加え発色させる。２〜３分放
置後ｓ５００ｎｍＫおける吸光度を測定する（ＯＤ ｔ
ｅｓｔ ）。
（Ｃ） ｋ ２．５ ｍｌ加え発色させる。２〜３分放
置後ｓ５００ｎｍＫおける吸光度を測定する（ＯＤ ｔ
ｅｓｔ ）。
５、盲検は上記基質溶液（Ａ） ２５０μｊ１：入れ３
７℃で１５分間放置後、上記ＤＮＰＨ溶液ＣＢ）２５０
μｌｔ−加えて混和し１次いで酵素溶液（Ｄ） ５０μ
Ｉｔ−加えて調製する。以下同様に２５℃で２０分間放
置後、 ０．４Ｎ ＮａＯＨ水溶液（Ｃ） ２．５ ｍ
ｌ加え２〜３分間後５００ ｎｍにおける吸光度を測定
する（ ００ ｂｌａｎｋ ）。
７℃で１５分間放置後、上記ＤＮＰＨ溶液ＣＢ）２５０
μｌｔ−加えて混和し１次いで酵素溶液（Ｄ） ５０μ
Ｉｔ−加えて調製する。以下同様に２５℃で２０分間放
置後、 ０．４Ｎ ＮａＯＨ水溶液（Ｃ） ２．５ ｍ
ｌ加え２〜３分間後５００ ｎｍにおける吸光度を測定
する（ ００ ｂｌａｎｋ ）。
計算式：
＝ΔＯ，Ｄｘ０．４３３ｘ希釈箇敗
９．３９：赤色色素のミリモル分子吸光係数１．０：光
路長（閏） （実施例） 以下に本発明によるＮ−ア￥ルノイラミン酸アルドラー
ゼの製造法を実施例を挙げて説明する。
路長（閏） （実施例） 以下に本発明によるＮ−ア￥ルノイラミン酸アルドラー
ゼの製造法を実施例を挙げて説明する。
チは特に断わりのない限り（Ｗ／Ｖ）％である。
実施例１゜
培地ｍ成 ０．５％Ｎ−アセチルノイラミン酸、０．１
チ酵母エキス、０．１％ポリペブト ン、 ０．２
ｆｂ ＮａＣｊＪ 、 ０．１ ％ Ｋ
Ｈ２Ｐ８４０．０５％ＭｆＳＯ４、ｐＨ７，０ 上記の培地３ｗ１ｔ−滅菌済試験管に入れ、１２１℃で
１０分間オートクレーブ殺菌した。各種菌株の１白金耳
を上記培地に接種し、３０’０．４日間振盪培養した。
チ酵母エキス、０．１％ポリペブト ン、 ０．２
ｆｂ ＮａＣｊＪ 、 ０．１ ％ Ｋ
Ｈ２Ｐ８４０．０５％ＭｆＳＯ４、ｐＨ７，０ 上記の培地３ｗ１ｔ−滅菌済試験管に入れ、１２１℃で
１０分間オートクレーブ殺菌した。各種菌株の１白金耳
を上記培地に接種し、３０’０．４日間振盪培養した。
培養液を遠心分離（１２＋００ Ｏｒｐｍ。
１０分）にて集菌し、３ｍｌの５０ ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液ｐＨ７，５に懸濁した。超音波（３Ａ、５分）
破砕後、遠心分離（１２＋００ Ｏｒｐｍ−１５分 ）
し、上清を粗酵素液とし、活性を測定した。測定結果は
表１の通りであった。
ム緩衝液ｐＨ７，５に懸濁した。超音波（３Ａ、５分）
破砕後、遠心分離（１２＋００ Ｏｒｐｍ−１５分 ）
し、上清を粗酵素液とし、活性を測定した。測定結果は
表１の通りであった。
表 １
実施例え
培地組成を実施例１と同様に調製した培地６Ｊを含む１
０４容ジャーファーメンタ−ｔ−１２１℃で２０分間蒸
気殺菌した。あらかじめ、実施例１と同様に培養した種
菌（ツカｐダイア・エリスロポリスＩＡＭ１４００）５
０ｍ１ｔ−植菌し、３０℃、３００ ｒｐｍ ｓ通気量
３１／ｉで３６１Ｉ＃間培養した。
０４容ジャーファーメンタ−ｔ−１２１℃で２０分間蒸
気殺菌した。あらかじめ、実施例１と同様に培養した種
菌（ツカｐダイア・エリスロポリスＩＡＭ１４００）５
０ｍ１ｔ−植菌し、３０℃、３００ ｒｐｍ ｓ通気量
３１／ｉで３６１Ｉ＃間培養した。
％うれた培養液のＮ−アＶルノイラミン酸アルドラーゼ
活性は０．３００ ／−であった。培養液６Ｊを遠心分
離し、菌体を集め５０ＦｆｆＭ！ｊン酸緩衡液ｐＨ７，
５に懸濁し、ＩＩとしてビーズ破砕機（ダイノミルＫＤ
Ｌ ）によシ破砕した。
活性は０．３００ ／−であった。培養液６Ｊを遠心分
離し、菌体を集め５０ＦｆｆＭ！ｊン酸緩衡液ｐＨ７，
５に懸濁し、ＩＩとしてビーズ破砕機（ダイノミルＫＤ
Ｌ ）によシ破砕した。
菌体破砕液を遠心分１ｌＩｉ（１０ｔＯＯＯｒｐｍ、
１５分）し、上溝を得た。５０ｍＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ
７，５で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムで脱
塩した。脱塩液をＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−４８カ
ヲム５０ｘｌに吸着させ、 ０．４Ｍ ＮａＣノにて溶
出した。溶出液の活性画分を限外濾過にて濃縮し。
１５分）し、上溝を得た。５０ｍＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ
７，５で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムで脱
塩した。脱塩液をＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−４８カ
ヲム５０ｘｌに吸着させ、 ０．４Ｍ ＮａＣノにて溶
出した。溶出液の活性画分を限外濾過にて濃縮し。
セファアクリ／Ｌ／Ｓ−２００カラムにて分子篩２行な
った。活性画分の比活性は１２．４Ｕ／Ｗ９−蛋白、全
活性は８３２Ｕ（収率４６．２チ）であった。
った。活性画分の比活性は１２．４Ｕ／Ｗ９−蛋白、全
活性は８３２Ｕ（収率４６．２チ）であった。
（発明の効果）
本発明方法により得られるＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼは、至適ｐＨが中性付近で作用が良く、好気性
菌由来の酵素をよシ安価に得ることができる。
ドラーゼは、至適ｐＨが中性付近で作用が良く、好気性
菌由来の酵素をよシ安価に得ることができる。
第１ 図ハＮ−アＶルノイラミン酸ア〃ドラーゼの至適
ｐＨ１に示す図である。５０ ｍＭ ａ新液（ナーり酢
酸、←→リン酸、×−×はう酸）中での作用を相対活性
にて示す。 第２図はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの至適温
度を示す図である。 第３図はＮ−アシｙノイツミン酸アルドラーゼのｐｉ（
安定性七本す図である（ ｐＨ３，５〜６．０酢酸、
ｐＨ６，０〜８．０リン酸、 ｐＨ８，０〜９．０
はう酸、各緩衝液）。１０℃、４５時間放置後、残存活
性を示す。 第４図はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの熱安定
性を示す図である。５０７７１Ｍ！Ｊン酸緩衝液ｐＨ７
，０，３０分間処理後の残存活性を示す。
ｐＨ１に示す図である。５０ ｍＭ ａ新液（ナーり酢
酸、←→リン酸、×−×はう酸）中での作用を相対活性
にて示す。 第２図はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの至適温
度を示す図である。 第３図はＮ−アシｙノイツミン酸アルドラーゼのｐｉ（
安定性七本す図である（ ｐＨ３，５〜６．０酢酸、
ｐＨ６，０〜８．０リン酸、 ｐＨ８，０〜９．０
はう酸、各緩衝液）。１０℃、４５時間放置後、残存活
性を示す。 第４図はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの熱安定
性を示す図である。５０７７１Ｍ！Ｊン酸緩衝液ｐＨ７
，０，３０分間処理後の残存活性を示す。
Claims (1)
- ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属又はストレプトミ
セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、Ｎ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有する菌株を栄養
培地に培養し、培養物中にＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼを生成蓄積せしめ、培養物からＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼを採取することを特徴とするＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25632284A JPS61135585A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25632284A JPS61135585A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61135585A true JPS61135585A (ja) | 1986-06-23 |
| JPH0313867B2 JPH0313867B2 (ja) | 1991-02-25 |
Family
ID=17291058
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25632284A Granted JPS61135585A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61135585A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6603235B1 (en) * | 1999-11-02 | 2003-08-05 | Mabuchi Motor Co. | Small-sized motor having a brush unit with an improved brush arm and terminal connections |
-
1984
- 1984-12-03 JP JP25632284A patent/JPS61135585A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6603235B1 (en) * | 1999-11-02 | 2003-08-05 | Mabuchi Motor Co. | Small-sized motor having a brush unit with an improved brush arm and terminal connections |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0313867B2 (ja) | 1991-02-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH031949B2 (ja) | ||
| US4710470A (en) | Process for producing neuraminidase | |
| JP2788174B2 (ja) | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法 | |
| JPH0284178A (ja) | Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット | |
| JPS61135585A (ja) | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 | |
| JPH01199576A (ja) | α−アミノアジピニルモノアミノ化合物の加水分解性を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ | |
| JPS61219384A (ja) | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 | |
| US5100795A (en) | Bile acid sulfate sulfatase, process for its preparation and method for assaying bile acid | |
| JPS6243670B2 (ja) | ||
| JP3152855B2 (ja) | 新規なソルビトールデヒドロゲナーゼ、その製造方法並びに該酵素を用いたソルビトールの定量のための試薬及び方法 | |
| JPH01317387A (ja) | 新規Ｄ―アミダーゼ及びＤ―α―アラニン及び／又はＬ―α―アラニンアミドの製造法 | |
| JP2970932B2 (ja) | 新規耐熱性β―ガラクトシル基転移酵素、その製造法及びその用途 | |
| JPH0249720B2 (ja) | ||
| JPS58152481A (ja) | 新規なホスホリパ−ゼｄ−ｐおよびその製造法 | |
| JPH0370472B2 (ja) | ||
| JP3040228B2 (ja) | Ｌ−フコースデヒドロゲナーゼ、その製造方法及びｌ−フコースの定量法 | |
| JP3107639B2 (ja) | アセチルアミノメチルシクロヘキサンカルボン酸エステルアミドヒドロラーゼおよびその製造方法 | |
| JPH0218064B2 (ja) | ||
| JP2680686B2 (ja) | プトレッシン：ピルビン酸トランスアミナーゼの製造方法 | |
| JP3190537B2 (ja) | 新規マルトース１−エピメラーゼの製造方法 | |
| JPS6248379A (ja) | セフアロスポリンｃアシラ−ゼの製造法 | |
| JPH01148184A (ja) | 耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 | |
| JPH04349890A (ja) | モノアセチルポリアミンの製造方法 | |
| JPH07155181A (ja) | 新規マルトビオン酸グルコヒドロラーゼ、その製造方法、この酵素を用いたマルトビオン酸の定量用試薬及びその定量方法 | |
| JPS5937947B2 (ja) | 新規ピログルタミン酸ヒドロラ−ゼ及びその酸素を用いたｌ−ヒログルタミン酸の定量方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |