DE2751879A1 - Cholinoxidase, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur bestimmung von cholin - Google Patents

Description

Es ist bekannt, dass Cholinoxidase durch Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter erzeugt wird. Diese Cholinoxidase beschleunigt die Umwandlung von Cholin-chlorid in Betain. Bei dieser Umwandlung entsteht Wasserstoffperoxid. Ein Verfahren zur Bestimmung von Cholin durch Messung der entstandenen Menge an Wasserstoffperoxid ist ebenfalls bekannt; vgl. Rinsho Byori (Clinical Pathology), Bd. 24 (1976), S. 461.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Cholinoxidase zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, dass bei der Züchtung von Cholinoxidase bildenden Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium in einem Nährmedium erhebliche Mengen an Cholinoxidase in der Kulturbrühe gebildet werden.

Untersuchungen der erfindungsgemäß hergestellten Cholinoxidase haben ergeben, dass bei der Oxidation von Cholin in Gegenwart von Cholinoxidase Betainaldehyd gebildet wird. Unter der Einwirkung des Enzyms wird der Betainaldehyd in Betain umgewandelt. Die erfindungsgemäß hergestellte Cholinoxidase kann zur Bestimmung von Cholin verwendet werden.

Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Figur 1 gibt das Dünnschichtchromatogramm der Reaktionslösung wieder, die bei der Oxidation von Cholin mit der erfindungsgemäß hergestellten Cholinoxidase erhalten wird.

Figur 2 erläutert den stabilen pH-Bereich der erfindungsgemäß hergestellten Cholinoxidase. Die Kurven (A), (B), (C) und (D) gegen die relative Aktivität des aus den Zellen von Brevibacterium album KY 4319, Corynebacterium murisepticum KY 3505, Corynebacterium cholinoxydans KY 4707 und Corynebacterium choliniphilum KY 4706 isolierten Enzyms wieder. In den nachfolgenden Figuren haben (A), (B), (C) und (D) die gleiche Bedeutung, wie sie vorstehend angegeben ist.

Figur 3 erläutert den optimalen pH-Bereich für die Reaktion der erfindungsgemäß hergestellten Cholinoxidase.

Figur 4 zeigt den optimalen Temperaturbereich für die Reaktion der erfindungsgemäß hergestellten Cholinoxidase.

Figur 5 zeigt den Bereich der Temperaturstabilität der erfindungsgemäß hergestellten Cholinoxidase.

Figur 6 zeigt die stabilisierende Wirkung von EDTA auf die erfindungsgemäß hergestellte Cholinoxidase.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann jeder Mikroorganismus verwendet werden, der Cholinoxidase bildet und zur Gattung Brevibactrium oder Corynebacterium gehört. Besonders bevorzugte Mikroorganismen finden sich unter den Arten Brevibacterium album, Brevibacterium cerinum, Corynebacterium murisepticum, Corynebacterium cholinoxydans (neue Art) und Corynebacterium choliniphilum (neue Art). Spezielle Beispiele für besonders bevorzugt verwendete Mikroorganismen sind

Brevibacterium album KY 4319 (FERM-P Nr. 3777;

NRRL B-11 046; ATCC 15 111), Brevibacterium cerinum KY 4320 (FERM-P Nr. 3778; NRRL B-11 047; ATCC 15 112), Corynebacterium murisepticum KY 3505 (FERM-P Nr. 3779; NRRL B-11 049; ATCC 21 374), Corynebacterium cholinoxydans KY 4707 (FERM-P Nr. 4111; NRRL B-11 158) und Corynebacterium choliniphilum KY 4706 (FERM-P Nr. 4110; NRRL B-11 157). FERM-P bedeutet die Hinterlegung eines Mikroorganismus beim Fermentation Research Institute, Chiba-ken, Japan, NRRL bedeutet die Hinterlegung eines Mikroorganismus bei ARS Culture Collection Research Fermentation Laboratory, Peoria, Illinois, V.St.A. und ATCC bedeutet die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A.

Die bakteriologischen Eigenschaften von Brevibacterium album KY 4319 und Brevibacterium cerinum KY 4320 sowie diejenigen von Corynebacterium murisepticum KY 3505 sind in den US-PSen 3 222 258 und 3 630 842 beschrieben.

Die vorstehend genannten Stämme KY 4707 und KY 4706 wurden aus Erdproben isoliert. Sie stellen neue Arten dar. Die bakteriologischen Eigenschaften dieser beiden neuen Stämme sind nachstehend eingehend beschrieben.

Die Versuche zur Identifizierung der beiden Stämme erfolgte im wesentlichen nach dem Manual of Microbiological Methods (1957), herausgegeben von der Society of American Bacteriologists' Committee on Bacteriological Technics und Biseibutsu no Bunrui to Dotei (Classification and Identification of Microorganisms), herausgegeben von T. Hasegawa und 1975 veröffentlicht von Tokyo Daigaku Shuppan-kai (Tokyo University Press).

Stamm KY 4707

I. Morphologie

Züchtung bei 30°C in Nähragarmedium:

Im allgemeinen kurze Stäbchen mit den Abmessungen 0,6 bis 0,8 x 1,5 bis 2,0 µ; einzeln oder V-förmig in Paaren, Verzweigungen werden beobachtet; in alten Kulturen entstehen kokkoide Formen, d.h. pleomorphe Formen; beweglich; die Bakterien haben mindestens eine subpolare Geißel; gram-positiv; es werden keine Sporen gebildet; nicht säurefest.

II. Kultureigenschafen auf verschiedenen Medien

1. Nähragarplatten (30°C)

kreisförmig; 4 bis 5 mm groß nach 2- bis 3-tägiger Züchtung; glatt; konvex; glattrandig; matt glänzend; durchscheinend; amorph, butterartig; zunächst weiß, nach 2 bis 3-tägiger Züchtung gelb.

2. Nährschrägagar (30°C)

kräftige Vermehrung; fadenförmig.

3. Nährbouillon (30°C)

kräftige Vermehrung, flockiges Sediment; keine Hautbildung.

4. Nährstichkultur (30°C)

kräftige Vermehrung nur auf der Oberfläche.

5. Nährgelatine-Stichkultur (20°C)

Wachstum an der Oberfläche und entlang dem Stich;

Gelatine wird verflüssigt.

6. Lackmus-Milch

Die Milch wird alkalisch und innerhalb 2 Wochen vollständig klar.

III. Physiologische Eigenschaften

1. Nitratreduktion: positiv

2. Denitrifizierung: negativ

3. Methylrot-Reaktion negativ

4. Voges-Proskauer-Reaktion: negativ

5. Indolbildung: negativ

6. Schwefelwasserstoffbildung: positiv

7. Stärkehydrolyse: negativ

8. Verwertung von Citronensäure: positiv in Koser's Medium

und Christensen's Medium

9. Verwertung anorganischer Ammoniumsalze und Nitrate

Stickstoffquellen: werden verwertet

10. Pigmentbildung: gelb; wasserunlöslich

11. Urease-Nachweis: positiv

12. Katalase-Nachweis: positiv

13. Lecithinase-Nachweis: negativ

14. Cholinoxidase-Nachweis: positiv

15. optimale Wachstumstemperatur: 15 bis 37°C; spärliches

Wachstum bei 5°C und 42°C

16. pH-Bereich zur Vermehrung: 5 bis 9

17. Sauerstoffbedarf: fakultativ anaerob, bestimmt nach

dem O-F (Oxidations-Fermentations)-

Test mit Glucose als Kohlenstoffquelle

18. NH[tief]3-Bildung aus Pepton: positiv

19. Äskulinspaltung: negativ

20. Cellulosezersetzung: negativ

21. Salzempfindlichkeit: Vermehrung bei 7 g/dl NaCl,

keine Vermehrung bei 10 g/dl NaCl.

22. hämolytische Aktivität: beta-Hämolyse

23. Verwertung von Cholin: positiv

24. Verwertung von Kreatin: positiv

25. Verwertung von Betain: positiv

26. Verwertung von Harnsäure: positiv

27. Vitaminbedarf: kein

28. Verwertung von Kohlenstoffquellen

Verwertbar: D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose,

D-Galactose, D-Xylose, L-Arabinose,

D-Ribose, L-Rhamnose, Sucrose,

Maltose, Trehalose, Cellobiose

Glycerin, D-Mannit, D-Sorbit,

D-Inosit, Essigsäure,

DL-Milchsäure, Brenztraubensäure,

Bernsteinsäure, Äthanol und Inulin.

nicht verwertbar: Lactose, Adonit, Cellulose und Stärke.

29. Säurebildung und Gasbildung aus Kohlenhydraten

(1) Sehr geringe Säurebildung bei Verwendung von Pepton-Medium

(2) Säurebildung bei Verwendung eines Mediums aus 2 g/Liter Trypton, 5 g/Liter NaCl und 0,3 g/Liter K[tief]2HPO[tief]4

(3) Säurebildung, jedoch keine Gasbildung aus D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Sucrose, Trehalose (schwach), D-Mannit und Glycerin.

(4) keine Säurebildung und Gasbildung aus L-Arabinose, D-Kylose, Lactose, D-Sorbit, Inosit und Stärke.

IV. Cytochemische Analyse

1. G-C-Verhältnis der DNA: 67,8%

2. Diaminosäure-Bestandteil der Lysin

Zellwand:

3. Zuckerbestandteil der Zellwand: Rhamnose, Galactose und Mannose.

Die bakteriologischen Eigenschaften des Stammes KY 4706 sind nahezu die gleichen wie diejenigen des Stammes KY 4707, ausgenommen folgende Eigenschaften:

1. nicht beweglich; keine Geißel

2. Hydrolyse von Stärke und Säurebildung aus Stärke; positiv

3. Lactose wird als einzige Kohlenstoffquelle verwertet.

Die vorstehend genannten beiden Stämme KY 4707 und KY 4706 werden mit bekannten Mikroorganismen hinsichtlich ihrer bakteriologischen Eigenschaften unter Bezugnahme auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage 81974) und 7. Auflage (1957), Yamada, Komagata u. Mitarb., J. Gen. Appl. Microbiol., Bd. 16 (1970), S. 103 und Bd. 16 81970), S. 215, Cummins, J. Gen. Microbiol., Bd. 28 (1962), S. 35 und US-PS 3 222 258 verglichen.

Die beiden Stämme sind gram-positiv, sie bilden keine Sporen, sie sind nicht säurefest, sie sind fakultativ anaerob und zeigen sich als pleomorphe Stäbchen. Deshalb sollten die beiden Stämme als coryneforme Gruppe der Bakterien klassifiziert werden, die in Teil 17 von Bergey's Manual 8. Auflage beschrieben sind. In dieser Gruppe sind vier Gattungen, nämlich Cellulomonas, Kurthia, Arthrobacter und Corynebacterium, enthalten. Die beiden Stämme unterscheiden sich von denen, die zur Gattung Cellulomonas, Kurthia oder Arthrobacter gehören, in folgenden Eigenschaften:

Die Stämme der Gattung Cellulomonas vermögen Cellulose zu zersetzen und sie benötigen Biotin und Thiamin zum Wachstum. Das G-C-Verhältnis der DNA in diesen Stämmen beträgt 71,7 bis 72,7 %; vgl. Yamada, Komagata u. Mitarb., J. Gen. Appl. Microbiol., Bd. 16 (1970), S. 215. Demgegenüber vermögen die Stämme KY 4706 und KY 4707 Cellulose nicht zu zersetzen und sie benötigen für ihr Wachstum kein Biotin und Thiamin. Das G-C-Verhältnis der DNA in Stamm KY 4707 und KY 4706 beträgt 68 +/- 0,5 %. Deshalb gehören die Stämme KY 4707 und 4706 nicht zur Gattung Cellulomonas.

Die Stämme der Gattung Kurthia haben eine regelmäßige Form, sie sind unverzweigt und bilden in der logarithmischen Wachstumsphase Ketten. Ferner sind diese Stämme streng aerob und sie reduzieren nicht Nitrate. Demgegenüber sind die Stämme KY 4707 und 4706 unregelmäßig geformt, teilweise verzweigt (eine Verzweigung wird bei einigen Zellen beobachtet) und sie bilden in der logarithmischen Wachstumsphase keine Ketten. Ferner sind diese Stämme fakultativ anaerob und sie reduzieren Nitrate. Deshalb gehören die Stämme KY 4707 und 4706 nicht zur Gattung Kurthia.

Die Stämme der Gattung Arthrobacter sind im allgemeinen gramnegativ in der logarthimischen Wachstumsphase. Ferner sind diese Stämme streng aerob und sie enthalten als einzigen Zucker in der Zellwand Galactose.

Zahlreiche Stämme dieser Gattung vermehren sich nicht bei 37°C. Demgegenüber sind die Stämme KY 4707 und 4706 grampositiv während der gesamten Züchtung. Weiterhin sind diese Stämme fakultativ anaerob, sie vermehren sich bei 37°C sehr stark und sie enthalten als Zucker in ihrer Zellwand Galactose, Rhamnose und Mannose. Deshalb gehören die Stämme KY 4707 und 4706 nicht zur Gattung Arthrobacter.

Die bakteriologischen Eigenschaften der Stämme KY 4707 und 4706 stehen nicht im Gegensatz zu denen der Stämme der Gattung Corynebacterium, die auf den Seiten 599 bis 617 von Bergey's Manual 8. Auflage beschrieben sind. Deshalb sollten die Stämme KY 4707 und 4706 als Stämme der Gattung Corynebacterium klassifiziert werden.

Auf Seite 599 von Bergey's Manual 8. Auflage ist erwähnt, dass die Gattungen Brevibacterium und Microbacterium nahe verwandt zu den Gattungen Corynebacterium und Arthrobacter sind, dass jedoch die Klassifikation unsicher ist. Nach Ansicht von Fiedler u. Mitarb., Bergey's Manual 8. Auflage, S. 625 und 626, sollten die Stämme der Gattung Brevibacterium als Glieder der Gattung

Corynebacterium klassifiziert werden. Nach Jensen, Bergey's Manual 8. Auflage, S. 628, sollen Microbacterium lacticum und Microbacterium liquefaciens als Stämme der Gattung Corynebacterium klassifiziert werden.

Unter den vorstehend beschriebenen Umständen wurden die Stämme KY 4706 und 4707 mit denen der verschiedenen Arten der Gattung Corynebacterium, Brevibacterium und Microbacterium unter Bezugnahme auf die verschiedenen Veröffentlichungen, wie Bergey's Manual 7. und 8. Auflage, verglichen. Ferner wurden weitere Versuche zum Vergleich durchgeführt.

Unter den Stämmen, die zu bekannten Arten der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium und Microbacterium gehören, gehören diejenigen Stämme, die in einem Cholin als einzige Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium sich kräftig vermehren, wie die Stämme KY 4707 und 4706, zu den Arten Corynebacterium murisepticum, Brevibacterium album, Brevibacterium cerinum oder Brevibacterium maris. Ferner gehören diejenigen Stämme, die in einem Cholin als einzige Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium sich nicht oder nur spärlich vermehren, die Lysin als Diaminosäurekomponente der Zellwand enthalten, und die den Stämmen KY 4707 und 4706 in den anderen bakteriologischen Eigenschaften ziemlich ähnlich sind, zu den Arten Corynebacterium poinsettiae, Brevibacterium fulvum, Brevibacterium helvolum, Brevibacterium imperiale oder Brevibacterium sulfureum.

Ein Vergleich der Stämme KY 4707 und KY 4706 mit den Stämmen der vorstehend erwähnten Arten hinsichtlich der bakteriologischen Eigenschaften ist in Tabelle I zusammengefasst.

Tabelle I

Anm.: C : Corynebacterium

B : Brevibacterium

Lys : Lysin

DL-DAP : DL-Diaminopimelinsäure

*1 : experimentelle Werte

*2 : US-PS 3 222 258

*3 : J. Gen. Appl. Microbiol., Bd. 16 (1970)

S. 103

*4 : Bergey's manual, 7. Auflage

*5 : J. Gen. Microbiol., Bd. 28 (1962), S. 35.

Aus Tabelle I ist ersichtlich, dass die Stämme KY 4707 und 4706 mit keinem der Stämme übereinstimmen, die zu den analogen Arten hinsichtlich der bakteriologischen Eigenschaften gehören. Deshalb werden diese beiden Stämme als neue Arten klassifiziert. Der Stamm KY 4707 gehört zur Art Corynebacterium cholinoxydans und der Stamm KY 4706 zur Art Corynebacterium choliniphilum.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium verwendet werden, sofern es eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und geringe Mengen anderer Nährstoffe enthält, die für den speziell verwendeten Stamm erforderlich sind.

Als Kohlenstoffquelle kommen bevorzugt Cholin und dessen Salze, jedoch auch Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Sucrose oder Melassen, Kohlenwasserstoffe, wie n-Paraffine oder Kerosin, Carbonsäuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure oder Fumarsäure, oder Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, in Frage.

Als Stickstoffquellen können Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumacetat, Harnstoff, Mononatriumglutamat, Glykokoll, Mononatriumaspartat, Cholin und andere stickstoffhaltige Verbindungen,

Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Fischmehl, Sojabohnenmehl oder andere stickstoffhaltige organische Substanzen verwendet werden.

Beispiele für verwendbare anorganische Salze sind Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Kaliumchlorid und Calciumcarbonat.

Sofern der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus spezielle Nährstoffe zur Vermehrung benötigt, wie Biotin oder Thiamin, müssen dem Nährmedium entsprechende Mengen dieser Verbindungen zugesetzt werden. In einigen Fällen können die stickstoffhaltigen organischen Verbindungen, die als Stickstoffquelle verwendet werden, auch als Quelle für die erforderlichen Nährstoffe dienen. Bei Verwendung derartiger stickstoffhaltiger organischer Verbindungen ist es deshalb nicht nötig, die erforderlichen Nährstoffe dem Nährmedium gesondert zuzusetzen.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die Bildung von Cholinoxidase durch Zusatz von Cholin oder dessen Salz zum Nährmedium zur Induktion der Bildung von Cholinoxidase erhöht. Beispiele für als Kohlenstoffquelle und Induktionsmittel verwendbare Cholinsalze sind Cholin-chlorid, Cholin-bromid, Cholin-bicarbonat, Cholin-citrat und Cholin-ascorbat. Bei Verwendung von Cholin oder dessen Salz als Induktionsmittel beträgt die Konzentration im Nährmedium vorzugsweise 7 bis 800 mMol/Liter, berechnet als Cholin-chlorid. Der Zusatz von Cholin oder dessen Salz kann zu Beginn oder während der Fermentation erfolgen. Beim Zusatz von Cholin oder dessen Salz während der Fermentation wird die Zugabe vorzugsweise gegen Ende der logarithmischen Wachstumsphase des Mikroorganismus beendet.

In dem nachstehenden Versuchsbeispiel wird die Bestimmung eines bevorzugten Mengenbereichs des dem Nährmedium zuzusetzenden Induktionsmittels erläutert.

Die Aktivität der Cholinoxidase in den Versuchsbeispielen und den Ausführungsbeispielen wird anhand der Oxidation von Cholin mit Cholinoxidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid, Zersetzung des Wasserstoffperoxids mit Peroxidase in Gegenwart von Phenol und 4-Aminoantipyrin zur Bildung eines Farbstoffs und Messung der Absorption der Farbstofflösung bestimmt. Einzelheiten der Bestimmung sind nachstehend angegeben.

Es wird eine 0,05 Mol/Liter Tris-Pufferlösung (pH 8,0) hergestellt, die 0,01 Mol/Liter 4-Aminoantipyrin, 0,01 Mol/Liter Phenol und 5000 E/Liter Peroxidase enthält. Diese Lösung dient als Farbbildner. 3 ml der Farbbildnerlösung werden zur Bestimmung der Aktivität mit 0,1 ml Enzymlösung sowie 0,1 ml einer 1/30 Mol/Liter Cholin-chlorid-Lösung versetzt. Die Reaktion wird 20 Minuten bei 37°C durchgeführt. Sodann wird die Absorption der Lösung bei 500 nm bestimmt. Die Menge des umgesetzten Cholin-Chlorids wird aufgrund des gemessenen Wertes berechnet. Die Enzymaktivität wird ausgedrückt durch "E". Eine Einheit ist definiert als diejenige Menge Enzym, die 1µMol Cholin in 1 Minute unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zersetzt.

Versuchsbeispiel

In diesem Versuchsbeispiel werden Brevibacterium album KY 4319, Corynebacterium murisepticum KY 3505, Corynebacterium cholinoxydans KY 4707 und Corynebacterium choliniphilum KY 4706 verwendet. 10 ml Anteile eines Nährmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung werden in 70 ml fassende Reagensgläser gegossen und 15 Minuten bei 120 °C sterilisiert.

Cholin-chlorid Konzentration in Tabelle I angegeben

Maisquellwasser 0,5 g/dl

Hefeextrakt 0,5 g/dl

K[tief]2H PO[tief]4 0,1 g/dl

MgSO[tief]4x7H[tief]2O 0,05 g/dl

Mononatriumglutamat 0,5 g/dl

(pH 7,2)

Eine Platinöse der vorstehend genannten Stämme wird gesondert in das Nährmedium in den Reagensgläsern überimpft und 24 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden die Kulturbrühen zentrifugiert. Die erhaltenen mikroben Zellen werden in 10 ml 0,05 Mol/Liter tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert und mit Ultraschall aufgebrochen. Das erhaltene Gemisch wird abgeschleudert und die Aktivität der Cholinoxidase im Überstand bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefasst.

Tabelle II

Die Züchtung der erfindungsgemäß verwendeten Cholinoxidase bildenden Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen, beispielsweise unter Schütteln oder unter Belüftung und Rühren, durchgeführt. Die geeignete Temperatur zur Züchtung liegt bei 25 bis 35°C. Der pH-Wert des Nährmediums wird während der Züchtung vorzugsweise auf einen Wert von 7,0 bis 8,5 eingestellt. Gewöhnlich hat sich nach 1- bis 3-tägiger Züchtung eine beträchtliche Menge an Cholinoxidase in der Kulturbrühe, hauptsächlich in den Zellen, angesammelt.

Nach beendeter Züchtung werden die Zellen von der Kulturbrühe abgetrennt, beispielsweise abgeschleudert und aufgebrochen, beispielsweise mittels Ultraschall. Das erhaltene Gemisch der Zelltrümmer wird abgeschleudert. Aus dem Überstand kann Cholinoxidase nach verschiedenen Verfahren zur Reinigung von Enzymen isoliert werden, beispielsweise durch Aussalzen, Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel, Dialyse, Säulenchromatographie an Dextrangel (Sephadex) Säulenchromatographie an Ionenaustauschern oder Cellulose.

Die enzymatischen Eigenschaften der erfindungsgemäß hergestellten Cholinoxidase aus Brevibactrium album KY 4319, Corynebacterium murisepticum KY 3505, Corynebacterium cholinoxydans KY 4707 und Corynebacterium choliniphilum KY 4706 sind in Tabelle III zusammengefasst.

Tabelle III

Anm.:

* Als Cholinoxidase aus den Stämmen KY 4319, KY 3505, KY 4707 KY 4706 werden die in den Beispielen 1, 3, 4 und 5 hergestellten Enzyme verwendet.

Die enzymatischen Eigenschaften in Tabelle III werden nach folgenden Methoden bestimmt.

(1) Wirkung

In den nachstehend geschilderten Versuchen (1) und (2) wird Cholinoxidase aus Brevibacterium album KY 4319 verwendet. Die gleichen Ergebnisse werden mit Cholinoxidase der anderen Stämme erhalten.

Versuch (1)

Identifizierung der Produkte der enzymatischen Reaktion durch Dünnschichtchromatographie.

Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer Konzentration von 17,0 E/ml gelöst. 0,1 ml der Lösung, 3,0 ml eines 0,2 Mol/Liter Borat-Puffers vom pH-Wert 9,0, 5 ml einer 1 Mol/Liter wässrigen Lösung von Cholin-chlorid und 5 mg Peroxidase werden miteinander vermischt und 15 Stunden bei 30°C unter Schütteln umgesetzt. Die nachstehend angegebenen Probelösungen einschließlich der vorstehend aufgeführten Reaktionslösung werden in einer Menge von jeweils 5 µl auf eine mit Cellulose beschichtete Dünnschichtchromatographieplatte (20 x 20 cm) aufgetragen.

Probelösungen:

(a) 0,1 Mol/Liter wässrige Lösung von Cholin-chlorid

(b) 0,1 Mol/Liter wässrige Lösung von Betain

(c) 0,13 Mol/Liter wässrige Lösung von Betainaldehyd

(d) Reaktionslösung

(e) Gemisch der Reaktionslösung und 0,1 Mol/Liter wässrige Lösung von Betain (Volumverhältnis 1 : 1).

(f) Gemisch der Reaktionslösung und einer 0,13 Mol/Liter wässrigen Lösung von Betainaldehyd (Volumverhältnis 1 : 1).

Die Entwicklung wird mit einem Gemisch von Methanol, Essigsäure und Wasser (Volumverhältnis 18 : 1 : 1) durchgeführt. Nach der Entwicklung wird die Platte an der Luft getrocknet und einmal in Dragendorff's Reagens eingetaucht; vgl. Karel Macek, Pharmaceutical Applications of Thin-layer and Paper Chromatography, Elsevier Publishing Co., Amsterdam-London-New York, 1972, S. 659. Hierauf wird die Platte an der Luft getrocknet und zur Farbentwicklung mit verdünnter Schwefelsäure besprüht. Die Ergebnisse sind in Figur 1 zusammengefaßt. Aus Figur 1 ist ersichtlich, dass als Produkte der enzymatischen Oxidation von Cholin Betainaldehyd und Betain anfallen.

Versuch (2)

Sauerstoffaufnahme und Wasserstoffperoxid-Bildung bei der enzymatischen Reaktion mit Cholin-chlorid und Betainaldehyd.

Teil 1 - Sauerstoffaufnahme

0,5 ml einer wässrigen Lösung des Substrats (mit Cholin-chlorid oder Betainaldehyd in der in Tabelle IV angegebenen Menge) und 1,0 ml eines 0,2 Mol/Liter Boratpuffers (pH-Wert 8,0) mit 0,01 Mol/Liter 4-Aminoantipyrin, 0,01 Mol/Liter Phenol und 50 mg/Liter Peroxidase werden in den Hauptbehälter eines Warburg-Gefäßes gegeben. Ferner werden 0,5 ml eines 0,05 Mol/Liter Tris-Puffers (pH-Wert 8,0) mit 1,5 E/ml Cholinoxidase in den Seitenarm gegeben. Die Reaktion wird bei 37°C durchgeführt. Während der Umsetzung wird die aufgenommene Sauerstoffmenge in regelmäßigen Zeitabständen bestimmt. Die Umsetzung ist innerhalb 30 bis 40 Minuten beendet. Das Molverhältnis von aufgenommenem Sauerstoff (µMol) zur Menge des eingesetzten Substrats (µMol) ist in Tabelle IV zusammengefasst.

Tabelle IV

Teil 2 - Bildung von Wasserstoffperoxid

Als Farbbildnerlösung wird ein Gemisch von 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer (pH 8,0) mit 0,001 Mol/Liter 4-Aminoantipyrin, 0,001 Mol/Liter Phenol und 50 mg/Liter Peroxidase verwendet. 1,9 ml der Farbbildnerlösung werden mit 0,1 ml einer wässrigen Lösung des Substrats (die Cholin-chlorid oder Betainaldehyd in der in Tabelle V angegebenen Menge enthält), 0,2 ml 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer (pH 8,0) mit 3,5 E/ml Cholinoxidase und 0,8 ml Wasser versetzt. Die Umsetzung wird 20 Minuten bei 37°C durchgeführt. Sodann wird die Absorption des Reaktionsgemisches bei 500 nm gemessen. Die Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids wird auf Grund des Messwertes berechnet. Das Molverhältnis der Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids (µMol) zur Menge des eingesetzten Substrats (µMol) ist in Tabelle V angegeben.

Tabelle V

Aus Tabelle IV ist ersichtlich, dass die Menge des durch 1 Mol Cholin-chlorid verbrauchten Sauerstoffs 1,87 bis 1,91 Mol beträgt. Aus Tabelle V ist ersichtlich, dass die Menge des aus 1 Mol Cholin-chlorid erzeugten Wasserstoffperoxids 1,67 bis 1,80 Mol beträgt. Daraus kann geschlossen werden, dass aus 1 Mol Cholin-chlorid unter Verbrauch von 2 Mol Sauerstoff 2 Mol Wasserstoffperoxid gebildet werden. Es ist ferner daraus zu schließen, dass aus 1 Mol Betainaldehyd unter Verbrauch von 1 Mol Sauerstoff 1 Mol Wasserstoffperoxid gebildet wird.

Aus den Ergebnissen der Versuche (1) und (2) ist ersichtlich, dass die erfindungsgemäß hergestellte Cholinoxidase die in Tabelle III angegebene Wirkung besitzt.

(2) Stabiler pH-Bereich

Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer bestimmten Konzentration gelöst (1,5, 0,9, 1,4 und 1,4 E/ml bei Verwendung von Cholinoxidase aus den Stämmen KY 4319, KY 3505, KY 4707 und KY 4706)

0,5 ml Anteile der Lösung werden mit jeweils 1 ml eines 0,05 Mol/Liter Tris-Puffers unterschiedlichen pH-Werts zur Herstellung von Lösungen mit unterschiedlichem pH-Wert zwischen 5 und 10 vermischt. Die erhaltenen Lösungen werden 30 Minuten auf 45°C erwärmt. Sodann wird die Cholinoxidase bestimmt. Die relativen Enzymaktivitäten werden berechnet, wobei die höchste Enzymaktivität unter den mit den Lösungen unterschiedlichen pH-Werts erhaltenen Aktivitäten zu 100 angenommen wird. Die Ergebnisse sind in Figur 2 zusammengefaßt.

In Figur 2 (A), (B), (C) und (D) sind die Versuchsergebnisse der Enzyme aus den Zellen von Brevibacterium album KY 4319, Corynebacterium murisepticum KY 3505, Corynebacterium cholinoxydans KY 4707 und Corynebacterium choliniphilum KY 4706 zusammengefaßt. Die gleichen Versuchsergebnisse sind in den weiteren Figuren zusammengefasst.

(5) Optimaler pH-Bereich für die Reaktion

Ein 4 ml Reaktor zur Bestimmung der Sauerstoffabsorption wird im Falle von Cholinoxidase aus den Stämmen KY 4319, KY 3505, KY 4707 und KY 4706 auf eine bestimmte Temperatur eingestellt, nämlich auf 30, 30, 37 und 37°C. Sodann wird eine Sauerstoffelektrode eingesetzt.

Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer bestimmten Konzentration gelöst (2,3, 1,2, 1,6 und 1,6 E/ml im Falle von Cholinoxidase aus den Stämmen KY 4319, KY 3505, KY 4707 und KY 4706). 0,1 ml der erhaltenen Enzymlösung, 0,1 ml einer 0,1 Mol/Liter wässrigen Cholinchloridlösung und 3,6 ml eines 0,05 Mol/Liter Tris-Puffers mit unterschiedlichem pH-Wert zwischen 6 und 11 werden in den Reaktor gegossen und gerührt. Die Konzentration des in der Lösung gelösten Sauerstoffs wird kontinuierlich aufgezeichnet. Die Abnahme der Sauerstoffkonzentration im Zeitraum zwischen 30 Sekunden und 3 Minuten nach Beginn der Reaktion wird berechnet. Die relativen Enzymaktivitäten werden berechnet, wobei die maximale Abnahme unter den mit den Lösungen mit unterschiedlichem pH-Wert erhaltenen Abnahmen als Enzymaktivität 100 definiert wird. Die Ergebnisse sind in Figur 3 zusammengefaßt.

(4) Optimaler Temperaturbereich zur Reaktion

Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer bestimmten Konzentration gelöst (1,2, 0,5 und 0,5 E/ml bei Verwendung von Cholinoxidase aus den Stämmen KY 4319, KY 4707 und KY 4706). Die erhaltenen Lösungen werden auf die vorstehend beschriebene Weise auf Cholinoxidase untersucht, wobei die Reaktion bei verschiedenen Temperaturen zwischen 20 und 60°C durchgeführt wird. Die relativen Enzymaktivitäten werden berechnet, wobei die höchste Enzymaktivität unter den bei den verschiedenen Temperaturen erhaltenen Aktivitäten zu 100 gesetzt wird. Die Ergebnisse sind in Figur 4 zusammengefaßt.

(5) Substratspezifität

Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer bestimmten Konzentration gelöst (1,5, 0,4, 0,9 und 0,9 E/ml bei Verwendung von Cholinoxidase aus den Stämmen KY 4319, KY 3505, KY 4707 und KY 4706). Die erhaltenen Lösungen werden auf die vorstehend beschriebene Weise auf Cholinoxidase untersucht, jedoch werden verschiedene andere Substanzen als Cholin-chlorid, die in Tabelle III angegeben sind, als Substrat verwendet. Die relativen Enzymaktivitäten gegenüber den verschiedenen Substanzen werden berechnet, wobei die Enzymaktivität gegenüber Cholin-chlorid zu 100 gesetzt wird.

(6) Stabiler Temperaturbereich

Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer Konzentration von 2,2 E/ml gelöst. Anteile der erhaltenen Lösung werden 30 Minuten auf 30, 40, 45, 50, 55, 60 und 65°C erwärmt und sodann abgekühlt. Die abgekühlten Lösungen werden auf Cholinoxidase untersucht. Die relativen Enzymaktivitäten bei den verschiedenen Temperaturen werden berechnet, wobei die Enzymaktivität bei 30°C zu 100 gesetzt wird. Die Ergebnisse sind in Figur 5 zusammengefaßt. Aus Figur 5 ist ersichtlich, dass bei 30minütiger Behandlung bei 65°C ein Aktivitätsverlust von 84 % eintritt.

(7) Stabilisatoren

Cholinoxidase und EDTA werden in 0,03 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 in einer Konzentration von 2,2 E/ml bzw. 10[hoch]-3 Mol/Liter gelöst. Davon getrennt wird Cholinoxidase in 0,05 Mol/Liter tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer Konzentration von 2,2 E/ml gelöst (Kontrollprobe). Die erhaltenen Lösungen werden als solche oder nach dem Erwärmen auf 45°C während 15, 30, 40 oder 60 Minuten und anschließendem Abkühlen auf Cholinoxidase untersucht. Die relativen Enzymaktivitäten werden berechnet, wobei die Enzymaktivität ohne Wärmebehandlung zu 100 gesetzt wird. Die Ergebnisse sind in Figur 6 zusammengefaßt. In Figur 6 zeigt die Kurve A den Fall der EDTA-Zugabe und die Kurve B den Fall ohne EDTA-Zugabe. Aus Figur 6 ist ersichtlich, dass EDTA die Aktivität der Cholinoxidase stabilisiert.

(8) Inhibitoren

Ein 4 ml Reaktor zur Bestimmung der Sauerstoffabsorption wird auf 37°C eingestellt und es wird eine Sauerstoffelektrode eingesetzt. Cholinoxidase wird in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 bis zu einer Konzentration von 0,8 E/ml gelöst. 0,1 ml der erhaltenen Enzymlösung, 50 µLiter einer 1 Mol/Liter wässrigen Cholin-chloridlösung, 0,1 ml einer 1,7 x 10[hoch]-3 Mol/Liter wässrigen Natriumazidlösung und 3,5 ml eines 0,05 Mol/Liter Tris-Puffers vom pH-Wert 8,0 werden in den Reaktor gegossen. Die Konzentration des in der Lösung gelösten Sauerstoffs wird kontinuierlich aufgezeichnet, während die Lösung gerührt wird. Die Abnahme der Sauerstoffkonzentration innerhalb 5 Minuten nach Beginn der Reaktion wird berechnet.

Das gleiche Verfahren wie vorstehend beschrieben, wird wiederholt, jedoch wird kein Natriumazid zugesetzt (Kontrollversuch).

Als Ergebnis wird gefunden, dass die Enzymaktivität durch Zusatz von 1,7 x 10[hoch]-3 Mol/Liter Natriumazid im Vergleich zur Kontrollprobe um 44,4 % inhibiert wird.

(9) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der Cholinoxidase wird nach der Gelfiltrationsmethode (vgl. Biochemical Journal, Bd. 96 (1965), S. 595) an Sephadex G 200 bestimmt. Nach dieser Methode hat das Enzym ein Molekulargewicht von etwa 97 000.

(10) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt der Cholinoxidase wird nach der Elektrofocussiermethode unter folgenden Bedingungen bestimmt:

Trägerampholite: pH-Werte von 3,5 - 5,0

Säulenvolumen: 110 ml

Dauer der elektrischen Spannung: 24 Stunden

Fraktion: 2 g.

Aufgrund dieser Untersuchung hat das Enzym einen isoelektrischen Punkt beim pH-Wert 4,05.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

In diesem Beispiel wird Brevibacterium album KY 4319 als Einsaatstamm verwendet. 10 ml eines Einsaatmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung werden in ein 70 ml fassendes Reagensglas gegossen und 15 Minuten bei 120°C sterilisiert.

Zusammensetzung des Einsaatmediums:

Cholin-chlorid 2 g/dl, Maisquellwasser 0,5 g/dl,

Hefeextrakt 0,5 g/dl, Mononatriumglutamat 0,5 g/dl,

K[tief]2HPO[tief]4 0,1 g/dl, MgSO[tief]4x7H[tief]2O 0,05 g/dl; pH-Wert 7,2.

Eine Platinöse des Stammes wird in das Einsaatmedium überimpft und 48 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Sodann wird die erhaltene Kulturbrühe in 300 ml des gleichen Einsaatmediums in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben übertragen und 48 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet.

Die gesamte erhaltene Kulturbrühe wird erneut in 3,0 Liter eines Mediums der gleichen Zusammensetzung wie das Einsaatmedium in einem 5 Liter fassenden Fermenter übertragen. Die Züchtung wird 24 Stunden bei 30°C unter Belüftung mit 1 Liter/Liter Medium/Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min durchgeführt. Nach beendeter Züchtung haben sich in der Kulturbrühe 0,62 E/ml Cholinoxidase angereichert.

Aus der Kulturbrühe werden die Zellen abgeschleudert. Die Zellen werden in 1 Liter eines 0,05 Mol/Liter Tris-Puffers vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die erhaltene Suspension wird mit einer Dyno-Laboratoriumsmühle (KDL-Typ) behandelt. Es wird ein Gemisch mit aufgebrochenen Zellen erhalten. Sodann wird das Gemisch abgeschleudert. Es wird ein Überstand erhalten. Die vorstehend erwähnte Menge des Enzyms in der Kulturbrühe wird berechnet, bezogen auf die Cholinoxidase-Aktivität des Überstands. Der Überstand wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 30 % versetzt. Es bildet sich eine Fällung. Das erhaltene Gemisch wird zentrifugiert und der Überstand mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 60% versetzt. Die erhaltene Fällung wird abzentrifugiert und in 0,05 Mol/Liter tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 gelöst. Die erhaltene Lösung wird gegen den gleichen tris-Puffer 15 Stunden bei 5°C unter Verwendung eines Cellophanschlauchs dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung auf eine Säule mit 1 Liter DEAE-Cellulose gegeben, die mit 0,05 Mol/Liter tris-Puffer (pH 8,0) mit 0,05 Mol/Liter Natriumchlorid äquilibriert worden ist. Nach dem Waschen des Harzes mit 1 Liter 0,05 Mol/Liter tris-Puffer (pH 8,0), der 0,05 Mol/Liter Natriumchlorid enthält, wird eine Gradienteneluierung mit 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer durchgeführt, der Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,05 bis 0,45 Mol/Liter enthält.

Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und die Cholinoxidase enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 60 % versetzt. Die entstandene Fällung wird abzentrifugiert und in 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 gelöst. Die Lösung wird auf eine Kolonne mit 500 ml Sephadex G-150 gegeben, die mit 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer (pH 8,0) äquilibriert worden ist.

Die Eluierung wird mit dem gleichen Puffer wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die Cholinoxidase enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 60 % versetzt. Die erhaltene Fällung wird abzentriefugiert und in 0,05 Mol/Liter tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 gelöst. Die Lösung wird gegen den gleichen Puffer 15 Stunden bei 5°C unter Verwendung eines Cellophanschlauchs dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung auf eine Kolonne mit 500 ml DEAE Sephadex A-50 gegeben, der mit 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer (pH 8,0) mit 0,1 Mol/Liter Natriumchlorid äquilibriert worden ist. Nach dem Waschen des Harzes mit 500 ml 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer (pH 8,0), der 0,1 Mol/Liter Natriumchlorid enthält, wird eine Gradienteneluierung mit 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer durchgeführt, der Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 Mol/Liter enthält. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die Cholinoxidase enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und 15 Stunden mittels eines Cellophanschlauchs gegen 0,05 Mol/Liter Tris-Puffer vom pH-Wert 8,0 dialysiert. Nach der Dialyse wird die Lösung gefriergetrocknet. Es wird Cholinoxidase in einer Ausbeute von etwa 10 % erhalten. Das Produkt zeigt eine spezifische Aktivität von 2,2 E/mg Protein.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird Brevibacterium cerinum KY 4320 als Einsaatstamm verwendet. 300 ml eines Mediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung werden in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben gegossen und 15 Minuten bei 120°C sterilisiert.

Zusammensetzung des Mediums:

Cholin-chlorid 2 g/dl, Maisquellwasser 1 g/dl,

Mononatriumglutamat 0,2 g/dl, K[tief]2HPO[tief]4 0,1 g/dl,

MgSO[tief]4x7H[tief]2O 0,05 g/dl; pH-Wert 7,2. Eine Platinöse des Stammes wird in das Medium überimpft und 48 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Nach beendeter Züchtung haben sich in der Kulturbrühe 0,36 E/ml Cholinoxidase angereichert.

Beispiel 3

Beispiel 1 wird mit Corynebacterium murisepticum KY 3505 wiederholt. Nach beendeter Züchtung haben sich in der Kulturbrühe 0,56 E/ml Cholinoxidase angereichert. Nach der Reinigung wird ein Cholinoxidase-Präparat in einer Ausbeute von etwa 10 % erhalten. Das Produkt zeigt eine spezifische Aktivität von 3,5 E/mg Protein.

Beispiel 4

Beispiel 1 wird mit Corynebacterium cholinoxydans KY 4707 wiederholt. Die Hauptzüchtung wird 18 Stunden durchgeführt. Nach beendeter Hauptzüchtung haben sich in der Kulturbrühe 1,21 E/ml Cholinoxidase angereichert. Nach der Reinigung wird ein Cholinoxidase-Präparat in einer Ausbeute von etwa 13 % erhalten. Das Produkt zeigt eine spezifische Aktivität von 4,5 E/mg Protein.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wird Corynebacterium choliniphilum KY 4706 als Einsaatstamm verwendet. 300 mg eines Einsaatmediums der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung werden in einen 2 Liter fassenden Erlenmeyerkolben gegossen und 15 Minuten bei 120°C sterilisiert. Sodann wird das Medium mit einer Platinöse des Stammes beimpft, und die Züchtung wird 48 Stunden bei 30°C unter Schütteln durchgeführt. Die gesamte Einsaatkultur wird in 3,0 Liter des gleichen Mediums in einem 5 Liter fassenden Fermenter übertragen, und die Züchtung wird 22 Stunden bei 30°C unter Belüftung mit 1 Liter/Liter Medium/min und einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min durchgeführt. Nach beendeter Züchtung haben sich in der Kulturbrühe 1,10 E/ml Cholinoxidase angereichert. Die Kulturbrühe wird gemäß Beispiel 1 gereinigt. Es wird ein Cholinoxidase-Präparat in einer Ausbeute von etwa 12 % erhalten. Das Produkt zeigt eine spezifische Aktivität von 4,2 E/mg Protein.

Claims (9)

1. Cholinoxidase, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Züchtung von Cholinoxidase bildenden Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium und Isolierung aus der Gärmaische hergestellt worden ist, und gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

a) Katalytische Beschleunigung der Oxidation von Cholin zu Betainaldehyd und von Betainaldehyd zu Betain,

b) stabil im pH-Bereich von 7,0 bis 8,3,

c) pH-Optimum für die Reaktion 7,5 bis 9,0,

d) Temperaturoptimum für die Reaktion bei 20 bis 35°C,

e) Temperaturstabilität im Bereich von 20 bis 45°C,

f) enzymatische Aktivität gegenüber Cholin oder dessen Salzen, geringe Aktivität gegenüber 2-Dimethylaminoäthanol, keine oder sehr geringe Aktivität gegenüber Acetylcholin- chlorid, Sarkosin, Betain, Glykokoll, 2-Methylaminoäthanol und Äthanolamin-hydrochlorid,

g) Stabilisierung durch EDTA,

h) Inhibierung durch Natriumazid,

i) Molekulargewicht etwa 97 000 und

j) isoelektrischer Punkt pH 4,05.

2. Verfahren zur Herstellung von Cholinoxidase, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Cholinoxidase bildenden Mikroorganismus der Gattung Brevibacterium oder Corynebacterium in einem Nährmedium züchtet und die Cholinoxidase aus der Gärmaische isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus der Art Brevibacterium album, Brevibacterium cerinum, Corynebacterium murisepticum, Corynebacterium cholinoxydans oder Corynebacterium choliniphilum verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Brevibacterium album KY 4319 (FERM-P Nr. 3777; NRRL B-11 046; ATCC 15 111), Brevibacterium cerinum KY 4320 (FERM-P Nr. 3778; NRRL B-11 047; ATCC 15 112), Corynebacterium murisepticum KY 3505 (FERM-P Nr. 3779; NRRL B-11 049; ATCC 21 374), Corynebacterium cholinoxydans KY 4707 (FERM-P Nr. 4 111; NRRL B-11 158) oder Corynebacterium choliniphilum KY 4706 (FERM-P Nr. 4110; NRRL B-11 157) verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Cholin oder dessen Salz enthaltendes Nährmedium verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man ein 7 bis 800 mMol/l Cholin oder dessen Salz (berechnet als Cholin-chlorid) enthaltendes Nährmedium verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei Temperaturen von 25 bis 35°C und einem pH-Wert von 7,0 bis 8,5 durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man nach der Züchtung die Zellen abtrennt und aufbricht.

9. Verwendung der Cholinoxidase gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung von Cholin.